KR101621447B1 - 삼백초, 강황 및 원지의 복합추출물을 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

삼백초, 강황 및 원지의 복합추출물을 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 삼백초, 강황 및 원지의 복합추출물 또는 삼백초, 강황, 원지 및 석창포의 복합추출물을 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 식품조성물 및 상기 복합추출물의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 복합추출물을 포함하는 조성물은 세포 독성의 부작용이 없이도, 지방생성을 저해할 수 있으므로, 비만 또는 비만 관련 질환의 예방, 개선 또는 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

삼백초, 강황 및 원지의 복합추출물을 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물{Pharmaceutical composition for anti-obesity comprising complex extracts including Saururi chinensis Baill. extract, Curcumae Longae Rhizoma extract and Polygalae Radix extract}
본 발명은 삼백초, 강황 및 원지의 복합추출물을 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 본 발명은 삼백초, 강황 및 원지의 복합추출물 또는 삼백초, 강황, 원지 및 석창포의 복합추출물을 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 식품조성물 및 상기 복합추출물의 제조방법에 관한 것이다.
비만은 일반적으로 체내에 지방 조직이 과다한 상태인 것을 의미하며, 음식물로 섭취한 에너지가 신체활동 등으로 소비한 에너지와 균형을 이루지 못하여 잉여의 에너지가 체지방으로 축적되는 현상이다. 오랜 시간에 걸쳐 에너지 불균형에 의해 체지방이 비정상적으로 많아지면 당뇨병, 고지혈증, 심장병, 뇌졸증, 동맥경화증, 지방간 등의 각종 대사성 질환과 성인병이 유발되며, 이는 서구에서뿐만 아니라 우리나라에서도 심각한 사회문제로 대두되고 있다.
비만은 유전적 요인, 서구화되는 식생활에 의한 환경적 요인, 스트레스에 의한 심리적 요인, 에너지 대사의 이상 등 다양한 원인에 의해 발생한다. 그리고 그 종류는 원인에 따라서 과식과 운동 부족에 의한 단순 비만과 내분비성, 시상하부성, 유전성, 대사성 등에 의한 증후성 비만으로 나눌 수 있다.
비만도 평가에는 체중을 측정하는 방법, 피부주름의 두께를 측정하는 방법이 있는데, 일반적으로 비만도 지수가 25 이상이면 비만으로 정의한다. 신체 비만지수(체질량지수, body mass index, BMI)는 체중(㎏)을 신장(m)의 제곱으로 나눈 값이며, 서양인은 30 이상이지만 인종 간의 차이를 고려하여 우리나라에서는 25 이상을 비만으로 평가한다.
전 세계적으로 비만 치료제의 개발을 위한 다각적인 측면의 연구가 진행되고 있다. 비만치료용 약물은 크게 지방흡수 억제, 지방 분해 및 열 발생 촉진, 식욕 및 포만감의 조절, 단백질 대사 저해 그리고 음식물의 섭취와 관련된 정서 조절 기전으로 나눌 수 있다. 대표적인 비만 치료제로는 오리스타트(oristat)를 원료로 하여 지방흡수를 억제하는 제니칼™(Xenical™)과 시부트라민(sibutramine)을 주원료로 교감신경계를 자극하여 식욕을 억제시키는 리덕틸™(Reductil™)이 있다. 그러나 제니칼™의 경우 지방변, 복부통증, 구토, 가려움증, 간 손상 등의 부작용이 보고되어 있으며, 리덕틸™의 경우는 두통, 식욕부진, 불면, 변비 등의 부작용뿐만 아니라 심각한 심혈관계 부작용을 일으킨다는 이유로 최근 사용 기준이 강화되는 등의 논란이 일고 있다.
이러한 비만치료제를 통한 약물요법 이외에도 비만을 예방하고 치료하기 위한 방법으로 음식물의 섭취를 제한하는 식이요법, 에너지 소비를 증가시키는 운동요법이 있으며, 정신요법, 행동요법, 외과요법 등도 실시되고 있다.
바람직한 비만의 치료 방법으로는 운동을 통한 에너지 소비 촉진과 부작용이 적은 비만치료용 약제를 병행하는 것이 가장 안전하고 효과적인 방법으로 제시되고 있다. 그러나, 비만치료용 약제의 경우, 상기의 제니칼™과 리덕틸™의 예처럼 심각한 부작용들이 보고되고 있으며 안전성에 대한 명확한 신뢰가 뒷받침되지 않고 있는 실정이다. 따라서, 인체에 대해서 항비만의 우수한 효능을 나타내면서도 안전성이 보장되는 물질의 개발이 요구되고 있다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 인체에 부작용을 일으키지 않으면서 비만의 치료 효과가 우수한 물질을 찾고자 예의 노력한 결과, 삼백초, 강황 및 원지의 복합추출물이 세포에 독성을 일으키지 않는 범위 내에서 비만에 대한 예방 및 치료 효과를 나타냄을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 삼백초, 강황 및 원지의 복합추출물 또는 삼백초, 강황, 원지 및 석창포의 복합추출물을 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 삼백초, 강황 및 원지의 복합추출물 또는 삼백초, 강황, 원지 및 석창포의 복합추출물을 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 삼백초, 강황 및 원지의 복합추출물 또는 삼백초, 강황, 원지 및 석창포의 복합추출물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 삼백초, 강황 및 원지의 복합추출물, 삼백초, 강황, 원지 및 석창포의 복합추출물 또는 이들의 분획물을 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "삼백초(Saururi chinensis Baill.)란, 한방에서 한약재로 사용되어온, 후추목 삼백초과의 다년생 초본을 의미한다. 상기 삼백초는 맛은 쓰고 맵고, 꽃과 뿌리가 백색이며 꽃이 필 무렵에 윗부분의 잎 2 ~ 3개가 백색으로 변하며, 열매가 9 ~ 10월경에 꽃망울에 한 개씩 둥글게 달린다고 알려져 있다.
본 발명에 있어서, 상기 삼백초는 비만의 예방 또는 치료용 약학조성물의 유효성분으로 사용될 수 있고, 이때 사용되는 부위는 잎, 줄기, 뿌리 또는 식물 전체 부위가 될 수 있다.
본 발명의 용어 "강황(Curcumae Longae Rhizoma)"이란, 한방에서 한약재로 사용되어온, 생강목 생강과의 다년생 초본을 의미한다. 상기 강황은 맵고 쓴 맛이 나고, 뿌리줄기의 겉은 연한 노란색이며, 속은 주홍빛으로 장뇌 같은 향기가 나고, 꽃이삭은 잎보다 먼저 나오며, 4 ~ 6월에 잎겨드랑이에서 노란 꽃이 피운다고 알려져 있다.
본 발명에 있어서, 상기 강황은 비만의 예방 또는 치료용 약학조성물의 유효성분으로 사용될 수 있고, 이때 사용되는 부위는 줄기 또는 뿌리 부위가 될 수 있다.
본 발명의 용어 "원지(Polygalae Radix)"란, 한방에서 한약재로 사용되어온, 쥐손이풀목 원지과의 다년생 초본을 의미한다. 상기 원지는 맵고 쓴 맛이 나며, 뿌리는 굵고 길며 능선이 있고, 윗부분에 있는 약간 꼬부라진 털을 제외하고는 털이 거의 없으며, 꽃은 7 ~ 8월에 자주색으로 피고 열매는 여러 칸으로 나뉘어져서 많은 종자가 들어있는 삭과라고 알려져 있다.
본 발명에 있어서, 상기 원지는 비만의 예방 또는 치료용 약학조성물의 유효성분으로 사용될 수 있고, 이때 사용되는 부위는 뿌리 부위가 될 수 있다.
본 발명의 용어 "석창포(Acori Gramineri Rhizoma)"란, 한방에서 한약재로 사용되어온, 천남성목 천남성과의 다년생 초본을 의미한다. 상기 석창포는 뿌리줄기가 옆으로 뻗고, 마디에서 수염뿌리가 나오며, 땅 속에서는 마디 사이가 길지만 땅 위에 나온 것은 마디 사이가 짧고, 전체적으로 녹색을 띄며, 꽃은 한 꽃에 암술, 수술이 모두 들어 있는 양성화이고, 6 ~ 7월에 노란 색으로 피며 열매는 여러 칸으로 나뉘어져서 많은 종자가 들어있다고 알려져 있다.
본 발명에 있어서, 상기 석창포는 비만의 예방 또는 치료용 약학조성물의 유효성분으로 사용될 수 있고, 이때 사용되는 부위는 줄기 및 뿌리 부위가 될 수 있다.
본 발명의 용어 "복합추출물"이란, 상기 삼백초, 강황 및 원지를 포함하는 시료를 추출하여 수득한 복합추출물 또는 상기 삼백초, 강황, 원지 및 석창포를 포함하는 시료를 추출하여 수득한 복합추출물을 의미한다. 식물은 추출 부위에 따라서 각 추출물 또는 이의 분획물의 활성 여부, 활성의 정도, 및 이에 포함되는 구체적인 성분이 상이할 수 있는데, 본 발명자들은 삼백초의 식물전체, 강황의 줄기와 뿌리부위 및 원지의 뿌리부위의 복합추출물 또는 삼백초의 식물전체, 강황의 줄기와 뿌리부위, 원지의 뿌리부위 및 석창포의 줄기와 뿌리부위의 복합추출물이 비만을 예방 또는 치료하는 효과를 나타냄을 최초로 규명하였다.
본 발명에 있어서, 상기 복합추출물은 비만의 예방 또는 치료용 약학조성물의 유효성분으로 사용될 수 있는데, 상기 복합추출물을 수득하기 위한 시료에 포함된 삼백초, 강황 및 원지의 함량은 비만의 예방 또는 치료효과를 나타내는 조성물의 제조에 사용될 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 상기 시료에 포함된 삼백초, 강황 및 원지의 혼합비가 1 : 0.2 내지 1 : 0.2 내지 1(w/w/w)가 될 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 혼합비가 1 : 0.4 내지 1 : 0.4 내지 1(w/w/w)가 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 상기 혼합비가 1 : 0.6 : 1(w/w/w)가 될 수 있다.
또한, 상술한 삼백초, 강황, 원지 및 석창포를 포함하는 시료로부터 복합추출물을 수득한 경우, 상기 시료에 포함된 삼백초, 강황, 원지 및 석창포의 함량은 비만의 예방 또는 치료효과를 나타내는 조성물의 제조에 사용될 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 상기 시료에 포함된 삼백초, 강황, 원지 및 석창포의 혼합비가 1 : 0.2 내지 1 : 0.2 내지 1 : 0.2 내지 1(w/w/w/w)가 될 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 혼합비가 1 : 0.4 내지 1 : 0.4 내지 1 : 0.4 내지 1(w/w/w/w)가 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 상기 혼합비가 1 : 0.6 : 1 : 0.4(w/w/w/w)가 될 수 있다. 아울러, 상기 삼백초, 강황, 원지 및 석창포는 상업적으로 판매되는 것을 구입하여 사용하거나, 자연에서 채취 또는 재배된 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 용어 "복합추출물의 분획물"이란, 상기 각 복합추출물로부터 특정성분 또는 특정 그룹을 분리하는 분획방법에 의하여 얻어진 결과물을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 분획물은 복합추출물에 다양한 분획방법을 적용하여 수득할 수 있는데, 상기 분획방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 다양한 용매를 처리하여 수행하는 용매 분획법, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 수행하는 한외여과 분획법, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)를 수행하는 크로마토그래피 분획법 등이 될 수 있다. 특히, 상기 용매 분획법에 사용되는 용매는 특별히 이에 제한되지 않으나, 극성 용매 또는 비극성 용매를 사용할 수 있고, 바람직하게는 비극성 용매를 사용할 수 있다. 상기 용매 분획법은 비극성 수준이 높은 용매로부터 낮은 용매를 사용하여 상기 복합추출물을 순차적으로 분획하는 방식으로 수행될 수 있는데, 예를 들어 헥산 또는 에틸아세테이트를 이용하여 상기 복합추출물을 순차적으로 분획하는 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 용어 "비만"이란, 체중의 증가로 인해 건강에 부적절한 상태를 초래하는 것으로 에너지 섭취가 에너지 소비보다 많아서, 소비되지 않고 남은 과잉 에너지가 여러 가지 지질의 형태로 체지방으로 축적되거나 혈액 내에 지질의 함량이 높아진 상태를 의미한다. 상기 비만이 발생하면, 당뇨병, 고지혈증, 심장병, 뇌졸증, 동맥경화증, 지방간 등의 각종 대사성 질환과 성인병이 유발될 수 있다.
본 발명에서 제공하는 조성물은 지방생성을 억제하여 비만을 치료할 수 있을 뿐만 아니라, 비만으로부터 파생되는 비만 관련 질환, 예를 들어, 당뇨병, 고지혈증, 심장병, 뇌졸증, 동맥경화증, 지방간 등의 각종 대사성 질환을 개선, 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 용어 "예방"이란, 본 발명의 조성물을 투여하여 상기 비만 또는 비만 관련 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어 "치료"란, 본 발명의 조성물을 투여하여, 상기 비만 또는 비만 관련 질환의 증세를 호전시키거나 또는 이롭게 변경시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 삼백초, 강황, 원지 및 석창포를 포함하는 시료 또는 상기 각 성분을 개별적으로 포함하는 시료의 열수 추출물(복합추출물 또는 개별추출물), 온수 추출물(복합추출물 또는 개별추출물) 또는 에탄올 추출물(복합추출물 또는 개별추출물)을 각각 수득하고(표 1), 상기 각 추출물을 다양한 농도로 3T3-L1 세포에 처리하여(표 2) in vitro 항비만 효과를 검증한 결과, 열수 추출물(도 1a 내지 도 1c), 온수 추출물(도 2a 내지 도 2c) 또는 에탄올 추출물(도 3a 내지 도 3c) 중에서, 복합추출물과 원지 추출물이 지방함량 감소효과와 세포수 감소효과를 나타내고, 삼백초 추출물, 강황 추출물 및 석창포 추출물은 지방함량 감소효과와 세포수 감소효과를 전혀 나타내지 않음을 확인하였다. 또한, 상기 열수 추출물, 온수 추출물 및 에탄올 추출물 중에서 에탄올 추출물이 지방함량 감소효과 및 안전성이 가장 우수함을 확인하였다. 또한, 상기 각 추출물을 다양한 함량으로 고지방 식이를 먹인 마우스에 투여하여(표 3), 상기 각 추출물의 in vivo 항비만 효과를 검증한 결과, 원지 추출물과 복합추출물(에탄올 추출물)을 투여한 마우스에서 가장 우수한 체중감소 효과를 나타내었고, 그 중에서 원지 추출물은 심각한 독성을 나타낸 반면, 복합추출물(에탄올 추출물)은 독성이 약화됨을 확인하였고(도 4); 지방중량을 측정한 결과 지방증가 억제효과에 가장 큰 영향을 미치는 성분은 원지이고, 그 다음이 강황이며, 석창포는 지방증가 억제효과에 기여하는 바가 가장 적은 것으로 분석되었으며(도 6); 간조직(도 7) 및 신장조직(도 8)에서 원지 추출물에 비하여 복합추출물(에탄올 추출물)이 높은 안전성을 나타냄을 확인하였다.
본 발명의 다른 실시예에 의하면, 상기 복합추출물에 포함된 성분 중에서 지방증가 억제효과에 기여하는 바가 가장 적은 것으로 분석된 석창포를 제외한 나머지 삼백초, 강황 및 원지의 복합추출물의 비만억제 효과를 확인하기 위하여, 삼백초, 강황 및 원지를 필수적으로 포함하고 석창포와 클로버를 선택적으로 포함하는, 시료를 대상으로 각각의 에탄올 추출물을 수득하였다(표 4). 상기 수득한 각각의 에탄올 추출물을 다양한 용량으로 마우스에 투여하여 각각의 실험동물을 수득하였고(표 5), 상기 수득한 실험동물을 대상으로, 체중(도 9), 식이섭취량(도 10), 지방중량(도 11a 내지 11d), 그렐린 수준(도 12a 내지 12c), 렙틴 수준(도 13) 및 혈중성분 수준(도 14a 내지 14k)을 평가하였다. 그 결과, 삼백초, 강황 및 원지의 복합추출물 뿐만 아니라 여기에 석창포를 포함하는 복합추출물 역시 대조군에 비하여 향상된 항 비만효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 항 비만용 조성물에 포함되는 복합추출물은 삼백초, 강황 및 원지를 필수적으로 포함하거나, 이에 더하여 석창포를 추가로 포함하는 시료로부터 수득할 수 있음을 알 수 있었다.
상기 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 희석제, 부형제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
상술한 본 발명의 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 (a) 상기 복합추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물을, 비만이 발생할 가능성이 있거나 또는 발생된 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 비만을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 이때, 상기 복합추출물에 포함되는 각 유효성분은 상술한 바와 동일하다.
본 발명의 용어 "개체"란, 비만이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다.
본 발명의 용어 "투여"란, 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 본 발명의 약학 조성물을 도입하는 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물의 투여는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 수행될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 목적하는 바에 따라 경구 투여, 구강 투여, 직장 투여, 국소 투여, 복강내 투여, 정맥내 투여, 동맥내 투여, 근육내 투여, 비측내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경피 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 안구 투여 등의 방법으로 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 약학 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 약학 조성물은 상기 복합추출물을 포함한다. 상기 조성물에 포함된 복합추출물의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 약학 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.
상기 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"이란, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 비만 예방 또는 치료용 약학조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 일 실시예로서, 본 발명의 약학 조성물은 성인 1인당 약 1 ㎍/kg/day 내지 100 mg/kg/day, 바람직하게는 20 내지 30 mg/kg/day으로 투여할 수 있다. 상기 약학 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 복합추출물 또는 그의 분획물을 포함하는 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 복합추출물에 포함된 삼백초, 강황, 원지 및 석창포는 오랫동안 한약재로서 사용되어 그의 안전성이 입증되었으므로, 상식할 수 있으면서도 비만의 예방 또는 개선을 도모할 수 있는 식품의 형태로 제조되어 섭취할 수 있다. 이때, 상기 식품에 포함되는 상기 복합추출물 또는 그의 분획물의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 식품 조성물의 총 중량에 대하여 0.01 내지 100 중량%, 보다 바람직하게는 1 내지 80 중량%로 포함될 수 있다. 식품이 음료인 경우에는 100㎖를 기준으로 1 내지 30g, 바람직하게는 3 내지 20g의 비율로 포함될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다. 또한, 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 첨가할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용된다.
한편, 상기 복합추출물 또는 그의 분획물을 포함하는 식품 조성물을 이용하여 비만 예방 또는 개선용 기능성 식품을 제조할 수 있다.
구체적인 예로, 상기 식품 조성물을 이용하여 비만을 예방 또는 개선시킬 수 있는 가공식품을 제조할 수 있다. 이런 가공식품에는 예들 들어, 과자, 음료, 주류, 발효식품, 통조림, 우유가공식품, 육륙가공식품, 국수 등을 포함한다. 과자는 비스킷, 파이, 케익, 빵, 캔디, 젤리, 껌, 시리얼(곡물푸레이크 등의 식사대용품류 포함) 등을 포함한다. 음료는 음용수, 탄산음료, 기능성이온음료, 쥬스(예들 들어, 사과, 배, 포도, 알로에, 감귤, 복숭아, 당근, 토마토 쥬스 등), 식혜 등을 포함한다. 주류는 청주, 위스키, 소주, 맥주, 양주, 과실주 등을 포함한다. 발효식품은 간장, 된장, 고추장 등을 포함한다. 통조림은 수산물 통조림(예들 들어, 참치, 고등어, 꽁치, 소라 통조림 등), 축산물 통조림(쇠고기, 돼지고기, 닭고기, 칠면조 통조림 등), 농산물 통조림(옥수수, 복숭아, 파일애플 통조림 등)을 포함한다. 우유가공식품은 치즈, 버터, 요구르트 등을 포함한다. 육류가공식품은 돈까스, 비프까스, 치킨까스, 소세지. 탕수육, 너겟류, 너비아니 등을 포함한다. 밀봉포장생면 등의 국수를 포함한다. 이 외에도 상기 조성물은 레토르트식품, 스프류 등에 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "기능성 식품(functional food)"이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미하는데, 상기 식품은 골질환의 예방 또는 개선에 유용한 효과를 얻기 위하여 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 삼백초, 강황 및 원지를 포함하는 시료를 물, C1 ~ C4의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출하여 추출물을 수득하는 단계를 포함하는 상기 복합추출물의 제조방법을 제공한다.
상기 복합추출물의 제조방법에 있어서, 열수 추출법, 온수 추출법, 에탄올 추출법, 초음파 추출법, 여과법 및 환류 추출법 등 당업계의 통상적인 추출방법을 사용할 수 있고, 추출물을 수득한 후에, 상기 추출물을 여과, 농축 또는 동결건조시키는 단계를 추가로 포함할 수도 있다.
본 발명의 복합추출물을 포함하는 조성물은 세포 독성의 부작용이 없이도, 지방생성을 저해할 수 있으므로, 비만 또는 비만 관련 질환의 예방, 개선 또는 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1a는 오일 레드 O 염색에 의해, 3T3-L1로부터 분화된 지방세포 내 중성지방 축적에 대한 KIOM-2012Ob(1) 열수추출물들의 억제 효과를 보여준다. 3T3-L1로부터 분화를 유도할 때 KIOM-2012Ob와 그 조성 생약 열수추출물을 처리하여 8일 후에 오일 레드 O염색을 수행하였다. 그래프에서 처리농도는 KIOM-2012Ob(1)의 농도로 나타냈으며 KIOM-2012Ob(1)에 조성되어 있는 삼백초, 강황, 원지, 석창포는 조성함량과 동일하게 처리하였다. * 표시는 대조군(0 ㎍/㎖) 대비 중성지방 축적의 감소에 대한 유의성(P < 0.05)을 나타낸다.
도 1b은 오일 레드 O 염색에 의해, 3T3-L1로부터 분화된 지방세포 내 중성지방 축적에 대한 KIOM-2012Ob(2) 열수추출물들의 억제 효과를 보여준다. 3T3-L1로부터 분화를 유도할 때 KIOM-2012Ob와 그 조성 생약 열수추출물을 처리하여 8일 후에 오일 레드 O염색을 수행하였다. 그래프에서 처리농도는 KIOM-2012Ob(2)의 농도로 나타냈으며 KIOM-2012Ob(2)에 조성되어 있는 삼백초, 강황, 원지, 석창포는 조성함량과 동일하게 처리하였다. * 표시는 대조군(0 ㎍/㎖) 대비 중성지방 축적의 감소에 대한 유의성(P < 0.05)을 나타낸다.
도 1c는 오일 레드 O 염색에 의해, 3T3-L1로부터 분화된 지방세포 내 중성지방 축적에 대한 KIOM-2012Ob(3) 열수추출물들의 억제 효과를 보여준다. 3T3-L1로부터 분화를 유도할 때 KIOM-2012Ob와 그 조성 생약 열수추출물을 처리하여 8일 후에 오일 레드 O염색을 수행하였다. 그래프에서 처리농도는 KIOM-2012Ob(3)의 농도로 나타냈으며 KIOM-2012Ob(3)에 조성되어 있는 삼백초, 강황, 원지, 석창포는 조성함량과 동일하게 처리하였다. * 표시는 대조군(0 ㎍/㎖) 대비 중성지방 축적의 감소에 대한 유의성(P < 0.05)을 나타낸다.
도 1d는 3T3-L1로부터 분화된 세포들의 생존율에 대한 KIOM-2012Ob(1) 열수추출물의 영향을 보여준다. 3T3-L1로부터 분화된 세포들의 생존율을 WST 방법으로 측정하여 나타내었다. 그래프에서 처리농도는 KIOM-2012Ob의 농도로 나타냈으며 KIOM-2012Ob(1)에 조성되어 있는 삼백초, 강황, 원지, 석창포는 조성함량과 동일하게 처리하였다. $ 표시는 대조군(0 ㎍/㎖)에 대비 세포 생존율의 감소에 대한 유의성(P < 0.05)을 나타낸다.
도 1e는 3T3-L1로부터 분화된 세포들의 생존율에 대한 KIOM-2012Ob(2) 열수추출물의 영향을 보여준다. 3T3-L1로부터 분화된 세포들의 생존율을 WST 방법으로 측정하여 나타내었다. 그래프에서 처리농도는 KIOM-2012Ob의 농도로 나타냈으며 KIOM-2012Ob(2)에 조성되어 있는 삼백초, 강황, 원지, 석창포는 조성함량과 동일하게 처리하였다. $ 표시는 대조군(0 ㎍/㎖)에 대비 세포 생존율의 감소에 대한 유의성(P < 0.05)을 나타낸다.
도 1f는 3T3-L1로부터 분화된 세포들의 생존율에 대한 KIOM-2012Ob(3) 열수추출물의 영향을 보여준다. 3T3-L1로부터 분화된 세포들의 생존율을 WST 방법으로 측정하여 나타내었다. 그래프에서 처리농도는 KIOM-2012Ob의 농도로 나타냈으며 KIOM-2012Ob(3)에 조성되어 있는 삼백초, 강황, 원지, 석창포는 조성함량과 동일하게 처리하였다. $ 표시는 대조군(0 ㎍/㎖)에 대비 세포 생존율의 감소에 대한 유의성(P < 0.05)을 나타낸다.
도 2a는 오일 레드 O 염색에 의해, 3T3-L1로부터 분화된 지방세포 내 중성지방 축적에 대한 KIOM-2012Ob(1) DW 추출물들(증류수 추출물들)의 억제 효과를 보여준다. 3T3-L1의 분화된 유도할 때 KIOM-2012Ob와 그 조성 생약 열수추출물을 처리하여 8일 후에 오일 레드 O염색을 수행하였다. 그래프에서 처리농도는 KIOM-2012Ob(1)의 농도로 나타냈으며 KIOM-2012Ob(3)에 조성되어 있는 삼백초, 강황, 원지, 석창포는 조성함량과 동일하게 처리하였다. * 표시는 대조군(0 ㎍/㎖) 대비 중성지방 축적의 감소에 대한 유의성(P < 0.05)을 나타낸다.
도 2b는 오일 레드 O 염색에 의해, 3T3-L1로부터 분화된 지방세포 내 중성지방 축적에 대한 KIOM-2012Ob(2) DW추출물들(증류수 추출물들)의 억제 효과를 보여준다. 3T3-L1의 분화된 유도할 때 KIOM-2012Ob와 그 조성 생약 열수추출물을 처리하여 8일 후에 오일 레드 O염색을 수행하였다. 그래프에서 처리농도는 KIOM-2012Ob(2)의 농도로 나타냈으며 KIOM-2012Ob(3)에 조성되어 있는 삼백초, 강황, 원지, 석창포는 조성함량과 동일하게 처리하였다. * 표시는 대조군(0 ㎍/㎖) 대비 중성지방 축적의 감소에 대한 유의성(P < 0.05)을 나타낸다.
도 2c는 오일 레드 O 염색에 의해, 3T3-L1로부터 분화된 지방세포 내 중성지방 축적에 대한 KIOM-2012Ob(3) DW추출물들(증류수 추출물들)의 억제 효과를 보여준다. 3T3-L1의 분화된 유도할 때 KIOM-2012Ob와 그 조성 생약 열수추출물을 처리하여 8일 후에 오일 레드 O염색을 수행하였다. 그래프에서 처리농도는 KIOM-2012Ob(3)의 농도로 나타냈으며 KIOM-2012Ob(3)에 조성되어 있는 삼백초, 강황, 원지, 석창포는 조성함량과 동일하게 처리하였다. * 표시는 대조군(0 ㎍/㎖) 대비 중성지방 축적의 감소에 대한 유의성(P < 0.05)을 나타낸다.
도 2d는 3T3-L1 분화된 세포들의 생존율에 대한 KIOM-2012Ob(1) DW추출물(증류수 추출물)의 영향을 보여준다. 3T3-L1 분화된 세포들의 생존율을 WST 방법으로 측정하여 나타내었다. 그래프에서 처리농도는 KIOM-2012Ob의 농도로 나타냈으며 KIOM-2012Ob(1)에 조성되어 있는 삼백초, 강황, 원지, 석창포는 조성함량과 동일하게 처리하였다. $ 표시는 대조군(0 ㎍/㎖)에 대비 세포 생존율의 감소에 대한 유의성(P < 0.05)을 나타낸다.
도 2e는 3T3-L1로부터 분화된 세포들의 생존율에 대한 KIOM-2012Ob(2) DW추출물(증류수 추출물)의 영향을 보여준다. 3T3-L1 분화된 세포들의 생존율을 WST 방법으로 측정하여 나타내었다. 그래프에서 처리농도는 KIOM-2012Ob의 농도로 나타냈으며 KIOM-2012Ob(2)에 조성되어 있는 삼백초, 강황, 원지, 석창포는 조성함량과 동일하게 처리하였다. $ 표시는 대조군(0 ㎍/㎖)에 대비 세포 생존율의 감소에 대한 유의성(P < 0.05)을 나타낸다.
도 2f는 3T3-L1 분화된 세포들의 생존율에 대한 KIOM-2012Ob(3) DW추출물(증류수 추출물)의 영향을 보여준다. 3T3-L1 분화된 세포들의 생존율을 WST 방법으로 측정하여 나타내었다. 그래프에서 처리농도는 KIOM-2012Ob의 농도로 나타냈으며 KIOM-2012Ob(3)에 조성되어 있는 삼백초, 강황, 원지, 석창포는 조성함량과 동일하게 처리하였다. $ 표시는 대조군(0 ㎍/㎖)에 대비 세포 생존율의 감소에 대한 유의성(P < 0.05)을 나타낸다. $$ 표시는 대조군(0 ㎍/㎖)에 대비 세포 생존율의 감소에 대한 유의성(P < 0.01)을 나타낸다.
도 3a는 오일 레드 O 염색에 의해, 3T3-L1으로부터 분화된 지방세포 내 중성지방 축적에 대한 KIOM-2012Ob(1) 25% EtOH추출물들의 억제 효과를 보여준다. 3T3-L1의 분화된 유도할 때 KIOM-2012Ob와 그 조성 생약 열수추출물을 처리하여 8일 후에 오일 레드 O 염색을 수행하였다. 그래프에서 처리농도는 KIOM-2012Ob(3)의 농도로 나타냈으며 KIOM-2012Ob(1)에 조성되어 있는 삼백초, 강황, 원지, 석창포는 조성함량과 동일하게 처리하였다. * 표시는 대조군(0 ㎍/㎖) 대비 중성지방 축적의 감소에 대한 유의성(P < 0.05)을 나타낸다.
도 3b는 오일 레드 O 염색에 의해, 3T3-L1로부터 분화된 지방세포 내 중성지방 축적에 대한 KIOM-2012Ob(2) 25% EtOH추출물들의 억제 효과를 보여준다. 3T3-L1의 분화된 유도할 때 KIOM-2012Ob와 그 조성 생약 열수추출물을 처리하여 8일 후에 오일 레드 O염색을 수행하였다. 그래프에서 처리농도는 KIOM-2012Ob(3)의 농도로 나타냈으며 KIOM-2012Ob(2)에 조성되어 있는 삼백초, 강황, 원지, 석창포는 조성함량과 동일하게 처리하였다. * 표시는 대조군(0 ㎍/㎖) 대비 중성지방 축적의 감소에 대한 유의성(P < 0.05)을 나타낸다.
도 3c는 오일 레드 O 염색에 의해, 3T3-L1으로부터 분화된 지방세포 내 중성지방 축적에 대한 KIOM-2012Ob(3) 25% EtOH추출물들의 억제 효과를 보여준다. 3T3-L1의 분화된 유도할 때 KIOM-2012Ob와 그 조성 생약 열수추출물을 처리하여 8일 후에 오일 레드 O염색을 수행하였다. 그래프에서 처리농도는 KIOM-2012Ob(3)의 농도로 나타냈으며 KIOM-2012Ob(3)에 조성되어 있는 삼백초, 강황, 원지, 석창포는 조성함량과 동일하게 처리하였다. * 표시는 대조군(0 ㎍/㎖) 대비 중성지방 축적의 감소에 대한 유의성(P < 0.05)을 나타낸다.
도 3d는 3T3-L1 분화된 세포들의 생존율에 대한 KIOM-2012Ob(1) 25% EtOH 추출물의 영향을 보여준다. 3T3-L1 분화된 세포들의 생존율을 WST 방법으로 측정하여 나타내었다. 그래프에서 처리농도는 KIOM-2012Ob의 농도로 나타냈으며 KIOM-2012Ob(1)에 조성되어 있는 삼백초, 강황, 원지, 석창포는 조성함량과 동일하게 처리하였다. $ 표시는 대조군(0 ㎍/㎖)에 대비 세포 생존율의 감소에 대한 유의성(P < 0.05)을 나타낸다. $$ 표시는 대조군(0 ㎍/㎖)에 대비 세포 생존율의 감소에 대한 유의성(P < 0.01)을 나타낸다.
도 3e는 3T3-L1 분화된 세포들의 생존율에 대한 KIOM-2012Ob(2) 25% EtOH 추출물의 영향을 보여준다. 3T3-L1 분화된 세포들의 생존율을 WST 방법으로 측정하여 나타내었다. 그래프에서 처리농도는 KIOM-2012Ob의 농도로 나타냈으며 KIOM-2012Ob(2)에 조성되어 있는 삼백초, 강황, 원지, 석창포는 조성함량과 동일하게 처리하였다. $ 표시는 대조군(0 μg/ml)에 대비 세포 생존율의 감소에 대한 유의성(P < 0.05)을 나타낸다. * 표시는 원지 25% EtOH추출물의 세포생존율 대비 KIOM-2012Ob(2) EtOH추출물의 세포생존율의 증가에 대한 유의성(P < 0.05)을 나타낸다.
도 3f는 3T3-L1 분화된 세포들의 생존율에 대한 KIOM-2012Ob(3) 25% EtOH 추출물의 영향을 보여준다. 3T3-L1 분화된 세포들의 생존율을 WST 방법으로 측정하여 나타내었다. 그래프에서 처리농도는 KIOM-2012Ob의 농도로 나타냈으며 KIOM-2012Ob(3)에 조성되어 있는 삼백초, 강황, 원지, 석창포는 조성함량과 동일하게 처리하였다. $ 표시는 대조군(0 ㎍/㎖)에 대비 세포 생존율의 감소에 대한 유의성(P < 0.05)을 나타낸다. $$ 표시는 대조군(0 ㎍/㎖)에 대비 세포 생존율의 감소에 대한 유의성(P < 0.01)을 나타낸다. * 표시는 원지 25% EtOH추출물의 세포생존율 대비 KIOM-2012Ob(3) EtOH추출물의 세포생존율의 증가에 대한 유의성(P < 0.05)을 나타낸다.
도 4는 KIOM-2012Ob 25% EtOH 추출물들의 비만 동물 모델에서 체중 감소 효과를 나타냈었다. 10% 고지방 식이만 공급한 노말(normal) 대조군, 60% 고지방 식이만 공급한 네가티브(negative) 대조군, 제니칼(Xenical, 62.5 mg/kg) + 60% 고지방 식이 공급한 포지티브(positive) 대조군을 사용하였다. 추출물 처리군의 1X 성인 남성이 하루에 먹는 탕제를 기준으로 한 추출물 투여량이고 4X는 그 투여량에 4배 높은 양으로 투여하였다. KIOM-2012Ob-4X군들의 뚜렷한 체중 감량을 보여준다
도 5는 KIOM-2012Ob 25% EtOH 추출물들을 공급한 마우스의 식이섭취량을 보여준다. * 표시는 60% HFD 생쥐의 식이섭취량 대비 KIOM-2012Ob(3) EtOH추출물의 공급한 생쥐의 식이 섭취량 감소에 대한 유의성(P < 0.05)을 나타낸다.
도 6은 KIOM-2012Ob 25%EtOH 추출물들의 지방 축적 억제 효과를 나타냈었다. 10% 고지방 식이만 공급한 노말(normal) 대조군, 60% 고지방 식이만 공급한 음성(HFD, negative) 대조군, 제니칼(Xenical, 62.5 mg/kg) + 60% 고지방 식이 공급한 양성(positive) 대조군을 사용하였다. 마우스의 지방 조직은 복부 및 피하지방의 무게를 측정하였다. ** 표시는 60% HFD 생쥐의 복부지방 무게 대비 KIOM-2012Ob(3) EtOH추출물의 공급한 생쥐의 복부지방 무게의 감소에 대한 유의성(P < 0.05)을 나타낸다.
도 7은 KIOM-2012Ob 25%EtOH 추출물들의 간에 미치는 영향을 나타냈었다. 간 조직은 포르말린에 고정하여 H & E 조직염색 및 병리학적 소견을 의뢰하였다. A는 간 조직에서 미세수포성 지방종의 증가를 나타내고 있으며 KIOM-2012Ob 처리군에서 미세수포성 지방종의 증가가 억제됨을 보여준다. B는 간에서 만성 염증의 증가를 나타내고 있다. KIOM-2012Ob의 처리군에서 다른 생약 추출물 처리군보다 특히, 원지 추출물 처리군보다 유의성(P < 0.05, P < 0.01)있게 감소하는 것을 보여준다. $$ 표시는 노말 대조군(Normal control) 대비 미세수포성 지방종의 증가에 대한 유의성(P < 0.01)을 나타낸다. $ 표시는 노말 대조군(Normal control) 대비 미세수포성 지방종의 증가에 대한 유의성(P < 0.05)을 나타낸다. ** 표시는 원지 추출물-4X 처리군 대비 KIOM-2012Ob 처리군에서 만성 염증의 감소에 대한 유의성(P < 0.01)을 나타낸다. * 표시는 원지 추출물-4X 처리군 대비 KIOM-2012Ob 처리군에서 만성 염증의 감소에 대한 유의성(P < 0.05)을 나타낸다. ## 표시는 네가티브 대조군(Negative control) 대비 만성 염증의 증가에 대한 유의성(P < 0.01)을 나타낸다. # 표시는 네가티브 대조군(Negative control) 대비 만성 염증의 증가에 대한 유의성(P < 0.05)을 나타낸다.
도 8은 KIOM-2012Ob 25%EtOH 추출물들의 신장에 미치는 영향을 나타냈었다. 신장 조직은 포르말린에 고정하여 H&E 조직염색 및 병리학적 소견을 의뢰하였다. 신장에서 만성 염증의 증가를 나타내고 있다. KIOM-2012Ob의 처리군에서 다른 생약 추출물 처리군보다 특히, 원지 추출물 처리군보다 유의성(P < 0.05, P < 0.01)있게 감소하는 것을 보여준다. ** 표시는 원지 추출물-4X 처리군 대비 KIOM-2012Ob 처리군에서 만성 염증의 감소에 대한 유의성(P < 0.01)을 나타낸다. * 표시는 원지 추출물-4X 처리군 대비 KIOM-2012Ob 처리군에서 만성 염증의 감소에 대한 유의성(P < 0.05)을 나타낸다. ### 표시는 네가티브 대조군(Negative control) 대비 만성 염증의 증가에 대한 유의성(P < 0.001)을 나타낸다. ## 표시는 네가티브 대조군(Negative control) 대비 만성 염증의 증가에 대한 유의성(P < 0.01)을 나타낸다. # 표시는 네가티브 대조군(Negative control) 대비 만성 염증의 증가에 대한 유의성(P < 0.05)을 나타낸다.
도 9는 삼백초, 강황 및 원지를 포함하고, 석창포 또는 클로버를 선택적으로 포함하는 추출물의 처리용량에 따른 동물모델의 체중을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10은 삼백초, 강황 및 원지를 포함하고, 석창포 또는 클로버를 선택적으로 포함하는 추출물의 처리용량에 따른 동물모델의 식이섭취량을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11a는 삼백초, 강황 및 원지를 포함하고, 석창포 또는 클로버를 선택적으로 포함하는 추출물의 처리용량에 따른 동물모델의 복부생식기지방의 중량을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11b는 삼백초, 강황 및 원지를 포함하고, 석창포 또는 클로버를 선택적으로 포함하는 추출물의 처리용량에 따른 동물모델의 장간지방의 중량을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11c는 삼백초, 강황 및 원지를 포함하고, 석창포 또는 클로버를 선택적으로 포함하는 추출물의 처리용량에 따른 동물모델의 피하지방의 중량을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11d는 삼백초, 강황 및 원지를 포함하고, 석창포 또는 클로버를 선택적으로 포함하는 추출물의 처리용량에 따른 동물모델의 총지방의 중량을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 12a는 삼백초, 강황 및 원지를 포함하고, 석창포 또는 클로버를 선택적으로 포함하는 추출물의 처리용량에 따른 동물모델의 활성화된 그렐린의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 12b는 삼백초, 강황 및 원지를 포함하고, 석창포 또는 클로버를 선택적으로 포함하는 추출물의 처리용량에 따른 동물모델의 활성화된 디스아실그렐린의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 12c는 삼백초, 강황 및 원지를 포함하고, 석창포 또는 클로버를 선택적으로 포함하는 추출물의 처리용량에 따른 동물모델의 활성화된 그렐린비율의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 13은 삼백초, 강황 및 원지를 포함하고, 석창포 또는 클로버를 선택적으로 포함하는 추출물의 처리용량에 따른 동물모델의 혈장내 렙틴의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 14a는 삼백초, 강황 및 원지를 포함하고, 석창포 또는 클로버를 선택적으로 포함하는 추출물의 처리용량에 따른 동물모델의 혈중 중성지방의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 14b는 삼백초, 강황 및 원지를 포함하고, 석창포 또는 클로버를 선택적으로 포함하는 추출물의 처리용량에 따른 동물모델의 혈중 총 콜레스테롤의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 14c는 삼백초, 강황 및 원지를 포함하고, 석창포 또는 클로버를 선택적으로 포함하는 추출물의 처리용량에 따른 동물모델의 혈중 LDL-콜레스테롤의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 14d는 삼백초, 강황 및 원지를 포함하고, 석창포 또는 클로버를 선택적으로 포함하는 추출물의 처리용량에 따른 동물모델의 혈중 HDL-콜레스테롤의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 14e는 삼백초, 강황 및 원지를 포함하고, 석창포 또는 클로버를 선택적으로 포함하는 추출물의 처리용량에 따른 동물모델의 혈당의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 14f는 삼백초, 강황 및 원지를 포함하고, 석창포 또는 클로버를 선택적으로 포함하는 추출물의 처리용량에 따른 동물모델의 혈중 크레아티닌의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 14g는 삼백초, 강황 및 원지를 포함하고, 석창포 또는 클로버를 선택적으로 포함하는 추출물의 처리용량에 따른 동물모델의 혈중 우레아의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 14h는 삼백초, 강황 및 원지를 포함하고, 석창포 또는 클로버를 선택적으로 포함하는 추출물의 처리용량에 따른 동물모델의 혈중 LDH의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 14i는 삼백초, 강황 및 원지를 포함하고, 석창포 또는 클로버를 선택적으로 포함하는 추출물의 처리용량에 따른 동물모델의 혈중 ALP의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 14j는 삼백초, 강황 및 원지를 포함하고, 석창포 또는 클로버를 선택적으로 포함하는 추출물의 처리용량에 따른 동물모델의 혈중 GPT의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 14k는 삼백초, 강황 및 원지를 포함하고, 석창포 또는 클로버를 선택적으로 포함하는 추출물의 처리용량에 따른 동물모델의 혈중 GOT의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 삼백초, 강황 , 원지 및 석창포의 개별추출물 및 복합추출물의 제조
삼백초, 강황, 원지 및 석창포의 각 분쇄물을 하기 표 1의 비율로 혼합하여 30g의 혼합물을 수득하고, 상기 혼합물을 열수 추출, 온수 추출 및 에탄올 추출방법에 각각 적용하여 각각의 해당 추출물을 수득하였다. 상기 수득한 각 추출물을 여과하여 액상성분을 수득하고, 수득한 액상성분을 동결건조시켜서 분말상의 추출물(열수 추출물, 온수 추출물 및 에탄올 추출물)을 수득하였으며, 상기 분말상의 추출물을 증류수에 100㎎/㎖의 농도로 용해시켜서 이후의 실험에서 시료로서 사용하였다. 이때, 상기 열수 추출은 상기 혼합물에 생수 1ℓ를 가하고 100㎖가 될 때 까지 가열하여 수행하였고, 상기 온수 추출은 상기 혼합물에 증류수 300㎖를 가하고 38℃로 유지하면서 24시간 동안 추출하여 수행하였으며, 상기 에탄올 추출은 상기 혼합물에 25% 에탄올 300㎖를 가하고, 38℃로 유지하면서 24시간 동안 추출하여 수행하였다.
아울러, 상기 삼백초, 강황, 원지 및 석창포 각각의 분쇄물 30g을 상술한 바와 동일한 방법에 적용하여 각 성분의 개별추출물(열수 추출물, 온수 추출물 및 에탄올 추출물)을 제조하였다.
추출물의 조성비
추출물 삼백초(%) 강황(%) 원지(%) 석창포(%) Total(%)
KIOM-2012Ob(1) 10g(33.3) 10g(33.3) 6g(20) 4g(13.4) 30g(100)
KIOM-2012Ob(2) 10g(33.3) 6g(20) 10g(33.3) 4g(13.4) 30g(100)
KIOM-2012Ob(3) 10g(33.3) 4g(13.4) 10g(33.3) 6g(20) 30g(100)
실시예 2: 삼백초, 강황 , 원지 및 석창포의 개별추출물 및 복합추출물의 in vitro 항비만 효과
미국 ATCC사로부터 분양받은 3T3-L1 세포를 10% 소 혈청(Bovine Serum, BS, Gibco) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 DMEM(Dulbcco's Modified Eagle's Medium, Lonza) 배지에 접종하고, 37℃ 및 5% CO2의 조건에서 배양한 다음, 3 내지 4일 간격으로 계대 배양하여 지방전구세포를 수득하였다.
상기 수득한 지방전구세포를 회수하고, 1 x 104세포수/㎖의 농도로 적정한 다음, 이를 96 웰 플레이트에 100㎕/웰의 양으로 분주하였으며, 37℃ 및 5% CO2의 조건에서 포화될 때까지 4일간 배양하였다. 그런 다음, 상기 배양된 세포에, 상기 실시예 1에서 제조된 각각의 개별추출물 또는 복합추출물이 포함된 지방세포 분화유도 배지(DMEM, 0.25μM 덱사메타손, 0.5mM 3-이소부틸-1-메틸산틴, 10㎍/㎖ 인슐린 및 FBS(Fetal Bovine Serum))를 가하고 2일 동안 추가로 배양하였다. 이때, 지방세포 분화유도 배지에 포함된 상기 개별추출물 또는 복합추출물의 농도는 하기 표 2와 같다.
개별추출물 및 복합추출물의 처리농도
추출물 처리농도(㎍/㎖)
KIOM-2012b(1) 0 10 50 100
삼백초 추출물 0 3.3 16.7 33.3
강황 추출물 0 3.3 16.7 33.3
원지 추출물 0 2 10 20
석창포 추출물 0 1.4 6.6 13.4
KIOM-2012b(2) 0 10 50 100
삼백초 추출물 0 3.3 16.7 33.3
강황 추출물 0 2 10 20
원지 추출물 0 3.3 16.7 33.3
석창포 추출물 0 1.4 6.6 13.4
KIOM-2012b(3) 0 10 50 100
삼백초 추출물 0 3.3 16.7 33.3
강황 추출물 0 1.4 6.6 13.4
원지 추출물 0 3.3 16.7 33.3
석창포 추출물 0 2 10 20
이어, 배지를 제거하고, 10 ㎍/㎖ 인슐린만을 포함하는 DMEM 배지를 가한 후, 2일 동안 배양하였으며, 그 후에는 2일 간격으로 FBS 만을 포함하는 DMEM 배지를 교체하면서 8일동안 배양하였다.
배양이 종료된 후, 세포를 회수하고 PBS로 세척한 다음, 10% 포르말린으로 고정시켰다. 고정된 세포에 오일 레드 O(Oil Red O)를 가하여 염색하고, 70% 이소프로필 알코올을 가하여 세척하였으며, 세척된 세포를 건조시키고, 100% 이소프로필 알코올을 가하여 세포에 염색된 오일 레드 O를 용해시켰으며, 490㎚에서 흡광도를 측정하고, 측정된 흡광도 값을 이용하여 세포내에 축적된 지방의 함량을 산출하였다. 이때, 지방의 함량은 대조군의 평균흡광도 값에 대한 백분율로 표시하였다.
한편, WST（Water-soluble tetrazolium, the sodium salt of 4-[3-(4iodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate) 측정법을 이용하여, 상기 분화된 세포의 생존율을 측정하여, 각 복합추출물 및 개별추출물의 세포독성을 평가하였다. 대략적으로, 상기 배양이 종료된 세포에 WST 용액(10㎕/100㎕)을 처리하여 1시간 동안 추가로 배양한 다음, 배양액으로 방출된 포츠마잔의 양을 흡광도(520㎚)를 사용하여 산출함으로써, 생존하는 세포의 수준을 측정하고, 이를 대조군의 값에 대한 비율로 표시하였다.
우선, 열수 추출물의 지방축적 억제 효과를 분석한 결과, 도 1a 내지 도 1c에서 보듯이, 각 복합추출물(KIOM-2012Ob(1), KIOM-2012Ob(2), KIOM-2012Ob(3))은 50 및 100㎍/㎖의 농도로 처리할 경우에 농도의존적으로 지방함량이 감소되었고, 각 개별추출물 중에서는 원지 추출물만이 복합추출물과 유사하게 지방함량이 감소되는 효과를 나타내었을 뿐, 삼백초, 강황 및 석창포 추출물은 처리농도에 관계없이 별다른 지방함량 감소효과를 나타내지 않음을 확인하였다. 또한, 각 복합추출물(KIOM-2012Ob(1), KIOM-2012Ob(2), KIOM-2012Ob(3))을 50㎍/㎖의 농도로 처리한 경우의 지방감소율은 각각 10, 13 및 17%이고, 100㎍/㎖의 농도로 처리한 경우의 지방감소율은 각각 25, 28 및 26% 임을 확인하였다.
아울러, 열수 추출물의 세포독성을 분석한 결과, 도 1d 내지 도 1f에서 보듯이, 각 복합추출물(KIOM-2012Ob(1), KIOM-2012Ob(2), KIOM-2012Ob(3))은 50 및 100㎍/㎖의 농도로 처리할 경우에 농도의존적으로 세포수가 감소되었고, 각 각 개별추출물 중에서는 원지 추출물을 처리한 경우에, 세포수가 현저히 감소하였으나, 삼백초, 강황 및 석창포 추출물을 처리한 경우에는 처리농도에 관계없이 세포수가 감소하지 않음을 확인하였다.
다음으로, 온수 추출물의 지방축적 억제 효과를 분석한 결과, 도 2a 내지 도 2c에서 보듯이, 각 복합추출물(KIOM-2012Ob(1), KIOM-2012Ob(2), KIOM-2012Ob(3))은 50 및 100㎍/㎖의 농도로 처리할 경우에 농도의존적으로 지방함량이 감소되었고, 각 개별추출물 중에서는 원지 추출물만이 복합추출물과 유사하게 지방함량이 감소되는 효과를 나타내었을 뿐, 삼백초, 강황 및 석창포 추출물은 처리농도에 관계없이 별다른 지방함량 감소효과를 나타내지 않음을 확인하였다.
아울러, 온수 추출물의 세포독성을 분석한 결과, 도 2d 내지 도 2f에서 보듯이, 각 복합추출물(KIOM-2012Ob(1), KIOM-2012Ob(2), KIOM-2012Ob(3))은 50 및 100㎍/㎖의 농도로 처리할 경우에 농도의존적으로 세포수가 감소되었고, 각 각 개별추출물 중에서는 원지 추출물을 처리한 경우에, 세포수가 현저히 감소하였으나, 삼백초, 강황 및 석창포 추출물을 처리한 경우에는 처리농도에 관계없이 세포수가 감소하지 않음을 확인하였다.
끝으로, 에탄올 추출물의 지방축적 억제 효과를 분석한 결과, 도 3a 내지 도 3c에서 보듯이, 각 복합추출물(KIOM-2012Ob(1), KIOM-2012Ob(2), KIOM-2012Ob(3))은 10, 50 및 100㎍/㎖의 농도로 처리할 경우에 농도의존적으로 지방함량이 감소되었고, 각 개별추출물 중에서는 원지 추출물만이 복합추출물과 유사하게 지방함량이 감소되는 효과를 나타내었을 뿐, 삼백초, 강황 및 석창포 추출물은 처리농도에 관계없이 별다른 지방함량 감소효과를 나타내지 않음을 확인하였다.
아울러, 온수 추출물의 세포독성을 분석한 결과, 도 3d 내지 도 3f에서 보듯이, 각 복합추출물(KIOM-2012Ob(1), KIOM-2012Ob(2), KIOM-2012Ob(3))은 100㎍/㎖의 농도로 처리할 경우에 세포수가 감소되었고, 각 각 개별추출물 중에서는 원지 추출물을 50 및 100㎍/㎖의 농도로 처리한 경우에, 세포수가 현저히 감소하였으나, 삼백초, 강황 및 석창포 추출물을 처리한 경우에는 처리농도에 관계없이 세포수가 감소하지 않음을 확인하였다.
상기 각 복합추출물(열수 추출물, 온수 추출물 및 에탄올 추출물)의 결과를 종합하면, 지방축적 억제효과와 세포안전성의 측면에서 에탄올 추출물이 가장 우수함을 알 수 있었다.
실시예 3: 삼백초, 강황 , 원지 및 석창포의 개별추출물 및 복합추출물의 in vivo 항비만 효과
상기 실시예 2의 결과로부터, in vitro에서 지방축적 억제효과와 세포안전성의 측면에서 삼백초, 강황, 원지 및 석창포의 에탄올 추출물이 우수한 효과를 나타냄을 확인하였는 바, 상기 에탄올 추출물이 in vivo 조건에서도 유효한지의 여부를 확인하고자 하였다. 이를 위하여, 상기 에탄올 추출방법으로 수득한 개별추출물과 복합추출물을 마우스에 섭식시키면서 사육하고, 사육된 마우스의 체중, 식이섭취량 및 지방 중량을 측정하고, 간 조직과 신장 조직을 비교분석하였다.
실시예 3-1: 각 조건별로 사육된 마우스의 수득
5주령의 수컷 C57BL/6N 마우스 170마리를 구입하여 1주일간 순응시킨 후, 60% 고지방식이(high fat diet, HFD)를 5주동안 섭식시키면서 사육한 다음, 사육된 마우스를 10마리씩 17개 그룹으로 나누어 서로 다른 시험물질을 포함하는 각각 다른 조건의 사료를 섭식시키면서 6주동안 추가로 사육하였다(표 3). 이때, 양성대조군은 공지된 비만치료제인 제니칼을 투여한 그룹으로 설정하였고, 복합추출물은 정상식이군(X1)과 과다식이군(X4)으로 나누어 투여하였다. 또한, 사육실 온도는 22±1℃로 유지하고, 습도는 50 ±5%로 유지하였으며, 명암은 12시간 간격으로 조절하였고, 10% 고지방 식이와 60% 고지방 식이는 중앙실험동물사에서 구입하여 공급하였다.
마우스의 식이조건
실험군
 명칭
 고지방
식이비율		 시험물질
종류 투여량
(㎎/㎏)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17		 정상 대조군(normal control)
음성 대조군(negative control)
양성 대조군(positive control)
삼백초-1X군
삼백초-4X군
강황-1X군
강황-4X군
원지-1X군
원지-4X군
석창포-1X군
석창포-4X군
KIOM-2012Ob(1)-1X군
KIOM-2012Ob(1)-4X군
KIOM-2012Ob(2)-1X군
KIOM-2012Ob(2)-4X군
KIOM-2012Ob(3)-1X군
KIOM-2012Ob(3)-4X군		 10%
60%
60%
60%
60%
60%
60%
60%
60%
60%
60%
60%
60%
60%
60%
60%
60%		 -
-
제니칼
삼백초 추출물
삼백초 추출물
강황 추출물
강황 추출물
원지 추출물
원지 추출물
석창포 추출물
석창포 추출물
KIOM-2012Ob(1)
KIOM-2012Ob(1)
KIOM-2012Ob(2)
KIOM-2012Ob(2)
KIOM-2012Ob(3)
KIOM-2012Ob(3)		 -
-
62.5
36.4
145.6
278.5
111.4
97.2
388.8
50.9
203.6
106.2
424.8
106.2
424.8
146.4
584.4
실시예 3-2: 체중 평가
상기 실시예 3-1에서 사육된 17종의 실험군 마우스의 체중을 측정하고, 비교분석하였다(도 4). 도 4에서 보듯이, 정상 대조군과 가장 유사한 수준으로 체중이 감소된 실험군은 실험군 9(원지-4X군)임을 확인하였고, 그 다음으로 체중이 감소된 실험군은 실험군 15(KIOM-2012Ob(2)-4X군) 및 17(KIOM-2012Ob(3)-4X군)임을 확인하였다. 나머지 실험군의 마우스 역시 음성 대조군 보다는 낮은 수준을 나타내어, 대체로 체중 감소효과를 나타냄을 알 수 있었다.
그러나, 실험군 9(원지-4X군)의 경우에는 6주동안 10마리 중에서 4마리가 폐사하였고, 1마리는 건강이 매우 악화되어, 독성에 의한 피해가 심각함을 확인하였다. 이에 반하여, 실험군 15(KIOM-2012Ob(2)-4X군) 및 17(KIOM-2012Ob(3)-4X군)은 독성에 의한 피해가 나타나지 않았다.
실시예 3-3: 식이섭취량 평가
상기 실시예 3-1에서 사육된 17종의 실험군 마우스의 식이섭취량을 측정하고, 비교분석하였다(도 5). 도 5에서 보듯이, 각 실험군별로 식이섭취량에 다소 차이가 있었으나, 실험군 9(원지-4X군)를 제외하고는, 유의한 차이를 나타내지 않았다.
실시예 3-4: 지방중량 평가
상기 실시예 3-1에서 사육된 17종의 실험군 마우스를 5시간 동안 절식시켜서, 마우스가 섭취한 사료를 모두 소화시키게 유도하고, 상기 각 마우스를 경추탈골 방법으로 희생시킨 다음, 각 마우스로부터 복부지방 및 피하지방을 적출하였다. 상기 적출된 복부지방과 피하지방을 생리식염수로 세척하고, 여과지에 안치시켜서 수분을 제거한 다음, 이들 지방의 총 중량을 측정하고, 비교분석하였다(도 6). 도 6에서 보듯이, 실험군 9(원지-4X군) 및 실험군 15(KIOM-2012Ob(2)-4X군)는 음성 대조군에 비하여 유의하게 지방중량이 감소됨을 확인하였다. 또한, 동일수준의 복합추출물이 투여된 실험군 12(KIOM-2012Ob(1)-1X군), 실험군 14(KIOM-2012Ob(2)-1X군) 및 실험군 16(KIOM-2012Ob(3)-1X군)을 비교하면, 실험군 14, 16 및 12의 순서로 지방중량이 증가하고, 실험군 13(KIOM-2012Ob(1)-4X군), 실험군 15(KIOM-2012Ob(2)-4X군) 및 실험군 17(KIOM-2012Ob(3)-4X군)을 비교하면, 실험군 15, 17 및 13의 순서로 지방중량이 증가함을 확인하였으므로, 상기 각 복합추출물에 포함된 삼백초, 강황, 원지 및 석창포의 함량에 비추어 볼 때, 상기 복합추출물의 지방증가 억제효과에 가장 큰 영향을 미치는 성분은 원지이고, 그 다음이 강황이며, 석창포는 지방증가 억제효과에 기여하는 바가 가장 적은 것으로 분석되었다.
실시예 3-5: 간 조직의 병리학적 분석
상기 실시예 3-4에서 희생시킨 마우스로부터 간 조직을 적출하고, 이를 포르말린에 고정시킨 다음, 병리학적 분석을 수행하여, 간 조직에 포함된 미세수포성 지방종의 수준 및 만성염증의 수준을 비교분석하였다(도 7). 도 7의 A에서 보듯이, 간 조직에 포함된 미세수포성 지방종은 음성 대조군에 비하여, 원지 추출물(실험군 8 및 9)와 복합추출물(실험군 12-17)이 투여된 경우에 모두 낮은 값을 나타내어 간 조직에 포함된 미세수포성 지방종의 수준이 유의하게 감소함을 확인하였다.
또한, 도 7의 B에서 보듯이, 간 조직의 만성염증 수준은 모든 실험군에서 음성 대조군 보다 높은 수준을 나타내었고, 그 중에서도, 원지 추출물(실험군 8 및 9)이 투여된 마우스에서는 가장 높은 수준을 나타내었다. 이에 반하여, 복합추출물(실험군 12-17)이 투여된 마우스에서는 원지 추출물이 투여된 마우스 보다는 낮은 수준을 나타내었다.
실시예 3-6: 신장 조직의 병리학적 분석
상기 실시예 3-4에서 희생시킨 마우스로부터 신장 조직을 적출하고, 이를 포르말린에 고정시킨 다음, 병리학적 분석을 수행하여, 신장 조직에 포함된 만성염증의 수준을 비교분석하였다(도 8). 도 8에서 보듯이, 신장 조직의 만성염증 수준은 모든 실험군에서 음성 대조군은 물론 정상 대조군 보다 높은 수준을 나타내었고, 그 중에서도, 원지 추출물(실험군 9)이 투여된 마우스에서는 비교적 높은 수준을 나타내었다. 이에 반하여, 복합추출물(실험군 12-17)이 투여된 마우스에서는 원지 추출물이 투여된 마우스와 동등하거나 또는 낮은 수준을 나타내었다.
상기 실시예 3-2 내지 3-6의 결과를 종합하면, in vivo 에서 원지 추출물과 복합추출물이 비만억제 효과를 나타내었고, 비만억제 효과가 우수하지만 동물에 대하여 심각한 독성을 나타내는 원지 추출물에 비하여, 복합추출물은 비교적 우수한 비만억제 효과와 함께 향상된 안전성을 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 4: 삼백초, 강황 및 원지로부터 유래된 복합추출물의 비만억제 효과
상기 실시예 3-4의 결과로부터, 상기 복합추출물에 포함된 성분 중에서 지방증가 억제효과에 기여하는 바가 가장 적은 것으로 분석되었으므로, 석창포 없이 삼백초, 강황 및 원지 만으로 구성된 시료로부터 추출된 복합추출물이 비만억제 효과를 나타내는지의 여부를 확인하고자 하였다.
실시예 4-1: 천연물 추출물의 수득
분쇄된 삼백초, 강황 및 원지를 필수적으로 포함하고, 석창포 및 클로버는 선택적으로 포함하는 혼합물을 수득하고(표 4), 상기 혼합물에 25% 에탄올 300㎖를 가하고, 38℃로 유지하면서 24시간 동안 추출하여 각각의 복합추출물을 수득하였다. 상기 수득한 각 추출물을 여과하여 액상성분을 수득하고, 수득한 액상성분을 동결건조시켜서 분말상의 추출물을 수득하였으며, 상기 분말상의 추출물을 증류수에 100㎎/㎖의 농도로 용해시켜서 이후의 실험에서 시료로서 사용하였다.
또한, 비교군에서 사용될 녹차 추출물 역시 동일한 방법으로 수득하였다.
복합추출물의 조성비
추출물 삼백초 강황 원지 석창포 클로버
K
KS
KC		 8g
8g
8g		 8g
8g
8g		 8g
8g
8g		 -
4g
-		 -
-
4g
실시예 4-2: 각 조건별로 사육된 마우스의 수득
5주령의 수컷 C57BL/6N 마우스 126마리를 구입하여 1주일간 순응시킨 후, 마우스를 9마리씩 14개 그룹으로 나누어, 60% 고지방식이(HFD)와 서로 다른 시험물질을 포함하는 각각 다른 조건의 사료를 섭식시키면서 8주동안 사육하였다(표 5). 이때, 정상 사육실 온도는 22±1℃로 유지하고, 습도는 50 ±5%로 유지하였으며, 명암은 12시간 간격으로 조절하였으며, 부형제로는 생리식염수를 사용하였다.
마우스의 식이조건
실험군 명칭 고지방
식이비율		 시험물질
종류 투여량
(㎎/㎏)
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34		 정상 대조군(normal control)
음성 대조군(negative control)
양성 대조군(positive control 1, PC1)
양성 대조군(positive control 2, PC2)
양성 대조군(positive control 3, PC3)
양성 대조군(positive control 4, PC4)
K 150
K 300
KS 150
KS 300
KC 150
KC 300
KCL
KSL		 10%
60%
60%
60%
60%
60%
60%
60%
60%
60%
60%
60%
60%
60%		 -
-
녹차 추출물
L-카르니틴
제니칼
제니칼
K
K
KS
KS
KC
KC
KC+L-카르니틴
KS+L-카르니틴		 -
-
200
30
25
75
150
300
150
300
150
300
300+30
300+30
실시예 4-3: 체중 평가
상기 실시예 4-2에서 사육된 14종의 실험군 마우스의 체중을 측정하고, 비교분석하였다(도 9). 도 9에서 보듯이, 모든 실험군(실험군 27-34)의 체중이 음성 대조군의 체중보다 낮은 수준을 나타내었고, 정상 대조군과 가장 유사한 수준으로 체중이 감소된 실험군은 실험군 34(KSL)이며, 그 다음으로 실험군 28(K 300), 실험군 30(KS 300), 실험군 33(KCL), 실험군 29(KS 150), 실험군 27(K 150), 실험군 31(KC 150) 및 실험군 32(KC 300)의 순서임을 확인하였다.
상기 결과로부터, 삼백초, 강황 및 원지로 구성된 시료로부터 추출된 복합추출물도 체중억제 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 4-4: 식이섭취량 평가
상기 실시예 4-2에서 사육된 14종의 실험군 마우스의 식이섭취량을 측정하고, 비교분석하였다(도 10). 도 10에서 보듯이, 각 실험군별로 식이섭취량에 다소 차이가 있었으나, 유의한 차이를 나타내지 않았다.
실시예 4-5: 지방중량 평가
상기 실시예 4-2에서 사육된 14종의 실험군 마우스를 5시간 동안 절식시켜서, 마우스가 섭취한 사료를 모두 소화시키게 유도하고, 상기 각 마우스를 경추탈골 방법으로 희생시킨 다음, 각 마우스로부터 복부생식기지방, 장간지방 및 피하지방을 적출하였다. 상기 적출된 복부생식기지방, 장간지방 및 피하지방을 생리식염수로 세척하고, 여과지에 안치시켜서 수분을 제거한 다음, 이들 지방의 각 중량 및 총 중량을 측정하고, 비교분석하였다(도 11a 내지 11d).
도 11a에서 보듯이, 복부생식기지방의 경우에는 모든 실험군(실험군 27-34)에서 음성 대조군보다 낮은 수준을 나타내었고, 정상 대조군과 가장 유사한 수준으로 지방중량이 감소된 실험군은 실험군 28(K 300)이며, 그 다음으로 실험군 34(KSL), 실험군 30(KS 300), 실험군 33(KCL), 실험군 27(K 150), 실험군 32(KC 300), 실험군 29(KS 150) 및 실험군 31(KC 150)의 순서임을 확인하였다.
도 11b에서 보듯이, 장간지방의 경우에는 모든 실험군(실험군 27-34)에서 음성 대조군보다 낮은 수준을 나타내었고, 정상 대조군과 가장 유사한 수준으로 지방중량이 감소된 실험군은 실험군 30(KS 300)이며, 그 다음으로 실험군 34(KSL), 실험군 28(K 300), 실험군 33(KCL), 실험군 32(KC 300), 실험군 29(KS 150), 실험군 27(K 150) 및 실험군 31(KC 150)의 순서임을 확인하였다.
도 11c에서 보듯이, 피하지방의 경우에는 모든 실험군(실험군 27-34)에서 음성 대조군보다 낮은 수준을 나타내었고, 정상 대조군과 가장 유사한 수준으로 지방중량이 감소된 실험군은 실험군 28(K 300)이며, 그 다음으로 실험군 34(KSL), 실험군 30(KS 300), 실험군 33(KCL), 실험군 29(KS 150), 실험군 27(K 150), 실험군 32(KC 300) 및 실험군 31(KC 150)의 순서임을 확인하였다.
도 11d에서 보듯이, 총지방의 경우에는 모든 실험군(실험군 27-34)에서 음성 대조군보다 낮은 수준을 나타내었고, 정상 대조군과 가장 유사한 수준으로 지방중량이 감소된 실험군은 실험군 28(K 300)이며, 그 다음으로 실험군 34(KSL), 실험군 30(KS 300), 실험군 33(KCL), 실험군 27(K 150), 실험군 29(KS 150), 실험군 32(KC 300) 및 실험군 31(KC 150)의 순서임을 확인하였다.
상기 도 11a 내지 11d의 결과를 종합하면, 삼백초, 강황 및 원지로 구성된 시료로부터 추출된 복합추출물이 지방축적 억제효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 4-6: 그렐린(ghrelin)의 수준평가
위에서 분비되고, 공복 호르몬(hunger hormone)이라고 알려진 그렐린의 수준을, 상기 실시예 4-2에서 사육된 14종의 실험군 마우스를 대상으로 하여, 활성화된 그렐린(activated ghrelin), 디스아실그렐린(desacyl-ghrelin) 및 그렐린비율(ghrelin ratio)로 세분하여 평가하였다
먼저, 혈장에 존재하는 활성화된 그렐린의 수준은 그렐린 측정키트(Active Ghrelin ELISA kit, SCETI, Japan)를 사용하여 측정하였다. 대략적으로, 각 실험군의 마우스로부터 수득한 혈액을 EDTA와 압토티닌(aptotinin)이 포함된 튜브에 넣고, 혼합한 다음, 원심분리하여 혈장을 수득하였으며, 상기 혈장에 혈장부피의 10%에 해당하는 1 mol/L HCL을 가하여 시료를 준비하였다. 상기 준비된 시료를 상기 그렐린 측정키트에 가하여 반응시키고 450nm에서의 흡광도를 측정하였으며, 측정된 흡광도의 값으로부터 활성화된 그렐린의 수준을 산출하였다(도 12a).
도 12a에서 보듯이, 활성화된 그렐린의 경우에는 음성 대조군의 값보다 높은 수준을 나타내는 실험군은 실험군 32(KC 300)이고, 음성 대조군의 값과 유사한 값을 나타내는 실험군은 실험군 27(K 150) 및 실험군 34(KSL)이며, 음성 대조군의 값보다 낮은 수준을 나타내는 실험군은 실험군 29(KS 150), 실험군 28(K 300), 실험군 33(KCL), 실험군 30(KS 300) 및 실험군 31(KC 150)이며, 가장 낮은 수준을 나타내는 실험군은 실험군 29(KS 150)임을 확인하였다.
다음으로, 혈장에 존재하는 디스아실그렐린의 수준은 상기 그렐린 측정키트(Active Ghrelin ELISA kit, SCETI, Japan) 대신에 디스아실그렐린 측정키트(desacyl-Ghrelin ELISA kit, SCETI, Japan)를 사용하는 것을 제외하고는, 상술한 바와 동일한 방법으로 측정하였다(도 12b).
도 12b에서 보듯이, 디스아실그렐린의 경우에는 음성 대조군의 값보다 낮은 수준을 나타내는 실험군은 실험군 32(KC 300)이고, 음성 대조군의 값과 유사한 값을 나타내는 실험군은 실험군 29(KS 150) 및 실험군 34(KSL)이며, 음성 대조군의 값보다 낮은 수준을 나타내는 실험군은 실험군 27(K 150), 실험군 28(K 300), 실험군 33(KCL), 실험군 30(KS 300) 및 실험군 31(KC 150)이며, 가장 높은 수준을 나타내는 실험군은 실험군 33(KCL)임을 확인하였다.
끝으로, 그렐린 비율은 상기 측정된 디스아실그렐린의 수준에 대한 활성화된 그렐린 수준의 백분율로 산출하였다(도 12c).
도 12c에서 보듯이, 그렐린비율의 경우에는 음성 대조군의 값보다 높은 수준을 나타내는 실험군은 실험군 32(KC 300)이고, 음성 대조군의 값과 유사한 값을 나타내는 실험군은 실험군 27(K 150)이며, 음성 대조군의 값보다 낮은 수준을 나타내는 실험군은 실험군 34(KSL), 실험군 29(KS 150), 실험군 28(K 300), 실험군 33(KCL), 실험군 30(KS 300) 및 실험군 31(KC 150)이며, 가장 낮은 수준을 나타내는 실험군은 실험군 33(KCL)임을 확인하였다.
상기 도 12a 내지 12c의 결과를 종합하면, 삼백초, 강황 및 원지로 구성된 시료로부터 추출된 복합추출물은 음성 대조군과 유사하거나 이보다 낮은 수준의 활성화된 그렐린, 디스아실그렐린 및 그렐린 비율을 나타내었으므로, 상기 복합추출물의 비만억제 효과는 식욕의 억제를 통하여 나타나는 것이 아님을 알 수 있었다.
실시예 4-7: 렙틴(leptin)의 수준평가
상기 실시예 4-2에서 사육된 14종의 실험군 마우스를 대상으로 하여 혈장내 렙틴의 수준을 평가하였다.
구체적으로, 혈장에 존재하는 렙틴은 렙틴 측정키트(Mouse and Rat Leptin ELISA kit, mediagnost, Germany)를 사용하여 측정하였다. 대략적으로, 각 실험군의 마우스로부터 수득한 혈액을 EDTA와 압토티닌이 포함된 튜브에 넣고, 혼합한 다음, 원심분리하여 혈장을 수득하였으며, 상기 혈장에 상기 키트에 포함된 희석완충액을 가하여 희석한 다음, 상기 희석액을 상기 렙틴 측정키트에 가하여 반응시키고 450nm에서의 흡광도를 측정하였으며, 측정된 흡광도의 값으로부터 렙틴의 수준을 산출하였다(도 13).
도 13에서 보듯이, 혈장내 렙틴의 수준은 모든 실험군(실험군 27-34)에서 음성 대조군보다 낮은 수준을 나타내었고, 정상 대조군과 가장 유사한 수준으로 혈장내 렙틴의 수준이 감소된 실험군은 실험군 28(K 300)이며, 그 다음으로 실험군 33(KCL), 실험군 34(KSL), 실험군 30(KS 300), 실험군 29(KS 150), 실험군 27(K 150), 실험군 32(KC 300) 및 실험군 31(KC 150)의 순서임을 확인하였다.
통상적으로, 비만이 유도된 실험동물에서는 렙틴의 저항성이 증가하여 혈중 렙틴의 수준이 증가된다고 알려져 있다. 본 발명에서 제공하는 삼백초, 강황 및 원지로 구성된 시료로부터 추출된 복합추출물이 투여된 실험군 28(K 300)은 가장 낮은 렙틴의 수준을 나타냄을 확인하였고, 이는 렙틴의 저항성이 가장 낮은 수준임을 의미하므로, 상기 복합추출물은 비만의 발생을 효과적으로 억제하는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 4-8: 혈중 성분의 수준평가
상기 실시예 4-2에서 사육된 14종의 실험군 마우스를 대상으로 하여, 공지된 방법에 따라 혈중 중성지방, 총 콜레스테롤, LDL-콜레스테롤, HDL-콜레스테롤, 혈당, 크레아티닌, 우레아, LDH, ALP, GPT, GOT 등의 혈중 성분의 수준을 평가하였다(도 14a 내지 14k).
도 14a에서 보듯이, 혈중 중성지방(triglyceride)의 경우에는 실험군 34(KSL)만이 음성 대조군의 값보다 낮은 수준을 나타내고, 나머지 실험군은 음성 대조군의 값과 유사하거나 높은 수준을 나타내었으며, 가장 높은 수준을 나타내는 실험군은 실험군 32(KC 300)임을 확인하였다.
도 14b에서 보듯이, 혈중 총 콜레스테롤(total cholesterol)의 경우에는 음성 대조군의 값보다 낮은 수준을 나타내는 실험군은 실험군 27(K 150) 및 실험군 34(KSL)이고, 음성 대조군의 값과 유사한 값을 나타내는 실험군은 실험군 28(K 300) 및 실험군 30(KS 300)이며, 음성 대조군의 값보다 높은 수준을 나타내는 실험군은 실험군 29(KS 150), 실험군 33(KCL), 실험군 32(KC 300) 및 실험군 31(KC 150)이고, 가장 높은 수준을 나타내는 실험군은 실험군 33(KCL)임을 확인하였다.
도 14c에서 보듯이, 혈중 LDL-콜레스테롤의 경우에는 음성 대조군의 값보다 높은 수준을 나타내는 실험군은 실험군 31(KC 150), 실험군 32(KC 300) 및 실험군 33(KCL)이고, 음성 대조군의 값과 유사한 값을 나타내는 실험군은 실험군 29(KS 150) 및 실험군 30(KS 300)이며, 음성 대조군의 값보다 낮은 수준을 나타내는 실험군은 실험군 27(K 150), 실험군 28(K 300) 및 실험군 34(KSL)이고, 가장 낮은 수준을 나타내는 실험군은 실험군 34(KSL)임을 확인하였다.
도 14d에서 보듯이, 혈중 HDL-콜레스테롤의 경우에는 실험군 28(K 300)만이 음성 대조군의 값보다 낮은 수준을 나타내고, 나머지 실험군은 음성 대조군의 값과 유사하거나 높은 수준을 나타내었으며, 가장 높은 수준을 나타내는 실험군은 실험군 31(KC 150)임을 확인하였다.
도 14e에서 보듯이, 혈당(glucose)의 경우에는 음성 대조군의 값보다 낮은 수준을 나타내는 실험군은 실험군 28(K 300) 및 실험군 29(KS 150)이고, 음성 대조군의 값과 유사한 값을 나타내는 실험군은 실험군 34(KSL)이며, 음성 대조군의 값보다 높은 수준을 나타내는 실험군은 실험군 27(K 150), 실험군 31(KC 150), 실험군 32(KC 300), 실험군 33(KCL) 및 실험군 30(KS 300)이고, 가장 높은 수준을 나타내는 실험군은 실험군 32(KC 300)임을 확인하였다.
도 14f에서 보듯이, 혈중 크레아티닌(creatinine)의 경우에는 모든 실험군(실험군 27-34)에서 음성 대조군과 유사하거나 또는 높은 수준을 나타내었는데, 음성 대조군과 유사한 수준을 나타내는 실험군은 실험군 29(KS 150) 및 실험군 31(KC 150)이고, 나머지 실험군은 모두 음성 대조군의 값보다도 높은 수준을 나타내었는데, 가장 높은 수준을 나타내는 실험군은 실험군 34(KSL)임을 확인하였다.
도 14g에서 보듯이, 혈중 우레아(urea)의 경우에는 모든 실험군(실험군 27-34)에서 음성 대조군의 값보다 높은 수준을 나타내었는데, 가장 높은 수준으로 우레아 수준이 증가된 실험군은 실험군 33(KCL)이고, 그 다음으로 실험군 30(KS 300), 실험군 34(KSL), 실험군 27(K 150), 실험군 31(KC 150), 실험군 28(K 300), 실험군 29(KS 150) 및 실험군 32(KC 300)의 순서임을 확인하였다.
도 14h에서 보듯이, 혈중 LDH(lactate dehydrogenase)의 경우에는 모든 실험군(실험군 27-34)에서 음성 대조군과 유사하거나 또는 높은 수준을 나타내었는데, 음성 대조군과 유사한 수준을 나타내는 실험군은 실험군 30(KS 300) 및 실험군 34(KSL)이고, 나머지 실험군은 모두 음성 대조군의 값보다도 높은 수준을 나타내었는데, 가장 높은 수준을 나타내는 실험군은 실험군 32(KC 300)임을 확인하였다.
도 14i에서 보듯이, 혈중 ALP(alkaline phosphatase)의 경우에는 실험군 29(KS 150)만이 음성 대조군의 값보다 높은 수준을 나타내고, 나머지 실험군은 음성 대조군의 값과 유사하거나 낮은 수준을 나타내었으며, 가장 낮은 수준을 나타내는 실험군은 실험군 31(KC 150)임을 확인하였다.
도 14j에서 보듯이, 혈중 GPT(glutamic-pyruvic transaminase)의 경우에는 모든 실험군(실험군 27-34)에서 음성 대조군과 유사하거나 또는 높은 수준을 나타내었는데, 음성 대조군과 유사한 수준을 나타내는 실험군은 실험군 27(K 150), 실험군 28(K 300) 및 실험군 30(KS 300)이고, 나머지 실험군은 모두 음성 대조군의 값보다도 높은 수준을 나타내었는데, 가장 높은 수준을 나타내는 실험군은 실험군 31(KC 150)임을 확인하였다.
도 14k에서 보듯이, 혈중 GOT(glutamic-oxaloacetic transaminase)의 경우에는 모든 실험군(실험군 27-34)에서 음성 대조군과 유사하거나 또는 높은 수준을 나타내었는데, 음성 대조군과 유사한 수준을 나타내는 실험군은 실험군 29(KS 150) 및 실험군 34(KSL)이고, 나머지 실험군은 모두 음성 대조군의 값보다도 높은 수준을 나타내었는데, 가장 높은 수준을 나타내는 실험군은 실험군 31(KC 150)임을 확인하였다.
상기 도 14i 내지 14k에서 보듯이, 본 발명에서 제공하는 삼백초, 강황 및 원지로 구성된 시료로부터 추출된 복합추출물을 투여한 실험군의 혈중 ALP, GPT 및 GOT 수준은 대체로 대조군과 비교하여 유의한 차이를 나타내지 않았으므로, 상기 복합추출물은 간독성을 나타내지 않는 것으로 분석되었다.

Claims (16)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삼백초, 강황, 원지 및 석창포가 10:6:10:4(w/w/w/w)의 비율로 혼합된 시료의 복합추출물 또는 그의 분획물을 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 삭제
  5. 제3항에 있어서,
    상기 복합추출물은 25% 에탄올(EtOH)을 이용하여 수득하는 것인 조성물.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 분획물은 상기 복합추출물을 용매 분획법, 한외여과 분획법, 크로마토그래피 분획법 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법에 적용하여 수득한 분획물인 것인 조성물.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삼백초, 강황, 원지 및 석창포가 10:6:10:4(w/w/w/w)의 비율로 혼합된 시료의 복합추출물 또는 그의 분획물을 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  10. 삭제
  11. 제9항에 있어서,
    상기 복합추출물은 25% 에탄올(EtOH)을 이용하여 수득하는 것인 조성물.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 분획물은 상기 복합추출물을 용매 분획법, 한외여과 분획법, 크로마토그래피 분획법 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법에 적용하여 수득한 분획물인 것인 조성물.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삼백초, 강황, 원지 및 석창포를 10:6:10:4(w/w/w/w)의 비율로 포함하는 시료를 물, C1 ~ C4의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출하여 추출물을 수득하는 단계를 포함하는, 제3항의 조성물의 제조방법.
  16. 삭제
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