KR101830048B1 - 가자나무열매추출물 및 암라추출물을 포함하는 비만 또는 고지혈증 개선용 식품 조성물 - Google Patents
가자나무열매추출물 및 암라추출물을 포함하는 비만 또는 고지혈증 개선용 식품 조성물 Download PDFInfo
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- A23V2250/5114—Dextrins, maltodextrins
Abstract
본 발명은 가자나무추출물 및 암라추출물을 포함하는 체중감소 및 혈중지질 개선용 식품 조성물에 관한 것으로, 우수한 체지방 생성억제 및 분해촉진 효과를 발휘하고, 혈중지질개선 효과도 우수하다. 또한, 본 발명의 비만 개선 및 고지혈증 개선용 식품 조성물은 우수한 지방세포내 지방축적 저해 효과, 중성지방 분해 효과, 지방합성효소 발현 억제 효과를 발휘한다.
한편, 본 발명은 독성이 없고 부작용이 없으며, 인체에 무해한 천연 추출물로 조성된 복합물이기 때문에, 소비자들에게 친밀하게 접근할 수 있으며, 건강한 삶에 도움을 줄 수 있는 장점이 있다.
한편, 본 발명은 독성이 없고 부작용이 없으며, 인체에 무해한 천연 추출물로 조성된 복합물이기 때문에, 소비자들에게 친밀하게 접근할 수 있으며, 건강한 삶에 도움을 줄 수 있는 장점이 있다.
Description
본 발명은 비만 또는 고지혈증 개선용 기능성 식품 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 가자나무열매추출물 및 암라추출물을 포함하는 체중감소 및 혈중지질 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
현대사회는 식량부족과 전염병이 만연하던 이전 시절과 달리 현대사회에서 추구하는 미의 기준이 변화하였고, 단순히 건강의 문제만을 생각하던 시절에서 외향적인 아름다움을 중시하게 되면서 개인적인 만족과 자신감 고취가 매우 중요한 가치를 갖게 되었다. 따라서 풍만한 신체보다는 날씬하고 날렵한 신체가 선망의 대상으로 인식되어 비만 예방 혹은 치료목적의 이른바 ‘다이어트’국내 시장의 규모도 무시할 수 없을 만큼 성장하였다.
비만은 에너지의 섭취와 소비간의 불균형으로 인해 과도하게 체지방이 축적되어 지방세포의 수와 크기가 증가하는 것을 말한다(Cell. 2001. 104:531-543). 체내 에너지는 지방세포에 중성지방 형태로 저장되었다가 에너지원이 고갈되면 저장되었던 지방이 유리지방산과 글리세롤로 분해되어 에너지원으로 사용된다. 하지만 에너지의 과잉 섭취는 지방세포의 분화를 촉진하고 체내 저장 지방량을 증가시켜 비만의 직접적인 원인이 된다(Biochem J. 2011. 435(3):723-732).
비만은 직접적인 사망의 원인은 아니나 고혈압, 동맥경화, 뇌졸중, 심장마비 등의 순환기계 질환과 당뇨, 고지혈증과 같은 대사질환을 대표적으로 수반하며 암이나 수면무호흡증을 일으키는 인자로서 광범위하고 치명적인 합병증을 동반하여 인간의 평균 수명과도 관련이 깊은 것으로 인식되고 있다. 뿐만 아니라, 자신의 신체에 대한 불평, 불안, 인격장애, 우울증 등의 정신적인 병까지 유발하기 때문에 만병의 근원이라고 할 수 있다.
고지혈증은 혈액중의 콜레스테롤, 중성지질, 인지질 및 유리지방산 등의 농도가 비정상적으로 증가한 상태로서 가장 직접적으로 영향을 미치는 인자는 혈중 콜레스테롤과 LDL(low density lipoprotein)-콜레스테롤을 들 수 있으며, 특히 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia)은 죽상동맥경화증(atherosclerosis)을 유발하는 것으로 알려져 있다. 죽상동맥경화증은 혈관벽을 따라 지질이 두껍게 쌓여 혈류를 감소시켜 허혈성 심장질환과 협심증, 심근경색의 원인이 되므로 임상적으로 중요한 문제가 되고 있다(Korean J. Food Sci. Technol. 2003. 35:720-725). 따라서 혈액내의 이들 지질 수준을 저하시키기 위한 치료 및 예방책의 일환으로 건강기능식품에 대한 관심이 모아지고 있다.
비만을 해소하기 위한 방법으로 식욕억제제, 지방흡수억제제, 에너지대사촉진제, 호르몬제제 등의 약물요법과 위절제술, 지방흡입술 등의 외과적 수술법이 사용되고 있다. 하지만, 치료효과의 지속적 유지 여부 및 약물중단시 체중이 증가하는 현상 등이 문제가 되고 있다(Curr Opin Chem Biol. 2004. 4(4):452-460). 한때, 제니칼, 리덕틸 등의 비만 치료제가 등장하면서 500억대 시장을 형성하기도 하였지만, 구토, 변비, 위장장애, 심혈관질환 등 심각한 부작용을 지닌 것으로 알려졌기 때문에 판매가 금지 되었다(Int J Obes Relat Metab Disord. 2001. 25(7):1095-1099; Lancet. 2007. 369(9555):71-77; Obes Res. 2000. 8(6):431-437).
판크레틱 리파아제는 트리글리세라이드를 2-모노아실글리세롤과 지방산으로 분해하는 중요 효소로서 작용한다. 대표적인 판크레틱 리파아제 억제제는 스트렙토마이세스 톡시트리시니(streptomyces toxitricini)로부터 유래된 립스타틴(lipstatin)의 유도체인 테트라하이드로립스타틴으로서 섭취된 지방의 약 30%를 분해 저해할 정도로 효능이 우수하며, 현재 의약품으로 시판 중에 있지만, 위장장애, 과민증, 담즙 분비장애 등의 부작용이 나타나고 있는 실정이다.
본 발명에서는 장기 복용하여도 부작용이 없는 천연물 유래의 비만 예방 또는 체지방 감소 효능이 있는 항비만 의약 또는 식품 조성물을 개발하여 제공하고자 한다.
본 발명은 가자나무열매추출물 및 암라추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 비만 개선용 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 가자나무열매추출물 및 암라추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 고지혈증 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 식품 조성물에 있어서, 상기 가자나무열매추출물은, 바람직하게 말토덱스트린을 포함하고 있는 것일 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에 있어서, 상기 가자나무열매추출물 또는 암라추출물은, 바람직하게 추출용매로 물 또는 탄소수가 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나를 추출 용매로 사용하여 추출된 것일 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에 있어서, 상기 가자나무열매추출물 및 암라추출물은, 바람직하게 가자나무열매추출물 1 중량부에 대해, 암라추출물 0.3~0.6 중량부를 혼합하여 조성하는 것일 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에 있어서, 상기 식품 조성물은, 바람직하게 가자나무열매추출물 및 암라추출물을 상기 조성물 총중량에 대하여 0.01 내지 50 중량% 함유하는 것이 좋다.
본 발명의 가자나무열매추출물 및 암라추출물로 조성된 복합물은 체지방 생성억제 및 분해촉진 효과를 발휘하고, 혈중지질개선 효과도 우수하다. 더욱 상세하게, 본 발명의 비만 개선 및 고지혈증 개선용 식품 조성물은 우수한 지방세포내 지방축적 저해 효과, 중성지방 분해 효과, 지방합성효소 발현 억제 효과를 발휘한다. 또한, 본 발명은 독성이 없고 부작용이 없으며, 인체에 무해한 천연 추출물로 조성된 복합물이기 때문에, 소비자들에게 친밀하게 접근할 수 있으며, 건강한 삶에 도움을 줄 수 있는 장점이 있다.
도 1은 본 발명 복합물이 지방세포내 지방축적에 미치는 영향을 확인하고자, 세포내 지방축적정도를 측정한 실험 결과 그래프이다.
도 2는 본 발명 복합물이 지방세포내 지방분해에 미치는 영향을 확인하고자, 세포에서 분비되는 글리세롤을 측정한 실험 결과 그래프이다.
도 3는 본 발명 복합물이 지방세포내 지방분해에 미치는 영향을 확인하고자, 세포내 중성지질의 함량을 측정한 실험 결과 그래프이다.
도 4는 본 발명 복합물의 지방합성 억제 효과를 확인하고자, 세포내 LPL (도 4의 a)과 FAS (도 4의 b)의 유전자 발현정도를 측정한 실험 결과 그래프이다.
도 5는 본 발명 복합물의 지방분해 촉진 효과를 확인하고자, 세포내 PKA (도 5의 a)와 HSL (도 5의 b)의 유전자 발현정도를 측정한 실험 결과 그래프이다.
도 6는 본 발명 복합물이 비만 동물모델의 체중에 미치는 영향을 확인하고자, 실험동물의 체중변화를 측정한 실험 결과 그래프이다.
도 7은 본 발명 복합물의 체지방 분해 효과를 확인하고자, 실험동물로부터 혈중 아디포넥틴을 확인한 실험 결과 그래프이다.
도 8은 본 발명 복합물의 지방합성 억제 효과를 확인하고자, 실험동물로부터 LPL (도 8의 a)과 FAS (도 8의 b)의 유전자 발현정도를 측정한 실험 결과 그래프이다.
도 9는 본 발명 복합물의 지방분해 촉진 효과를 확인하고자, 실험동물로부터 PKA (도 9의 a)와 HSL (도 9의 b)의 유전자 발현정도를 측정한 실험 결과 그래프이다.
도 10은 본 발명 복합물의 체지방 감소 효과를 확인하고자, 실험동물로부터 복부 전체지방 부피를 측정한 실험 결과 그래프이다.
도 11는 본 발명 복합물이 혈중 지질 개선에 미치는 영향을 확인하기 위해, 실험동물로부터 혈중 중성지질을 확인한 실험 결과 그래프이다.
도 12은 본 발명 복합물이 혈중 지질 개선에 미치는 영향을 확인하기 위해, 실험동물로부터 혈중 총 콜레스테롤 (도 12의 a)과 LDL-콜레스테롤 (도 12의 b)을 확인한 실험 결과 그래프이다.
도 2는 본 발명 복합물이 지방세포내 지방분해에 미치는 영향을 확인하고자, 세포에서 분비되는 글리세롤을 측정한 실험 결과 그래프이다.
도 3는 본 발명 복합물이 지방세포내 지방분해에 미치는 영향을 확인하고자, 세포내 중성지질의 함량을 측정한 실험 결과 그래프이다.
도 4는 본 발명 복합물의 지방합성 억제 효과를 확인하고자, 세포내 LPL (도 4의 a)과 FAS (도 4의 b)의 유전자 발현정도를 측정한 실험 결과 그래프이다.
도 5는 본 발명 복합물의 지방분해 촉진 효과를 확인하고자, 세포내 PKA (도 5의 a)와 HSL (도 5의 b)의 유전자 발현정도를 측정한 실험 결과 그래프이다.
도 6는 본 발명 복합물이 비만 동물모델의 체중에 미치는 영향을 확인하고자, 실험동물의 체중변화를 측정한 실험 결과 그래프이다.
도 7은 본 발명 복합물의 체지방 분해 효과를 확인하고자, 실험동물로부터 혈중 아디포넥틴을 확인한 실험 결과 그래프이다.
도 8은 본 발명 복합물의 지방합성 억제 효과를 확인하고자, 실험동물로부터 LPL (도 8의 a)과 FAS (도 8의 b)의 유전자 발현정도를 측정한 실험 결과 그래프이다.
도 9는 본 발명 복합물의 지방분해 촉진 효과를 확인하고자, 실험동물로부터 PKA (도 9의 a)와 HSL (도 9의 b)의 유전자 발현정도를 측정한 실험 결과 그래프이다.
도 10은 본 발명 복합물의 체지방 감소 효과를 확인하고자, 실험동물로부터 복부 전체지방 부피를 측정한 실험 결과 그래프이다.
도 11는 본 발명 복합물이 혈중 지질 개선에 미치는 영향을 확인하기 위해, 실험동물로부터 혈중 중성지질을 확인한 실험 결과 그래프이다.
도 12은 본 발명 복합물이 혈중 지질 개선에 미치는 영향을 확인하기 위해, 실험동물로부터 혈중 총 콜레스테롤 (도 12의 a)과 LDL-콜레스테롤 (도 12의 b)을 확인한 실험 결과 그래프이다.
본 발명은 가자나무열매추출물 및 암라추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 체지방 감소효과를 갖는 비만 개선용 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 가자나무열매추출물 및 암라추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 고지혈증 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 고지혈증 개선용 식품조성물에 있어서, 상기 고지혈증은, 혈중 LDL(Low Density Lipoprotein)-콜레스테롤의 증가로 말미암은 것을 특징으로 하는 고지혈증 개선용 식품 조성물일 수 있다.
본 발명은 독성 및 부작용이 없는 천연물질로부터 항비만 효과를 발휘하는 새로운 식품 원료에 대해 연구한 결과, 가자나무열매추출물 및 암라추출물을 복합으로 사용하였을 때, 이들을 단독으로 사용하였을 때에 비해, 우수한 지방세포 분화 억제 효과, 지방 축적 억제 효과, 지방합성 효소 억제 효과, 지방분해 단백질 조절 유전자 발현 증가 효과가 나타남을 확인하였다. 또한, 실험동물에서 체중 감소 효과, 혈중 지질(총콜레스테롤, 중성지질, LDL 콜레스테롤) 감소 효과를 발휘함을 확인하였다.
본 발명에서는 가자나무열매를 사용하는데, 가자나무열매는 사군자과(Combfreetaceae)에 속하는 가자나무(Terminalia chebula Retz.)의 성숙한 열매이다. 이를 말린 가자(訶子, medicinal Terminalia fruit)는 가려늑, 가리늑, 수풍자, 가리, 가려라고 해서 아시아에서 약용으로 사용되고 있다. 한의학에서는 삽한 맛과 온한약성을 가지며 수렴, 지혈, 만성 후두염, 후두결핵, 장출혈, 만성자궁염, 이질 등의 치료에 많이 쓰이고 있다. 가자나무열매추출물은 항암활성, 항당뇨활성, 항돌연변이활성, 항균활성, 충치 예방효과 등 다양한 생리활성을 가지고 있음이 알려져 있다(J. Ethnopharmacol. 2002. 81:327-336; Food Chem. Toxicol. 2002. 40:527-534; Int. J. Antimicrob. Ag. 2001. 18:85-88).
또한, 가자나무열매는 인도 고대 의학서인 아유르베다 의학에서도 매우 중요하게 다루어지는 식물이다. 맛은 쓰고 시고 떫으며 짜고 달고, 성질은 따뜻하여, 아유르베다의 6가지 맛 중 5가지를 포함하고 있는데 그 중 특히 쓴맛을 지니고 있다. 또한 인도에서 널리 사용되는 약재인 트리팔라(Triphala)의 세가지 성분 중 하나로서 하리타키(Haritaki)라 불리며, 하제로서의 효능이 가장 강한 것으로 알려져 있다. 열매, 잎, 줄기를 모두 약재로 이용하나 주로 가을에 성숙한 과실을 채취하여 말려 사용한다. 한방에서 가자는 장청과라 하여 인후염, 폐렴 등에 쓰는데, 얼굴과 가슴에 있는 기를 내리며, 오래된 담을 삭히고, 소화를 돕고 설사를 멎게 한다. 열매를 그대로 복용하거나 밀기울에 볶거나 술에 담갔다가 쪄서 살만 발라 약한 불에 말려 쓰기도 한다(경전 속 불교식물. 2011.5.9. 이담북스).
가자에는 항산화, 항균, 상처치료 등의 효능을 가진 것으로 알려진 타닌(tannins), 엘라그산(ellagic acid), 푸니칼라진(punicalagin), 플라보노이드(flavonoids), 갈산(gallic acid), 케불린산(chebulinic acid), 케불라그산(chebulagic acid) 등이 함유되어 있다(Inter. J. Fres. Pharm. Biomed. Sci. 2012. 3(2):679-683).
한편, 본 발명에서는 암라를 사용하는데, 암라(Amla, Phyllanthus emblica)는 인디안구스베리라고도 하며, 이명으로 엠블리카 오피시날리스(Emblica officinalis )라고도 한다. 중소형 크기의 낙엽 교목으로 인도 전역에서 자생하며 인도의 히말라야 산맥으로 주로 재배된다. 중간 크기이며 작은 가지의 길이는 10~20 cm이다. 잎은 레몬향이 나며 꽃은 작고 황록색이다. 열매는 납작한 공모양으로 직경 2 cm이며, 익으면 연노랑 빛을 띠고 반들거리며 여섯 조각 줄로 된 녹황색이다. 또한, 아유르베다에 의거, 널리 사용되는 처방인 트리팔라(Triphala)의 세 가지 열매중의 하나로 아말라키(amalaki)라고 불리며, 비타민C, 미네랄, 아미노산(amino acid), 타닌(tannins), 루틴(rutin) 등을 함유하고 있는 것으로 알려져 있다(J. Nat. Orod. 2000. 63:1507-1510). 암라의 비타민C는 오렌지보다 20배 많이 함유되어 있으며, 열에도 대단히 안정적이어서 고온에 장시간 노출되어 있더라도 비타민이 거의 파괴되지 않는다. 암라의 비타민C 내열성은 함께 들어있는 타닌 성분에서 비롯된 것으로 여겨지며, 이 성분들에 의해 항산화, 항종양, 항염증 활성 등을 나타낸다(J. Ethnopharmacology. 2006. 104:113-118).
한편, 본 발명의 식품 조성물에 있어서, 상기 가자나무열매추출물 또는 상기 암라추출물은 물 또는 탄소수가 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나를 추출 용매로 하여 추출된 것이 좋다. 또한, 상기 가자나무열매추출물 또는 암라추출물은 추출방법으로써 일 예로, 열수 추출, 냉침 추출, 환류냉각 추출 또는 초음파 추출을 이용하여 추출된 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 상기 추출물은 추출 후 여과하여 감압 농축 또는 진공 농축하여 수득된 농축물을 포함하며, 동결 건조 또는 열풍 건조하여 수득된 분말 형태일 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에 있어서, 상기 가자나무열매추출물은, 바람직하게 말토덱스트린을 포함하고 있는 것일 수 있다. 말토덱스트린은 가자나무열매의 추출액으로부터 분무건조를 통해 추출물을 만들시 첨가되어 사용될 수 있다.
한편, 본 발명의 식품 조성물은 바람직하게 가자나무열매추출물 1 중량부에 대해, 암라추출물 0.3~0.6 중량부를 혼합하여 조성하는 것이 좋다. 더욱 바람직하게는 가자나무추출물 7 중량부, 암라추출물 3 중량부로 혼합되어 조성되는 것이 좋다.
한편, 본 발명의 식품 조성물에 있어서, 가자나무열매추출물 및 암라추출물을 상기 조성물 총중량에 대하여 0.01 내지 50 중량% 함유되는 것이 좋다.
한편, 본 발명의 식품 조성물은, 바람직하게 육류, 곡류, 카페인 음료, 일반 음료, 젤리, 면류, 검류, 비타민 복합제 및 그 밖의 건강보조식품류 중 선택되는 어느 하나인 것이 좋으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 식품 조성물은 식품 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 담체, 부형체 및 희석제는 예를 들면, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케니트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 톨리돈, 물, 꿀, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시 벤저에이트, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 일 수 있다. 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 중검제, pH조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에도 천연 과일 쥬스 및 과일 음료 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
이하, 본 발명의 구성을 하기 실시예 및 실험예를 통해 구체적으로 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[제조예 1: 가자나무열매추출분말의 제조]
건조된 가자나무열매 1 kg을 집기병에 담은 후 물 5 L를 넣고 40℃에서 3시간 추출하였다. 그 후, 10 mesh의 거름망으로 거른 다음, 최종 분말의 10%가 되도록 말토덱스트린을 첨가한 후 분무 건조하여 본 발명에서 사용할 가자나무열매추출분말을 제조하였다.
[제조예 2: 암라추출분말의 제조]
암라 열매 1 kg을 건조 후, 마쇄하여 얻은 분말 300 g을 집기병에 담은 후 물 3 L를 넣고 60℃에서 6시간으로 3회 반복 추출하여 암라열매추출물을 수득하였다. 그 후, 여과지(whatman No.1, England)로 감압 여과한 후, 진공회전농축기로 60℃에서 감압 농축한 다음, 분무 건조하여, 본 발명에서 사용할 암라추출분말을 제조하였다.
[실시예 1 : 복합물의 제조]
상기 제조예 1 내지 2에서 제조한 가자나무열매추출분말 및 암라추출분말을 무게비로 하기 표 1과 같이 배합하여 복합물을 제조하였다.
| 가자나무열매추출분말 (중량%) |
암라추출분말 (중량%) |
|
| 실시예 1 | 70 | 30 |
[실험예 1: 본 발명의 복합물이 지방세포 분화 과정에서 지방축적에 미치는 영향 확인]
본 실험예에서는 제조예 1 내지 2에서 제조한 단일추출물과 실시예 1에서 제조한 복합물이 지방세포 분화 과정에서 지방축적에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.
전지방세포인 3T3-L1 프리아디포사이트(preadipocyte)를 10% NCS(newborn calf serum)과 1% 페니실린-스트렙토마이신, 1% L-글루타민, 1% 소듐 피루베이트(sodium pyruvate), 1% 헤페스(hepes), 1% NEAA 혼합물을 함유한 high-glucose Dulbeco's modified Eagle's medium(DMEM)을 사용하여 37℃, 5% CO2가 유지되는 배양기에서 배양하였다. 2일마다 배양액을 교환하였고 세포가 단일 층으로 플라스크 바닥에 80% 이상 부착하면 PBS 용액을 사용하여 세포표면을 세척하였으며, 0.25% 트립신(trypsin)-EDTA를 첨가한뒤, 배양기에서 3분간 방치하여 세포를 분리하였다. 그 후 원심분리기(GYROZEN 416G)를 사용하여 1,600 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 모았다. 이들 세포를 10% FBS(fetal bovine serum)과 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin), 1% L-글루타민(glutamin), 1% 헤페스(hepes), 1% NEAA 혼합물(mixture), 젠타마이신(gentamycin)이 포함된 DMEM 배양액에 아디포제닉 칵테일(adipogenic cocktail) (MDI solution)인 3-이소부틸-1-메틸잔틴(3-isobutyl-1-methylxanthine)(IBMX, 0.5 mM), 인슐린 (10μg/mL), 덱사메타손(dexamethasone)(DEX, 1 μM)을 혼합하여 분화유도를 시작하였다. 분화 기간은 총 9일간 지속되었으며, 분화 초기 3일 동안 매일 같은 배양액을 교환해 주었다. 분화 중기 3일 동안은 배양액을 인슐린(insulin)(10 μg/mL)만을 포함하는 10% FBS를 함유한 DMEM으로 교환하여 매일 교환해 주었고, 분화 후기 3일동안은 10% FBS를 함유한 DMEM배양액으로 매일 교환해 주었다.
본 발명의 복합물이 전지방세포가 지방세포로 분화하는 과정에서 지방세포분화에 미치는 영향을 측정하기 위해 oil red O 염색을 수행하였다. 즉 세포배양 및 분화유도 방법에 따라 분화시키면서 분화 초기에 제조예 1 내지 2와 실시예 1을 각각 80 μg/mL로 처리하였다. 24, 48, 72시간 동안 아디포제닉 칵테일(adipogenic cocktail)을 포함한 10% FBS를 함유하는 DMEM 배양액과 추출물을 매일 교환해 주었고, 분화 후기(9일째)에 각각 oil red O 염색을 실시하였다. 배양액을 제거하고 PBS용액으로 2회 세척한 뒤 PBS 용액을 완전히 제거하였고, 10% 포르말린을 넣고 5분간 실온에서 고정 시킨 후, 포르말린을 제거하고 다시 새로운 10% 포르말린을 넣어 2시간 이상 실온에서 고정시켰다. 그 후, 포르말린을 제거하였고, 60% 이소프로판올(isopropanol)을 넣어 바로 제거한 뒤 플라스크를 완전히 건조시켰으며, oil red O solution을 첨가하여 60분동안 지방구를 염색하였다. 염색 후 증류수로 4번 세척하고 잘 건조된 상태에서 100% 이소프로판올을 첨가하여 oil red o 염색약을 용출시킨뒤 'ELISA reader(Molecular Devices, USA)'를 사용하여 520 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 아무것도 처리하지 않고 지방세포로 분화시킨군(대조군)을 100%로 하여, 제조예 1 내지 2와 실시예 1의 염색정도로 축적된 지방구양을 %로 확인하였다. 측정한 결과는 도 1에 나타내었으며, 실험군 간의 유의차는 ANOVA분석을 사용하였고, 유의성 평가는 p<0.05로 하였다.
실험결과, 대조군보다 제조예 1 내지 2 와 실시예 1 군 모두 축적된 지방이 적은 것으로 확인되었다. 특히, 실시예 1 군이 단일추출물인 제조예 1 내지 2보다 지방세포내 지방축적량이 적은 것으로 확인할 수 있었다.
[실험예 2: 본 발명의 복합물이 세포내 지방분해에 미치는 영향 확인]
본 실험예에서는 지방세포내 지방분해에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 지방세포내 중성지질의 함량과 지방분해시 증가하게 되는 글리세롤을 측정하였다.
글리세롤의 함량을 측정하기 위하여 맥고완(McGowan)등(Clin Chem. 1988. 29:538-542)의 방법에 따라 글리세롤 포스페이트 옥시다아제(glycerol phosphate oxidase)-TRINDER 효소반응법을 적용한 프리 글리세롤 시약(Free glycerol reagent)를 이용하여 배양액 내 글리세롤 함량을 측정하였다. 제조예 1 내지 2 또는 실시예 1을 80 μg/mL로 72시간 처리하여 분화 후기(9일째)에 각각 배양액을 모아 사용하였다. 배양액 1 mL과 프리 글리세롤 시약(free glycerol reagent) 800 μL를 혼합하여 37℃ 핫 플레이트(hot plate)에서 10분간 반응시킨 후 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 글리세롤 함량은 유리글리세롤을 표준시약으로 사용한 표준곡선을 작성함으로써 측정하였고, 단백질 함량은 BSA를 표준시약으로 사용하여 측정하였다.
중성지질 함량을 측정하기 위해서 'Triglyceride Quantification colorimetric kit(BioVision Inc. Milpitas Blvd., Milpitas, CA USA)'를 이용하였다. 지방세포에 제조예 1 내지 2 또는 실시예 1을 80 μg/mL로 처리하고 72시간 후에 지방세포를 거두었고, 5% NP-40이 들어있는 증류수로 세포를 용균(lysis)시켰다. 그리고 80~100℃에서 2~5분간 끓여주고, 급속냉각을 시킨 후, 원심분리하여 상층액 분리 후 증류수로 10배 희석하여 시험용액을 준비하였다. 시험용액과 표준시약을 96 웰 플레이트(well plate)의 각 웰(well)에 분주하고 어세이 버퍼(assay buffer)로 전체용량을 50 μL로 맞춰 준 다음 리파아제(lipase) 시약을 각 웰(well) 마다 2 μL씩 분주하고 잘 섞어 준 다음 20분간 실온에 방치하였다. 20분 후 리액션 믹스(reaction Mix)를 50 μL씩 각 웰(well)마다 분주한 다음 30~60분간 실온 방치하고 570 nm파장에서 흡광도를 측정하였다.
측정한 결과는 도 2와 도 3에 나타내었으며, 실험군 간의 유의차는 ANOVA분석을 사용하였고, 유의성 평가는 p<0.05로 하였다.
도 2에 나타난 글리세롤 측정결과 대조군 보다 제조예 1 내지 2와 실시예 1군 모두 글리세롤 분비량이 높았으며, 특히 단일 추출물보다 복합물이 같은 농도에서 더 높은 글리세롤 분비량을 나타내고 있어 지방분해에 더 효과적이라는 것을 알 수 있었다.
도 3에 확인된 세포내 중성지질의 경우 대조군과 비교하였을 때 제조예 1 내지 2와 실시예 1군 모두 낮은 중성지질 함량을 보였으며, 특히, 단일 추출물 각각의 효과보다 복합물의 경우, 같은 농도에서 더 효과적으로 낮은 중성지질 함량을 확인할 수 있었다.
[실험예 3: 본 발명의 복합물이 지방세포내 지방합성효소와 지방분해효소의 유전자 발현 측정]
본 실험예에서는 본 발명의 복합물이 지방세포내 지방합성효소인 FAS(fatty acid synthetase)와 지방축적효소인 LPL(lipoprotein lipase), 지방분해효소인 PKA(protein kinase A), HSL(hormone sensitive lipase)의 유전자 발현을 측정하기 위하여 RT-PCR(Real-time PCR)로 분석하였다.
지방세포에 제조예 1 내지 2 또는 실시예 1을 각각 80 μg/mL로 처리하고 72시간 후에 지방세포를 거두었다. 지방세포로부터 총 RNA의 추출은 'RNeasy lipid tissue mini kit(QIAGEN sciences, Maryland, USA)'와 제조사에서 제공하는 방법을 이용하여 추출하였다. cDNA 합성은 각 시료에 대하여 1 μL의 RNA를 이용하여 'iScript cDNA Synthesis Kit(Bio-Rad Laboratories, Inc., CA, USA)'로 합성하였다. 유전자들의 발현을 측정하기 위하여 'SUBR Green(iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, Inc., CA, USA))'을 이용하였고, 'one step real-time PCR(Applied biosystems)'을 사용하였다. 모든 유전자의 PCR 산물의 크기는 100 bp 내외로 하였고, Tm(melting temperature)은 54℃ 부근으로 디자인 하였다. 각각의 유전자에 대한 PCR 프라이머(PCR primer)의 염기서열은 표 2와 같다. 리얼타임 PCR (Real-time PCR) 반응은 총 20 μL내에 cDNA 1 μL와 10 μL의 2X SYBR mix, 프라이머(primer)는 각각 100 pmol/μL를 1 μL씩 첨가하였고, 나머지는 증류수로 채워 주었다. 모든 유전자에 대하여 PCR 증폭 단계는 다음과 같고 증폭 사이클(cycle)은 40 사이클(cycle)을 실시하였다. 핫 스타트(hot start)를 위해 95℃에서 10분, 증폭단계의 변성(denaturation)을 95℃에서 2초, 어닐링(annealing)을 60℃에서 6초, 연장(extension)을 72℃에서 10초간 반복하며, 각 사이클(cycle)의 연장(extension) 후에 형광 값이 기록되었다. 모든 사이클(cycle)이 완료된 후 프라이머(primer)의 특이성을 확인하기 위해 멜팅 커브(melting curve)분석을 실시하였다. 결과의 분석은 'applied biosystems'에서 제공하는 'one step system software v2.1'로 분석하였다.
측정한 결과는 도 4에 나타내었으며, 실험군 간의 유의차는 ANOVA분석을 사용하였고, 유의성 평가는 p<0.05로 하였다.
| 유전자(Gene) | 프라이머 서열(Primer sequences) |
| LPL | F 5'-CAA GAT TCA CTT TTC TGG GAC TGA-3' |
| R 5'-GCC ACT GTG CCG TAC AG AGA-3' | |
| FAS | F 5'-GAA GTG TCT GGA CTG TGT CAT TTT TAC-3' |
| R 5'-TTA ATT GTG GGA TCA GGA GAG CAT-3' | |
| PKA | F 5'-TTC ACT CAG AGC CGC TTA AGG-3' |
| R 5'-CTC TAT CCG AAG TAT TGC TGC TAC CT-3' | |
| HSL | F 5'-CAC TAG TCC CTC CCC CAG TTT-3' |
| R 5'-AGC TGG CAC AGC AGG TCT GT-3' | |
| GAPDH |
F 5'-CAT GGC CTT CCG TGT TCC TA-3' |
| R 5'-GCG GCA CGT CAG ATC CA-3' |
도 4에 나타난 LPL과 FAS 발현량 측정 결과, 분화 유도 하지 않은 일반 전지방세포를 일반군으로 하여 일반군에서 측정된 유전자 발현량을 1로 정하였다. 분화유도를 마친 대조군의 지방세포내 LPL과 FAS 발현량이 높아졌으며, 제조예 1 내지 2 또는 실시예 1군은 대조군보다 낮은 발현량을 나타내었다. 이와 같은 결과로부터, 복합물이 지방세포내 지방합성 및 지방축적 저해 효과를 나타내고 있음을 확인 할 수 있었으며, 단일추출물 각각의 효과보다 복합물이 같은 농도에서 더 높은 효과를 보이고 있음을 알 수 있었다.
도 5에서 볼 수 있듯이, PKA와 HSL의 발현량을 측정한 결과, 분화유도하지 않은 일반 전지방세포를 일반군으로 하여 일반군에서 측정된 유전자 발현량을 1로 정하였다. PKA의 경우, 분화유도를 마친 대조군에서의 발현량은 일반군과 비교하여 현저히 낮아졌지만, 제조예 1 내지 2 또는 실시예 1에 의해 발현량이 증가하는 것이 확인됐었다. HSL의 경우, 대조군에서의 발현량이 일반군과 비교하여 비슷한 수준을 나타내었지만, 제조예 1 내지 2 또는 실시예 1에 의해 발현량이 증가하는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과로부터 복합물이 지방세포내 지방분해 효소의 발현량을 증가시켜 지방분해효과를 나타내고 있음을 확인할 수 있었으며, 단일추출물 각각의 효과보다 복합물이 같은 농도에서 더 높은 효과를 보이고 있음을 알 수 있었다.
[실험예 4: 본 발명의 복합물이 비만유도된 마우스의 체중변화에 미치는 영향 확인]
본 실험예에서는 복합물이 고지방식이로 유도된 비만 마우스의 체중변화에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.
실험동물은 ㈜새론바이오로부터 찰스 리버(Charles river) 실험동물 회사의 생후 6주령의 수컷 C57BL/6J mice(n=56) 마우스를 구입하여 일주일 동안 설치류 사육실에서 일반식이(AIN 93G; D10012G)를 공급하며 적응시킨 후 적응기간 중 일반 상태를 관찰하여 건강한 개체를 선택하여 무작위법으로 군 분리를 실시하였다. 7마리씩 5군으로 분류하여 12주간 사육이 진행되었고, 실험군의 분류와 실험식이 조성은 표 3과 같다.
| (n=7/group) | |
| 실험군 | 실험식이 |
| 일반군 | 일반식이(AIN93G) |
| 대조군 | 고지방식이(60% 지방) |
| 제조예 1 150 mg/kg | 고지방식이(60% 지방) + 가자나무열매추출물 0.12% |
| 제조예 2 150 mg/kg | 고지방식이(60% 지방) + 암라추출물 0.12% |
| 실시예 1 150 mg/kg | 고지방식이(60% 지방) + 복합물 0.12% |
사육환경은 온도 23℃, 습도 50%에서 라이트 사이클(light cycle)이 12시간으로 유지되게 하였다. 실험기간동안 식이와 음용수는 자유롭게 섭취하도록 하였고, 1주일에 두 번씩 일정한 시간에 체중과 식이섭취량을 측정하였다. 식이효율(food efficiency ratio; FER)은 실험식이 공급일로부터 희생일까지 총 실험기간동안의 체중 증가량을 실험기간동안의 식이 섭취량을 나누어 산출하였다. 측정한 체중 결과는 표 4에 나타내었으며, 체중 증가량은 도 6에 나타내었다. 실험군 간의 유의차는 ANOVA 분석을 사용하였고, 유의성 평가는 p<0.05로 하였다.
| Initial body weight(g) |
Final body weight(g) |
Weight gain (g/12weeks) |
Food intake (g/day) |
FER | |
| 일반군 | 22.33±1.021a | 33.51±3.165c | 11.19±2.417d | 3.28±0.461a | 2.89±0.625d |
| 대조군 | 22.47±1.267a | 50.10±0.316a | 27.03±1.417a | 3.04±0.313bc | 7.32±0.528a |
| 제조예 1 | 22.07±1.370a | 42.33±6.333b | 23.40±2.825b | 3.10±0.460ab | 5.66±2.126b |
| 제조예 2 | 22.77±1.083a | 42.70±4.008b | 20.23±3.354bc | 2.79±0.289d | 5.52±1.790bc |
| 실시예 1 | 22.93±0.709a | 42.30±1.200b | 19.13±2.003c | 2.88±0.287cd | 7.03±1.001ab |
실험 결과, 고지방식이에 의해 비만을 유도한 대조군은 일반군보다 높은 체중을 보였다. 대조군과 비교하여 제조예 1 내지 2 및 실시예 1군에서는 그보다 낮은 체중을 보였으며, 그 효과는 단일 추출물 각각의 효과보다 복합물로 했을 때 더 효과가 크게 나타나 더 낮은 체중증가량을 확인할 수 있었다. 이상의 결과로부터 본 발명의 복합물이 뛰어난 체중 감소 효과를 보이고 있음을 확인할 수 있었다.
[실험예 5: 본 발명의 복합물이 비만유도된 마우스의 혈중 아디포넥틴 변화에 미치는 영향 확인]
실험동물의 실험식이 공급이 끝난 후, 희생일 전 12시간 절식시킨 후 이소푸루란(isofluorane)으로 마취하고 간정맥을 통해 채혈하였다. 혈액은 원심분리(14,000 rpm, 20분, 4℃)하여 혈청과 혈장으로 분리한 후 분석하였다.
분리한 혈청의 아디포넥틴은 'R&D system Quantikine ELISA kit (Bio-Techne co. Minneapolis, MN, USA)'를 사용하여 분석하였다. 혈청 샘플을 'calibrator diluent RD5-26 '시약으로 2000배 희석하여 실험에 사용하였다. 96 웰플레이트(well plate)의 각 웰(well)에 어세이 딜루언트(assay diluent) RD1W를 50 μL씩 분주하였고 각 샘플과 표준시약을 50 μL씩 분주한 후 1분간 가볍게 흔들어 주었다. 96 웰 플레이트(well plate) 위를 코팅 해 준 다음 3시간 동안 실온에 방치하였고, 워시 버퍼(wash buffer)로 각 웰(well)당 400 μL씩 분주하여 총 5번 세척해 주었다. 그 다음 각 웰(well) 마다 아디포넥틴 컨주게이트(adiponectin conjugate) 시약을 100 μL씩 분주하여 1시간 실온 방치를 하였고, 워시 버퍼(wash buffer)로 총 5번 세척 해준 후 각 웰(well) 마다 기질 용액(substrate solution) 100 μL씩 분주하여 빛을 차단한 상태로 30분간 실온에 방치하였다. 각 웰(well) 마다 멈춤 용액(stop solution)을 100 μL씩 분주하고 450 nm파장에서 흡광도를 측정하였다. 측정 결과는 도 7에 나타내었으며, 실험군 간의 유의차는 ANOVA 분석을 사용하였고, 유의성 평가는 p<0.05로 하였다.
도 7에서 확인된 혈중 아디포넥틴은 일반군과 비교하여 비만 유도된 대조군에서 함량이 낮아졌으며, 단일 추출물인 제조예 1 내지 2에 의해 그 함량의 차이가 나타나지 않았지만 복합물인 실시예 1군에서 그 함량이 유의적으로 증가된 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 6: 본 발명의 복합물이 비만유도된 마우스의 지방조직내 지방합성효소와 지방분해효소의 유전자 발현 측정]
상기 실험동물의 실험식이 공급이 끝난 후, 희생일에 채혈을 한 후 즉시 개봉하여 장기 및 지방조직을 적출 한 다음 생리식염수로 세척하여 여과지로 수분을 제거한 후 중량을 측정하고 분석 전까지 70℃에 냉동 보관하였다.
지방조직에서 지방대사 관여효소의 발현을 확인하기 위해 RT-PCR을 실시하였다. 각 군별로 QIAzol 용균 시약(lysis reagent) 1 mL에 보관해 둔 내장지방조직 100 mg 정도를 균질화 하여 클로로폼(chloroform) 시약을 200 μL 분주 후 15초간 볼텍싱(vortexing) 해주었다. 12,000 g, 4℃에서 15분간 원심분리 해주었고, 상층액을 새로운 튜브에 옮겨준 후 'RNasy lipid tissue mini kit'와 제조사에서 제공하는 방법을 이용하여 RNA를 추출하였다. cDNA 합성은 각 시료에 대하여 1μL의 RNA를 이용하여 'iScript cDNA synthesis kit'로 합성하였다. 유전자들의 발현을 측정하기 위하여 SYBR Green을 이용하였고, 'one step real-time PCR'을 사용하였다. 모든 유전자의 PCR 산물의 크기는 100 bp내외로 하였고, Tm은 54℃ 부근으로 디자인하였다. 각각의 유전자에 대한 피씨알 프라이머(PCR primer)의 염기서열은 표 2와 같다. 리얼타임 PCR(real-time PCR) 반응은 총 20 μL 내에 cDNA 1μL와 10 μL의 2X SYBR mix, 프라이머(primer)는 각각 100 pmol/μL를 1 μL씩 첨가하였고, 나머지는 증류수로 채워 주었다. 모든 유전자에 대하여 PCR 증폭 단계는 다음과 같고 증폭 사이클(cycle)은 40 사이클(cycle)을 실시하였다. 핫 스타트(hot start)를 위해 95℃에서 10분, 증폭단계의 변성(denaturation)을 95℃에서 2초, 어닐링(annealing)을 60℃에서 6초, 연장(extension)을 72℃에서 10초간 반복하며, 각 사이클(cycle)의 연장(extension)후에 형광 값이 기록되었다. 모든 사이클(cycle)이 완료된 후 프라이머(primer)의 특이성을 확인하기 위해 멜팅 커브(melting curve)분석을 실시하였다. 결과의 분석은 'applied Biosystems'에서 제공하는 'one step system software v2.1'로 분석하였다.
측정한 결과는 도 8과 도 9에 나타내었으며, 실험군 간의 유의차는 ANOVA분석을 사용하였고, 유의성 평가는 p<0.05로 하였다.
도 8에 나타난 LPL과 FAS 발현량 측정 결과, 비만유도 하지 않은 일반 마우스를 일반군으로 하여 일반군에서 측정된 유전자 발현량을 1로 정하였다. 비만 유도된 대조군의 지방조직내 LPL과 FAS 발현량이 높아졌으며, 제조예 1 내지 2 또는 실시예 1군은 대조군보다 낮은 발현량을 나타내었다. 이와 같은 결과로부터, 복합물이 지방조직내 지방합성 및 지방축적 저해 효과를 나타내고 있음을 확인 할 수 있었으며, 단일추출물 각각의 효과보다 복합물이 같은 농도에서 더 높은 효과를 보이고 있음을 알 수 있었다.
도 9에 나타난 PKA와 HSL의 발현량을 확인한 결과, 일반 마우스를 일반군으로 하여 일반군에서 측정된 유전자 발현량을 1로 정하였다. PKA의 경우 대조군에서의 발현량은 일반군과 비교하여 현저히 낮아졌지만, 제조예 1 내지 2 또는 실시예 1에 의해 발현량이 증가하는 것이 확인되었다. HSL의 경우 대조군에서의 발현량이 일반군과 비교하여 더 높은 수준을 나타내었으며, 단일추출물인 제조예 1 내지 2군은 대조군과 비슷한 발현량을 확인하였다. 그러나 복합물인 실시예 1군은 유의적으로 증가된 발현량을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과로부터 복합물이 비만유도된 마우스의 지방조직내 지방분해 효소의 발현량을 증가시켜 지방분해효과를 나타내고 있음을 확인할 수 있었으며, 단일추출물 각각의 효과보다 복합물이 같은 농도에서 더 높은 효과를 보이고 있음을 알 수 있었다.
[실험예 7: 본 발명의 복합물이 비만유도된 마우스의 복부전체지방 부피 CT 측정]
상기 실험동물의 복부 마이크로-CT(micro-CT)는 ㈜노터스 실험기관에서 전문가에 의한 촬영을 진행했었고, 다이렉트-TV(Direct-TV)로 전체 지방 부피를 촬영하였으며, 다이렉트-BV(Direct-BV)로 내장지방부피를 촬영하여 수치화 하였다. 측정 결과는 도 10에 나타내었으며, 실험군 간의 유의차는 ANOVA 분석을 사용하였고, 유의성 평가는 p<0.05로 하였다.
실험결과 일반군의 복부전체지방 부피보다 비만유도된 대조군의 복부전체지방 부피가 현저히 증가하였으며, 제조예 1 내지 2 또는 실시예 1을 섭취한 군의 복부전체지방 부피는 대조군보다 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다. 게다가, 단일추출물보다 복합물을 섭취하였을 때 그 감소량이 현저히 증가된 것이 확인되었다.
[실험예 8: 본 발명의 복합물이 비만유도된 마우스의 혈중 지질 변화에 미치는 영향 확인]
본 실험예에서는, 본 발명의 복합물 섭취가 혈중 지질에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 혈중 중성지질, 총 콜레스테롤, LDL-콜레스테롤 비율을 측정하였다.
상기 실험 동물에서 분리한 혈청을 이용하여 중성지질, 총콜레스테롤, LDL-콜레스테롤은 'enzyme assay kit(BioVision Inc. Milpitas Blvd., Milpitas, CA, USA)'것을 사용하여 분석하였다. 중성지질의 경우 96 웰 플레이트(well plate)에 각 혈청 샘플과 표준시약을 5 μL씩 분주하였고, 어세이 버퍼(assay buffer)로 총용량을 50 μL로 맞춰 준 다음, 리파아제(lipase) 시약을 각 웰(well) 마다 2 μL씩 분주하고 잘 섞어 준다음 20분간 실온에 방치하였다. 20분 후 리액션 믹스(reaction mix)를 50 μL씩 각 웰(well) 마다 분주 한 다음 30~60분간 실온에 방치하였고, 570 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
총 콜레스테롤의 경우, 혈청 샘플 전체를 사용하였다. LDL-콜레스테롤의 경우, 혈청을 2X 침전 버퍼(precipitation buffer)를 이용하여 1:1로 희석하여 실온에 10분 방치한 다음, 원심분리기를 이용하여 상층액을 제외한 나머지 샘플 부분을 분리하여 실험을 진행하였다. 분리된 샘플과 표준시약을 5 μL씩 96 웰 플레이트(well plate)의 각 웰(well) 마다 분주하였고, 어세이 버퍼(assay buffer)로 총용량을 50 μL로 맞춰 주었다. 그 다음 리액션 믹스(reaction mix)를 50 μL씩 각 웰(well)마다 분주하였고, 약 60분간 37℃에 방치한 후 570 nm파장에서 흡광도를 측정하였다. 측정결과는 도 11과 도 12에 나타내었으며, 실험군 간의 유의차는 ANOVA 분석을 사용하였고, 유의성 평가는 p<0.05로 하였다.
도 11에서 확인된 혈중 중성지질의 경우 일반군보다 비만유도된 대조군에서 훨씬 높은 함량이 측정되었으며, 제조예 1 내지 2 또는 실시예 1을 섭취시킨 군에서는 일반군과 비슷한 함량이 확인 되었다. 이 실험결과를 통해 복합물을 섭취하였을 때 혈중 중성지질이 일반군과 유사한 정도로 감소될 수 있음을 알 수 있었다.
도 12에서 확인된 총콜레스테롤과 LDL-콜레스테롤의 경우 일반군보다 비만유도된 대조군에서 훨씬 높은 함량이 측정되었으며, 제조예 1 내지 2 또는 실시예 1을 섭취시킨 군에서는 대조군과 비교하여 감소되는 것을 확인할 수 있었으며, 제조예 2 또는 실시예 1의 경우는 일반군과 비슷한 수준까지 감소되었다. 이 실험결과를 통해 복합물을 섭취하였을 때, 혈중 총 콜레스테롤과 LDL-콜레스테롤 모두 감소되었으며, 단일추출물보다 복합물로 하였을때, 그 효과가 더 증대되고 있음을 알 수 있었다.
[실시예 2: 체지방 생성 및 축적 저해효과, 혈중 지질 개선 효과를 갖는 식품 조성물의 제조]
본 실시예에서는 하기와 같이 체지방 생성 및 축적 저해효과, 혈중지질개선효과를 갖는 식품 조성물을 제조하였다.
(1)선식 제조
현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 mesh의 분말로 준비하였다. 검정콩, 검정깨 및 들깨 각각을 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 후 배전 및 분쇄하여 입도 60 mesh의 분말로 준비하였다. 이후, 현미 30 중량%, 율무 15 중량%, 보리 20 중량%, 찹쌀 9 중량%, 들깨 7중량%, 검정콩 8중량%, 검정깨 7중량%, 복합물(실시예 1) 3중량%, 영지 0.5중량% 및 지황 0.5중량%를 혼합하여 선식을 제조하였다.
(2)건강음료 제조
꿀 0.26 중량%, 치옥토산아미드 0.0002 중량%, 니코틴산아미드 0.0004 중량%, 염산리보플라빈나트륨 0.0001 중량%, 염산피리독신 0.0001 중량%, 이노시톨 0.001 중량%, 오르트산 0.002 중량%, 물 98.7362 중량% 및 복합물(실시예 1) 1 중량%를 배합하여 통상의 방법으로 건강음료를 제조하였다.
(3)건강보조식품 제조
복합물(실시예 1) 50중량%, 구아검효소 분해물 16 중량%, 비타민 B1 염산염 0.01중량%, 비타민 B6 염산염 0.01중량%, DL-메티오닌 0.23중량%, 스테아린산 마그네슘 0.7중량%, 유당 31.2중량% 및 옥수수전분 1.85중량%를 배합하여 통상의 방법으로 정제형 건강보조식품을 제조하였다.
Claims (6)
- 가자나무열매추출물 70중량% 및 암라추출물 30중량%로 조성된 복합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 비만 개선용 식품 조성물.
- 가자나무열매추출물 70중량% 및 암라추출물 30중량%로 조성된 복합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 고지혈증 개선용 식품 조성물.
- 삭제
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 가자나무열매추출물 또는 암라추출물은,
추출용매로 물 또는 탄소수가 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나를 추출 용매로 사용하여 추출된 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
- 가자나무열매를 열수추출한 후 분무건조하여 가자나무열매추출분말을 수득하는 단계;
암라열매를 열수추출한 후 분무건조하여 암라추출분말을 수득하는 단계; 및
상기 가자나무열매추출분말 및 암라추출분말을 7 : 3의 중량비로 혼합하여 복합물을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 비만 개선용 식품 조성물의 제조방법.
- 가자나무열매를 열수추출한 후 분무건조하여 가자나무열매추출분말을 수득하는 단계;
암라열매를 열수추출한 후 분무건조하여 암라추출분말을 수득하는 단계; 및
상기 가자나무열매추출분말 및 암라추출분말을 7 : 3의 중량비로 혼합하여 복합물을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 고지혈증 개선용 식품 조성물의 제조방법.
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