KR102571313B1

KR102571313B1 - 삼백초추출물과 녹차추출물이 포함된 비만 예방 및 개선용 식품조성물 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR102571313B1
Application number: KR1020210018854A
Authority: KR
Inventors: 배정식; 전연정; 박지은; 안지혜; 손일권
Original assignee: 주식회사 웰파인
Priority date: 2021-02-10
Filing date: 2021-02-10
Publication date: 2023-08-29
Also published as: KR20220115192A

Abstract

본 발명은 삼백초추출물과 녹차추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방, 치료 또는 개선용 복합조성물 및 그 제조방법을 개시하고 이는 (a)건조된 천연물 원료를 분쇄하여 건조원료분말을 얻는 1차 분쇄단계; (b)상기 1차 분쇄단계(a)의 건조원료분말에 친수성 유기용매를 가하여 교반하면서 추출한 후 농축 및 동결건조하는 단계; (c)상기 농축 및 동결건조단계(b)에서 얻은 천연물의 동결건조 추출물을 일정 비율로 배합하여 혼합조성물을 제조하는 단계로 이루어지는 식품 조성물 제조방법에 있어서, 상기 1차 분쇄단계(a)에서, 고압 유화기에서 일정 조건으로 고압처리하는 전처리로 변경 수행하는 것을 특징여 제조된 삼백초와 녹차 추출물을 중량비 1 : 1(w/w) 포함하는 식품 조성물은 지방축적 억제에 효과적인 삼백초추출물과 탄수화물의 흡수를 저해하여 혈당 상승을 억제하는 효능을 가지는 녹차추출물을 복합적으로 사용함으로써 이를 활용한 단일소재보다 비만에대한 예방, 치료 또는 개선 효과가 뛰어난 식품소재의 개발이 가능한 각별한 장점이 있는 유용한 발명이다.

Description

삼백초추출물과 녹차추출물이 포함된 비만 예방 및 개선용 식품조성물 및 그 제조방법{Food composition for preventing or improving obesity comprising of extracts from Lizard's tail and Green tea}

본 발명은 비만 예방 개선용 식품조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 체지방 감소와 탄수화물 흡수를 저해하여 식후 혈당 상승 억제를 통하여 과다하게 축적된 체지방에 의한 비만 증상을 예방 또는 개선할 수 있는 식품조성물로 삼백초추출물과 녹차추출물의 동량(w/w) 배합비로 함유하도록 제조된 혼합물이 포함된 식품조성물은 비만 예방 및 개성에 있어서, 체중조절용 기능성 혼합조성물로서 뛰어난 효과가 제공된다.

비만(obesity)은 체내 지방세포(adipocyte)가 수적 및 양적 증가로 인해 지방조직이 과다 축적된 상태를 의미하고 이러한 지방세포가 증가하여 지방화 즉 지방세포의 분화와 지방의 축적에 의해 유기된다. 한편, 탄수화물은 체내에서 에너지원으로 사용되는 필수 영양소이다. 건강한 신체기능을 유지하기 위해서는 탄수화물을 하루 총 섭취 영양소의 55 ∼ 70%를 차지하도록 것이 이상적이나 그 이상으로 섭취하는 경우 비만이 유기되는데 한국인의 65%가 탄수화물을 과잉섭취 하고 있다고 보고되고 있다. 국민건강영양조사에 따르면 탄수화물 하루 최소 섭취량은 100 ∼ 130g 정도이나 우리나라 성인의 탄수화물 섭취량은 평균 298.1g으로 최소 섭취량의 2배 이상의 양을 섭취하고 있다. 탄수화물을 과잉 섭취하는 경우 혈당수치를 증가시켜 인슐린을 분비시키며 그 결과 잉여 탄수화물은 지방으로 바뀌어 체내에 축적되어 비만이 되고 더 진행하면, 고혈압, 당뇨 등 각종 성인병의 원인이 된다.

세계보건기구 (WHO)는“비만과의 전쟁”을 선포하며 전 세계적으로 비만의 심각성을 알리고 있으며, 세계 10대 건강위험 요인 중 하나로 선정하였다. 국내에서도 활동량은 줄고 서구화된 식습관 등으로 인해 비만인구는 점점 증가하는 추세이며, 건강에 대하여 남녀노소 누구나 가장 흔히 걱정 중 하나가 비만에 관한 것일 것이다. 비만은 혈액에 지방과 당이 많이 쌓여 당뇨, 고혈압, 이상지질혈증, 심혈관질환 등에 취약하며, 과도한 체중증가로 인해 관절에 무리를 주거나 정상인들 보다 합병증으로 질환발병 및 사망률도 매우 높아진다.

본 발명자들은 50여종의 천연물을 조사 대상으로 in vitro 독성시험 및 지방축적억제 효능, α-glucosidase 활성 저해 효과를 측정하여 안전성 및 항비만 효능을 가지는 새로운 식품소재로서 다수 실험결과, 체지방감소 효능을 나타내는 소재로서 삼백초를 그리고 체내 탄수화물 흡수를 저해하는 소재로서 녹차를 각각 최종적으로 선정하였다(도 1, 표 1).

지방세포 분화 및 α-glucosidase 활성 억제 효능평가

소재	지방세포 분화(%)	α-glucosidase inhibition(%)	소재	지방세포 분화(%)	α-glucosidase inhibition(%)
가시오가피열매	113.4	-	상엽	99.3	-
감태	87.6	99.1	수세미오이	100.7	19.6
겨우살이	117.0	-	신선초	105.7	-
겨자채	97.3	4.7	아마란스	95.7	-
결명자	112.0	18.2	어성초	94.8	52.6
고지베리	124,3	26.8	여주	35.5	-
과라나	100.2	-	연근	96.1	-
구아바잎	41,9	99.8	연잎	98.8	48.5
나한가	95.4	-	오디	110.5	-
녹차	66.4	99.9	옻나무	93,6	-
눈개승마	91.6	17.1	유자	106.9	-
단삼	125.9	-	인진쑥	93.7	45.5
달개비	95.2	23.5	자몽	117.9	33.5
두릅	96.1	-	작약	90.6	93.7
둥근마	100,5	22,0	정향	55.9	97.7
둥글레	98.8	-	지황	94.1	-
로즈힙	100.7	-	진피	90.4	-
맥문동	93.6	-	참마	98.7	11.0
박하	120.7	77.3	치거리	105.8	39.7
복분자	35.5	99.7	토복령	90.9	99.0
비타민나무	103.8	-	함초	103.9	-
산수유	96.3	34.6	해당화	71.2	98.1
삼백초	54.0	-	호장근	26.3	96.7
상백피	98.9	-	홍화씨	106.6	-

(-: 효능없음)

삼백초(Saururus chinesis (Lour.) Bail)는 중국, 일본, 한국에 분포하며 떡잎식물 후추목 삼백초과에 딸린 다년생 초본식물로 '천성초'라 하기도 한다. 항산화, 항노화, 해독, 항암, 이뇨, 혈액순환 등 갖가지 질병에 뛰어난 약초로 고대로부터 다양한 약효로 민간약으로 사용되어 왔다. 삼백초에 함유된 주요 성분으로 methyl n-nonyl ketone의 정유성분과 다양한 플라보노이드가 함유되어 있다. 삼백초에 관한 연구로는 이미 주로 향균, 피부 미백 및 항노화 관련 연구들이 이루어져왔다.

녹차(Camellia sinensis)는 상록의 활엽관목으로 세계적으로 가장 널리 소비되고 있는 음료이다. 녹차는 채취시기, 계절에 따라 크게 우전, 세작, 중작, 대작으로 나뉘며 채취시기가 늦을수록 카테킨 성분이 많이 함유되어 있다고 알려져 있다 (Yang 등, 2012). 녹차의 주요 성분인 카테킨으로 폴리페놀의 일종으로 (-)-epigalloe-catechin 3-O-gallate (EGCG), (-)-epigallocatechin (EGC), (-)-epicatechin 3-O-gallate (ECG), (-)-epicatechin (EC) 등으로 구성되어 있으며 그 작용으로는 혈압저하, 항혈전, 항암, 항비만, 항당뇨, 항염증, 심혈관질환 등 다양한 질환을 예방할 수 있다고 이미 보고 되어있다.

다양한 효능으로 녹차에 대한 연구는 활발하게 이루어져 왔으며 녹차추출물은 이미 비만개선 및 체중 감량 효과를 지닌 체지방감소 건강기능식품 소재로 많이 활용되어 왔다. 본 발명에서는 녹차추출물은 α-glucosidase 활성을 억제하여 섭취한 탄수화물의 소화와 흡수를 지연시켜 체내 흡수를 줄여 비만을 예방할 수 있는 기전으로 작용하도록 녹차추출물을 제조하였다.

천연물의 추출방법에는 물, 메탄올, 에탄올 등 극성용매를 사용하여 유효성분을 추출하거나 초음파, 초임계추출 등으로 물리적인 힘들 가하는 다양한 추출방법이 존재한다. 그러나 본 발명자들은 천연물의 유효성분을 효율적으로 추출하고자 상기 용매추출 또는 물리적 추출 외에 고압추출법을 부가 적용하여 천연물이 함유하고 있는 유효성분 추출을 증대하고자 하였다. 고압 추출법은 높은 압력을 바탕으로 좁은 나노셀(diamond)을 통과시켜 천연물의 입자를 쪼개 유효성분을 증대시키는 방법으로서 추출시간, 비용 및 추출성분의 안정성 등을 고려하여야 하였다.

본 발명은 천연자원 소재를 선정한 후 인체에 부작용이 없는 항비만 소재를 탐색하여 비만의 원인이 되는 중성지방의 축적 감소 및 체내 탄수화물 체내흡수 저해에 가장 유용한 삼백초와 녹차를 이용하여 체중조절용 소재 및 제품 등에 활용할 수 있는 비만 예방 및 개선 효능을 가지는 항비만 기능성 식품조성물을 제공한다.

한국 특허공개번호 10-2019-0103665호에는 삼백초의 용매추출물의 비만 개선 및 예방효과가 개시되어 있고, 한국 특허등록공보 10-161447호에는 삼백초, 강황, 원지 및 석창포 에탄올 추출물의 10:6:10:4(w/w) 복합추출물의 비만개선 및 예방 기능성 조성물이 개시되어 있다.

또 한국 특허등록 제10-1461098호에는 삼백초, 구기자 및 어성초의 알콜 추출물 2:1:1(w/w) 혼합 조성물의 항비만 효과가 개시되어 있다. 한편, 한국 특허공개번호 10-2007-19395호에는 녹차분말, 스피루리라 및 옥수수 전분의 복합분말의 항비만 효과가 개시되어 있다.

1. 공개특허 10-2019-0103665호 2. 특허등록 10-1621447 3. 특허등록 10-1461098 4. 공개특허 10-2007-19395

따라서, 본 발명의 목적은 삼백초와 녹차의 최적 배합비로 이루어지는 천연물 복합추출물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 인체 체지방 감소에 뛰어난 소재와 탄수화물의 체내흡수를 저해하여 식후 혈당 상승 억제를 통해 비만 예방 및 체중 조절용 천연물 복합추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 30 ∼ 70%의 농도의 알코올 농도범위(30 ∼ 70%)내에서 유효성분을 가장 효율적으로 추출한 방법을 찾아내어 각각의 추출물을 추출하고 해당 고형분함량을 기준으로 각각의 추출물을 혼합하여 체지방감소 효능을 극대화 하는 천연물 혼합 조성물의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 상기 목적은 삼백초추출물과 녹차추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및 개선용 혼합조성물의 제조방법은 (a)상기 식품 소재로서의 각 건조된 천연물 원료를 분쇄하여 건조원료분말을 얻는 1차 분쇄단계; (b)상기 1차 분쇄단계(a)에서 얻은 천연물 건조원료분말에 친수성 유기용매를 가하여 교반하면서 추출한 후 농축 및 동결건조하는 단계; (c)상기 동결건조단계(b)에서 얻은 천연물의 동결건조 추출물을 2차 분쇄하는 단계; (d)상기 2차 분쇄단계(c)에서 얻은 천연물의 건조분말을 일정 비율로 배합하여 혼합조성물을 제조하는 단계로 이루어지는 삼백초 및 녹차 추출물의 제조방법에 있어서;

상기 (b)단계는 1차 분쇄단계(a)에서 얻은 각 건조원료분말에 친수성 유기용매를 가하고 고압 유화기에서 가장 바람직하게는 10,000 ∼ 30,000 psi의 압력으로 1 ∼ 3시간 상기 천연물 입자를 쪼깨는 전처리 단계로 변경 수행하여 유효성분 추출 효율과 안전성을 증대시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 의하면, 상기 단계 (b)에서 친수성 유기용매는 물 또는 알코올이거나 그 혼합물이고, 열수추출방법은 온도 40 ～ 60℃에서 60분 ～ 240분 동안 1 ～ 3회 추출하되, 1회 추출 시 사용되는 정제수의 양은 원료 중량대비(w/w) 10～ 30배로 하는 것이 공정의 안전성 및 원료에 함유되어 있는 유효성분의 안정성 등을 고려할 때 효율적이고 추출공정의 단순화에 바람직하였다. 또한 상기 유기용매를 사용할 경우 비교적 극성이 높은 에탄올을 사용하는 것이 바람직하며, 정제수와 혼합하여 주로 30 ∼ 70%(w/w)의 에탄올을 사용하는 것이 바람직하였다.

건조 분쇄된 상기 2종의 선택 식물재료의 경우 10,000 psi ∼ 30,000 psi 에서 쪼깨기 효과 극대화 및 그 후 분쇄물의 엉김이 없는 효과가 있다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 제조방법에 따라 지방세포의 분화 또는 지방의 축적을 억제, 탄수화물 체내흡수를 저해기전으로 인하여 식후 혈당 상승 억제 작용으로 각각 관여하는 삼백초추출물과 녹차추출물을 특별히선정하여 최적 배합비로 혼합한 복합조성물을 사용함으로써 항비만 효능 및 지질 개선 효능을 확인하는 효과가 있으며 나아가 비만 예방 또는 개선용 식품조성물을 제공하는 뛰어난 효과가있다.

도 1은 본 발명 천연물 원료 선택을 위한 기초실험 결과를 나타낸 도면,
도 2는 본 발명의 바람직한 실시예를 도시한 삼백초 및 녹차 추출물의 제조공정의 다이어그램,
도 3은 본 발명의 가장 바람직한 실시예에 따라 제조된 삼백초추출물 (TM-1), 녹차추출물(TM-2)의 세포생존율 그래프,
도 4는 본 발명의 가장 바람직한 실시예에 따라 제조된 녹차추출물 (TM-2)의 α-Glucosidase 저해 활성(AGI) 그래프,
도 5는 본 발명의 가장 바람직한 실시예에 따라 제조된 삼백초추출물 (TM-1)을 3T3-L1세포에 처리하여 확인한 지방세포분화(지방축적) 그래프,
도 6은 본 발명의 가장 바람직한 실시예에 따라 제조된 삼백초추출물(TM-1)을 분화가 유도된 3T3-L1세포에 처리하여 확인한 중성지질 함량 그래프,
도 7은 본 발명의 가장 바람직한 실시예에 따라 제조된 삼백초추출물 (TM-1), 녹차추출물(TM-2), 삼백초추출물과 녹차추출물의 1:1(w/w) 혼합물 (TM-3)을 고지방식이 비만모델 쥐에게 처리하여 8주간 사육하며 측정한 체중변화를 나타낸 그래프와 희생 전에 측정한 최종 체중을 나타낸 그래프,
도 8은 본 발명의 가장 바람직한 실시예에 따라 제조된 삼백초추출물 (TM-1), 녹차추출물(TM-2), 삼백초추출물과 녹차추출물의 1:1(w/w) 혼합물 (TM-3)을 고지방식이 비만모델 쥐에게 처리하여 8주간 사육한 후에 측정한 체중증가량 및 식이효율을 나타낸 그래프,
도 9는 본 발명의 가장 바람직한 실시예에 따라 녹차추출물(TM-2), 삼백초추출물과 녹차추출물의 1:1(w/w) 혼합물 (TM-3)을 고지방식이 비만모델 쥐에게 처리하여 8주간 사육한 후 측정한 경구 내당능 측정 그래프 및 혈당 반응곡선 아래의 면적 그래프,
도 10은 본 발명의 가장 바람직한 실시예에 따라 제조된 녹차추출물(TM-2), 삼백초추출물과 녹차추출물의 1:1(w/w) 혼합물 (TM-3)을 고지방식이 비만모델 쥐에게 처리하여 8주간 사육한 후 측정한 당화혈색소 함량,
도 11은 본 발명의 가장 바람직한 실시예에 따라 제조된 삼백초추출물 (TM-1), 녹차추출물(TM-2), 삼백초추출물과 녹차추출물의 1:1(w/w) 혼합물 (TM-3)을 고지방식이 비만모델 쥐에게 처리하여 8주간 사육한 후 장기(간, 총 백색지방조직)의 무게를 나타낸 그래프,
도 12는 본 발명의 가장 바람직한 실시예에 따라 제조된 삼백초추출물 (TM-1), 녹차추출물(TM-2), 삼백초추출물과 녹차추출물의 1:1(w/w) 혼합물 (TM-3)을 고지방식이 비만모델 쥐에게 처리하여 8주간 사육한 후 부고환 지방조직의 지방세포 크기 및 세포수를 나타낸 그래프,
도 13은 본 발명의 가장 바람직한 실시예에 따라 제조된 삼백초추출물 (TM-1), 녹차추출물(TM-2), 삼백초추출물과 녹차추출물의 1:1(w/w) 혼합물 (TM-3)을 고지방식이 비만모델 쥐에게 처리하여 8주간 사육한 후 부고환 지방조직의 조직 형태학적 변화,
도 14는 본 발명의 가장 바람직한 실시예에 따라 제조된 삼백초추출물 (TM-1), 녹차추출물(TM-2), 삼백초추출물과 녹차추출물의 1:1(w/w) 혼합물 (TM-3)을 고지방식이 비만모델 쥐에게 처리하여 8주간 사육한 후 혈청 내 혈당(glucose), 중성지질(triglyceride), 총콜레스테롤(total cholesterol), 저밀도지단백콜레스테롤( LDL-cholesterol), 고밀도지단백콜레스테롤(HDL-cholesterol)를 측정한 결과를 나타낸 그래프,
도 15는 본 발명의 가장 바람직한 실시예에 따라 제조된 삼백초추출물 (TM-1), 녹차추출물(TM-2), 삼백초추출물과 녹차추출물의 1:1(w/w) 혼합물 (TM-3)을 고지방식이 비만모델 쥐에게 처리하여 8주간 사육한 후 혈청 내 인슐린(insulin), 렙틴(leptin)의 함량을 측정한 결과를 나타낸 그래프,
도 16은 본 발명의 가장 바람직한 실시예에 따라 제조된 삼백초추출물 (TM-1), 녹차추출물(TM-2), 삼백초추출물과 녹차추출물의 1:1(w/w) 혼합물 (TM-3)을 고지방식이 비만모델 쥐에게 처리하여 8주간 사육한 후 지방대사 조절 단백질의 mRNA 발현량을 나타낸 그래프,
도 17은 본 발명의 가장 바람직한 실시예로 제조된 조성물의 유효성분 함량을 측정하기 위해 HPLC 분석한 결과물 중 크로마토그램을 나타낸 도면이다.

이하, 첨부 도면에 따라 본 발명의 구체적인 구성을 비교 실시예를 들어 상세히 설명하지만 당업자들에게 그 절차와 순서를 쉽게 변경하여 본 발명을 변경할 수 있음은 물론이다. 이러한 변경은 본 발명의 권리범위에 속한다.

실시예1. 천연물 추출물의 제조 및 이들의 혼합조성물의 제조

본 발명에서 일 실시예로 제조된 삼백초와 녹차의 혼합추출물 제조공정은 도 2에 나타냈다.

1-1.삼백초 추출물의 제조

본 발명에서 선정한 상기 삼백초는 삼백초 생산 농가(보현산 청정약초 영농조합법인)를 통해 건조물을 구매하였다. 구매한 삼백초는 분쇄기(blender)를 이용하여 분쇄하여 삼백초 원료로 제조한 후 추출기에 넣고 삼백초 건조 원료 중량대비(w/w) 30배의 30% 주정을 가하고, 60℃에서 4시간 추출하여 얻어진 여액을 농축하고 동결건조기를 통해 동결건조한 후 2차 분쇄하여 삼백초 추출 파우더를 제조하였다.

1-2.녹차 추출물의 제조

본 발명에서 선정한 상기 녹차는 녹차 생산 농가(농업회사법인 보성녹차선다원)을 통하여 엽차를 구매하였다. 구매한 녹차는 분쇄기(blender)를 이용하여 1차 분쇄하여 녹차 원료로 제조한 후 추출기에 넣고 녹차 원료 중량대비(w/w) 20배의 30%의 주정을 가하고, 60℃에서 4시간 추출하여 얻어진 여액을 농축하고 동결건조기를 통해 동결건조한 후 2차 분쇄하여 녹차 추출 파우더를 제조하였다.

1-3. 혼합조성물의 제조

상기 1-1. 및 1-2.에서 제조된 삼백초추출물과 녹차추출물을 고형분함량 대비 1 ∼ 9:9 ∼ 1(w/w)의 비율로 혼합하였다. 본 발명자들은 다수의 실험결과 1:1(w/w) 혼합물이 본 발명의 기전 및 항비만 효과 달성에 가장 유효하였으므로 하기 실험에서는 이 비율을 적용하였다.

1-4. 삼백초 및 녹차 고압유화 추출물 제조(비교 실시예)

상기 실시예 1-2.와 동일하게 하되 삼백초 및 녹차 원료를 30% 주정과 각각 혼합하여 가장 바람직하기는 고압유화기에서 10,000 ∼ 30,000 psi에서 1 ∼ 3시간 입자를 쪼개는 전 처리단계로 변경 수행하여 천연물 추출과정을 통하여 수득한 여액을 농축하고 동결건조기를 통해 동결건조한 후 2차 분쇄하여 각 추출물의 추출 파우더를 제조하였다. 본 비교 실시에 1-4.에 따라 수득한 각 추출물의 추출 파우더를 각 1:1(w/w) 배합비로 배합한 혼합 주성물을 얻고 이를 본 발명의 공시재료로 사용하였다.

실시예2. 혈당조절 효능 확인하기 위한 α-Glucosidase 저해 효과 측정

α-glucosidase 저해활성은 Watanabe 등의 방법에 따라 측정하였다. 액체시료 20㎕와 100mM phosphate buffer(pH 6.8) 20μL 넣은 후 효소인 0.2unit/mL α-glucosidase를 10mM phosphate buffer(pH 6.8)에 녹여 20μL를 넣고, 기질로써 100mM phosphate buffer(pH 6.8)에 녹인 2.5mM p-nitrophenyl-D-glucopyranoside (p-NPG)을 20μL을 넣고, 37℃에서 15분간 incubation 시킨 후 반응을 종결시키기 위하여 0.2M sodium carbonate solution 80μL를 혼합하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다. α-Glucosidase 저해 활성(AGI)은 아래의 식을 이용하여 활성을 구하였다.

녹차의 형태(분말/잎)나 채취시기(세작/대작)에 따라 α-glucosidase 활성 저해 효과를 확인하여 원료 수급, 경제성 등을 고려하여 탄수화물 체내흡수를 저해하는 소재로 건조된 대작(엽차)를 선정하였다(도 3). 또한 농도별로 α-Glucosi dase 저해 활성을 확인하여 IC50(α-glucosidase의 활성을 50% 감소시키는 소재의 농도) 값이 20.0 ug/mL을 확인하였다.

실시예3. 비만 예방, 치료 및 개선효과 를 확인하기 위한 in vitro 세포실험

3-1. 세포 배양

생쥐에서 유래한 지방전구세포인 3T3-L1 세포는 한국세포주은행에서 구입하여 사용하였다. 3T3-L1 세포는 DMEM배지 (Welgene)에 10% bovine calf serum(BCF), 100units/mL penicillin과 100 ug/mL streptomycin을 첨가한 세포 배양액(complete DMEM 배양액)을 사용하여 37℃ 습윤한 CO₂ 배양기 (5% CO₂/95% air)에서 배양하였다. 세포가 배양접시의 80% 정도 찼을 때, phosphate buffer saline(PBS, pH 7.4)으로 세포 단층을 씻어낸 후 trypsin-2.65 mM EDTA를 첨가하여 세포를 떼어내어 계대 배양하였고, 배지는 2일마다 교환하였다.

3-2. 세포 생존율(cell viability) 측정

3T3-L1 세포를 3 x 10⁴ cells/well이 되도록 24-well plate에 분주하고 24시간 세포를 배양하였다. 세포를 24시간 배양한 후 각각의 시험물질을 다양한 농도 (0, 10, 25, 50, 100, 200 ug/mL)로 함유한 세포 배양액으로 교환하여 세포를 72시간 배양하였다. 세포를 72시간 배양한 후 MTT assay (Denizot F and Lang R. J Immunological Method 89: 271-277, 1986)을 실시하여 살아있는 세포수를 측정하였다. MTT assay 방법은 미토콘드리아의 dehydrogenase가 MTT (Amresco)를 환원시켜 푸른색 물질인 formazan을 만드는 원리에 기초한 것으로 본 시험에서는 formazan을 isopropanol에 용해시킨 다음 570 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다(도 4).

3-3. 세포 분화 유도 및 시험물질 처리

3T3-L1 세포를 1 x 10⁵ cells/w의 농도로 24 well plate에 분주하였다. 세포가 confluence한 상태에 도달한 후, 순차적으로 3종의 분화유도배약액 (DM)으로 세포 배양액을 교환하여 세포를 배양하여 지방세포로 분화를 유도하였다. 즉, 10% FBS를 함유한 DMEM 배지에 DMI (1 uM dexamethasone, 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), 5 ug/mL insulin)를 첨가한 분화유도배양액으로 세포배양액을 교환하여 2일 동안 분화를 자극하였다. 2일 후, 10% FBS를 함유한 DMEM배지에 5 ug/mL insulin을 첨가한 새로운 분화유도배양액으로 교환하여 다시 2일 동안 분화를 자극하였다. 총 4일 동안 분화를 자극한 후, 세포를 10% FBS를 함유한 DMEM 배지에서 약 4 ∼ 8일 동안 유지하여 지방세포로의 분화를 유도하였으며, 이 기간에는 세포배양액을 2일마다 교환하였다. 시험물질이 지방세포 분화에 미치는 영향을 조사하기 위해 분화유도배양액에 시험물질을 농도별 (6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200 ug/mL)로 첨가하여 세포에 처리하였다.

3-4. 지방세포 분화 (지방 축적) 측정 (Oil red-O 염색 및 정량)

3T3-L1 세포의 분화를 유도하며 시험물질을 처리한 후, 세포를 DPBS (Welgene)로 헹군 후 4% paraformaldehyde (PFA, Biosesang)를 넣어 1시간 동안 실온에서 세포를 고정시켰다. 세포를 고정시킨 후, oil Red O (Sigma-Aldrich Co.) 용액을 처리하여 1 ∼ 2시간 동안 실온에서 염색하였다. 지방세포의 염색 정도를 눈으로 관찰한 후, 세포를 증류수로 헹구고 현미경을 통해 지방세포를 관찰하였다. 지방세포 분화 정도를 정량 분석하기 위해 oil red O 염색 후 isopropanol로 녹여 490nm 파장에서 흡광도를 측정하였다(도 5).

3-5. 지방세포 내 중성지방 함량 측정

3T3-L1 세포를 3 x 10⁵ cells/well이 되도록 6-well plate에 분주하여 분화 유도 하면서 시험물질을 처리한 후, 세포배양액을 제거하고 세포를 DPBS *Welgene로 헹궈주었다. 세포에 증류수 300μL 를 넣고 cell scraper를 사용하여 세포를 1.5 mL 에펜튜브에 모은 후 homogenizer로 균질화하였다. 균질화한 세포용액에 Folchchloroform : methanol = 2:1(v/v)용매를 900μL 넣고 잘 섞어준 후 37℃에서 30분간 반응 시켰다. 30분 후, 10분간 원심분리 (5,000 rpm)하여 지질이 함유되어 있는 하층액을 새로운 1.5 mL tube에 옮겨 담은 후 고효율 원심농축장치 (GeneVac)를 사용하여 2시간 동안 원심분리하며 chloroform층을 증발 및 건조 시켜 pellet을 얻었다. 이 pellet에 chloroform 20μL 를 넣고 지질을 다시 용해시킨뒤 시험용액으로 이용하였다. 시험용액은 triglyceride assay kit (아산제약)을 이용하여 제조사에서 제시하는 방법에 따라 중성지방을 측정하였다(도 6).

3-6. 통계처리

모든 분석 수치는 평균(mean)±표준오차(standard error of the mean, SEM)으로 나타내었다. 대조군과 시험물질 투여군의 차이를 비교하기 위하여 분산분석 (ANOVA)로 분석 후 SAS software version 9.4(SAS　institute)에서 Duncan’multiple range test를 이용하여 유의성을 검증하였다(ρ < 0.05).

실시예4. 비만 예방, 치료 및 개선효과 를 확인하기 위한 in vivo 동물실험

4-1. 실험동물 사육환경

실험동물은 특정병원체가 없는 5주령, 수컷 C57BL/6 mouse는 ㈜두열바이오에서 구입하여 사용하였으며, 1주일 간 검역 및 적응과정을 거친 뒤 체중 감소가 없는 건강한 실험동물을 선별하여 실험에 사용하였다. 실험동물은 온도 23±3℃, 상대습도 50±10%, 환기회수 10 ∼ 15 회/시간, 조명시간 12시간(08:00 ∼ 20:00), 조도 150 ∼ 300Lux으로 설정 된 사육환경에서 사육하였으며, 시험 전 기간 동안 실험동물은 실험동물용 고형사료와 음수를 자유롭게 섭취하도록 하였다.

4-2. 실험물질 투여

1주일 간 적응 기간을 거쳐 선별 된 실험동물은 난괴법에 의거하여, (G1)대조식이군, (G2)고지방식이군 대조군, (G3)고지방식이+ 삼백초 추출물: 녹차 추출물 1:1 혼합물(TM-3), (G4)고지방식이+양성대조물질(가르시니아 캄보지아추출물, HCA) 투여군으로 분류하였으며, 각 시험군 당 10마리의 실험동물을 사용하였다. 시험 전 기간 동안 정상대조식이군(G1)과 고지방식이군(G2, G3, G4, G5, G6)에는 대조식이군(10% of kcal from fat, Research Diets Inc)과 고지방식이(60% of kcal from fat, Research Diets Inc)를 각각 공급하였고, 음수는 자유 섭취하게 하였다. 시험물질은 음수에 녹여 8주 간 일정한 시간에 경구 투여하였다.

4-3. 체중 및 식이섭취량 측정

시험기간 동안 매주 일정한 시간에 실험동물의 체중을 측정하였다. 각 실험동물의 식이섭취량은 2일 간격으로 측정하였고, 시험기간 동안 섭취한 양을 계산하여 일일식이섭취량과 일일에너지섭취량을 산출하였다. 식이효율(Food Efficiency Ratio, FER)은 시험기간 내에 체중 증가량을 동일기간 섭취한 식이의 양으로 나누어 다음과 같이 계산하였다.

시험기간 중에 측정한 동물의 체중 변화는 도 7에 표시한 것과 같이 모든 군에서 꾸준히 증가하여 정상적인 체중 변화를 나타내었으며, 대조식이군에 비해 고지방식이 대조군에서 체중의 증가량이 많았으며, 고지방식이 대조군과 비교하여 시험물질을 처리한 모든 군(TM-1, TM-2, TM-3, HCA) 에서 고지방식이 대조군에 비해 체중의 증가 양상이 감소하였다. 시험물질 TM-3 투여군은 1주차부터 유의적인 체중 감소를 나타내었으며 특히, 시험물질 TM-3 투여군에서 가장 적은 체중 증가량을 나타내었다(도 8).

4-4. 경구 내당능 측정 (Oral glucose tolerance test, OGTT)

혈당 수준을 확인하기 위하여 대조식이군, 고지방식이 대조군, 시험물질 TM-2, TM-3 투여군에 대하여 경구 내당능 측정하였다. 시험물질을 투여하고 30분 후에 2g/kg BW 포도당을 경구 투여하였다. 시험 종료 3일 전에 실험동물을 12시간 금식 후 포도당 경구 투여 후 30, 60 및 120분 후에 실험동물의 꼬리에서 혈액을 취해 혈당측정기(ACCU-CHEK, 한국로슈진단(주))를 사용하여 혈당을 측정하였다.

포도당 투여 전 혈당(0분)과 30분의 혈당은 대조식이군고 비교하여 고지방식이 대조군은 유의적으로 높은 혈당수치를 나타내었고, 시험물질 TM-3 투여군에서 낮은 혈당 수치를 나타내었으나 유의적인 차이는 없었다. 60분, 120분 혈당은 고지방식이 대조군과 비교하여 시험물질 TM-3 투여군에서 유의적으로 낮은 혈당수치를 나타내었다. 혈당 반응곡선 아래의 면적(area under the curves; AUC)은 대조식이군과 비교하여 고지방식이 대조군에서 유의적으로 AUC가 증가하였고, 시험물질 TM-3 투여에 의해 유의적으로 AUC가 유의적으로 감소하였다(도 9).

4-5. 실험동물 채혈

실험동물을 희생 전 tribromoethanol을 tertiary amylalcohol로 희석하여 만든 마취제를 사용하여 마취한 후 안와채혈을 하였다. 혈액은 plasma sepatate tube(Becton Dickinson) 또는 serum separate tube(Becton Dickinson)에 담아 30분간 실온에 방치한 후 5,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 혈장 및 혈청을 분리하였으며, 분석 전까지 -70℃에 보관하였다.

4-6. 당화혈색소(HbA1C) 측정

장기간의 혈당 수준을 나타내는 지표인 당화혈색소 함량을 시험 종료 시 수집한 혈장을 이용하여 대조식이군, 고지방식이 대조군, 시험물질 TM-2, TM-3 투여군에 대하여 측정하였다. 혈장 내 HbA1C는 Mybiosource에서 구입한 측정 kit를 사용하였으며 제조사에서 제시한 방법에 따라 측정하였다. 대조식이군(G1)과 비교하여 고지방식이 대조군의 당화혈색소 함량이 유의적으로 증가하였으며, 시험물질 TM-3 투여군의 당화혈색소 함량은 고지방식이 대조군과 비교하여 현저히 감소하였다(도 10).

4-7. 간 및 지방조직 분석

실험동물에서 혈액 채취 후 간, 지방조직(부고환지방, 후복강지방, 내장지방, 서혜부지방 및 견갑골지방 등)을 적출하여 각각의 무게를 측정하였다. 각 조직학적 분석을 위해 각각의 조직 일부를 절단하여 4% paraformaldehyde (Sigma-Aldrich Co.)에 고정하였고, 남은 조직은 향후 추가 분석을 위해 -70℃에 보관하였다.

도 11에서 보듯이 간의 무게는 대조식이군과 비교하여 고시방식이 대조군은 유의적으로 증가하였고 이는 시

유의적으로 증가하였고 이는 시험물질 TM-2, TM-3 투여군에서 간 무게가 유의적으로 감소하였다(도 11).

체지방은 형태나 작용에 따라 백색지방조식과 갈색지방조직으로 구분되며, 백색지방조직은 주로 체내 잉여 에너지를 지방으로 저장하고, 갈색지방조직은 열을 생산하는 기능을 하며, 백색지방의 중량이 증가할수록 체중이 증가한다. 백색지방 조직인 부고환지방, 후복강지방, 내장지방, 서혜부지방의 무게는 대조식이군과 비교하여 고지방식이 대조군에서 모두 유의적으로 증가하였고, 고지방식이 대조군에서 증가한 백색지방의 총 무게는 시험물질 TM-3 투여군에서 유의적으로 감소하였다.

또한, 고지방식이 공급은 부고환 지방조직의 지방세포 크기를 증가시켰고, 모든 시험물질에 의해 감소하였으며, 특히 시험물질 TM-3 투여군에서 증가된 지방세포 크기가 감소하였다. 또한, 동일면적 대비 총 지방세포 수도 모든 시험물질 투여군에서 유의적으로 증가하였고, 특히 TM-3 투여군에서 현저하게 증가하였다(도12).

4-8. 혈액(혈청) 내 포도당, 지질 성분 분석

혈청 내 포도당, 중성지방, 총 콜레스테롤, LDL-콜레스테롤, HDL-콜레스테롤 수준은 혈액생화학 분석기(KoneLab 20 XT, Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 측정하였다. 혈당은 대조식이군과 비교하여 고지방식이 대조군에서 현저하게 증가하였으며, 시험물질 TM-2, TM-3 투여군에서 유의적으로 감소하였다. 혈중 중성지방 함량은 대조식이군과 비교하여 고지방식이 대조군은 증가하는 경향을 나타내었으나 유의적인 차이는 나타내지 않았고, 시험물질 TM-3 투여군에서 고지방식이 대조군과 비하여 혈중 중성지방 함량이 유의적으로 감소하였다. 혈중 총콜레스테롤 함량, HDL-콜레스테롤 함량은 대조식이군과 비교하여 고지방식이 대조군에서 유의적으로 증가하였고 시험물질 TM-2, TM-3 투여군에서 유의적으로 감소하였다(도 14).

4-9. 혈액(혈청) 내 지방대사 관련 호르몬 분석

렙틴(leptin)은 지방조직에서 생성되어 분비되는 호르몬으로 에너지 섭취와 저장, 인슐린 민감도, 대사속도 등을 조절하는 중요한 물질로 비만인 경우에 그 분비량이 증가하는 경향을 나타내는 것으로 알려져 있다. 장기간의 고지방섭취는 만성적인 혈당의 상승을 초래하여 인슐린저항성이 유도되며, 체지방이 과다하게 축적되면 혈중에 인슐린농도가 높게 나타나는 고인슐린혈증이 지속된다. 혈청 내 leptin 함량은 R&D Systems에서 구입한 측정 kit을 사용하였고, insulin 함량은 Millipore Corporation에서 구입한 측정 kit을 사용하여 각각 제조사에서 제시한 방법에 따라 측정하였다.

본 발명에서 동물의 혈중 leptin과 인슐린 함량 측정한 결과 대조식이군에 비교하여 고지방식이 대조군에서 유의적으로 증가하였고 시험물질 TM-2, TM-3 투여군에서 혈중 leptin의 함량이 유의적으로 감소하였다. 혈중 인슐린 함량은 시험물질 투여군에서 감소하는 경향을 나타내었으나 유의적인 차이는 확인할 수 없었다(도 15).

4-10. 지방조직 내 지방합성 및 에너지 대사 관련 유전자 mRNA 발현 분석

시험물질(TM-1, TM-3)이 부고환 지방조직의 지방합성, 분해 및 에너지 대사 관련 mRNA 발현에 미치는 영향을 분석하였다. 시험 종료 시 수집한 부고환 지방조직에 TRIzol REAGENT(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 total RNA를 분리한 후, micro-volume spectrophotometer(BioSpec-nano,SHIMADZU)를 사용하여 정량 후, RNA를 실험에 사용하였다. Total RNA로부터 cDNA를 얻은 후 Rotor-Gene 300 PC(Corbett Research)와 Roter-Gene SYBR Green Kit(QIAGEN)을 사용하여 real-time PCR을 수행하였다.

지방합성 관련 유전자인 SREBP-1, PPAR-γ, C/EBPα, FAS, aP2, ACC1 mRNA 발현이 대조식이군과 비교하여 고지방식이 대조군에서 유의적으로 증가하였고, 시험물질 TM-1, TM-3 투여군에서 감소하였다. 반면, 지방분해 관련 유전자인 CPT-1 mRNA 발현은 고지방식이 대조군에서 감소하였고, 시험물질 TM-1,TM-3 투여군에서 증가하였다.

실시예5. 유효성분 함량 분석

삼백초의 유효성분인 Sauchinone과 녹차의 유효성분인 EGCG는 HPLC-DAD를 이용하여 분석하였으며, 분석조건은 다음의 표와 같다. 각각의 시료를 적당량 정확하게 칭량하여 용량플라스크에 덜고, 플라스크의 표시선까지 70% 메탄올을 채운다. 10분간 초음파처리를 한 후 syringe filter (0.45μ를 이용하여 여과한 후에 HPLC 장치에 주입하였다. 표준품은 5 종 이상의 농도로 조제하여 HPLC로 분석하였으며, 각 농도별로 HPLC장치로 분석하아여 산출된 peak의 면적을 직선성으로 연결하여 얻어진 함수식에 대입하여 함량을 산출하였다.

Sauchinone의 HPLC 분석 조건

항목	조건
주입량	10 μL
검출기 파장	240 nm
칼럼 온도	35 ℃
이동상	A : 0.1% 인산 용액 B : 아세토니트릴
유속	1.0 mL/분

Sauchinone의 이동상조건

시간(분)	A용액(%)	B용액(%)
0.0	50	50
40.0	50	50

EGCG의 HPLC 분석 조건

항목	조건
주입량	10 μL
검출기 파장	275 nm
칼럼 온도	35 ℃
이동상	A : 0.1% 인산용액 B : 0.1% 인산이 함유한 아세토니트릴
유속	1.0 mL/분

EGCG의 이동상조건

시간(분)	이동상(%)
	A 용액		B 용액
0.0	90		10
5.0	90		10
10.0	87		13
20.0	85		15
25.0	70		30
30.0	70		30
31.0	90		10
35.0	90		10
		주정 추출		고압유화 후 주정 추출
Sauchinone (mg/g)		6.8		8.2 (임시값)
EGCG (mg/g)		136.8		163.3 (임시값)

Claims

(a)건조된 삼백초와 녹차 원료를 분쇄하여 건조원료분말을 얻는 1차 분쇄단계;
(b)상기 1차 분쇄단계(a)에서 얻은 건조원료분말에 친수성 유기용매를 가하고 고압 유화기에서 10,000 ∼ 30,000 psi의 압력으로 1 ∼ 3시간 분말 입자를 쪼깨는 전처리 단계를 수행하여 교반 추출한 후 추출액을 여과하고 농축하는 단계;
(c)상기 농축단계(b)에서 얻은 삼백초와 녹차 추출물의 농축물을 동결건조하고 2차 분쇄단계;
(d) 상기 2차 분쇄단계(c)에서 얻은 삼백초와 녹차 추출물의 건조분말을 1 : 1(w/w)로 배합하여 혼합물을 얻는 단계를 모두 포함하여 제조된 삼백초와 녹차 추출물의 혼합물.
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제 1항의 삼백초와 녹차 추출물의 혼합물을 포함하는 비만 예방 및 개선용 식품 조성물.
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