KR102378396B1 - 인디안구스베리 추출물과 새싹보리 추출물의 복합물(ib복합물)을 유효성분으로 포함하는 비만 및/또는 당뇨를 동반하는 대사증후군의 예방, 개선 치료용 조성물 - Google Patents

인디안구스베리 추출물과 새싹보리 추출물의 복합물(ib복합물)을 유효성분으로 포함하는 비만 및/또는 당뇨를 동반하는 대사증후군의 예방, 개선 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인디안구스베리(암라)추출물과 새싹보리추출물의 복합물을 유효성분으로 포함하는 대사증후군의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 인디안구스베리추출물과 새싹보리추출물의 복합물은 각각의 단일 물질보다 췌장 리파아제의 효소활성을 억제시켜 섭취한 지방의 소화 및 흡수를 저해하고, IRS, PI3K 를 포함한 GLUT4 signaling을 촉진시켜 혈당 흡수 조절 및 당대사로부터 지방 합성을 억제하며 cAMP 발현 조절을 통해 지방 분해를 촉진하여 세포 밖으로 배출되는 glycerol양을 증가시킴으로써 지방 축적을 억제하고 체중, 혈당, 혈중 인슐린, 혈중 당화혈색소를 감소시켜 비만 또는 당뇨의 개선에 상승효과를 보이므로 비만, 당뇨와 같은 대사증후군의 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물 또는 건강기능식품으로 이용될 수 있다.

Description

인디안구스베리 추출물과 새싹보리 추출물의 복합물(IB복합물)을 유효성분으로 포함하는 비만 및/또는 당뇨를 동반하는 대사증후군의 예방, 개선 치료용 조성물{Composition for preventing, improving or treating metabolic syndrome accompanying obesity and/or diabetes comprising a complex of Emblica officinalis extract and Hordeum vulgare extract(IB Complex) as an active ingredient}
본 발명은 천연 추출물을 유효성분으로 포함하는 대사증후군의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.　
비만(Obesity)은 체내에 지방이 과도하게 축적된 상태를 의미하며 유전적 요인, 운동량 결핍, 스트레스, 호르몬 불균형, 서구화된 식생활 등의 다양한 원인으로 발생될 수 있다. 최근에는 에너지의 섭취와 소비의 불균형으로 인하여 비만 유병률은 매년 증가하고 있는 추세이며 2017 국민건강영양조사에 따르면, 우리나라의 만 19세 이상 비만율은 34.1%로, 2001년 29.2%에 대비하여 4.9% 증가하였다. 비만 자체로만으로도 건강에 문제가 될 수 있지만, 고지혈증, 고혈압, 제 2형 당뇨병, 고혈당증 등 대사성 증후군과 밀접하게 연관되어있어 현재 심각한 보건문제로 인식되고 있다.
현재 다양한 방면에서 비만을 치료 또는 개선하기 위한 방법들이 제공되고 있으며 그 하나의 방법으로는 비만치료제가 있다. 대표적인 비만치료제에는 펜터민(Phentermine), 펜디메트라진(Phendimetrazine), 마진돌(Mazindol) 등의 식욕억제제와 오르리스타트(Orlistat)의 지방흡수억제제가 있으나 식욕억제제의 경우에는 중추신경을 흥분시켜 두근거림, 가슴통증, 현기증, 불안, 불명 등의 부작용이 문제되고 있으며, 지방흡수 억제제의 경우에는 지용성 비타민 흡수 저해, 소화기 장애 등 위장관련 부작용을 가지고 있다.
이러한 비만치료제를 통한 약물요법 외에도 에너지의 섭취를 제한하는 식이요법과 에너지 소비를 증가시키는 운동요법, 정신요법, 행동요법, 외가요법 등도 실시되고 있으나 바람직한 비만의 치료 방법으로는 운동을 통한 에너지 소비 촉진과 부작용이 적은 비만치료용 약제를 병행하는 것이 가장 안전하고 효과적인 방법으로 제시되고 있다.
따라서, 인체에 안전하고 우수한 효과를 나타내는 비만 또는 당뇨의 억제 또는 치료용 물질의 개발이 절실히 필요한 상황이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
대한민국 등록특허공보 제10-1830048호
본 발명자들은 비만 또는 당뇨의 치료 및 억제의 효과를 나타내면서 부작용이 없는 천연물을 개발하고자 연구 노력한 결과, 다양한 천연 원료 중에서 인디안구스베리 추출물 및 새싹보리 추출물이 비만 또는 당뇨와 같은 대사증후군의 우수한 치료 효과가 있음을 확인하였고, 상기 연구 결과를 기반으로 각각의 원료가 갖는 효능을 극대화하여 대사증후군의 치료에 상승효과를 갖는 배합비를 밝혀냄으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 인디안구스베리 추출물과 새싹보리 추출물의 복합물을 유효성분으로 포함하는 대사증후군의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 인디안구스베리 추출물과 새싹보리 추출물의 복합물을 유효성분으로 포함하는 대사증후군의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 하나의 관점은 인디안구스베리(Emblica officinalis) 추출물과 새싹보리(Hordeum vulgare) 추출물의 복합물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 대사증후군의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
인디안구스베리(Phyllanthus emblica L.)는 엠블리카 오피시날(Emblica officinalis Gaertn) 또는 암라(Amla)라고도 하며 각 지방 또는 언어에 따라 고유의 명칭을 가지고 있다. 예를 들면, 아마라키, 여감자(余柑子), 유감(油甘), 엄마늑(奄摩勒), 엔브릭크·미로바란, 마락카노키, 마락카트리, 아론라, 아미라, 아미라키, 아미라캐트라, 네리카이, 네르리, 타샤, 카유라카, 켐라카, 낙크혼폰 등으로도 불린다. 인디안구스베리는 야생에서 네팔을 비롯한 남부 아시아와 말레이시아 지역을 포함하는 동남아시아 지역 및 중부 남부 등 넓은 지역에 걸쳐 분포하여 자생하고 있는 식물이다. 경작지로는 대만의 해발 1500m 이상의 산의 경사면 및 히말라야 산맥에서 많이 재배되고 있다.
인디안구스베리는 높이 3~8m의 낙엽교목으로 잎의 길이는 약 10mm, 폭은 약 2~3mm의 장방형이고, 레몬향이 나는 황록색의 작은 꽃이 4~5월에 핀다. 열매는 납작한 공모양으로 크기는 평균 18~25mm이며, 익으면 연노랑 빛을 띠고 반들거리며 여섯 조각 줄로 된 황녹색이다. 신선한 과일의 맛은 새콤달콤 떫으며 뒷맛은 달다. 열매는 건조하면 흑색이 되며 건조해도 영양 성분이 약해지지 않아 건조한 것이 유통되고 있다. 암라는 아말라키(amalaki)라고도 불리는데, 아말라키는 네팔에서 성스러운 나무로 간주된다.
인디안 구스베리(암라)에는 비타민 C, 미네랄, 아미노산(amino acid), 타닌(tannins), 루틴(rutin) 등을 함유하고 있는 것으로 알려져 있다. 인디안 구스베리의 비타민 C는 오렌지보다 20배 많이 함유되어 있으며, 열에도 대단히 안정적이어서 고온에 장시간 노출되어 있더라도 비타민이 거의 파괴되지 않는다. 비타민 C의 내열성은 함께 들어있는 타닌 성분에서 비롯된 것으로 여겨지며, 이 성분들에 의해 항산화, 항종양, 항염증 활성 등을 나타낸다. 이 외에도 인디안구스베리(암라)에는 엘라그산(ellagic acid), 갈산(gallic acid), 퀘르세틴(quercetin) 등의 다양한 생리활성 성분들이 포함되어 있다.
새싹보리(Hordeum vulgare L.)는 보리의 어린 순으로 보리 종자를 파종하여 자란 어린 잎 상태를 말한다. 일 구현예에서 새싹보리는 파종 후 약 8-15일 후의 10~20 cm 가량의 어린 잎일 수 있다. 보리는 약 10,000년 전 유라시아 대륙에서 처음으로 재배 된 곡물 중 하나로, 인류가 재배한 가장 오래된 작물의 하나로 알려져 있다. 새싹보리는 비타민 A, B 및 비타민 C를 포함한 각종 비타민과 칼슘, 마그네슘 및 칼륨 등의 미네랄 함량이 높을 뿐만 아니라 다량의 식이섬유를 함유하여 영양학적으로도 우수한 식품원으로 알려져 있어 건강기능성 식품 및 의약품 소재로 산업적 이용 가능성이 커지고 있다. 미국, 일본 등에서는 어린 보리잎을 동결건조하여 가루로 만들어 건강식품으로 개발하여 판매하고 있으며 국내에서는 일반식품 및 건강기능식품으로써 분말, 환, 녹즙, 차, 화장품 등 다양하게 제품화하여 판매하고 있다. 약리활성의 측면에서 상기 새싹보리는 여러 생리활성 물질에 의한 항산화 활성, 배변활동 원활, 콜레스테롤 수치 개선, 혈당수치 개선, 고지혈증 개선 및 비만 억제의 효과 등 다양한 기능성을 나타낸다. 이러한 생리활성 효과는 사포나린(saponarin), 루토나린(lutonarin) 등을 포함한 플라보노이드에서 비롯된 것으로 여겨진다.
본 발명의 조성물은 유효성분으로서 인디안구스베리와 새싹보리의 추출물을 포함하는데, 본 명세서에서 사용되는 용어 '추출물'은 원물을 착즙, 또는 원물에 추출용매를 처리하여 얻은 추출 결과물이나 이를 제형화(예컨대, 분말화)한 가공물도 포함하는 의미를 갖는다.
본 발명의 조성물에서 이용되는 추출물을 원물에 추출용매를 처리하여 얻는 경우에는, 다양한 추출용매가 이용될 수 있는데 예컨대, 극성 용매 또는 비극성 용매를 이용할 수 있다. 극성 용매로는 (i) 물, (ii) 알코올(바람직하게는, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜), (iii) 아세트산, (iv) DMFO(dimethyl-formamide) 및 (v) DMSO(dimethyl sulfoxide) 등을 사용할 수 있고, 비극성 용매로는 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF 등을 사용할 수도 있다.
바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 추출물은 원물을 착즙하거나, 또는 물, 탄소수가 1 내지 4의 저급 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나를 추출 용매로 사용하여 추출한 것일 수 있지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어 '추출물'은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 원물을 착즙 또는 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 추출물뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 추출물에 포함되는 것이다.
또한, 본 발명의 추출물은 이후 추가적인 과정, 예컨대 여과하거나 농축 또는 건조과정을 수행하여 용매를 제거한 것, 또는 여과, 농축 및 건조를 모두 수행한 것일 수도 있다. 여과는 예를 들어 여과지를 이용하거나 감압여과기를 이용할 수 있으며, 농축은 감압 농축기, 건조는 분무건조 하거나 동결건조법 등을 수행하여 분말 상태의 추출물을 얻을 수도 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기와 같이 제조한 인디안구스베리 추출물은 1 내지 25 mg/g의 엘라그산을 포함할 수 있는데, 분석 방법에 따라 산 가수분해 하는 조건에서 1 내지 5 mg/g의 엘라그산(Ellagic acid)을 포함하는 것일 수 있으며, 산 가수분해 하지 않는 조건에서 5 내지 25 mg/g의 유리 엘라그산(Free ellagic acid)을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기와 같이 제조한 새싹보리추출물은 6 내지 11 mg/g의 사포나린(Saponarin)을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 조성물에서 상술한 인디안구스베리 추출물과 새싹보리 추출물은 혼합물 또는 복합물로 포함될 수 있다. 상기 혼합물 또는 복합물은 인디안구스베리 추출물과 새싹보리 추출물 각각의 단일 물질에 대비하여 상승효과를 가질 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 인디안구스베리 추출물 및 새싹보리 추출물은 4:1 내지 1:1의 중량비로, 예컨대 4:1, 2:1 또는 1:1의 중량비로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 착즙 및 건조 공정을 포함하여 인디안구스베리 열매로부터 인디안구스베리 추출물을 수득하는 단계; 착즙 및 건조 공정을 포함하여 새싹보리로부터 새싹보리 추출물을 수득하는 단계; 및 상기 인디안구스베리 추출물 및 새싹보리 추출물을 4:1 내지 1:1의 중량비로 혼합하여 복합물을 제조하는 단계를 포함하는 것에 의하여 제조될 수 있다.
이와 같은 본 발명의 인디안구스베리 추출물과 새싹보리 추출물의 혼합물 또는 복합물은 췌장 리파아제의 효소활성을 억제함으로써 지방의 소화 및 흡수를 저해하고, 지방 합성 억제 효과, 지방 분해 효과를 발휘하여 지방 축적 억제와 혈당의 흡수 조절 및 당대사를 촉진하여 혈당, 인슐린 및 당화혈색소 감소, 체중 감소의 효능을 보유하고, 이에 의하여 비만 또는 당뇨와 같은 대사증후군의 예방, 개선 또는 치료 효과를 나타낸다.
본 발명에서 용어 “췌장 리파아제(Pancreatic lipase)”는 췌장에서 분비되는 중성지방인 트리글리세라이드(Triglyceride, TG)를 모노글리세라이드(Monoglyceride, MG)와 지방산(Fatty acid)으로 가수분해하는 지방분해효소로, 췌장 트리아실글리세롤 리파아제(pancreatic triacylglycerol lipase)라고도 하며, 중성지방의 세포 내 흡수를 촉진하는 효소이다. 따라서, 상기 췌장 리파아제 활성 저해능은 체내 지방 흡수도를 평가하는 지표로 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어 "cAMP(Cyclic adenosine monophosphate)"는 세포 표면 수용체에 β-아드레날린 길항제, 프로스타글란딘 E2(prostaglandin E2, PGE2), 히스타민들이 결합하여 adenylate cyclase를 활성화시키거나 세포 내 cAMP phosphodiesterase의 작용을 억제함으로써 세포 내 농도가 증가된다. cAMP는 지방분해효소인 호르몬 민감성 지방분해효소(hormone sensitive lipase, HSL)를 활성화시켜 중성지방 분해를 촉진하며 열 생성을 촉진하는데 관여한다. 따라서, 상기 cAMP level은 지방분해를 평가하는 지표로 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어 "Glycerol release"는 글리세롤의 방출량을 나타내며 지방세포 내 축적된 지방구에 존재하는 트리글리세라이드(Triglyceride, TG)가 분해되면 글리세롤(glycerol)과 지방산(fatty acid)로 나누어진다. 따라서 유리된 글리세롤의 함량이 지방구 내 트리글리세라이드(Triglyceride, TG)의 분해 정도를 평가하는 지표로 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어 "IRS(Insulin receptor substrate)"는 근육, 간, 지방조직 등 전신조직에 분포한 인슐린수용체 기질로써, 인슐린 신호전달 경로에 관여하여 당 및 지질대사를 조절하는 기능을 수행한다.
본 발명에서 용어 "PI3K(Phosphoinositide 3-Kinase)"는 인슐린 신호 전달 경로에 관여하는 인산화 효소로써, 인슐린수용체 기질인 "IRS(Insulin receptor substrate)"과 상호작용하여 혈당 흡수 조절 및 지방합성을 억제하는 기능을 한다.
본 발명에서 용어 "GLUT4(glucose transporter 4)"는 지방세포와 근육세포에서 주로 존재하는 포도당 수용체로, 인슐린 의존적으로 세포 내로부터 세포막에 포도당(glucose)을 이동시켜 당대사로부터 지방 합성을 억제하는 지표가 된다. 지방 축적에 의한 인슐린 저항성이 생기면 GLUT4 전위(Translocation)가 원할히 일어나지 않으며, GLUT4 발현의 증가는 세포 내로 당을 이동시켜 에너지로 사용하게 함으로써 체내 당대사를 조절하는 기능을 수행한다.
또한 본 발명은 상기 유효성분을 함유하는 조성물을 포함하고, 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제 등을 추가하여 약제학적 단위 투여형으로 제형화된 비만 또는 당뇨와 같은 대사증후군의 예방 및 치료를 위한 약제학적 조성물을 제공한다.
여기에서, 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성 셀룰로스, 폴리비닐피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 유효성분을 포함하는 조성물을 제제화할 경우에는 통상적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면 활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
또한, 상기 약제학적 투여 형태는 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제, 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 경구 투여를 위한 고형 제제에는 상기 추출물 또는 분말에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분은 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.
상기 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다.
상기 비 수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸 올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 연령, 성별, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
또한 본 발명은 상기 유효성분을 함유하는 조성물을 포함하고, 식품 보조 첨가제를 추가하여 건강기능 식품으로 제형화된 비만 또는 당뇨와 같은 대사증후군의 예방 또는 개선용 건강기능 식품 조성물을 제공한다.
여기에서, 상기 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.
본 발명의 건강 기능성 식품 조성물은 상기 추출물을 함유하는 외의 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 식품 및 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기 천연 탄수화물에는 모노사카라이드, 예를 들면, 포도당, 과당; 디사카라이드, 예를 들면, 말토스, 수크로스; 폴리사카라이드, 예를 들면, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이 존재할 수 있다.
상기 이외에 향미제로써 천연 향미제(타우마틴, 스테비아추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수도 있다.
상기 외에 본 발명의 추출물, 분말 또는 복합물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제, 펙트산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
그 밖에 본 발명의 추출물, 분말 또는 복합물은 천연 과일 주스 및 야채음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 인디안구스베리 추출물 및 새싹보리 추출물로 조성된 복합물은 지방의 소화 및 흡수를 저해하는 효능을 발휘하고, 더욱 상세하게는, 췌장 리파아제의 효소활성을 억제시키는데 상승효과를 가지며 섭취한 지방의 소화 및 흡수를 저해하는 효능을 발휘하고, IRS, PI3K를 포함한 GLUT4 signaling을 촉진시켜 당대사로부터 지방 합성을 억제하며 cAMP 발현 조절을 통해 지방분해를 촉진하여 세포 밖으로 배출되는 glycerol 양을 증가시켜 지방 축적을 억제하고, 혈당의 흡수 조절 및 당대사를 촉진하여 체중, 혈당, 인슐린 및 당화혈색소를 감소시킴으로써 비만 또는 당뇨와 같은 대사증후군의 예방, 개선 또는 치료 효과가 뛰어난 효능을 보유하고 있다.
또한, 본 발명의 인디안구스베리추출물 및 새싹보리추출물은 독성이 없으며 부작용이 없는, 인체에 무해한 천연 추출물로 조성된 복합물로 효과적인 대사증후군의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 인디안구스베리 추출물과 새싹보리 추출물을 포함한 11종의 천연물에 대한 췌장리파아제(Pancreatic lipase) 저해 활성도를 나타낸 도이다.
도 2는 인디안구스베리 추출물과 새싹보리 추출물의 복합물이 단일물로 처리하였을 때와 대비하여 췌장리파아제 저해 활성도에 대한 상승효과를 나타낸 도이다.
도 3은 인디안구스베리 추출물과 새싹보리 추출물의 혼합 비율에 따른 췌장리파아제 저해활성도를 나타낸 도이다.
도 4 는 인디안구스베리 추출물과 새싹보리 추출물의 혼합 비율에 따른 세포 내 cAMP level을 나타낸 도이다.
도 5는 인디안구스베리 추출물과 새싹보리 추출물의 혼합 비율에 따른 세포 내 glycerol release를 나타낸 도이다.
도 6은 인디안구스베리 추출물과 새싹보리 추출물의 복합물이 단일물로 처리하였을 때와 대비하여 세포 내 P-IRS1/IRS1의 단백질 발현 비율에 대한 상승효과를 나타낸 도이다.
도 7은 인디안구스베리 추출물과 새싹보리 추출물의 복합물이 단일물로 처리하였을 때와 대비하여 세포 내 P-PI3K/PI3K의 단백질 발현 비율에 대한 상승효과를 나타낸 도이다.
도 8은 인디안구스베리 추출물과 새싹보리 추출물의 복합물이 단일물로 처리하였을 때와 대비하여 세포 내 GLUT4의 단백질 발현 정도에 대한 상승효과를 나타낸 도이다.
도 9는 인디안구스베리 추출물과 새싹보리 추출물의 복합물이 단일물로 처리하였을 때와 대비하여 세포 내 지방 축적 억제에 대한 상승효과를 나타낸 도이다.
도 10은 인디안구스베리 추출물과 새싹보리 추출물의 복합물이 단일물로 처리하였을 때와 대비하여 실험동물로부터 혈당(Glucose)를 나타낸 도이다.
도 11은 인디안구스베리 추출물과 새싹보리 추출물의 복합물이 단일물로 처리하였을 때와 대비하여 실험동물로부터 혈중 인슐린(Insulin)을 나타낸 도이다.
도 12는 인디안구스베리 추출물과 새싹보리 추출물의 복합물이 단일물로 처리하였을 때와 대비하여 실험동물로부터 혈중 당화혈색소(Hemoglobin A1c; HbA1c)를 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
1. 시험물질 제조방법
1.1 인디안구스베리(암라)추출물의 제조(비교예1)
인디안구스베리(암라, 원산지 네팔)의 열매를 세척하여 착즙한 후, 인디안구스베리열매추출물을 수득하였다. 그 후, 여과하여 농축한 다음, 건조하여 본 발명에서 사용할 인디안구스베리추출물을 제조하였다.
1.2 새싹보리추출물의 제조(비교예2)
새싹보리(원산지 한국)를 수확하여 착즙한 후, 셀룰로오스와 같은 불용성 섬유질을 제거하기 위하여 여과한 다음, 건조하였다. 건조된 분말은 균질화하여 본 발명에서 사용할 새싹보리추출물을 제조하였다.
1.3 복합물의 제조(실시예1 내지 5)
상기 비교예1 내지 비교예2 에서 제조한 인디안구스베리(암라)추출물 및 새싹보리추출물을 하기 표 1과 같은 중량비로 배합하여 복합물을 제조하였다.
구분 인디안구스베리:새싹보리
복합비율		 인디안구스베리추출물
(중량%)		 새싹보리추출물
(중량%)
실시예1 1:1 50 50
실시예2 4:1 80 20
실시예3 2:1 66.67 33.33
실시예4 1:2 33.33 66.67
실시예5 1:4 20 80
1.4 후보 소재 제조방법
국내외 문헌검토를 통해 항비만 또는 항당뇨 활성 소재를 탐색하고, 국내 원료 수급 여부, 식품원료로 섭취 가능여부를 고려하여 확보된 천연물을 후보소재로 선정하여 연구에 사용하였다. 후보소재 A, B, C, D는 각각 연잎, 길경, 꾸지뽕, 계피를 나타내며 열수를 첨가하여 추출하여 분무건조 한 뒤 연구에 사용하였다. E, F는 상엽, 연자육을 나타내며 열수를 첨가하여 추출한 후 농축하여 분무건조 한 뒤 연구에 사용하였다. G, H, I 는 비트루트, 석류, 타트체리를 나타내며 농축하여 분무건조 한 뒤 연구에 사용하였다.
1.5 지표성분 함량 확인
인디안구스베리(암라)추출물과 새싹보리추출물의 지표성분 함량 분석 및 원료 표준화를 위하여 인디안구스베리(암라)추출물(비교예1-1, 비교예1-2, 비교예1-3) 및 새싹보리추출물(비교예2-1, 비교예2-2, 비교예2-3) 각각의 원료에 대해 3가지의 원료를 생산하였다.
인디안구스베리(암라) 추출물의 지표성분은 ‘엘라그산(Ellagic acid)'으로 설정하였으며, 새싹보리추출물의 지표성분은 사포나린(Saponarin)으로 설정하여 분석하였다. 분석 방법에 따라 인디안구스베리(암라)추출물에 대한 지표성분의 함량은 표 2와 표 3에 정리하였으며, 새싹보리추출물에 대한 지표성분의 함량은 표 4에 정리하였다.
보다 구체적으로, 상기 각 추출물의 지표성분 함량 분석은 다음과 같이 실시하였다.
상기 인디안구스베리(암라)추출물의 엘라그산(Ellagic acid) 정량을 위해 사용한 분석법은 다음과 같다.
인디안구스베리(암라)추출물 내 엘라그산의 함량은 산 가수분해 후, 고속액체크로마토그래피 방법을 이용하여 측정하였다. 칼럼으로는 Capcellpak C18 UG120 (4.6 ㎜ X 50 ㎜, 5 ㎛)를 이용하였으며, 이동상으로는 0.85% 인산 정제수 및 메탄올의 6 : 4 혼합액(A) 및 메탄올(B)을 이용하여 그레이디언트(gradient) 방법으로 분리하였으며, UV 검출기로 370 ㎚의 파장에서 엘라그산을 검출하였다. 그 결과, 상기 실험방법 1.1에 따라 제조된 인디안구스베리(암라)추출물 내 엘라그산 함량은 1 - 5 mg/g 범위로 확인되었다.
구분 엘라그산의 함량
(mg/g)
비교예1-1 3.17
비교예1-2 1.91
비교예1-3 4.65
상기 인디안구스베리(암라)추출물의 유리 엘라그산(Free ellagic acid) 정량을 위해 사용한 분석 방법에서 산 가수분해 하지 않는 조건의 분석법은 다음과 같다.
인디안구스베리(암라)추출물 내 유리 엘라그산의 함량은 메탄올 초음파 추출 후, 고속액체크로마토그래피 방법을 이용하여 측정하였다. 칼럼으로는 Capcellpak C18 UG120 (4.6 ㎜ X 50 ㎜, 5 ㎛)를 이용하였으며, 이동상으로는 0.85% 인산 정제수 및 메탄올의 6 : 4 혼합액(A) 및 메탄올(B)을 이용하여 그레이디언트(gradient) 방법으로 분리하였으며, UV 검출기로 370 ㎚의 파장에서 엘라그산을 검출하였다. 그 결과, 상기 실험방법 1.1에 따라 제조된 인디안구스베리(암라)추출물 내 유리 엘라그산 함량은 5 - 25 mg/g 범위로 확인되었다.
구분 유리 엘라그산의 함량
(mg/g)
비교예1-1 11.73
비교예1-2 5.36
비교예1-3 24.15
상기 새싹보리추출물의 사포나린 정량을 위해 사용한 분석법은 다음과 같다.
새싹보리추출물 내 사포나린의 함량은 고속액체크로마토그래피 방법을 이용하여 측정하였다, 칼럼으로는 Capcellpak C18 UG120 (4.6 ㎜ X 50 ㎜, 5 ㎛)를 이용하였으며, 이동상으로는 0.1% 포름산(A) 및 메탄올(B)을 이용하여 그레이디언트(gradient) 방법으로 분리하였으며, UV 검출기로 340 ㎚의 파장에서 사포나린을 검출하였다. 그 결과, 상기 실험방법 1.2에 따라 제조된 새싹보리추출물 내 사포나린 함량은 6 - 11 mg/g 범위로 확인되었다.
구분 사포나린의 함량
(mg/g)
비교예2-1 6.56
비교예2-2 7.38
비교예2-3 10.54
2. 효능 평가
2.1 췌장 리파아제(pancreatic lipase) 저해 활성 측정
췌장 리파아제는 중성지방인 트리글리세라이드(Triglyceride, TG)를 모노글리세라이드(Monoglyceride, MG)와 지방산(Fatty acid)으로 가수분해 하는 효소로서 지방의 소화를 진행하고, 장내 상피세포가 분해산물을 흡수하도록 돕는다. 따라서 췌장 리파아제의 활성이 억제되면 중성지방의 분해와 함께 소장세포 및 소화관으로의 지방 흡수가 저해되므로 췌장 리파아제 활성 저해능은 항비만 활성을 예측하기에 매우 유용한 시험법이다. 본 실시예에서는 췌장 리파아제 저해 활성을 다음과 같이 측정하였다. 먼저 enzyme buffer (10 mM MOPS, 1 mM EDTA, pH6.8)에 porcine pancreatic lipase를 0.5g/200 mL의 농도로 용해한 효소용액 6 μL에 Tris buffer (100 mM Tris-HCl, 5mM CaCl2. pH 7.0) 169 μL와 시료를 20 μL 첨가하여 혼합한 후 37℃에서 15분간 incubation 시켰다. 이후 substrate solution(10 mM of p-nitrophenylbutyrate in dimethyl formamide)을 5 μL를 첨가하여 37℃에서 30분간 incubation 시킨 후 분광광도계(UV-visible spectrophotometer)를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. Pancreatic lipase 저해 활성도(%)는 아래의 수학식 1에 나타내었으며 X는 시료를 첨가한 흡광도, Y는 시료를 첨가하지 않은 흡광도를 나타낸다. 측정값은 3회 반복 실험의 평균값으로 나타내었다.
수학식1
췌장리파아제 저해활성도(%)= (1-(X-Y)/Y) × 100
2.2 췌장리파아제 저해 활성에 대한 복합물의 상승효과 확인
본 발명의 인디안구스베리추출물과 새싹보리추출물의 복합물이 단일물로 처리하였을 때와 대비하여 췌장 리파아제 억제능의 상승효과를 알아보기 위해, 동일 농도에서 단일물과 복합물의 활성을 분석하였으며 복합물의 상승효과를 확인하기 위하여 콜비(Colby) 계산식을 활용하였다. 콜비식은 아래 수학식 2에 나타내었으며, 측정된 값이 콜비식으로 도출된 E값을 초과하는 경우 상승효과를 인정할 수 있다. E는 복합물(A+B)의 예측되는 효과(%), A는 단일물 A의 효과(%), B는 단일물 B의 효과(%)를 나타낸다.
수학식2
E=A+B-(AB/100)
2.3 세포배양 및 분화유도
본 발명의 인디안구스베리추출물과 새싹보리추출물의 복합물이 단일물로 처리하였을 때와 대비하여 지방세포 분화 과정에서 지방합성 및 지방분해에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 본 실시예에서는 3T3-L1 cell을 American Type Cultured Collection (ATCC; Rockville, MD, USA)에서 분양 받아 실험하였다. 3T3-L1 preadipocyte를 10% newborn calf serum(NCS)과 1% penicillin-streptomycin, 1% L-glutamin, 1% sodium pyruvate, 1% hepes, 1% NEAA mixture를 함유한 high-glucose Dulbeco’s modified Eagle’s medium (DMEM)을 사용하여 37℃, 5% CO2 가 유지되는 배양기 (Thermo Fisher Scientific Inc., Pittsburgh, PA, USA)에서 배양하였고, 2일마다 배양액을 교환하였으며 세포가 단일 층으로 플라스크 바닥에 80%이상 부착하면 PBS용액을 사용하여 세포표면을 세척하였고, 0.25% trypsin-EDTA를 첨가한 뒤, 배양기에서 3분간 방치하여 세포를 분리하였다. 그 후 원심분리기(GYROZEN 416G)를 사용하여 1600rpm에서 5분간 원심분리 하여 세포를 모았으며 세포의 분화는 10% fetal bovine serum(FBS)과 1% penicillin- streptomycin, 1% L-glutamin, 1% sodium pyruvate, 1% hepes, 1% NEAA mixture, gentamycin이 포함된 DMEM 배양액을 사용하여 세포를 6-well plate (TPP)에 1X105cells/well을 균등하게 분주하였고, 100% confluent 상태일때, 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin, 1% L-glutamin, 1% sodium pyruvate, 1% hepes, 1% NEAA mixture, gentamycin이 포함된 DMEM 배양액에 adipogenic cocktail(MDI solution)인 3-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX, 0.5 mM), insulin(10 μg/mL), dexamethasone(DEX, 1 μM)을 혼합하여 분화 유도를 시작하였다. 분화 기간은 총 9일간 지속 되었으며, 분화 초기 3일 동안 매일 같은 배양액을 교환 해 주었고, 분화 중기 3일 동안은 배양액을 Insulin(10 μg/mL)만을 포함하는 10% FBS를 함유한 DMEM으로 교환하여 매일 교환 해 주었고, 분화 후기 3일 동안은 10% FBS를 함유한 DMEM 배양액으로 매일 교환 해 주었다. lipogenesis기전에서는 분화시작과 동시에 시료를 매일 처리하였고, lipolysis기전에서는 분화 종료되기 3일 전부터 3일간 처리하였다.
2.4 세포 내 cAMP level에 대한 복합물의 상승효과 확인
cAMP는 지방분해효소인 호르몬 민감성 지방분해효소(hormone sensitive lipase, HSL)를 활성화시켜 중성지방분해를 촉진하며 열 생성을 촉진하는데 관여한다. 본 실시예에서는 세포 내 cAMP level을 측정하기 위하여 cAMP ELISA kit(Cell biolabs Inc., San Diego, CA USA)를 사용하였으며 다음과 같이 측정하였다. 먼저, 1×106 cell 을 Lysis buffer에 넣고 균질화 하여 5분간 13,000 rpm에서 원심분리하고, 그 상층액을 sample로 사용하였다. Sample과 standard 시약을 96well plate의 각 well에 50μL씩 분주하고 Peroxidase cAMP Tracer Conjugate 시약을 25μL씩 분주 한 후, Rabbit Anti-cAMP Polyclonal Antibody 시약을 50μL 씩 분주하고, Plate cover을 씌우고 2시간동안 실온에 방치하였다. 2시간 후 wash buffer로 250μL씩 분주하여 총 5번 washing 작업을 해주었고, 실온에서 따뜻해진 substrate solution을 각 well에 100μL씩 분주한 후, 실온에 20분간 방치하였다. 20분 후 stop solution 100μL씩 각 well에 분주하여 반응을 멈추게 하였고, 450 nm파장에서 흡광도를 측정하였다.
2.5 세포 내 glycerol release에 대한 복합물의 상승효과 확인
지방분해는 지방세포 내의 중성지방(Triglyceride)이 유리지방산(fatty acid)과 글리세롤(glycerol)로 가수분해되는 과정으로, 지방세포 내 지방분해에 미치는 영향을 확인하기 위하여 지방분해 시 증가하게 되는 글리세롤을 측정하였다. 본 실시예에서는 지방세포의 분화 과정에서 글리세롤 방출량에 미치는 영향을 측정하기 위해 McGowan등의 방법에 따라 glycerol phosphate oxidase-TRINDER 효소반응법을 적용한 Free glycerol reagent를 이용하여 배양액 내 glycerol함량을 측정하였으며 다음과 같이 측정하였다. 먼저, 각 시료를 농도별로 처리하여 분화 후기 (9일째)에 각각 배양액을 모아 사용하였으며, 배양액 (1mL)과 free glycerol reagent (800 μL)를 혼합하여 37℃ hot plate에서 10분간 반응시킨 후, ELISA reader(Molecular Devices, USA)를 사용하여 540 nm 파장에서 optical density 를 측정하였다. 글리세롤 함량은 유리글리세롤을 표준시약으로 사용한 표준곡선을 작성함으로써 측정하였고, 단백질 함량은 BSA를 표준시약으로 사용하여 Bradford방법에 따라 측정하였다.
2.6 세포 내 IRS, PI3K 및 GLUT4에 대한 복합물의 상승효과 확인
IRS(Insulin receptor substrate)는 전신조직에 분포하는 인슐린수용체 기질로써, 인슐린 신호전달 경로에 관여하여 당 및 지질대사를 조절하며, PI3K(Phosphoinositide 3-Kinase)는 인슐린 신호 전달 경로에 관여하는 효소로써, IRS와 상호작용하여 혈당 흡수 조절 및 지방합성을 억제하는 기능을 한다. GLUT4(Glucose transport 4)는 지방세포와 근육세포에서 주로 존재하는 포도당 수용체로, 인슐린의 작용으로 세포 내로부터 세포막에 포도당 수송을 촉진한다. 내장지방 축적에 의한 인슐린 저항성이 생기면 세포질로부터 세포막으로의 GLUT4 전위(translocation)가 원활히 일어나지 않게 된다. 본 실시예에서는 IRS, PI3K 및 GLUT4의 단백질 발현을 측정하기 위해 Western blotting용 cell lysate의 protein 정량을 Bradford assay를 사용하여 수행하였다. Protein(40 μg)을 10% Mini-PROTEAN® TGXTM Precast Gels(Bio-Rad)에 loading 하였고, Trans-Blot® TurboTM Transfer system (Bio-Rad)을 사용하여 transfer를 진행하였다. Membrane을 blocking buffer(5% skim milk in Tris buffered saline with 1% Tween® 20)에서 1시간 동안 blocking 시켰고, 세척 후 IRS, PI3K 및 GLUT4 1차 항체와 반응시켰다. 세척 후 HRP가 중합된 2차 항체 (Cell Signaling, 1:3000)와 1시간 반응시킨 다음, 세척하여 EzWest Lumi plus(ATTO, Tokyo, Japan)를 이용해 발색하였고 Ez- Capture Ⅱ(ATTO)와 CS Analyzer 3.0 software(ATTO)를 사용하여 분석하였다.
2.7 세포 내 지방 축적 억제에 대한 복합물의 상승효과 확인
본 발명의 인디안구스베리추출물과 새싹보리추출물의 복합물이 preadipocyte에서 adipocyte로 분화하는 과정에서 지방세포분화에 미치는 영향을 측정하기 위해 Oil red O 염색을 수행하였다. 즉, 세포배양 및 분화유도 protocol에 따라 adipogenic cocktail을 포함한 10% FBS를 함유하는 DMEM 배양액과 추출물을 매일 교환 해 주었고, 분화 후기(9일째)에 각각 Oil red O staining을 실시하였다. 배양액을 suction하고 PBS용액으로 2회 세척한 뒤 PBS 용액을 완전히 suction하였고, 10% formalin을 넣고 5분간 실온에서 고정 시킨 후, 10% formalin을 suction하고 다시 새로운 10% formalin을 넣어 2시간이상 실온에서 고정시켰다. 그 후 formalin을 suction하고 60% isopropanol을 넣어 바로 suction한 후 flask를 완전히 건조시켰으며, Oil red O solution 용액을 첨가하여 60분 동안 지방구를 염색하였다. 염색 후 증류수로 4번 세척하여 지방구의 세포내 축적을 현미경과 카메라로 관찰하였다. 지방구 축적 contents를 정량하기 위해 잘 건조된 상태에서 100% isopropanol을 첨가하여 Oil red O dye를 용출한 뒤 ELISA reader(Molecular Devices, USA)를 사용하여 520 nm 파장에서 optical density를 측정하였다. 이때 100% isopropanol을 blank로 사용하였다.
2.8 복합물이 비만 유도된 마우스의 체중변화에 미치는 영향 확인
본 발명의 인디안구스베리추출물과 새싹보리추출물의 복합물이 고지방식이로부터 비만 유도된 마우스의 체중변화에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 실험동물은 ㈜새론바이오(Uiwang-si, Korea)에서 20 g 내외의 4주령 수컷 C57BL/6J 마우스를 공급받았다. 명암은 12시간(light/dark cycle), 온도는 23±2℃, 상대습도는 50±5%인 조건에서 1주 동안 적응기를 거쳐 실험에 이용하였다. 적응기간 동안 AIN-93G 식이와 음용수는 자유롭게 섭취하도록 하였으며 체중을 측정하여 평균체중에 가까운 개체를 무작위 법으로 각 군당 8마리씩 분리하였다. 적응기간이 끝나고 시료의 섭취는 15주간 자율식이섭취로 진행 하였으며, 매주 식이섭취량과 몸무게를 측정하고, 실험종료 후에는 체중증가량(weight gain)을 동일 기간의 식이섭취량(total food consumption)으로 나누어 식이효율(Food efficiency ratio, FER)을 계산하였다. 실험군의 분류와 실험식이 조성은 표 5와 같으며 식이효율의 계산식은 아래 수학식 3에 나타내었다.
수학식3
FER=weight gain(g)/total food consumption(g)x100
실험군 실험식이
일반군(NC) AIN 93G diet
대조군(C) 60% high fat diet
양성대조군(Met) 60% high fat diet + Metformin 250 mg/kg b.w.
실시예3 100mg/kg 60% high fat diet + IG:BP (2:1) 100 mg/kg b.w.
실시예3 200mg/kg 60% high fat diet + IG:BP (2:1) 200 mg/kg b.w.
실시예3 400mg/kg 60% high fat diet + IG:BP (2:1) 400 mg/kg b.w.
2.9 복합물이 비만 유도된 마우스의 장기 및 지방조직 무게 변화에 미치는 영향 확인
본 발명의 인디안구스베리추출물과 새싹보리추출물의 복합물이 고지방식이로부터 비만 유도된 마우스의 장기 및 지방조직무게 변화에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 조직 적출은 채혈 후 장기(간, 신장, 비장)와 백색지방조직(피하지방, 내장지방(부고환지방 및 복강 내 지방))을 적출한 다음 생리식염수로 세척하여 여과지로 수분을 제거한 후, 중량을 측정하였다.
2.10 복합물이 비만 유도된 마우스의 혈중 Glucose, Insulin 및 HbA1c 변화에 미치는 영향 확인
본 발명의 인디안구스베리추출물과 새싹보리추출물의 복합물이 고지방식이로부터 비만 유도된 마우스의 혈중 Glucose, Insulin 및 HbA1c 변화에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 혈액 분석은 실험종료 시 실험동물은 12 시간 절식 후 Isoflurane 으로 마취하고 간정맥을 통해 채혈하였고 혈액은 전혈 및 원심분리 (14,000 rpm, 20 min, 4℃)하여 분리된 혈청으로 분석하였으며, ELISA kit(Biovision)를 사용하여 측정하였다.
3. 실험 결과
3-1. 11종의 천연물에 대한 췌장리파아제 저해 활성
상기 실험방법에서 제시한 제조방법으로 제조한 11종의 천연물에 대한 췌장리파아제 저해 활성도를 측정하였다. 도 1 및 표 6에 제시된 바와 같이 동일한 농도에서 비교예 1의 시료가 리파아제 저해 활성도가 83.77±0.27%로 가장 높았음을 확인하였으며 그 다음으로는 비교예 2의 시료가 리파아제 저해 활성이 42.81±2.09%로 우수하였음을 확인하였다. 이러한 결과는 11종의 천연물에 대한 췌장리파아제 저해 활성도는 인디안구스베리추출물 및 새싹보리추출물이 가장 우수하였으며 이는 인디안구스베리추출물과 새싹보리추출물이 췌장 리파아제 저해제로 작용하여 체내 지방 흡수율을 저하시켜 항비만 활성을 보유할 수 있음을 확인하였다.
구분 시료 췌장리파아제 저해능(%)
A 연잎 25.36
B 길경 13.48
C 꾸지뽕 36.75
비교예1 인디안구스베리 83.77
D 계피 14.39
E 상엽 14.75
F 연자육 1.05
G 비트루트 13.62
H 석류 31.97
I 타트체리 26.91
비교예2 새싹보리 42.81
3-2. 췌장리파아제 저해 활성에 대한 인디안구스베리와 새싹보리 복합물의 상승효과
상기 실험방법에서 제시한 제조방법으로 제조한 인디안구스베리추출물과 새싹보리추출물의 단일물 및 복합물에 대한 췌장리파아제 저해 활성도를 측정하였다. 인디안구스베리추출물의 췌장리파아제 저해 활성도는 비교예 1로, 새싹보리추출물의 췌장리파아제 저해 활성도 결과는 비교예 2로 표기하였으며 동일한 농도에서의 복합물에 대한 췌장리파아제 저해 활성도는 실시예1-1로 나타내었으며 복합물의 상승효과를 확인하기 위하여 콜비(Colby) 계산식으로 활용하여 측정한 결과는 실시예1-2로 나타내었다. 도 2 및 표 7에서 제시한 바와 같이 인디안구스베리추출물의 췌장리파아제 저해 활성도는 94.42±0.66%로, 새싹보리추출물은 40.83±3.14%의 효능을 보였으며 동일한 농도에서의 복합물에 대한 췌장리파아제 저해 활성도는 112.64±3.20%로 단일 물질보다 복합물에서 췌장리파아제 저해 활성도는 더욱 우수하였다. 콜비 계산식을 사용하여 도출한 복합물에서의 상승효과 예측치는 96.70%로 실시예1-2에서는 130.06±2.21%로 예측치보다 약 134% 이상 우수한 효과를 보였다. 이는 인디안구스베리추출물과 새싹보리추출물의 복합물은 각각의 단일 물질보다 췌장 리파아제의 효소 활성을 억제시키는데 현저한 상승효과를 가지며 섭취한 지방의 소화 및 흡수를 저해하여 항비만 활성을 보유할 수 있음을 확인하였다.
구분 시료 농도(mg/mL) 췌장리파아제 저해능(%)
비교예1 인디안구스베리추출물 50 94.42
비교예2 새싹보리추출물 50 40.83
실시예1-1 인디안구스베리추출물과
새싹보리추출물의 1: 1 혼합물		 50 112.64
실시예1-2 인디안구스베리추출물과
새싹보리추출물의 1: 1 혼합물		 100 130.06
3-3. 췌장리파아제 저해 활성에 대한 다양한 중량비로 배합한 인디안구스베리와 새싹보리 복합물의 효과 확인
상기 실험방법에서 제시한 제조방법으로 제조한 인디안구스베리추출물과 새싹보리추출물의 복합물에서 최적비율을 선정하기 위하여 췌장리파아제 저해 활성도를 측정하였다. 실험결과 3-2에 따라 인디안구스베리와 새싹보리는 각각의 단일 물질보다 복합물에서 상승효과를 나타내었음을 확인하여 제조공정 및 경제성을 고려한 다음, 인디안구스베리와 새싹보리의 복합물이 가장 우수한 효능을 나타내는 최적비율을 선정하고자 하였다. 도 3 및 표 8에 제시된 바와 같이 동일한 농도에서 인디안구스베리와 새싹보리의 혼합 비율에 따른 췌장리파아제 저해 활성도는 인디안구스베리:새싹보리의 비율이 4:1, 2:1, 1:1에서 각각 103.45±2.14, 108.37±1.92, 105.62±0.40로 비슷한 활성을 보였으며 1:2, 1:4에서 측정된 83.30±1.63, 60.98±0.33 보다 우수한 활성을 보였다. 이러한 결과에 의하여, 각각의 단일 물질보다 현저한 상승효과를 갖는 인디안구스베리추출물과 새싹보리추출물의 복합물이 인디안구스베리:새싹보리의 비율이 4:1~1:1에서 다른 혼합 비율에서 보다 우수한 췌장 리파아제 저해제로 작용하여 지방의 소화 및 흡수를 억제할 수 있음을 확인하였다.
구분 인디안구스베리:새싹보리
복합비율		 농도(mg/mL) 췌장리파아제 저해능(%)
실시예2 4:1 50 103.45
실시예3 2:1 50 108.37
실시예1 1:1 50 105.62
실시예4 1:2 50 83.30
실시예5 1:4 50 60.98
3-4. 세포 내 cAMP level에 대한 다양한 중량비로 배합한 인디안구스베리와 새싹보리 복합물의 효과 확인
상기 실험방법에서 제시한 제조방법으로 제조한 인디안구스베리추출물과 새싹보리추출물을 다양한 중량비로 배합하여 세포 내 cAMP level을 측정하였다. 도 4 에서 제시된 바와 같이 동일한 농도에서 인디안구스베리와 새싹보리의 단일물은 각각 1479.3±16.8, 1300.0±81.9의 활성을 보였으며 인디안구스베리와 새싹보리의 혼합 비율에 따른 cAMP level은 인디안구스베리:새싹보리의 비율이 4:1, 2:1에서 각각 2472.3±163.8, 2508.3±106.3로, 단일물에 대비하여 현저한 상승효과를 보였다. 그 다음으로는 1:1, 1:2, 1:4에서 측정된 2132.7±149.4, 1763.7±101.1, 1469.7±24.5의 순서로 우수한 활성을 보였다. 이러한 결과에 의하여, 각각의 단일 물질보다 현저한 상승효과를 갖는 인디안구스베리추출물과 새싹보리추출물의 복합물이 cAMP 발현 조절을 통해 지방 분해를 촉진할 수 있음을 확인하였다.
3-5. 세포 내 glycerol release에 대한 다양한 중량비로 배합한 인디안구스베리와 새싹보리 복합물의 효과 확인
상기 실험방법에서 제시한 제조방법으로 제조한 인디안구스베리추출물과 새싹보리추출물을 다양한 중량비로 배합하여 세포 내 glycerol release를 측정하였다. 도 5 에서 제시된 바와 같이 동일한 농도에서 인디안구스베리와 새싹보리의 단일물은 각각 0.55±0.03, 0.47±0.03의 활성을 보였으며 인디안구스베리와 새싹보리의 혼합 비율에 따른 glycerol release는 인디안구스베리:새싹보리의 비율이 4:1, 2:1에서 각각 1.01±0.17, 1.01±0.01로, 단일물에 대비하여 현저한 상승효과를 보였다. 그 다음으로는 1:1, 1:4, 1:2에서 측정된 0.77±0.06, 0.69±0.06, 0.60±0.09의 순서로 우수한 활성을 보였다. 이러한 결과에 의하여, 각각의 단일물질보다 현저한 상승효과를 갖는 인디안구스베리추출물과 새싹보리추출물의 복합물이 지방세포 내 축적된 지방구에 존재하는 트리글리세라이드 즉, 중성지방을 분해하여 글리세롤 방출량이 증가됨을 확인하였다.
3-6. 세포 내 IRS1에 대한 인디안구스베리와 새싹보리 복합물의 상승 효과
상기 실험방법에서 제시한 제조방법으로 제조한 인디안구스베리추출물과 새싹보리추출물을 배합하여 세포 내 P-IRS1/IRS1의 발현 비율을 확인하였다. 도 6 에서 제시된 바와 같이 동일한 농도에서 인디안구스베리와 새싹보리의 단일물은 각각 0.42, 0.32의 발현 비율을 보였으며 인디안구스베리와 새싹보리의 복합물인 실시예3 에서는 0.86의 발현 비율로, 단일물에 대비하여 현저한 상승효과를 보였다. 또한, 50, 100 μg/mL의 처리군에서는 각각 0.51, 0.63의 발현 비율을 보여 인디안구스베리와 새싹보리의 복합물이 농도의존적으로 세포 내 P-IRS1/IRS1의 발현 비율을 증가시켰으며 이러한 결과에 의하여, 인디안구스베리추출물과 새싹보리추출물의 복합물이 P-IRS1/IRS1의 발현 비율을 증가시켜 혈당 흡수 조절 및 당대사로부터 지방 합성을 억제할 수 있음을 확인하였다.
3-7. 세포 내 PI3K에 대한 인디안구스베리와 새싹보리 복합물의 상승 효과
상기 실험방법에서 제시한 제조방법으로 제조한 인디안구스베리추출물과 새싹보리추출물을 배합하여 세포 내 P-PI3K/PI3K의 발현 비율을 확인하였다. 도 7 에서 제시된 바와 같이 동일한 농도에서 인디안구스베리와 새싹보리의 단일물은 각각 1.93, 1.26의 발현 비율을 보였으며 인디안구스베리와 새싹보리의 복합물인 실시예3 에서는 4.31의 발현 비율로, 단일물에 대비하여 현저한 상승효과를 보였다. 또한, 50, 100 μg/mL의 처리군에서는 각각 1.05, 1.47의 발현 비율을 보여 인디안구스베리와 새싹보리의 복합물이 농도의존적으로 세포 내 P-PI3K/PI3K의 발현 비율을 증가시켰으며 이러한 결과에 의하여, 인디안구스베리 추출물과 새싹보리추출물의 복합물이 혈당 흡수 조절 및 당대사로부터 지방 합성을 억제할 수 있음을 확인하였다.
3-8. 세포 내 GLUT4에 대한 인디안구스베리와 새싹보리 복합물의 상승 효과
상기 실험방법에서 제시한 제조방법으로 제조한 인디안구스베리추출물과 새싹보리추출물을 배합하여 세포 내 GLUT4의 발현량을 측정하였다. 도 8 에서 제시된 바와 같이 동일한 농도에서 인디안구스베리와 새싹보리의 단일물은 각각 0.18, 0.11의 발현량을 보였으며 인디안구스베리와 새싹보리의 복합물인 실시예3에서는 0.38의 발현량으로, 단일물에 대비하여 현저한 상승효과를 보였다. 또한, 50, 100 μg/mL의 처리군에서는 각각 0.14, 0.33의 발현량을 보여 인디안구스베리와 새싹보리의 복합물이 농도의존적으로 세포 내 GLUT4의 발현량을 증가시켰으며 이러한 결과에 의하여, 인디안구스베리추출물과 새싹보리추출물의 복합물이 GLUT4 signaling 을 촉진시켜 당대사로부터 지방 합성을 억제할 수 있음을 확인하였다.
3-9. 세포 내 지방 축적 억제에 대한 인디안구스베리와 새싹보리 복합물의 상승 효과
상기 실험방법에서 제시한 제조방법으로 제조한 인디안구스베리 추출물과 새싹보리추출물을 배합하여 지방세포 분화에 미치는 영향을 측정하기 위해 Oil red O 염색을 수행하였다. 도 9 에서 제시된 바와 같이 동일한 농도에서 세포 내 중성지방의 함량은 인디안구스베리와 새싹보리의 단일물이 각각 0.60±0.02, 1.10±0.05를 나타냈으며 인디안구스베리와 새싹보리의 복합물인 실시예3 에서는 0.29±0.03으로, 단일물에 대비하여 현저한 상승효과를 보였다. 또한, 50, 100 μg/mL의 처리군에서는 각각 0.88±0.02, 0.57±0.03으로 인디안구스베리와 새싹보리의 복합물이 농도의존적으로 지방세포 내 지방 축적을 억제하는 것을 확인하였다.
3-10. 인디안구스베리와 새싹보리 복합물이 비만 유도된 마우스의 체중변화에 미치는 영향 확인
상기 실험방법에서 제시한 제조방법으로 제조한 인디안구스베리추출물과 새싹보리추출물을 배합하여 고지방식이로부터 비만 유도된 마우스의 체중변화에 미치는 영향을 확인하고자 실험동물의 체중을 측정하였다. 표 9 에서 제시된 바와 같이 고지방식이에 의해 비만을 유도한 대조군은 30.92±3.53의 체중증가량을 보였으며 인디안구스베리와 새싹보리의 복합물인 실시예3에서는 100, 200, 400 mg/kg 투여군에 따라 각각 28.13±3.93, 25.78±3.35, 24.70±1.85으로, 농도의존적인 체중 감소를 보였다. 식이효율을 비교한 결과에서도 대조군 대비 인디안구스베리와 새싹보리 복합물에서 농도의존적으로 감소하는 것을 확인하여 인디안구스베리추출물과 새싹보리추출물의 복합물이 체중 감소에 우수한 효과를 보이고 있음을 확인하였다.
Figure 112020050526712-pat00001
3-11. 인디안구스베리와 새싹보리 복합물이 비만 유도된 마우스의 장기 및 지방조직 무게 변화에 미치는 영향 확인
상기 실험방법에서 제시한 제조방법으로 제조한 인디안구스베리추출물과 새싹보리추출물을 배합하여 고지방식이로부터 비만 유도된 마우스의 장기 및 지방조직무게 변화에 미치는 영향을 확인하고자 실험동물의 장기(간, 신장, 비장)와 백색지방조직(피하지방, 내장지방(부고환지방 및 복강내 지방))을 측정하였다. 표 10 에서 제시된 바와 같이 고지방식이에 의해 비만 유도한 대조군의 백색지방조직의 총량과 피하지방조직, 내장지방조직의 중량이 각각 7.06±0.72, 3.57±0.62, 3.49±0.32로, 대조군과 비교하여 인디안구스베리와 새싹보리의 복합물인 실시예3 에서는 100, 200, 400 mg/kg투여군에 따라 백색지방조직의 총량이 각각 5.52±0.86, 5.37±0.31, 3.95±0.41로 감소하였으며 피하지방조직의 중량은 2.62±0.43, 2.31±0.18, 1.54±0.31로 감소하고, 내장지방조직의 중량은 2.90±0.67, 3.06±0.14, 2.41±0.15으로 감소하여 인디안구스베리와 새싹보리의 복합물이 농도의존적으로 지방조직의 중량을 감소시키는 것을 확인하여 인디안구스베리추출물과 새싹보리추출물의 복합물이 체지방 축적 억제에 우수한 효과를 보이고 있음을 확인하였다.
Figure 112020050526712-pat00002
3-12. 인디안구스베리와 새싹보리 복합물이 비만 유도된 마우스의 혈당 변화에 미치는 영향 확인
상기 실험방법에서 제시한 제조방법으로 제조한 인디안구스베리추출물과 새싹보리추출물을 배합하여 고지방식이로부터 비만 유도된 마우스의 혈당 변화에 미치는 영향을 확인하고자 실험동물의 혈당을 측정하였다. 도 10 에서 제시된 바와 같이 동일한 농도 400 mg/kg에서 인디안구스베리와 새싹보리의 단일물에서의 혈당 수치는 각각 4.74±0.64, 6.99±0.79을 보였으며 인디안구스베리와 새싹보리의 복합물인 실시예3 에서는 혈당이 4.63±0.51으로, 단일물에 대비하여 현저한 감소 효과를 보였다. 또한, 100, 200, 400 mg/kg의 처리군에서 인디안구스베리와 새싹보리의 복합물이 농도의존적으로 혈당을 감소시키는 것을 확인하여 인디안구스베리추출물과 새싹보리추출물의 복합물이 혈당 감소에 우수한 효과를 보이고 있음을 확인하였다.
3-13. 인디안구스베리와 새싹보리 복합물이 비만 유도된 마우스의 혈중 인슐린 변화에 미치는 영향 확인
상기 실험방법에서 제시한 제조방법으로 제조한 인디안구스베리추출물과 새싹보리추출물을 배합하여 고지방식이로부터 비만 유도된 마우스의 인슐린 변화에 미치는 영향을 확인하고자 실험동물의 혈중 인슐린을 측정하였다. 도 11 에서 제시된 바와 같이 동일한 농도 400 mg/kg 에서 인디안구스베리와 새싹보리의 단일물에서의 혈중 인슐린 수치는 각각 0.67±0.01, 0.76±0.02을 보였으며 인디안구스베리와 새싹보리의 복합물인 실시예3 에서는 혈중 인슐린이 0.56±0.01으로, 단일물에 대비하여 현저한 감소 효과를 보였다. 또한, 100, 200, 400 mg/kg의 처리군에서 인디안구스베리와 새싹보리의 복합물이 농도의존적으로 인슐린을 감소시키는 것을 확인하여 인디안구스베리추출물과 새싹보리추출물의 복합물이 혈중 인슐린 감소에 우수한 효과를 보이고 있음을 확인하였다.
3-14. 인디안구스베리와 새싹보리 복합물이 비만 유도된 마우스의 혈중 당화혈색소(HbA1c) 변화에 미치는 영향 확인
상기 실험방법에서 제시한 제조방법으로 제조한 인디안구스베리추출물과 새싹보리추출물을 배합하여 고지방식이로부터 비만 유도된 마우스의 혈중 당화혈색소 변화에 미치는 영향을 확인하고자 실험동물의 혈중 HbA1c를 측정하였다. 도 12 에서 제시된 바와 같이 동일한 400 mg/kg 농도에서 인디안구스베리와 새싹보리의 단일물에서의 혈중 HbA1c는 각각 7.50±0.11, 9.67±0.57을 보였으며 인디안구스베리와 새싹보리의 복합물인 실시예3 에서는 혈중 HbA1c가 7.15±0.22으로, 단일물에 대비하여 현저한 감소 효과를 보였다. 또한, 100, 200, 400 mg/kg의 처리군에서 인디안구스베리와 새싹보리의 복합물이 농도의존적으로 혈중 HbA1c를 감소시키는 것을 확인하여 인디안구스베리추출물과 새싹보리추출물의 복합물이 혈중 HbA1c의 감소에 우수한 효과를 보이고 있음을 확인하였다.

Claims (13)

  1. 인디안구스베리(Emblica officinalis) 추출물과 새싹보리(Hordeum vulgare) 추출물의 복합물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 비만의 예방, 개선 또는 치료용 조성물로서,
    상기 인디안구스베리 추출물 대비 새싹보리 추출물의 중량비는 4:1 ~ 1:1 (인디안구스베리 추출물: 새싹보리 추출물)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인디안구스베리 추출물 대비 새싹보리 추출물의 중량비는 4:1, 2:1 또는 1:1 (인디안구스베리 추출물: 새싹보리 추출물)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 인디안구스베리 추출물과 새싹보리 추출물의 복합물은 각각의 단일 물질에 대비하여 상승효과를 갖는 것이고,
    상기 인디안구스베리 추출물과 새싹보리 추출물의 복합물은 당뇨의 예방 또는 개선 효과도 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 인디안구스베리 추출물과 새싹보리 추출물의 복합물은 췌장 리파아제의 효소활성을 억제함으로써 지방의 소화 및 흡수를 저해하고, 지방 합성을 억제, 지방 분해를 촉진하여 지방 축적 억제와 체중 감소의 효능을 보유하고; 그리고 혈당의 흡수 조절 및 당대사를 촉진하여 혈당, 인슐린 및 당화혈색소 감소의 효능을 보유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 삭제
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 인디안구스베리 추출물은 산 가수분해 하는 조건에서 1 내지 5 mg/g의 엘라그산(Ellagic acid)을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 인디안구스베리 추출물은 산 가수분해 하지 않는 조건에서 5 내지 25 mg/g의 유리 엘라그산(Free ellagic acid)을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 새싹보리추출물은 6 내지 11 mg/g의 사포나린(Saponarin)을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 인디안구스베리 추출물 또는 새싹보리 추출물은 착즙한 것이거나 또는 물, 탄소수가 1 내지 4의 저급 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나를 추출 용매로 사용하여 추출한 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 인디안구스베리 추출물 또는 새싹보리 추출물은 건조 분말인 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 조성물은 비만의 예방 또는 개선용 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 착즙 및 건조 공정을 포함하여 인디안구스베리 열매로부터 인디안구스베리 추출물을 수득하는 단계;
    착즙 및 건조 공정을 포함하여 새싹보리로부터 새싹보리 추출물을 수득하는 단계; 및
    상기 인디안구스베리 추출물 및 새싹보리 추출물을 4:1 내지 1:1 (인디안구스베리 추출물: 새싹보리 추출물)의 중량비로 혼합하여 복합물을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 비만의 예방, 개선 또는 치료용 조성물의 제조방법.
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