KR101158856B1

KR101158856B1 - 콩잎 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 비만, 고지혈증, 동맥경화, 지방간, 당뇨 또는 대사증후군의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101158856B1
Application number: KR1020090041321A
Authority: KR
Inventors: 정태숙; 이우송; 박기훈; 최명숙; 박호용; 한종민
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2009-05-12
Filing date: 2009-05-12
Publication date: 2012-06-25
Anticipated expiration: 2029-05-12
Also published as: US20100291248A1; US9381222B2; KR20100122333A

Abstract

본 발명은 콩잎 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 비만, 고지혈증, 동맥경화, 지방간, 당뇨 또는 대사증후군의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 콩잎을 물, 유기용매 또는 이의 혼합용매로 추출한 콩잎 추출물 또는 이의 유기용매 분획물은 콜레스테롤 아실 전이효소(ACAT)의 활성 및 지질단백질-결합 포스포리파아제 A₂(Lp-PLA₂)의 활성을 효과적으로 억제하고, 고지방식이에 의한 체지방 크기 증가를 억제하고, 혈중 및 간의 콜레스테롤 및 중성지방 증가를 억제하며, 대동맥동의 병변크기 및 동맥 병변에 대식세포의 침착을 억제하고, 비만, 동맥경화와 관련되는 유전자의 발현을 조절할 수 있으므로, 이와 관련되는 비만, 고지혈증, 동맥경화, 지방간, 당뇨 또는 대사증후군의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

콩잎 추출물, 비만, 고지혈증, 동맥경화, 지방간, 당뇨, 대사증후군

Description

콩잎 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 비만, 고지혈증, 동맥경화, 지방간, 당뇨 또는 대사증후군의 예방 또는 치료용 조성물{Compositions for the prevention and treatment of obesity, hyperlipidemia, atherosclerosis, fatty liver, diabetes mellitus or metabolic syndrome comprising extracts or fractions of Glycine max leaves as an active ingredient}

본 발명은 콩잎 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 비만, 고지혈증, 동맥경화, 지방간, 당뇨 또는 대사증후군의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

현대인의 만성질환 중의 하나인 비만은 산업화와 소득 수준 향상에 따른 식습관 및 생활습관 변화로 전세계적으로 가장 심각한 건강 문제의 하나로 대두되고 있으며, 1996년에는 세계보건기구(WHO)에 의하여 질병으로 규정되었다. 또한, 비만은 당뇨, 고혈압, 고지혈증, 심장병 등의 성인병과 각종 암 유발에 직?간접적으로 연관되어 있는 것으로 알려지고 있다.

현재까지 알려진 비만 치료제의 작용기전으로는 식욕억제, 열대사촉진, 이뇨 제, 소화억제, 호르몬 조절 등이 있다. 이 중 가장 많이 사용되는 비만 치료제인 리덕틸(Reductil^TM, 애보트사, 미국)은 식욕억제제로서 미국에서 한 해 1억불 이상의 시장을 형성하고 있다. 그러나 비만 치료용 식욕억제제는 혈압상승, 의존성 설사, 변비, 불면, 불안 등의 부작용을 나타내므로, 비만을 억제하기 위하여 오랜 세월 동안 안전성과 생리기능이 검증된 여러 식품 소재의 이용에 대한 관심이 크게 높아지고 있다. 현재 비만인을 위한 건강식품으로 식이섬유, 생약제 및 여러 식품 소재를 함유하는 제품들이 개발되고 있으나, 식사량을 줄이고 상기 건강식품들을 섭취할 경우 여러 영양소의 부족으로 정상적인 생활이 어렵고, 복용을 중단하면 빠르게 다시 비만해지는 것으로 알려져 있다. 따라서 부작용을 줄이고 장기복용시에도 안전성이 우수한 비만의 예방 및 치료제의 개발이 절실히 요구된다.

또한, 최근 성인병 증가와 더불어 동맥경화 등의 혈관장애 질환이 크게 증가하고 있다. 대표적인 혈관장애 질환으로서 동맥경화는 동맥벽에 지질과 섬유질 요소가 축적되어 진행되는 염증성 질환으로서, 고혈압, 흡연, 비만, 혈장 저밀도 지질 단백질(low-density lipoprotein: LDL)의 증가 등이 그 주요 원인이다. 상기 동맥경화는 뇌동맥 또는 관상동맥에서 일어나기 쉬우며, 이로 인하여 심장질환, 뇌혈관 질환 등의 순환계 질환으로 발전하게 된다.

아실 코에이: 콜레스테롤 아실전이효소(acyl-CoA: cholesterol acyltransferase; ACAT)는 일반적으로 콜레스테롤을 에스테르화하여 세포 내에 콜 레스테롤을 축세포내에서 ACAT는 콜레스테롤을 그의 에스테르 형태로 전환시켜 세포내에 콜레스테롤이 축적되는 것을 촉진하는 역할을 한다. 일반적으로 사람의 ACAT는 사람 ACAT-1 및 사람 ACAT-2가 있는데, 사람 ACAT-1(50 kDa)은 성인의 간, 부신, 대식세포, 신장에서 주로 작용하며, 사람 ACAT-2(46 kDa)는 소장에서 작용한다(Curr. Opin. Lipidol 12: 121-127, 2001). 사람 ACAT 활성을 저해하는 물질은 음식으로부터 유입되는 콜레스테롤의 흡수를 억제하고, 혈관내벽에 콜레스테릴 에스테르의 축적을 억제하는 기작을 통해 고콜레스테롤증, 콜레스테롤 결석 또는 동맥경화 예방 및 치료제의 표적이 되고 있다(Nature Med. 6, 1341-1347, 2000).

Lp-PLA₂는 고콜레스테롤증 환자에서 관상동맥질환의 독립적인 위험요인으로서, 염증전구체(pro-inflammatory agent)로 제안되고 있으며, 동맥병변(atherosclerosis lesion)의 대식세포에서 발견되었다(Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 19: 2909-2971, 1999). 최근 연구에서 Lp-PLA₂ 저해제의 투여로 동맥경화 모델동물인 와타나베 유전성 과지질 토끼(Watanabe heritable hyperlipidemic rabbit)의 지방선(fatty streak) 생성이 현저하게 감소되었는바(Atherosclerosis, 151: 166, 2000),이로부터 Lp-PLA₂의 활성저해가 동맥경화 예방 및 치료의 타겟으로 주목받고 있다(N. Engl. J. Med. 343: 1148-1155, 2000).따라서 Lp-PLA₂저해제 개발연구는 동맥경화 예방 및 치료에 매우 중요할 것으로 사료된다.

나아가, 대사증후군(metabolic syndrome)은 인슐린저항성증후군(insulin resitance syndrome)으로도 알려져 있으며, 비만, 제2형 당뇨병, 고혈압, 고중성지방혈증, 고콜레스테롤혈증, 동맥경화와 같은 질환과 밀접한 연관성이 있다. 현재, 대사증후군의 발생률은 전 세계적으로 증가하여 중요한 보건의료상의 문제로 대두되고 있다. 2005년 국민건강 영양조사 자료에 의하면 대사증후군 유병률(30세 이상)은 전체적으로 32.3% (남자 32.9%, 여자 31.8%)이었으며, 이로부터 발병되는 심장질환과 뇌졸중이 한국인 사망원인의 2. 3위를 차지하고 있어, 대사증후군의 제어기술 개발로 이들 질환의 발병률을 조속히 개선할 필요가 있다. 특히, 대사증후군의 사회적인 관심이 되고 있는 이유는 합병증으로 동맥경화에 의한 다양한 혈관질환을 유발하여 환자들의 조기사망과 함께 환자들의 삶의 질이 저하되는 결과를 초래하기 때문이다. 따라서, 급증하는 대사증후군을 조기 발견하여 치료하고, 더 나아가서 예방하는 것은 매우 중요하다.

콩 또는 대두(Glycine max (L.) Merr.)는 아시아, 아프리카, 오스트레일리아 등지에 널리 분포하는 콩목 콩과의 한해살이풀로 식용작물로 널리 재배하고 있다. 콩은 단백질과 지질의 함량이 풍부하며, 생리활성물질을 다량 함유하고 있어 관상심장질환, 유방암, 전립선암, 대장암 등의 발병을 억제하며, 골다공증, 호르몬 관련 질환, 고지혈증, 동맥경화 억제 등 성인병 예방에 대한 많은 연구가 알려져 있다. 한편, 콩뿌리는 한방 및 민간요법에서 사용되는 약용식물로서, 이를 사용한 종래기술로는 대한민국 등록특허 제500641호에 개시된 모발재생용 식품, 대한민국 특허출원 제2001-0034791호에 개시된 여드름 피부 및 지루성 피부의 관리를 위한 조 성물, 대한민국 특허출원 제2000-7014485호에 개시된 골다공증 및 폐경기 증후군 치료제, 대한민국 등록특허 제806226호와 제758265호에 개시된 콩뿌리 추출물 또는 이로부터 분리된 폴리페놀계 화합물 또는 트리터페노이드계 화합물을 유효성분으로 하는 심혈관계 질환의 예방 및 치료용 조성물이 있다.

한편, 콩잎은 3개, 혹은 5개의 작은 잎으로 되어 있고, 어긋나며 짧은 털로 덮여 있다. 상기 콩잎은 콩잎장아찌와 콩잎김치의 형태로 경상도 지역에서 주로 애용되는 향토음식으로 섭취된다. 최근 콩잎의 성분들에 대한 연구가 많이 진행되고 있는데, 표 1에 나타낸 바와 같이, 콩잎의 함유성분이 콩 또는 콩뿌리와는 많이 다른 것으로 나타났다(Agric. Chem. Biotechnol. 49: 51-55, 2006; J. Agric. Food Chem. 54. 2057-2063, 2006; Bull. Kor. Chem. Soc. 29: 615-619, 2008; Phytochemistry 20: 795-798, 1981; Chem. Pharm. Bull. 45: 1593-1595, 1997; Can. J. Bot. 53: 219-224, 1975; Plant Physiol. 68: 358, 1981; Phytochemistry 23: 1204, 1984; Phytochemistry 37: 1413, 1994; Phytochemistry 23: 1153, 1984; Chem. Pharm. Bull. 33: 589, 1985; Agric. Biol. Chem. 155: 315-332, 1991; Phytochemistry 34: 1351-1356, 1993; Chem. Pharm. Bull. 44: 1222, 1996; J. Nat. Prod. 62: 853-858, 1999; Phytochemistry 26: 1214-1215, 1987.).

배당체 화합물	콩잎	콩	콩뿌리
Daidzein (4',7-dihydroxyisoflavone)	○	○	○
Genistein (4',5,7-trihydroxyisoflavone)	○	○	○
Genistin (4',5,7-Trihydroxyisoflavone-7-O-β-D-glucopyranoside)	○	○	ND
Glycitein (4',7-Dihydroxy-6-methoxyisoflavone)	○	○	○
6'-O-malonyldaidzin	○	○	ND
6'-O-malonylgenistin	○	○	ND
Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-β-D-glucopyranosyl(1→6)-β-D-galactopyranoside	○	ND	ND
Kaempferol-3-O-(2,6-di-O-α-rhamnopyranosyl)-β-galactopyranoside	○	ND	ND
Kaempferol-3-O-digalactopyranoside	○	ND	ND
Kaempferol-3-O-diglucopyranoside	○	ND	ND
Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→6)-β-D-galactopyranoside	○	ND	ND
Kaempferol-3-O-rutinoside	○	ND	ND
3',4',5,7-tetrahydroxyflavone	○	ND	ND
3',4',5-trihydroxyflavone-7-O-β-D-glucopyranoside	○	ND	ND
3',4',5,7-tetrahydroxyflavonol	○	ND	ND
coumestrol	○	○	ND
glyceofuran	○	○	ND
4-hydroxybenzoic acid	○	ND	ND
methyl-4-hydroxybenzoate	○	ND	ND
soysapogenol B	○	ND	ND
stigmasterol	○	○	ND
D-mannitol	○	ND	ND
5,7,4'-trihydroxyflavone	○	ND	ND
Isoformononetin (4′-Hydroxy-7-methoxyisoflavone)	○	ND	ND
3-O-[α-L-Rhamnopyranosyl-(1→2) -[β-D-glucopyranosyl-(1→6)]-β-D-glucopyranoside]	○	ND	ND
Fluorocitric acid	○	ND	ND
* ND: 측정불가

또한, 일반적으로 콩의 주성분인 이소플라본과 이들의 배당체(Daidzein, Glycitein, Genistein, Genistin, Daidzin, Glycitin)의 함량은 콩>콩뿌리>콩잎(90일 이상 재배 후 수확)의 순으로 현저하게 감소하는 것으로 나타났다(J. Agric. Food Chem. 53: 5848-5852, 2005). 따라서 콩잎 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 콩 또는 콩뿌리에 함유된 이소플라본과 이들의 배당체와는 다른 물질로 구성되어 있음을 알 수 있다. 이러한 콩잎은 Kaempferol 배당체가 많이 함유되어 있는데, 상기 Kaempferol 배당체를 포함하는 콩잎의 효능에 대한 연구 결과는 거의 알려져 있지 않다.

이에 본 발명자들은 부작용이 적은 새로운 비만 치료제를 천연물에서 탐색하던 중, 콩잎 추출물 및 이의 분획물이 체지방 크기 증가를 억제하고, 혈중 콜레스테롤, 중성지방, 포도당, 인슐린 및 간독성 지표효소치를 감소시키고, 간조직 내 지방 축적을 억제하고, 심장 대동맥 내에 동맥 병변의 형성을 억제하며, 동맥경화 및 비만 관련 효소 또는 단백질의 활성 및 단백질 유전자의 발현을 조절함으로써, 비만, 고지혈증, 동맥경화, 지방간, 당뇨 또는 대사증후군의 예방 또는 치료에 사용될 수 있음을 알아내고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 콩잎(Glycine max leaves) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 비만, 고지혈증, 동맥경화, 지방간, 당뇨 또는 대사증후군의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 콩잎 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 비만, 고지혈증, 동맥경화, 지방간, 당뇨 또는 대사증후군의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 콩잎을 물, 유기용매 또는 이의 혼합용매로 추출한 콩잎 추출물 또는 이의 유기용매 분획물을 유효성분으로 함유하는 비만, 고지혈증, 동맥경화, 지방간, 당뇨 또는 대사증후군의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 콩잎을 물, 유기용매 또는 이의 혼합용매로 추출한 콩잎 추출물 또는 이의 유기용매 분획물을 유효성분으로 함유하는 비만, 고지혈증, 동맥경화, 지방간, 당뇨 또는 대사증후군의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명에 따른 콩잎 추출물은 또는 이의 분획물은 Kaempferol 배당체를 다 량 포함하고 있으며, 콜레스테롤 아실 전이효소(ACAT)의 활성 및 지질단백질-결합 포스포리파아제 A₂(Lp-PLA₂)의 활성을 효과적으로 억제하고, 고지방식이에 의한 체지방 크기 증가를 억제하고, 혈중 및 간의 콜레스테롤 및 중성지방 증가를 억제하며, 대동맥동의 병변크기 및 동맥 병변에 대식세포의 침착을 억제하고, 비만, 동맥경화와 관련되는 유전자의 발현을 조절할 수 있으므로, 이와 관련되는 비만, 고지혈증, 동맥경화, 지방간, 당뇨 또는 대사증후군의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 콩잎(Glycine max leaves) 추출물 및 이의 유기용매 분획물을 유효성분으로 함유하는 비만, 고지혈증, 동맥경화, 지방간, 당뇨 및 대사증후군 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 콩잎 추출물은

1) 콩잎을 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매로 추출하는 단계; 및

2) 단계 1)의 추출물을 감압농축 및 건조시켜 건조분말을 수득하는 단계를 포함하는 제조 방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나 상기 방법에 한정되지 않는다.

상기 제조 방법에 있어서, 단계 1)에서는 콩잎은 재배한 것 또는 시판되는 것을 제한 없이 사용될 수 있다.

상기 제조 방법에 있어서, 단계 1)의 유기용매는 알코올, 에틸아세테이트 또는 아세토니트릴을 사용할 수 있고, 이때 알코올은 C₁ 내지 C₄ 저급 알코올을 이용하는 것을 특징으로 하며, 상기 저급 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올 또는 이소프로판올인 것을 특징으로 한다. 유기물질은 100% 알코올에서 용출이 더 잘 되고 배당체는 알코올 수용액에서 용출이 더 잘 되므로 필요에 따라 알코올 또는 알코올 수용액으로 선택하여 사용할 수 있다. 특히, 에탄올을 이용하는 경우에는 전분으로부터 제조되는 주정을 이용하는 것이 바람직하다. 추출시 용매를 콩잎 분량의 5 내지 15배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하며, 10배 첨가하여 추출하는 것이 더욱 바람직하다. 상온에서 추출하는 것이 바람직하나 이에 한정하는 것은 아니다. 아울러 추출 회수는 1 내지 5회인 것이 바람직하며, 3회 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 제조 방법에 있어서, 단계 2)의 감압농축 및 건조과정은 당업계에서 사용되는 통상의 방법에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 콩잎 추출물의 분획물은

1) 상기 콩잎 추출물을 유기용매로 용해시키는 단계;

2) 단계 1)의 용해물을 분리하여 분획물을 수득하는 단계; 및

3) 단계 2)의 분획물을 감압농축 및 건조시켜 건조분말을 수득하는 단계를 포함하는 제조 방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나 상기 방법에 한정되지 않는다.

상기 제조 방법에 있어서, 단계 1)의 콩잎 추출물은 상기 기재된 추출물 제조 방법에 따라 제조가 가능하나 이에 한정되지 않는다.

상기 제조 방법에 있어서, 단계 1)의 유기용매는 헥산 및 에틸아세테이트산 순으로 가하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 제조 방법에 있어서, 단계 2)의 분획물은 분별깔대기를 이용하여 분획하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 콩잎 추출물은 또는 이의 분획물은 HPLC 분석을 통해 Kaempferol 배당체를 다량 포함하고 있음을 알 수 있다(표 2 및 도 1~9 참조).

본 발명에 따른 콩잎 추출물은 또는 이의 분획물은 콜레스테롤 아실 전이효소(ACAT) 및 지질단백질-결합 포스포리파아제 A₂(Lp-PLA₂)의 활성 실험에서 콩 추출물 또는 콩뿌리 추출물에 비하여 동등하거나 20~60% 더 높은 저해활성을 나타냈다(표 3 및 표 4 참조). 따라서, 본 발명의 콩잎 추출물 또는 이의 분획물은 ACAT 및 Lp-PLA₂를 효과적으로 저해함으로써 동맥경화의 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있다.

또한, 실험모델동물을 이용하여 정상식이를 섭취하는 음성대조군(ND군), 고지방고콜레스테롤 식이를 섭취하는 대조군(Control군), 및 상기 고지방고콜레스테롤 식이와 본 발명에 따른 콩잎 추출물 또는 이의 분획물을 함께 섭취하는 시험군들로 분리하여 사육한 후 각 동물의 체지방, 간 중량당 총지질량, 혈중 총콜레스테롤, HDL-콜레스테롤, 중성지방, 인지질, 포도당, 인슐린, 간독성 지표인 GOT, GPT의 함량 측정 실험에서, 본 발명에 따른 콩잎 추출물 또는 이의 분획물은 체지방 증가를 억제하고(도 11 및 표 5 참조), 간 중량당 총지질량을 감소시키고(표 6 참조), 혈중 콜레스테롤, 중성지방, 포도당, 인슐린 및 간독성 지표 효소(GOT, GPT)치를 감소시키는 것으로 나타났다(표 7~9 참조). 따라서 본 발명의 콩잎 추출물 또는 이의 분획물은 비만, 지방간 또는 당뇨의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

나아가, 대동맥동의 병변크기 및 동맥 병변에 침착된 대식세포의 양을 측정하는 실험에서, 고지방고콜레스테롤 식이를 섭취하는 대조군(Control군)에 비하여 본 발명에 따른 콩잎 추출물 또는 이의 분획물 투여시 상기 대동맥동의 병변크기 및 동맥 병변에 침착된 대식세포의 양이 유의적으로 감소되었다(표 10 및 11, 도 12 참조). 따라서, 본 발명에 따른 콩잎 추출물 또는 이의 분획물은 항동맥경화 활성을 나타내므로 동맥경화의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

또한, 실험모델동물 중 대조군 및 시험군으로부터 적출한 뇌와 동맥, 간 및 지방조직들의 유전자 발현 양상을 알아보는 실험에서, 본 발명에 따른 콩잎 추출물 또는 이의 분획물은 고지방고콜레스테롤 식이를 섭취하는 대조군(Control군)에 비 하여 간 조직에서 지방산화 및 에너지 소비에 관련된 유전자 및 그들을 촉진시키는 역할을 하는 전사인자의 발현을 증가시키며(도 13 참조), 동맥병변에서 염증반응과 관련이 있는 산화질소 합성효소 및 싸이토카인의 발현을 감소시키고(도 14 참조), 부고환지방 조직에서 지방세포 분화를 촉진하는 유전자의 발현을 감소시키며, 에너지 소비에 관련된 유전자들의 발현을 촉진하는 전사인자 및 지방대사에 관여하여 지방산의 산화를 촉진하고 에너지 발산을 증진시키는 전사인자의 발현을 증가시키며, 지방세포의 이동 및 축적을 억제하고(도 15 참조), 뇌의 포만중추 리셉터(MC4R), 열발생 촉진(TrKB) 및 식욕 억제(PYY) 유전자들의 발현을 증가시키는 것으로 나타났다(도 16 참조).

상기 결과들로 보아, 본 발명에 따른 콩잎 추출물 또는 이의 분획물은 고지방식이에 의한 체지방 크기 증가를 억제하고, 혈중 및 간의 콜레스테롤 및 중성지방 증가를 억제하며, 대동맥동의 병변크기 및 동맥 병변에 대식세포의 침착을 억제하고, 비만, 동맥경화와 관련되는 유전자의 발현을 조절할 수 있으므로, 이와 관련되는 비만, 고지혈증, 동맥경화, 지방간, 당뇨 또는 대사증후군의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 비만, 고지혈증, 동맥경화, 지방간, 당뇨 또는 대사증후군의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약재학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(18th ed., Mack Publishing Company, Easton PA, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 혼합 추출물의 일일 투여량은 500±200 ㎎/㎏이며, 바람직하게는 400±100 ㎎/㎏이고, 하루 1회 내지 3회에 나눠 투여하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 콩잎 추출물 또는 이의 분획물 및 식품학적으로 허용 가능 한 식품 보조 첨가제를 포함하는 식품 조성물을 제공한다.

상기 콩잎 추출물 또는 이의 분획물을 제조하는 방법은 당업계의 통상적인 방법으로 하여 제조할 수 있으며, 상기 기재된 추출물 또는 이의 분획물 제조 방법에 따라 제조가 가능하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 콩잎 추출물 또는 이의 분획물은 비만, 고지혈증, 동맥경화, 지방간, 당뇨 또는 대사증후군의 개선을 목적으로 하는 건강식품에 첨가할 수 있으며, 본 발명의 추출물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 콩잎 추출물 또는 이의 분획물을 혼합하여 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 콩잎 추출물 또는 이의 분획물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안정성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸컬릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아리스크림류를 포함하는 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 식품 보조 첨가제는 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 사용할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에르트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명에 따른 조성물 100 중량부 당 일반적으로 약 0.01~0.04 중량부, 바람직하게는 0.02~0.03 중량부이다.

상기 외에 본 발명에 따른 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 중점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명에 따른 조성물은 천연 과일 주스, 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명에 따른 조성물 100 중량부 당 0.01~0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 다음의 실시예 및 실험예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 콩잎의 추출물 제조

<1-1> 콩잎의 에탄올 추출물

경상남도 진주시에서 대두콩을 파종하여 생유기간이 90일 이후에 수확한 콩잎을 음지에서 건조하였다. 건조된 콩잎 1 kg을 95% 에탄올(주정) 50 L를 가하고 교반하면서 하루 동안 실온에서 추출한 후, 여과지를 사용하여 에탄올 가용부만을 회수하였다. 여과물은 동일한 방법으로 1회 더 반복 실시한 후 에탄올 가용부를 모아 감압농축하여 181 g의 에탄올 추출물을 수득하였다.

<1-2> 콩잎의 열수 추출물

상기의 건조된 콩잎 100 g에 증류수 1 L를 가하고 2 시간 동안 85 ~ 90 ℃에서 추출하였다. 상기 추출을 2회 반복하였다. 상기에서 수득한 추출물을 여과지로 여과하여 침전물을 제거하고 여과액을 수득하였다. 상기 여과액을 감압하에서 농축하여 콩잎 열수 추출물 15.0 g을 얻었다.

<1-3> 콩잎의 메탄올, 에틸아세테이트, 아세토니트릴 및 이소프로판올 추출물

상기 실시예 <1-1>에서 95% 에탄올 대신 80% 메탄올, 100% 에틸아세테이트, 100% 아세토나이트릴 및 100% 이소프로판올을 이용한 것을 제외하고 동일하게 추출 하여 각각 150 g의 메탄올 추출물, 43 g의 에틸아세테이트 추출물, 30 g의 아세토니트릴 추출물 및 116 g의 이소프로판올 추출물을 수득하였다.

< 실시예 2> 콩잎 추출물의 분획물 제조

상기 실시예 <1-1>에서 수득한 콩잎 에탄올 추출물 181 g에 물 500 ml를 가하여 현탁시키고 동량의 헥산을 넣어 물층과 헥산층으로 분리하였다. 물층은 동일한 방법으로 1회 더 반복 실시하여 헥산층을 분리하였다. 같은 방법으로 헥산층을 분리한 물층에 동량의 에틸아세테이트를 넣어 위와 같은 방법으로 분획하고 감압농축하여 헥산 분획물(18 g) 및 에틸아세테이트 분획물(32 g)을 각각 얻었다.

< 실험예 1> 콩잎 추출물의 HPLC 분석

콩잎 추출물의 활성성분을 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

음지에서 건조한 콩잎 분말 1 g을 코니칼튜브 50 ml에 넣고 80% 메탄올 20 ml로 실온에서 6시간 동안 추출한 추출물을 거름종이(No. 6)로 여과 후, HPLC용 0.45 ㎛ 멤브레인 필터로 다시 한번 여과하였다. 이후 추출된 활성성분들을 HPLC(칼럼: Spheri-5 RP-18, 5 mm, 250×4.6 mm; 용매: 아세토니트릴/물[40:60 (v/v)]; 시료: 10 ㎕; 용리속도: 1.0 ml/min; 검출조건: UV 254 nm; HPLC 기기: PE Series 200)와 LC-Mass를 이용하여 분석하여 하기 표 2 및 도 1~9에 나타내었다.

화합물	구조
Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl(12)-β-D-glucopyranosyl(16)-β-D-galactopyranoside
Kaempferol-3-O-(2,6-di-O-α-rhamnopyranosyl)-β-galactopyranoside
Kaempferol-3-O-digalactopyranoside
Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl(16)-β-D-galactopyranoside
Kaempferol-3-O-rutinoside
Genistin
6'-O-Malonylgenistin
6'-Malonylgenistein

표 2 및 도 1~9에 나타낸 바와 같이 콩잎 추출물에는 Kaempferol 배당체가 많이 함유되어 있으며, 일반적인 콩의 주성분인 이소플라본과 이들의 배당체(Daidzein, Glycitein, Genistein, Genistin, Daidzin, Glycitin)의 함량은 매우 적은 것을 알 수 있다.

< 비교예 1> 콩 에탄올 추출물의 제조

콩잎 대신 대두콩 1 kg을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법으로 콩 에탄올 추출물을 제조하였다.

< 비교예 2> 콩뿌리 추출물 및 이의 분획물의 제조

콩잎 대신 콩뿌리 1 kg을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법으로 콩뿌리 에탄올 추출물을 제조하였다.

이후, 수득한 콩뿌리 에탄올 추출물을 이용하여 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 수행하여 콩뿌리 에틸아세테이트 분획물을 제조하였다.

< 실험예 2> 콩잎 추출물의 활성물질 HPLC 분석

음건한 콩잎, 콩뿌리 및 콩줄기 각각 1 g을 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 메탄올 추출하여 HPLC를 이용하여 활성물질 함량을 분석하여 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 콩잎 추출물은 콩뿌리 및 콩줄기 추출물에 비하여 활성물질 함량이 매우 높음을 알 수 있다.

< 실험예 3> ACAT 활성 측정

본 발명에 따른 콩잎 추출물 또는 이의 분획물의 사람 ACAT-1 및 ACAT-2의 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

사람 간 cDNA 라이브러리 스크리닝(library screening)을 통하여 얻어진 hACAT-1 및 hACAT-2 각각의 cDNA를 베큘로바이러스 전달 벡터에 삽입하고, 곤충세포인 sf9 세포에 도입하여 바이러스를 제조하였다. 다음으로, 플라크 정제(plaque purification) 방법으로 hACAT-1 및 hACAT-2 각각의 재조합 바이러스를 분리한 후, 3차례의 증폭과정을 거쳐 저장용 바이러스(viral stock)의 역가(titer)를 높였다. 단백질 발현 효율이 좋은 Hi5 곤충세포에 재조합 바이러스를 감염다중도(mutiplicity of infection)가 1이 되도록 감염시킨 후, 27 ℃에서 하루 동안 진탕 배양하였다. 상기 배양된 hACAT-1 및 hACAT-2가 각각 과량 발현된 Hi5 세포들로부터 마이크로좀 분획을 분리하기 위하여, 500 x g에서 15분간 원심분리하여 세포들을 모으고 저장완충액(hypotonic buffer)에서 급냉동, 급해동 방법으로 세포를 깬 후, 100,000 x g에서 한 시간 동안 초원심분리하였다. 상기 얻어진 마이크로좀 분획들은 단백질 농도가 8 ㎎/㎖이 되도록 저장완충액으로 현탁하여 -70 ℃ 저온냉동기에 보관하면서 사용하였다.

ACAT 활성의 측정은 [1-¹⁴C] 올레오일-코에이(oleoyl-CoA)(56.0 μCi/μmol; Amersham)를 기질로 하여 Brecher & Chan의 방법(P. Brecher and C. Chan, Biochim. Biophys. Acta, 617: 458, 1980)을 일부 수정하여 사용하였다. 상기 실시예에서 수득한 콩잎 추출물 및 이의 분획물을 각각 10 ㎕, 상기에서 수득한 마이크로좀 용액 4.0 ㎕, 활성분석 완충액(0.5 M KH₂PO₄, 10 mM DTT, pH 7.4; Sigma) 20.0 ㎕, 지방이 제거된 우혈청알부민(BSA; bovine serum albumin, 저장액 농도 40 ㎎/㎖; Sigma) 15.0 ㎕, 콜레스테롤(저장액 농도 20 ㎎/㎖; Sigma) 2.0 ㎕, 증류수 41.0 ㎕를 가하여 37 ℃에서 15 분간 예비 반응시켰다. 또한 비교군으로써 비교예에서 제조된 콩 추출물, 콩뿌리 추출물 또는 콩뿌리 분획물을 사용하였다. 이 반응액에 [1-¹⁴C] 올레오일-코에이(0.05 μCi, 최종농도: 10 μM) 8 ㎕를 첨가하여 다시 37 ℃에서 30분간 반응시킨 후, 이소프로판올:헵탄 혼합물(4:1(v/v)) 1 ㎖을 가하여 반응을 정지시켰다. 여기에 600 ㎕의 헵탄과 200 ㎕의 0.1 M KH₂PO₄(pH 7.4)을 첨가하고, 혼합물을 볼텍서(vortexer)로 격렬하게 혼합한 후, 300 x g에서 5분 동안 원심분리를 하였다. 상기 원심분리하여 얻은 100 ㎕의 상층액을 신틸레이션 병(scintillation bottle)에 넣고, 신틸레이션 액(Lipoluma) 4 ㎖을 가하였다. 상기 혼합물의 방사선량은 1450 마이크로베타 액체 신틸레이션 계수기(1450 Microbeta liquid scintillation counter, Wallacoy)로 측정하였다. ACAT 활성은 측정된 방사선량으로부터 시간당 방사선량을 계산하여 1분 동안 단백질 1 ㎎당 합성된 콜레스테릴 올레이트 피코몰(피코몰/분/㎎ 단백질)로 계산하여 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

구분	100 ㎍/㎖에서 저해활성 (%)
구분	hACAT-1	hACAT-2
콩 에탄올추출물	33	31
콩뿌리 에탄올추출물	50	42
콩뿌리 에탄올추출물의 에틸아세테이트 분획	62	55
콩잎 에탄올 추출물	84	91
콩잎 에틸아세테이트추출물	95	98
콩잎 아세토니트릴추출물	94	93
콩잎 이소프로판올추출물	84	80
콩잎 에탄올추출물의 헥산 분획	97	97
콩잎 에탄올추출물의 에틸아세테이트 분획	93	92

표 3에 나타낸 바와 같이, 콩잎 추출물 및 이의 분획물은 hACAT1 및 hACAT2에 대하여 100 ㎍/㎖에서 80~98%의 저해활성을 나타냄으로써 콩 추출물(31~33%) 또는 콩뿌리 추출물(42~62%)에 비하여 20~60% 더 높은 저해활성을 나타냄을 알 수 있다.

따라서, 본 발명의 콩잎 추출물 이의 분획물은 사람 ACAT-1 및 ACAT-2에 대한 저해 활성이 매우 우수하므로, 콜레스테릴 에스테르 합성 및 축적으로 유발되는 고지혈증, 관상동맥 심장병, 동맥경화, 심근경색 및 비만과 같은 심혈관계 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

< 실험예 4> Lp - PLA ₂ 활성 측정

본 발명에 따른 콩잎 추출물 또는 이의 분획물의 Lp-PLA₂의 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

인간의 혈장으로부터 분리한 LDL을 효소원으로 사용하여 보이드(Boyd) 등의 방법(Boyd, et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 10: 2557-2561, 2000)을 일부 수정하여 Lp-PLA₂ 저해 효과를 측정하였다.

Lp-PLA₂ 활성 측정의 표준조건은 반응액 200 ㎕에 2.7 mM EDTA, 10 mM PBS(pH 7.4)와 80 μM PAF([³H]PAF, 0.05 μCi/tube)를 포함한다. 즉, 기질은 유기용매에 용해되어 있는 10 ㎕ [³H]PAF(250 μCi, 21.50 Ci/mmol)와 12.5 μM Cold-PAF 20 ㎕을 질소가스 하에서 용매를 완전히 제거한 후, 3.4 mM EDTA를 포함하는 10 mM PBS(pH 7.4) 3.2 ㎖를 첨가하여 마이셀(micelle) 형태로 준비하였다(A 용액). 시험관에 LDL(0.5~0.8 ㎎/㎖) 40 ㎕와 PAF 80 ㎕를 포함하는 A 용액 160 ㎕, DMSO에 녹인 시료 20 ㎕를 를 첨가하여 37 ℃에서 15분간 반응시킨 후, 클로로포름/메탄올(2:1, 부피비) 용액 600 ㎕를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 다음 1,500 x g에서 3분간 원심분리하여 유기용매층과 물층을 분리하였다. 상층액(물층) 250 ㎕를 취한 후 클로로포름 250 ㎕를 첨가하여 상기 분액 실험을 반복하였다. 최종 상층액 100 ㎕를 취하여 섬광 바이알(vial)에 넣고 섬광 칵테일(Lumagel, Lumac Co.) 3 ㎖를 첨가하여 액체 섬광계수기(1450 Microbeta Trilux, Wallac Oy, Finland)를 이용하여 [³H]PAF(1-O-hexadecyl-acetyl-3H(N)-phosphatidylcholine)로부터 생성된 [³H]아세테이트(acetate)의 양을 측정하였다. 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

구분	200 ㎍/㎖에서 Lp-PLA₂ 저해활성 (%)
콩 에탄올추출물	9
콩뿌리 에탄올추출물	28
콩잎 에탄올추출물	48
콩잎 에틸아세테이트추출물	65
콩잎 아세토니트릴추출물	16
콩잎 이소프로판올추출물	44
콩잎 에탄올추출물의 헥산 분획	27
콩잎 에탄올추출물의 에틸아세테이트 분획	45

표 4에 나타낸 바와 같이, 콩잎 추출물 및 이의 분획물은 Lp-PLA₂에 대하여 200 ㎍/㎖에서 16~65%의 저해활성을 나타냄으로써 콩 추출물(9%) 또는 콩뿌리 추출물(28~48%)에 비하여 동등하거나 더 높은 저해활성을 나타냄을 알 수 있다. 특히 콩잎 에틸아세테이트 추출물의 경우에는 65%의 저해활성을 나타냄으로써 Lp-PLA₂에 대하여 우수한 저해활성을 나타내었다.

따라서, 본 발명에 따른 콩잎 추출물 이의 분획물은 리소포스파티딜콜린과 자유 산화된 지방산의 생성으로 인해 유발되는 고지혈증, 관상동맥 심장병, 동맥경화 및 심근경색과 같은 심혈관계 질환 및 염증 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

< 실험예 5> 비만 억제 효과

본 발명에 따른 콩잎 추출물 또는 이의 분획물의 비만에 미치는 영향을 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

<5-1> 동물의 사육

실험동물은 질환모델동물인 수컷 LDLr k/o 마우스를 미국 Jackson Lab.으로부터 수입하여 사용하였다. 분양받은 실험동물은 2주간 기본사료(AIN-76A diet)와 물을 자유롭게 공급하면서 실험실 환경에 적응시킨 후, 건강상태가 양호한 10 주령의 마우스를 실험에 사용하였다. 실험군은 다음과 같이 분류하였다.

(1) 기본 정상식이(AIN76A diet)를 섭취하는 음성 대조군(ND군);

(2) 고지방고콜레스테롤 식이(HFHC, western-type diet with 21% milk fat and 0.15% cholesterol; Dyets Inc.)를 섭취하는 대조군(Control군);

(3) HFHC 식이에 본 발명의 콩잎 에탄올 추출물(1%, wt/wt diet)을 보충한 시험군 1 (EGML);

(4) HFHC 식이에 본 발명의 콩잎 물 추출물(1%, wt/wt diet)을 보충한 시험군 2;

(5) HFHC 식이에 본 발명의 콩잎 추출물의 헥산 분획물(0.5%, wt/wt diet)을 보충한 시험군 3; 및

(6) HFHC 식이에 본 발명의 콩잎 추출물의 에틸 아세테이트 분획물(0.5%, wt/wt diet)을 보충한 시험군 4.

상기 실험군을 12 주간 실험하면서 지질강하, 항동맥경화 및 항비만 효능을 관찰하였다.

동물 사육실의 환경은 항온(25± 2℃), 항습(50± 5%) 및 12시간 간격의 광주기(light on 07:00 ~ 19:00)로 일정한 조건을 유지하였고, 실험동물은 3 ~ 4 마리씩 분리하여 사육하였으며, 식이와 식수는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 식이섭취량 및 체중은 매주 일정한 시간에 측정하여 기록하였으며, 일주일마다 후안과 정맥총으로부터 모세관(capillary tube)을 사용하여 채혈한 후 EDTA를 사용하여 응고를 방지하였고, 혈액생화학적 검사를 실시하기 위하여 채혈 후 30분 이내에 8,000 x g, 4 ℃에서 5분간 원심분리하여 혈장(plasma)을 분리하여 -70 ℃에 보관하였다가 분석하였다. 사육이 끝난 실험동물은 희생 전 3시간 동안 절식시킨 후 혈액을 채취하여 동일한 방법으로 처리하였고, 각 실험동물의 장기조직(간, 소장, 뇌, 대동맥 및 지방조직)은 혈액 채취 후 즉시 적출하여 칭량 후, RNA 실험용은 RNA 안정액(stbilization solution)(Qiagen)에 보관하여 일주일 안에 RNA을 뽑고, 나머지 부분은 액체질소로 급냉시켜 -70 ℃ 냉동고에 보관하였다.

<5-2> 지방조직의 중량 측정

상기 실험예 <5-1>의 각 실험동물을 복부(Abdominal), 부고환(Epididymal) 및 사타구니(Inguinal)의 지방조직(adipose tissue)을 부위별로 적출하여, 지방조직들의 총 중량을 측정하여 체중 kg 당 지방조직의 중량을 산출하였다. 대조군과 시험물질 투여군 간의 결과는 평균치±표준편차로 나타내었으며, 각 군 간의 차이에 대해 T-검정(paired t-test)를 실시하여 유의차가 5% 미만(P<0.05)일 때 통계적 유의성이 있는 것으로 판정하였다.

측정 결과를 표 5 및 도 11에 나타내었다.

시험군	상대적인 총 지방 중량(g/kg 체중)
정상식이군 (ND)	168.2±0.4
Control군 (HFHC)	206.7±6.0^#
시험군 1 (HFHC + 콩잎 에탄올 추출물, EGML)	137.0±5.6^#,*
시험군 2 (HFHC + 콩잎 물 추출물)	170.2±0.5^*
시험군 3 (HFHC + 콩잎 헥산 분획물)	148.8±4.7^*
시험군 4 (HFHC + 콩잎 에틸 아세테이트 분획물)	135.1±4.3^#,*
# : ND군과 비교하여 P<0.05 * : HFHC군과 비교하여 P<0.05

도 11 및 표 5에 나타낸 바와 같이, 12주 후의 기본식이를 섭취한 음성 대조군(ND군)의 복부, 부고환 및 사타구니의 지방조직의 중량을 합한 총 지방 중량은 168.2± 20.4 g/kg 체중이었고, 대조군(Control군)의 총 지방 중량은 206.7± 26.0 g/kg 체중으로 현저하게 증가한 반면, 콩잎 에탄올 추출물을 섭취한 시험군 1의 총 지방 중량은 137.0± 25.6 g/kg 체중으로 현저하게 체지방 증가를 억제하였다. 상기 에탄올 이외 콩잎 추출물 및 이의 분획물을 섭취한 시험군 2 내지 4 역시 상기 시험군 1과 유사하게 체지방 증가를 현저히 감소시켰다.

<5-3> 간조직의 지질 함량 측정

12주 동안 기본식이를 섭취한 ND군, 고지방고콜레스테롤을 섭취한 Control군 및 시험군들로부터 부검한 간 조직 내의 총지질(total lipid)의 함량을 측정하였다. 상기 실험예 <5-1>의 각 실험동물로부터 적출한 간의 총 지질 함량은 Folch 등의 방법 (J. Biol. Chem. 226: 497-509, 1957)에 따라 유기용매를 이용하여 지질을 추출하여 측정하여 표 6에 나타내었다.

시험군	간 중량당 총지질량(mg/g 간)
정상식이군 (ND)	109±5
Control군 (HFHC)	145±11
시험군 1 (HFHC + 콩잎 에탄올 추출물, EGML)	117±11
시험군 2 (HFHC + 콩잎 물 추출물)	125±9
시험군 3 (HFHC + 콩잎 헥산 분획물)	120±12
시험군 4 (HFHC + 콩잎 에틸 아세테이트 분획물)	112±10

표 5에 나타낸 바와 같이, 간 중량당 총지질량은 ND군이 109±5 mg/g 간(liver)이고 Control군이 145±11 mg/g 간에 반해 본 발명에 따른 콩잎 에탄올 추출물을 섭취한 시험군 1(EGML)은 117±11 mg/g 간으로 현저하게 감소되었다. 상기 에탄올 이외 콩잎 추출물 및 이의 분획물을 섭취한 시험군 2 내지 4 역시 상기 시험군 1과 유사하게 간 중량당 총지질량을 감소(14 ~ 23%)시켰다.

따라서, 본 발명에 따른 콩잎 추출물 이의 분획물은 체지방 증가를 억제하고, 간 중량당 총지질량을 감소시킴으로써 비만, 지방간의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

< 실험예 6> 지질생화학적 분석

상기 실험예 <5-1>의 각 실험동물로부터 분리한 혈장(plasma)으로 간 기능의 지표인 GOT 및 GPT를, 혈장 및 간의 지질함량의 지표인 총콜레스테롤, HDL(High-density lipoprotein) 및 중성지방(triglyceride)을 생화학자동분석기(Hitachi-720, Hitachi Medical, Japan)를 이용하여 측정하였다.

<6-1> 혈중 지질 측정

12주 동안 기본식이를 섭취한 ND군, 고지방고콜레스테롤을 섭취한 Control군 및 시험군들의 혈중 총콜레스테롤, HDL-콜레스테롤, 중성지방 및 인지질의 함량을 측정하여 하기 표 7에 나타내었다.

시험군	총콜레스테롤 (mg/dl)	총콜레스테롤 당 HDL-콜레스테롤의 비율(%)	중성지방 (mg/dl)	인지질 (mg/dl)
ND군	477±35	29.5±1.8	225±46	482±23
Control군	1143±93	12.3±0.6	385±37	741±50
시험군 1	900±63	16.5±1.2	303±81	664±54
시험군 2	972±66	16.0±1.1	323±39	682±56
시험군 3	915±60	16.4±1.0	311±55	662±50
시험군 4	800±58	17.1±1.2	295±40	630±34

표 7에 나타낸 바와 같이, 총콜레스테롤은 ND군이 477±35 mg/dl이고 Control군이 1143±93 mg/dl에 비해 콩잎 에탄올 추출물을 섭취한 시험군 1은 900±63 mg/dl로 감소되었다(P<0.05). 총콜레스테롤 당 HDL-콜레스테롤의 비율은 ND군이 29.5±1.8%이고 Control군이 12.3±0.6%에 반해 시험군 1(EGML)은 16.5±1.2%로 증가하였다(P<0.01). 중성지방은 ND군이 225±46 mg/dl이고 Control군이 385±37 mg/dl에 반해 시험군 1은 303±81 mg/dl로 감소시켰다(P<0.05). 또한, 인지질은 ND군이 482±23 mg/dl이고 Control군이 741±50 mg/dl에 반해 시험군 1(EGML)은 664±54 mg/dl로 감소시켰다(P<0.05). 상기 에탄올 이외 콩잎 추출물 및 이의 분획물을 섭취한 시험군 2 내지 4 역시 상기 시험군 1(EGML)과 유사하게 총콜레스테롤을 감소(15 ~ 30%)시키고, 총콜레스테롤 당 HDL-콜레스테롤의 비율을 증가(30 ~ 39%)시키고, 중성지방을 감소(16 ~ 23%)시키고, 인지질을 감소(8 ~ 15%)시켰다.

<6-2> 혈중 포도당 및 인슐린 측정

12주 동안 기본식이를 섭취한 ND군, 고지방고콜레스테롤을 섭취한 Control군 및 시험군들의 혈중 포도당 및 인슐린의 함량을 측정하여 표 8에 나타내었다.

시험군	포도당 (mg/dl)	인슐린 (ng/ml)
ND군	125±34	0.584±0.059
Control군	173±25	0.773±0.158
시험군 1	154±33	0.640±0.102
시험군 2	157±31	0.657±0.112
시험군 3	155±28	0.643±0.095
시험군 4	145±30	0.611±0.088

표 8에 나타낸 바와 같이, 포도당은 ND군이 125±34 mg/dl이고 Control군이 173±25 mg/dl에 비해 콩잎 에탄올 추출물을 섭취한 시험군 1(EGML)은 154±33 mg/dl로 감소되었다. 인슐린은 ND군이 0.584±0.059 ng/ml이고 Control군이 0.773±0.158 ng/ml에 반해 시험군 1은 0.640±0.102 ng/ml로 감소시켰다. 상기 에탄올 이외 콩잎 추출물 및 이의 분획물을 섭취한 시험군 2 내지 4 역시 상기 시험군 1과 유사하게 포도당을 감소(9 ~ 16%)시키고, 인슐린을 감소(15 ~ 21%)시켰다.

<6-3> 혈중 간독성 지표 효소

12주 동안 기본식이를 섭취한 ND군, 고지방고콜레스테롤식이를 섭취한 Control군 및 시험군들의 혈중 간독성 지표인 GOT(aspartate transaminase, AST), GPT(alanine transaminase, ALT) 함량을 측정하여 표 9에 나타내었다.

시험군	GOT 함량 (IU/L)	GPT 함량 (IU/L)
ND군	90±9	32±12
Control군	150±35	74±32
시험군 1	128±27	54±21
시험군 2	131±30	58±21
시험군 3	127±28	55±18
시험군 4	122±25	47±15

표 9에 나타낸 바와 같이, GOT 함량은 ND군이 90±9 IU/L이고 Control군이 150±35 IU/L인데 반해 콩잎 에탄올 추출물을 섭취한 시험군 1(EGML)은 128±27 IU/L로 감소되었으며, GPT 함량은 ND군이 32±12 IU/L이고 Control군이 74±32 IU/L인데 반해 시험군 1은 54±21 IU/L로 감소되었다. 상기 에탄올 이외의 추출물 및 이의 분획물을 섭취한 시험군 2 내지 4 역시 상기 시험군 1(EGML)과 유사하게 GOT 함량(13 ~ 19%) 및 GPT 함량(22 ~ 36%)이 감소되었다.

따라서, 본 발명에 따른 콩잎 추출물 이의 분획물은 혈중 간독성의 지표인 GOT 및 GPT의 함량을 감소시키고, 간 또는 혈중 총콜레스테롤, HDL 및 중성지방의 함량을 감소시킴으로써 비만, 지방간의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있으며, 혈중 포도당 및 인슐린의 함량을 감소시킴으로써 당뇨 및 대사증후군의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

< 실험예 7> 항동맥경화 효과

본 발명에 따른 콩잎 추출물 또는 이의 분획물의 동맥경화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

<7-1> 대동맥궁의 병변 크기 변화

Paigen 등의 방법(Atherosclerosis, 68:231, 1987)을 약간 변형하여 상기 실험예 <5-1>에서 12주 동안 고지방고콜레스테롤식이를 섭취한 Control군 및 고지방고콜레스테롤식이와 본 발명에 따른 콩잎 추출물을 함께 섭취한 시험군 1의 각 개체의 심장을 심실에서부터 대동맥궁 쪽으로 10 ㎜의 간격으로 대동맥동이 노출될 때까지 냉동 박편 절단하였다. 다음으로, 상기 대동맥동이 잘 노출된 부위의 박편 조직을 골라 오일-레드 O를 사용하여 리피드 염색을 수행하였다(Gulledgr, AA, et al., Arteioscler. Thromb. Vasc, Biol. 23:130-135, 2003). 정확한 병변분석을 위해 대동맥동 부위를 심장과 가까운 부분인 원부위(distal portion)와 심장과 먼 부분인 근부위(proximal portion)로 나누어 비교 분석하고 그 결과를 표 10에 나타내었다.

		Control군 (n=10)	시험군 1 (n=10)	^* P
대동맥동 병변(원부위)	병변의 크기 (㎛²×10³)	129.6±45.7	70.3±53.9	0.01243
대동맥동 병변(원부위)	병변/총 대동맥동의 비율	39.0±13.4	16.0±10.1	0.00062
대동맥동 병변(근부위)	병변의 크기 (㎛²×10³)	141.4±56.3	58.2±32.9	0.00060
대동맥동 병변(근부위)	병변/총 대동맥동의 비율	37.7±8.9	14.3±9.3	0.00003
^* P<0.05인 경우 통계학적으로 유의함

표 10에 나타낸 바와 같이, 원부위에서 Control군 대동맥동의 전체 병변의 크기가 129.6±45.7 ㎛²×10³으로 나타났고, 본 발명에 따른 콩잎 추출물을 함께 투여한 시험군에서는 70.3±53.9 ㎛²×10³으로 나타나, 콩잎 에탄올 추출물 투여로 병변의 크기가 약 46% 감소한 것으로 나타났다. 이를 전체 대동맥동에 대한 병변 크기로 나누어 계산해 보면 Control군과 시험군이 각각 39.0±13.4와 16.0±10.1로, 콩잎 에탄올 추출물 투여로 59%의 병변 형성 억제 효과를 보였다.

또한, 근부위에서의 전체 병변은 Control군과 시험군에서 각각 141.4±56.3 ㎛²×10³과 58.2±32.9 ㎛²×10³로 나타나, 콩잎 에탄올 추출물 투여로 병변의 크기가 약 59% 감소한 것으로 나타났다. 이를 전체 대동맥동에 대한 병변 크기로 나누어 계산해 보면 Control군과 시험군이 각각 37.7±8.9와 14.3±9.3으로, 콩잎 에탄올 추출물 투여로 62%의 병변 형성 억제 효과를 보였다.

<7-2> 병변내 침착된 대식세포의 측정

동맥 병변에는 침착된 대식세포와 콜레스테롤이 주요한 병변 구성물질로 알려져 있다. 따라서, 동맥내피세포 안쪽으로 유입된 대식세포의 양을 조사하기 위해 동맥 병변 조직을 면역조직화학법을 수행하여 관찰하였다.

구체적으로, 대식세포의 병변조직내 침착 확인을 위한 면역염색을 위하여, 항-마우스 대식세포 항체(MOMA-2, MCA519, Serotec)를 1차 항체로 사용하였고, Cy2가 결합되어 있는 항-래트 IgG 항체(Abcam ab6952)를 2차 항체로 사용하였다. 마우스 대식세포를 선택적으로 인식하는 항체(MOMA-2)를 1차 항체로 사용하여 박편 조직내 분포되어 있는 대식세포와 1 시간 정도 반응시켜 결합시키고, 이후 PBS로 3회 수세하였다. 형광을 띠는 2차 항체와 30 분 정도 반응시킨 후, 결합된 2차 항체의 형광 활성을 형광현미경(fluorescence microscopy, Olympus, BX61)으로 관찰하였고, 검출된 형광의 양을 계산하여 동맥 병변에 침착된 대식세포의 양으로 환산하였다. 이때 Cy2는 녹색을 띠는 형광으로 MOMA-2에 의해서 검출된 대식세포의 양을 정량적으로 보여주기 위해 2차 항체에 결합되어 있다.

그 결과, 고지방고콜레스테롤 식이를 섭취한 Control군의 동맥 내벽에서 가장 선명한 녹색형광이 검출되었고, 콩잎 에탄올 추출물을 투여한 시험군(EGML)에서는 비교적 적은 비율의 형광활성을 보였다.

또한, MOMA-2 염색된 대동맥판 병변 영역을 컴퓨터를 이용하여 정량화한 후 오일 레드 O로 염색된 병변 영역에 대한 MOMA-2로 염색된 영역의 비율을 계산하여 그 결과를 표 11 및 도 12에 나타내었다.

구분	MOMA-2 염색/동맥 병변 염색 (%)
ND군	48.4±25.3
Control군	70.0±15.1
시험군 1	54.7±17.2
^* P	0.00088
^* P<0.05인 경우 통계학적으로 유의함

표 11 및 도 12에 나타낸 바와 같이, Control군은 70.0±15.1%이었고, 본 발명에 따른 시험군은 54.7±17.2%로 감소하였다. 따라서 본 발명의 콩잎 에탄올 추출물의 투여로 22%의 대식세포 침착억제 효과가 있음을 유의성 있게 보여 주었다.

따라서, 본 발명에 따른 콩잎 추출물 이의 분획물은 대동맥궁의 병변크기를 감소시키고, 동맥 병변에 침착된 대식세포의 양을 감소시킴으로써 항동맥경화 활성을 나타내므로 동맥경화의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

< 실험예 7> 동물조직의 유전자 발현 분석

본 발명에 따른 콩잎 추출물 또는 이의 분획물의 유전자 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

상기 실험예 <5-1>의 대조군 및 시험군으로부터 적출한 뇌와 동맥, 간 및 지방조직들의 유전자 발현 양상을 역전사 PCR 증폭법을 사용하여 알아보았다. 지방조직(adipose tissue) 및 뇌(brain)는 RNeasy lipid tissue kit(Qiagen)을 사용하고 나머지 조직은 Trizol(Intron) 용액을 사용하여 각 조직으로부터 RNA를 추출한 뒤 Quantitect Reverse transcriptase kit(Qiagen)를 사용하여 cDNA를 만들고, 이를 주형(template)으로 하여 각각의 유전자를 증폭시킬 수 있도록 합성된 올리고(oligo)들과 함께 dsDNA에 끼어들어가는 SYBR Green의 특성을 이용한 Quantitect SYBR Green PCR kit(AB science)를 사용하여 reverse transcriptase PCR(RT-PCR, Applied Bioscience)에서 실시간으로 cDNA의 증폭과정을 확인하였다. 이때 사용된 올리고들은 PCR 증폭과정에서 150 ~ 200 bp정도의 단일 앰플리콘(single amplicon)을 형성함을 확인하였고, 이들의 염기서열은 하기 표 12과 같다.

유전자 명칭	유전자 번호	센스	안티-센스
C/EBPα	NM_007678	CAAGAAGTCGGTGGACAAGA (서열번호 1)	TCAACTCCAGCACCTTCTGT (서열번호 2)

CD11β	NM_008401	CTGTGAAGTACGCCATCTAC (서열번호 3)	CTTACAGACTGCAACAGAGC (서열번호 4)
CD18	NM_008404	TATAACAGCCAAGTCTGCGG (서열번호 5)	ATGTTCCTTCCGTCCTTCTG (서열번호 6)
CD36	NM_007643	TGCTGGAGCTGTTATTGGTG (서열번호 7)	CTCAAAGATGGCTCCATTGG (서열번호 8)
DGAT1	NM_010046	ACAACCTGACCTACCGAGAT (서열번호 9)	AGTAGGGACCATCCACTGTT (서열번호 10)
FAS	NM_007988	TGTGAGTGGTTCAGAGGCAT (서열번호 11)	TTCTGTAGTGCCAGCAAGCT (서열번호 12)
FATP	NM_011977	CTTTCTGCGTATCGTCTGCA (서열번호 13)	GTGCGAAGGTCCAGCATATA (서열번호 14)
ICAM-1	NM_010493	GTGATGCTCAGGTATCCATC (서열번호 15)	GAATACACGGTGATGGTAGC (서열번호 16)
iNOS	NM_010927	CTTTAGACCTCAACAGAGCC (서열번호 17)	GTAGGACAATCCACAACTCG (서열번호 18)
LPL	NM_008509	GGTCACCTGGTCGAAGTATT (서열번호 19)	GCAGGGAGTCAATGAAGAGA (서열번호 20)
MC4R	NM_016977	GGTCGGAAACCATCGTCATT (서열번호 21)	TGAAATACCTGTCCACCGCA (서열번호 22)
PEPCK-C	NM_011044	TCATCACCCAAGAGCAGAGA (서열번호 23)	GGCGAGTCTGTCAGTTCAAT (서열번호 24)
PPARα	NM_011144	CCTGAACATCGAGTGTCGAA (서열번호 25)	GTACTGGCATTTGTTCCGGT (서열번호 26)
PPARδ	NM_011145	GCAGCCTCAACATGGAATGT (서열번호 27)	GTTGCGGTTCTTCTTCTGGA (서열번호 28)
PYY	NM_145435	CTCCAAACTGCTCTTCACAG (서열번호 29)	CGAGACACCGAGATATGAAG (서열번호 30)
SCD1	NM_009127	AGGGCGGAAAACTGGACAT (서열번호 31)	GGAGGCCGGGCTTGTAGTAC (서열번호 32)
TrKB	NM_001025074	GATCCACGTCACCAATCACA (서열번호 33)	TGGGTTTGTCTCGTAGTCGA (서열번호 34)
VCAM-1	NM_011693	CTGTTTGCAGTCTCTCAAGC (서열번호 35)	CCAAACACTTGACTGTGACC (서열번호 36)

유전자의 발현 수치는 cDNA가 증폭되어 형광이 포화상태에 이르는 지점의 PCR 사이클(cycle) 횟수로써 표시되는데, 이를 갭디에이치(GAPDH)에 대한 값으로 보정한 뒤 최종적으로 고지방고콜레스테롤을 섭취한 Control군에 대한 상대적인 수치로 산출하였다.

이때, 간 조직에서 지방산화 및 에너지 소비에 관련된 유전자들(SCD1, PEPCK, DGAT1 및 FAS)의 발현 변화는 도 13에 나타내었고, 동맥에서 싸이토카인 및 세포부착물질 유전자들(CD11β, CD18, CD36, ICAM-1, iNOS 및 VCAM-1)의 발현 변화는 도 14에 나타내었고, 부고환지방 조직에서 지방세포 분화, 에너지 소비, 지방산 산화 및 지방세포의 이동 및 축적을 조절하는 유전자들(C/EBPα, FATP. PPARδ, LPL, PPARα)의 발현 변화는 도 15에 나타내었고, 뇌조직에서 포만중추 리셉터(MC4R), 열발생 촉진(TrKB) 및 식욕억제(PYY) 유전자의 발현 변화는 도 16에 나타내었다.

실험결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 콩잎 에탄올 추출물을 투여한 시험군은 간 조직에서 지방 소비를 감소시키는 스테로일 코에이 불포화효소(SCD-1), 포스포에놀 피부르산 카르복시 키나아제(PEPCK-C) 및 지방산 합성효소(FAS) 등의 지방산 합성에 관련된 여러가지 효소 및 단백질들의 발현이 Control군에 비해 감소하는 것으로 나타났다. 또한 중성지방 합성의 마지막 과정에 작용하는 효소인 아실 코에이:디아실 글리세롤 아실트랜스퍼라제-1(DGAT-1)의 발현이 Control군에 비해 본 발명에 따른 콩잎 에탄올 추출물을 투여한 시험군에서 현저하게 감소하는 것으로 나타났다. 따라서 본 발명에 따른 콩잎 추출물 및 이의 분획물은 항비만 효과 및 항대사질환 효과가 있음을 알 수 있다.

또한, 도 14에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 콩잎 에탄올 추출물을 투여한 시험군은 동맥 조직에서 동맥병변의 염증반응과 관련이 있는 산화질소 합성효소(nitric oxide synthases; iNOS) 및 CD11β, CD18, CD36 등 싸이토카인(cytokine)의 발현이 Control군에 비해 현저하게 감소하였다. 구체적으로 염증세포가 내피세포로 들어가는 내피세포횡단이동(transendothelial migration) 단계를 매개하는 세포 부착물질인 ICAM-1과 VCAM-1의 발현이 Control군에 비해 현저하게 감소하였다. 따라서 본 발명에 따른 콩잎 추출물 및 이의 분획물은 항동맥경화 효능이 있다는 것을 알 수 있다.

나아가, 도 15에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 콩잎 에탄올 추출물을 투여한 시험군은 부고환지방 조직에서 지방세포 분화를 촉진하는 CCAAT/증진제 결합 단백질 알파(CCAAT/enhancer binding protein alpha; C/EBPα)의 발현이 Control군에 비해 현저하게 감소하였고, 에너지 소비에 관련된 유전자들의 발현을 촉진하는 전사인자인 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체 알파(peroxisome proliferator-activated receptor alpha; PPARα) 및 지방대사에 관여하여 지방산의 산화를 촉진하고 에너지 발산을 증진시키는 전사인자인 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체 델타(peroxisome proliferator-activated receptor delta; PPARδ)의 발현이 Control군에 비해 증가하였다. 또한, 지방 합성을 촉진하는 지방산 이동 단백질(fatty acid transfer protein, FATP)과 중성지방을 분해해 지방 세포 속으로 흡수를 도와주는 지단백질 리파아제(Lipoprotein Lipase, LPL)의 발현이 Control군에 비해 시험군에서 유의성있게 감소되었다. 따라서 본 발명에 따른 콩잎 에탄올 추출물 및 이의 분획물은 지방세포의 이동 및 축적을 억제하여 항비만 효과를 나타내므로 비만의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 도 16에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 콩잎 에탄올 추출물이 뇌신경 회로와 관련하여 섭취 행동(feeding behavior) 및 열발생(thermogenesis)에도 영향을 미치는지를 알아보기 위하여 뇌에서의 유전자들의 발현양상을 알아본 결과, 본 발명에 따른 콩잎 에탄올 추출물을 투여한 시험군은 포만중추 리셉터인 멜라노코르틴 수용체(melanocortin-4 receptor; MC4R)의 발현이 Control군에 비해 증가하였고, 교감, 부교감 신경에 자극을 주어 열발생를 촉진하는 티로신 카이네이즈 B(tyrosine kinase B, TrKB)의 발현이 Control군에 비해 5배 이상 매우 유의적으로 증가하였다. 또한, 배가 부르다는 신호를 보내 식욕을 억제시키는 펩타이드 YY(peptide YY; PYY) 호르몬도 Control군에 비해 증가하여 항비만 효과를 나타내었다. 따라서 본 발명에 따른 콩잎 에탄올 추출물 또는 이의 분획물은 뇌의 포만중추 리셉터(MC4R), 열발생 촉진(TrKB) 및 식욕 억제(PYY) 유전자들의 발현을 증가시킴으로써 비만, 고지혈증 및 대사증후군의 예방 또는 치료 효과가 있음을 알 수 있다.

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.

< 제제예 1> 약학적 제제의 제조

<1-1> 산제의 제조

콩잎 추출물 및 이의 분획물 2 g

유 당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<1-2> 정제의 제조

콩잎 추출물 및 이의 분획물 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<1-3> 캡슐제의 제조

콩잎 추출물 및 이의 분획물 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<1-4> 환의 제조

콩잎 추출물 및 이의 분획물 1 g

유당 1.5 g

글리세린 1 g

자일리톨 0.5 g

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1환 당 4 g이 되도록 제조하였다.

<1-5> 과립의 제조

콩잎 추출물 및 이의 분획물 150

대두추출물 50

포도당 200

전분 600

상기의 성분을 혼합한 후, 30 % 에탄올 100 을 첨가하여 섭씨 60 ℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.

< 제제예 2> 식품의 제조

<2-1> 밀가루 식품의 제조

본 발명의 콩잎 추출물 및 이의 분획물을 0.5~5.0 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

<2-2> 유제품( dairy products )의 제조

본 발명의 콩잎 추출물 및 이의 분획물 0.1 ~ 1.0 중량%를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

<2-3> 선식의 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.

검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.

콩잎 추출물 및 이의 분획물을 진공 농축기에서 감압하에서 농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다.

상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 콩잎 추출물 및 이의 분획물의 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.

- 곡물류(현미 30 중량%, 율무 15 중량%, 보리 20 중량%),

- 종실류(들깨 7 중량%, 검정콩 8 중량%, 검정깨 7 중량%),

- 콩잎 추출물 및 이의 분획물의 건조분말(1 중량%),

- 영지(0.5 중량%),

- 지황(0.5 중량%)

< 제제예 3> 음료의 제조

<3-1> 건강음료의 제조

액상과당(0.5%), 올리고당(2%), 설탕(2%), 식염(0.5%), 물(75%)과 같은 부재료와 콩잎 추출물 및 이의 분획물을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강음료를 제조하였다.

<3-2> 야채쥬스의 제조

콩잎 추출물 및 이의 분획물 0.5 g을 토마토 또는 당근 쥬스 1,000 ㎖에 가하여 건강 증진용 야채쥬스를 제조하였다.

<3-3> 과일쥬스의 제조

콩잎 추출물 및 이의 분획물 0.1 g을 사과 또는 포도 쥬스 1,000 ㎖에 가하여 건강 증진용 과일쥬스를 제조하였다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 콩잎 에탄올 추출물의 HPLC 분석 그래프이다.

도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 콩잎 에탄올 추출물에서 분리된 화학식 1의 화합물의 질량분석 스펙트럼이다.

도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 콩잎 에탄올 추출물에서 분리된 화학식 2의 화합물의 질량분석 스펙트럼이다.

도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 콩잎 에탄올 추출물에서 분리된 화학식 3의 화합물의 질량분석 스펙트럼이다.

도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 콩잎 에탄올 추출물에서 분리된 화학식 4의 화합물의 질량분석 스펙트럼이다.

도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 콩잎 에탄올 추출물에서 분리된 화학식 5의 화합물의 질량분석 스펙트럼이다.

도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 콩잎 에탄올 추출물에서 분리된 화학식 6의 화합물의 질량분석 스펙트럼이다.

도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 콩잎 에탄올 추출물에서 분리된 화학식 7의 화합물의 질량분석 스펙트럼이다.

도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 콩잎 에탄올 추출물에서 분리된 화학식 8의 화합물의 질량분석 스펙트럼이다.

도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 콩잎 에탄올 추출물, 콩뿌리 추출물 및 콩줄기 추출물의 활성물질을 HPLC을 이용하여 분석한 그래프이다.

도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 콩잎 에탄올 추출물 투여에 따른 고지방고콜레스테롤 식이로 유도된 비만 마우스 모델의 지방조직의 무게 변화를 나타낸 그래프이다.

도 12는 본 발명의 일실시예에 따른 콩잎 에탄올 추출물 투여에 따른 고지방고콜레스테롤 식이로 유도된 비만 마우스 모델의 대동맥판 병변 영역 비율을 나타낸 그래프이다.

도 13은 본 발명의 일실시예에 따른 콩잎 에탄올 추출물 투여에 따른 고지방고콜레스테롤 식이로 유도된 비만 마우스 모델의 간 조직의 유전자 발현 변화를 나타낸 그래프이다.

도 14는 본 발명의 일실시예에 따른 콩잎 에탄올 추출물 투여에 따른 고지방고콜레스테롤 식이로 유도된 비만 마우스 모델의 동맥 조직의 유전자 발현 변화를 나타낸 그래프이다.

도 15는 본 발명의 일실시예에 따른 콩잎 에탄올 추출물 투여에 따른 고지방고콜레스테롤 식이로 유도된 비만 마우스 모델의 부고환지방 조직의 유전자 발현 변화를 나타낸 그래프이다.

도 16은 본 발명의 일실시예에 따른 콩잎 에탄올 추출물 투여에 따른 고지방고콜레스테롤 식이로 유도된 비만 마우스 모델의 뇌 조직의 유전자 발현 변화를 나타낸 그래프이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Compositions for the prevention and treatment of obesity, hyperlipidemia, atherosclerosis, fatty liver, diabetes mellitus or metabolic syndrome comprising extracts or fractions of Glycine max leaves as an active ingredient <130> 9p-05-02 <160> 36 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C/EBP alpha sense <400> 1 caagaagtcg gtggacaaga 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C/EBP alpha antisense <400> 2 tcaactccag caccttctgt 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD11 beta sense <400> 3 ctgtgaagta cgccatctac 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD11 beta antisense <400> 4 cttacagact gcaacagagc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD18 sense <400> 5 tataacagcc aagtctgcgg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD18 antisense <400> 6 atgttccttc cgtccttctg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD36 sense <400> 7 tgctggagct gttattggtg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD36 antisense <400> 8 ctcaaagatg gctccattgg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DGAT1 sense <400> 9 acaacctgac ctaccgagat 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DGAT1 antisense <400> 10 agtagggacc atccactgtt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAS sense <400> 11 tgtgagtggt tcagaggcat 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAS antisense <400> 12 ttctgtagtg ccagcaagct 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FATP sense <400> 13 ctttctgcgt atcgtctgca 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FATP antisense <400> 14 gtgcgaaggt ccagcatata 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ICAM-1 sense <400> 15 gtgatgctca ggtatccatc 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ICAM-1 antisense <400> 16 gaatacacgg tgatggtagc 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS sense <400> 17 ctttagacct caacagagcc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS antisense <400> 18 gtaggacaat ccacaactcg 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LPL sense <400> 19 ggtcacctgg tcgaagtatt 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LPL antisense <400> 20 gcagggagtc aatgaagaga 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MC4R sense <400> 21 ggtcggaaac catcgtcatt 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MC4R antisense <400> 22 tgaaatacct gtccaccgca 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPCK-C sense <400> 23 tcatcaccca agagcagaga 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPCK-C antisense <400> 24 ggcgagtctg tcagttcaat 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPAR alpha sense <400> 25 cctgaacatc gagtgtcgaa 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPAR alpha antisense <400> 26 gtactggcat ttgttccggt 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPAR delta sense <400> 27 gcagcctcaa catggaatgt 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPAR delta antisense <400> 28 gttgcggttc ttcttctgga 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY sense <400> 29 ctccaaactg ctcttcacag 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY antisense <400> 30 cgagacaccg agatatgaag 20 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCD1 sense <400> 31 agggcggaaa actggacat 19 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCD1 antisense <400> 32 ggaggccggg cttgtagtac 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TrKB sense <400> 33 gatccacgtc accaatcaca 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TrKB antisense <400> 34 tgggtttgtc tcgtagtcga 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VCAM-1 sense <400> 35 ctgtttgcag tctctcaagc 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VCAM-1 antisense <400> 36 ccaaacactt gactgtgacc 20

Claims

콩잎을 물, 유기용매 또는 이의 혼합용매로 추출한 콩잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만, 고지혈증, 동맥경화, 지방간 또는 당뇨의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 유기용매는 알코올, 에틸아세테이트 또는 아세토니트릴인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제2항에 있어서, 상기 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올 또는 이소프로판올인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 콩잎 추출물은 하기 화학식 1 내지 화학식 8로 표시되는 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]
제1항의 콩잎 추출물을 추가적으로 유기용매로 추출하여 제조된 유기용매 분획물을 유효성분으로 함유하는 비만, 고지혈증, 동맥경화, 지방간 또는 당뇨의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제5항에 있어서, 상기 유기용매는 헥산 또는 에틸아세테이트인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
콩잎을 물, 유기용매 또는 이의 혼합용매로 추출한 콩잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만, 고지혈증, 동맥경화, 지방간 또는 당뇨의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
제7항에 있어서, 상기 유기용매는 알코올, 에틸아세테이트 또는 아세토니트릴인 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
제8항에 있어서, 상기 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올 또는 이소프로판올인 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
제7항에 있어서, 상기 콩잎 추출물은 하기 화학식 1 내지 화학식 8로 표시되는 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]
제7항의 콩잎 추출물을 추가적으로 유기용매로 추출하여 제조된 유기용매 분획물을 유효성분으로 함유하는 비만, 고지혈증, 동맥경화, 지방간 또는 당뇨의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
제11항에 있어서, 상기 유기용매는 헥산 또는 에틸아세테이트인 것을 특징으 로 하는 건강기능식품.