KR102210082B1

KR102210082B1 - AMPK을 활성화시키는 HM-chromanone을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물

Info

Publication number: KR102210082B1
Application number: KR1020190014864A
Authority: KR
Inventors: 한지숙; 박재은; 서영완
Original assignee: 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2019-02-08
Filing date: 2019-02-08
Publication date: 2021-01-29
Also published as: KR20200097459A

Abstract

본 발명은 AMPK(Adenosine monophosphate-activated protein kinase; AMP-activated protein kinase)를 활성화시키는 HM-chromanone을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 근육의 AMPK를 활성화 시켜 세포 내의 포도당 흡수를 촉진시킴으로써, 혈당을 강하시킬 수 있는 AMPK의 활성화가 필요한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

AMPK을 활성화시키는 HM-chromanone을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물 {A pharmaceutical composition comprising HM-chromanone which activates AMPK as an active ingredient}

본 발명은 AMPK(Adenosine monophosphate-activated protein kinase; AMP-activated protein kinase)를 활성화시키는 HM-chromanone((E)-5-hydroxy-7-methoxy-3-(2′-hydroxybenzyl)- 4-chromanone)을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 근육의 AMPK를 활성화 시켜 세포 내의 포도당 흡수를 촉진시킴으로써, 혈당을 강하시킬 수 있는 AMPK의 활성화가 필요한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

당뇨병은 인슐린 분비 결함과 인슐린 저항성으로 인해 혈액 중 포도당 농도가 지나치게 높아져 소변으로 포도당을 배출하고, 혈당의 수치가 정상인보다 훨씬 높아지는 고혈당 증상을 보이는 만성질환이다. 세계적으로 당뇨병환자의 발병 빈도가 급증하는 추세이며, 우리나라에서도 제2형 당뇨병 환자는 성인인구의 10 %, 당뇨전단계인 예비환자는 20 %를 차지함으로서 제2형 당뇨병의 적극적인 예방 및 치료가 요구되고 있다.

당뇨병 치료의 목표는 골격근 및 지방조직과 같은 말초조직에서 포도당 흡수(glucose uptake)를 증가시킴으로써 정상 수준의 혈당으로 유지하는 것이다. 식후 소화관에서 음식물로부터 흡수된 포도당에 의해 혈당이 증가하면 췌장β세포에서 인슐린이 분비되고, 분비된 인슐린은 근육으로 포도당의 흡수를 촉진한다. 따라서 인슐린과 같이 근육을 포함한 말초조직으로 포도당흡수 촉진활성을 가진 물질은 혈중 포도당 농도를 낮추어 혈당 조절에 도움을 줄 수 있다.

최근 AMPK(Adenosine monophosphate-activated protein kinase)가 탄수화물 및 지질대사 그리고 포도당 흡수를 조절하는 역할이 밝혀지면서 AMPK 활성을 증가시키는 물질이 제2형 당뇨병 치료제가 될 수 있음이 제시되고 있다. AMPK가 활성화 되면 이는 세포 내에서 GLUT4의 이동을 세포막으로 증가시키고, AMPK에 의해 이동된 세포막에 있는 GLUT4는 포도당 흡수를 촉진함으로써 혈당을 낮춤이 보고되어 있다. 제2형 당뇨병의 치료제인 비구아나이드 계열의 메트포민은 AMPK의 활성화를 통해 근육세포로 포도당을 이동시키고 간에서 당 신생을 억제하여 혈당을 낮추는 작용이 보고되고 있다.

또한, AMPK는 지방 조직-유래된 2가지 호르몬인 렙틴(leptin)과 아디포넥틴(adiponectin)의 표적분자이며, 상기 호르몬들은 에너지 대사 및 글루코스 항상성의 주요 조절인자(regulator)이다. 이와 같이 축적된 연구 결과들이 AMPK를 제2형 당뇨병, 대사증후군, 고혈압, 심혈관질환 및 비만의 치료를 위한 매력적인 치료적 표적으로 만들고 있으며, AMPK를 활성화시키는 신규 물질에 대한 요구가 꾸준히 있어왔다.

그러나 이러한 약물은 시간이 경과함에 따라 점점 많은 양의 약물이 요구되고, 부작용이 많기 때문에 이를 예방하기 위해 독성은 없으면서 장기간 당뇨 환자들이 섭취하여도 될 안전한 당뇨병 예방 또는 치료제 개발이 시급한 실정이다.

일반적으로 새로운 성분의 약제를 개발하기 위한 여러 가지 방법론 중에서도, 기존 약제의 실험적 변형에 의한 노력보다는 전통의학에서 사용되고 있는 천연물 약제들로부터 새로운 활성 성분을 발견하는 것이 보다 가능성이 높으며, 오랫동안 사용되어 왔기 때문에 합성된 약물들에 의한 독성 염려가 적어지는 장점이 존재한다.

한편, 쇠비름(Portulacaoleracea L.)은 쇠비름과에 속하는 식물로서, 전국의 낮은 산과 들에서 자라는 1년생 초본이다. 꾸준히 먹으면 오래 산다고 하여 일명 '장명채(長命菜)'라고도 하며, 필수지방산인 오메가3 (omega-3), 알칼로이드(alkaloids), 테르페노이드(terpenoid), 쿠마린(coumarin), 플라보노이드(flavonoid)계 성분을 풍부하게 함유하고 있다. 이에 항산화제, 고지혈증, 항염증제, 신경보호 효과 및 항고혈당증과 같은 다양한 생리활성을 가지는 것으로 보고되고 있다.

따라서, 전술한 문제점을 보완하기 위해 본 발명가들은 천연물을 이용하여 AMPK의 활성화가 필요한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 개발이 시급하다 인식하여, 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록특허공보 제10-1190141호

본 발명의 목적은 천연물인 쇠비름 추출물에서 분리한 HM-chromanone ((E)-5-hydroxy-7-methoxy-3-(2′-hydroxybenzyl)-4- chromanone)을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 AMPK(Adenosine monophosphate-activated protein kinase; AMP-activated protein kinase)의 활성화가 필요한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 AMPK의 활성화가 필요한 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 AMPK(Adenosine monophosphate-activated protein kinase; AMP-activated protein kinase)의 활성화가 필요한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품을 제공한다.

이하, 본 명세서에 대하여 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명은 AMPK의 활성화가 필요한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 하기 [화학식 1]로 표시되는 쇠비름 추출물에서 분리된 HM-chromanone((E)-5-hydroxy-7-methoxy-3- (2′-hydroxybenzyl)-4-chromanone)을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.

[화학식 1]

본 발명에 있어서, 상기 쇠비름 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 추출 용매로 추출되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 AMPK의 활성화가 필요한 질환은 제2형 당뇨병, 대사증후군, 고혈압, 심혈관질환, 비알코올성 지방간 또는 비만으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 AMPK의 활성화가 필요한 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 건강기능식품은 상기 [화학식 1]로 표시되는 쇠비름 추출물에서 분리된 HM-chromanone((E)-5-hydroxy-7-methoxy-3- (2′-hydroxybenzyl)-4-chromanone)을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 약학적 조성물 및 건강기능식품에서 언급된 모든 사항을 서로 모순되지 않는 한 동일하게 적용된다.

본 발명의 [화학식 1]로 표시되는 HM-chromanone은 AMPK(AMP-activated Protein Kinase)의 발현 또는 활성을 증대시켜 세포 내 포도당(글루코스)의 흡수를 촉진시킬 수 있으며, 쇠비름 추출물에서 분리된 천연 화합물이기 때문에 장기간 복용 시에도 부작용이 없다.

따라서 상기 [화학식 1]로 표시되는 HM-chromanone을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 약학적 조성물은 AMPK의 활성화가 필요한 질환, 특히 제2형 당뇨병, 대사증후군, 고혈압, 심혈관질환, 비알코올성 지방간 또는 비만 등의 예방 및 치료를 위한 약제로서 사용 가능하다.

도 1은 본 발명의 쇠비름 추출물에서 분리된 HM-chromanone의 (A) ¹H-NMR 및 (B) ¹³C-NMR을 나타낸 그래프이다.
도 2는 실시예 1에서 제조된 쇠비름 80% 에탄올 추출물(A)과 [화학식 1]로 표시되는 HM-chromanone(B)의 포도당 흡수능을 확인한 그래프이다.
도 3은 실시예 1에서 제조된 본 발명의 [화학식 1]로 표시되는 HM-chromanone의 세포 독성을 확인한 그래프이다.
도 4는 실시예 1에서 제조된 본 발명의 [화학식 1]로 표시되는 HM-chromanone의 포도당 흡수에 관련된 IRS-1(A), PI3K(B), AKT(C)에 대한 효과를 확인한 그래프이다.
도 5는 실시예 1에서 제조된 본 발명의 [화학식 1]로 표시되는 HM-chromanone의 포도당 흡수에 관련된 AMPK(A), ACC(B)에 대한 효과를 확인한 그래프이다.
도 6는 실시예 1에서 제조된 본 발명의 [화학식 1]로 표시되는 HM-chromanone의 포도당 흡수 증가효과가 세포 내에서 원형질막(plasma membrane, PM)으로 GLUT4 전이를 증가시켜 포도당 흡수능을 증가시킨 효과를 확인한 그래프이다.
도 7은 실시예 1에서 제조된 본 발명의 [화학식 1]로 표시되는 HM-chromanone의 포도당 흡수능을 인슐린 및 경구혈당강하제인 로지글리타존, 메트포민과 비교하고, 상기 HM-chromanone이 근육세포 L6에서 PI3K/AKT 및 AMPK 경로를 통한 포도당 흡수능 증가를 확인하기 위해 PI3K/AKT 및 AMPK 경로의 저해제인 상기 compound C(AMPK 저해제) 및 wortmannin(PI3K 저해제)을 각각 처리하여 포도당 흡수능을 확인한 그래프이다.

본 발명은 AMPK(Adenosine monophosphate-activated protein kinase; AMP-activated protein kinase)의 활성화가 필요한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품을 제공한다.

이하, 본 명세서에 대하여 더욱 상세하게 설명한다.

약학적 조성물

본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 하기 [화학식 1]로 표시되는 쇠비름 추출물에서 분리된 HM-chromanone((E)-5-hydroxy-7-methoxy-3- (2′-hydroxybenzyl)-4-chromanone)을 유효성분으로 포함할 수 있다.

[화학식 1]

본 발명에 있어서, 상기 쇠비름(마치현, 오행초)은 Portulaca oleracea L.를 학명으로 하는 쇠비름과에 속하는 한해살이풀을 말한다. 상기 쇠비름 줄기의 높이는 15-30 cm 정도이며, 줄기는 가지로 나뉘어 있는데, 아랫부분은 땅을 기고 윗부분은 비스듬히 선다. 잎은 긴 타원형으로 마주나며 잎자루가 없으며 다육질이다. 5-8월경이 되면 5개의 꽃덮이를 가진 꽃이 가지 끝에 2-5개씩 피는데, 꽃자루가 없으며, 아침에 피었다가 한낮이 되면 오므라든다. 7-12개의 수술이 있으며 열매는 개과로, 익으면 위의 반쪽이 모자처럼 떨어진다. 상기 쇠비름은 옥살산 칼슘과 같은 다량의 무기염과 도파민 등을 함유하여 한국과 중국에서는 해독, 이뇨 약 등으로 사용할 수 있으며, 서양에서는 건위, 천식, 방광염 등에 사용할 수 있다고 보고되고 있다.

본 발명의 쇠비름은 자연에서 자생하는 것, 구입하거나 재배한 것을 모두 제한 없이 사용할 수 있으며, 이의 전초, 지상부, 잎, 뿌리, 줄기, 꽃, 종자 등을 모든 부위를 제한 없이 포함하나 바람직하게는 이의 전초, 지상부, 또는 잎 및 꽃을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 "추출물"이란 쇠비름으로부터 분리하여 얻은 물질을 의미하며, 구체적으로는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 추출 용매로 추출된 물질을 모두 포함할 수 있다. 상기 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올은 예를 들어 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 및 n-부탄올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것이 바람직하다. 또한, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올은 무수 또는 함수 알코올을 모두 포함할 수 있다. 상기 알코올, 예컨대 바람직하게는 에탄올은 1 내지 100%(v/v%), 바람직하게는 30 내지 100%, 또는 50% 내지 100%, 더욱 바람직하게는 70 내지 100%, 더더욱 바람직하게는 30%, 50%, 70%, 또는 100% 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 쇠비름 추출물은 상술한 추출 용매에 의한 추출물뿐만 아니라 통상적인 정제과정을 거친 추출물도 제한없이 포함될 수 있다. 예를 들어, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 추출물에 포함된다.

본 발명에 있어서, 상기 쇠비름 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로도 제조될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 쇠비름 추출물은 다음과 같은 단계를 통해 제조될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

(S1) 쇠비름을 건조하고 분쇄하는 단계;

(S2) 분쇄된 쇠비름을 추출하여 추출물을 얻는 단계; 및

(S3) 추출물을 여과한 후 감압 농축하는 단계.

본 발명에 있어서, 상기 (S1) 단계에 사용되는 쇠비름은 자연에서 자생하는 것, 직접 재배한 것 또는 시판되는 것을 제한 없이 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (S2) 단계의 추출은 침지(냉침, 온침) 추출, 열수 추출, 초음파 추출, 초임계 추출 또는 환류 추출법을 제한 없이 사용할 수 있으나, 침지 추출, 초음파 추출, 환류 추출법을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 추출의 추출온도는 15 내지 100 ℃, 바람직하게는 15 내지 80 ℃일 수 있고, 보다 바람직하게는 15 내지 60 ℃일 수 있다. 또한, 상기 추출의 추출 시간은 1 내지 120 시간, 바람직하게는 5 내지 96 시간, 보다 바람직하게는 12 내지 72 시간일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 쇠비름 추출물은 추출 효율에 따라 상기 추출 횟수를 한정하지 않으나, 추출 횟수는 1 내지 10, 바람직하게는 2 또는 5회일 수 있다. 이와 같이 얻어진 쇠비름 추출물은 의약품 원료로 사용하기에 적합하도록 잔존하는 저급 알코올 및 유기 용매를 제거하기 위하여 감압건조, 분무건조, 또는 동결건조 등의 통상적인 건조 방법을 이용하여 분말상태로 제조할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 AMPK의 활성화가 필요한 질환은 상기 AMPK의 활성화가 필요한 질환은 제2형 당뇨병, 대사증후군, 고혈압, 심혈관질환, 비알코올성 지방간 또는 비만으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 예방은 상기 [화학식 1]로 표시되는 쇠비름 추출물에서 분리된 HM-chromanone ((E)-5-hydroxy-7-methoxy-3-(2′-hydroxybenzyl)-4-chromanone)을 유효성분으로 포함하는 조성물의 투여로 AMPK의 활성화가 필요한 질환을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하고, 본 발명에서 치료는, 상기 [화학식 1]로 표시되는 쇠비름 추출물에서 분리된 HM-chromanone을 유효성분으로 포함하는 조성물의 투여로 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 본 발명의 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘, 스티레이드, 탈크 같은 윤활제도 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제와 현탁용제로는 프로필레글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤 및 젤라틴 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 비경구 투여 시 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사를 통하여 투여될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 담체, 부형제 또는 희석제로는 락토즈, 텍스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오즈, 메틸 셀루로오즈, 하이드록시 프로필 메틸 셀룰로오즈, 미정질 셀룰로오즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 플로필히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 이산화규소 등의 광물 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물의 투여량은 약학적으로 유효한 양이어야 한다. 상기 “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 예방 또는 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 제제화 방법, 환자의 상태 및 체중, 환자의 성별, 연령, 질환의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간, 배설 속도, 반응 감응성 등과 같은 요인들에 따라 당업자에 의해 다양하게 선택될 수 있다. 유효량은 당업자에게 인식되어 있듯이 처리의 경로, 부형제의 사용 및 다른 약제와 함께 사용할 수 있는 가능성에 따라 변할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물의 투여량 또는 복용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하나, 성인 기준으로 0.001 mg/kg 내지 1000 mg/kg을 1회 내지 수회에 나누어 복용하는 것이 바람직하다.

건강기능식품

본 발명은 AMPK의 활성화가 필요한 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 건강기능식품은 상기 [화학식 1]로 표시되는 쇠비름 추출물에서 분리된 HM-chromanone을 유효성분으로 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없다. 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 음료, 껌, 비타민 복합제, 드링크제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 건강기능식품은 건강기능음료일 수 있으며, 상기 음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트릴톨 등의 당알콜이다. 또한, 상술한 것 이외의 향미제(사카린, 아스파르탐 등)을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

이상 본 명세서에 기재된 수치 값은 달리 명시되어 있지 않은 한 균등범위까지 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해 질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하세 알려 주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

이하에서 언급된 시약 및 용매는 특별한 언급이 없는 한 Sigma-Aldrich Korea로부터 구입한 것이며, ¹H NMR 및 ¹³C NMR은 Varian Gemini-300 (300MHz) spectrometer (Palo Alto, California, USA) 로 측정하였고, UV는 Varian 5E UV-vis-NIR spectrophotometer (Palo Alto, California, USA)로 측정하였다.

실시예 1. HM-chromanone 제조

1.1 쇠비름 추출물 제조

쇠비름 전체를 정제수로 세척한 후, 0.1 내지 1 cm의 두께로 절단하여 3일 동안 동결 건조하고, 상기 건조된 쇠비름을 분쇄기를 이용하여 150 메쉬(mesh)의 크기로 분쇄하여 분말화 하였다. 상기 쇠비름 분말 200 g에 80% 에탄올(ethanol) 2 L를 넣고 실온에서 24시간 동안 3번씩 반복 추출하였다. 그리고, 상기 추출물을 여과지(Whatman No. 1)를 이용하여 여과시키고, 30분 동안 원심분리를 수행하였다. 마지막으로, 상기 분리된 상등액을 35 ℃에서 감압농축하여 쇠비름 80% 에탄올 추출물을 제조하였다.

1.2 HM-chromanone 제조

상기 쇠비름 80% 에탄올 추출물은 디클로로메탄(CH₂Cl₂, dichloromethane) 및 물(H₂O, water)을 이용하여 1차 분획하고, 디클로로메탄 층은 헥산(C₆H₁₄, n-hexane)과 85% 메탄올 수용액(aq. CH₃OH, aq. mathanol) 으로 다시 분획하였다. 그리고, 5% 메탄올 수용액 층은 C₁₈역상 진공 속성 크로마토그래피(C₁₈reversed-phase vacuum flash chromatography)를 이용하여 80% 메탄올 수용액 분획물을 수득하였다. 상기 80% 메탄올 수용액 분획물을 실리카 순상 컬럼 크로마토그래피(silica normal-phase column chromatography)을 이용하여 5% 메탄올 및 클로로포름(CH₃Cl, chloroform) 혼합 용액의 소분획물(subfraction)을 수득하였다. 최종적으로, 역상 PHLC를 이용하여 상기 5% 메탄올 및 클로로포름(CH₃Cl, chloroform) 혼합 용액의 소분획물에서 [화학식 1]로 표시되는 본 발명의 HM-chromanone을 제조하였다.

[화학식 1]

실험예 1. 포도당 흡수(glucose uptake)능 확인

상기 실시예 1에서 제조된 쇠비름 80% 에탄올 추출물과 [화학식 1]로 표시되는 HM-chromanone의 포도당 흡수능을 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.

[세포 배양]

근육세포인 L6 세포를 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS)이 들어있는 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 5% CO₂, 95% 공기 및 37 ℃의 환경에서 배양하였다. 상기 L6 세포의 분화는 2일 후 1% 우태아혈청으로 보충된 DMEM으로 유도하였으며, 배지는 2일 마다 교체하였다.

상기 분화된 근육세포 L6를 96 well plate에 1Ⅹ10⁴cells/well로 48 시간 동안 배양하였다. 그리고, 각 well에 80 uM의 2-NBDG를 가하고 1시간 후 빙냉(Ice-cold) PBS로 2회 세척하였다. 마지막으로, 1% 우태아혈청이 들어간 DMEM을 첨가한 뒤 형광 흡광도를 이용하여 측정하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2를 참조하면, 상기 실시예 1에서 제조된 쇠비름 80% 에탄올 추출물과 [화학식 1]로 표시되는 HM-chromanone의 포도당 흡수능을 비교하면, 본 발명의 [화학식 1]로 표시되는 HM-chromanone의 포도당 흡수능이 약 2.3 배 이상 높은 것을 확인할 수 있다. 결과적으로, 본 발명의 [화학식 1]로 표시되는 HM-chromanone은 일반적인 쇠비름 추출물과 비교하여 포도당 흡수를 증진시키는 효과가 현저함을 확인할 수 있다.

실험예 2. 세포 독성 확인

상기 실시예 1에서 제조된 본 발명의 [화학식 1]로 표시되는 HM-chromanone의 세포 독성을 확인하기 위하여, 다음과 같이 실험을 수행하였다.

상기 실시예 1에서 분화된 근육세포 L6의 세포 독성 분석은 상기 근육세포 L6를 96 well plate에 1Ⅹ10⁴cells/well로 3시간 배양하고, 상기 실시예 1에서 제조된 0.05, 0.10, 0.25, 0.50, 5.0 10.0 mM 농도를 갖는 HM-chromanone을 첨가하였다. 그리고, 상기 각 well에 100 ul의 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) solution을 첨가하고, 37 ℃에서 4시간 동안 재배양하였다. 상기 각 well의MTT solution을 제거하고 100 ul dimethyl sulfoxide (DMSO)를 첨가하고, 30분 동안 배양한 후 흡광도를 측정하여 세포 독성 정도를 나타내었으며, 그 결과를 도3에 나타내었다.

도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 HM-chromanone을 근육세포 L6에 농도 별로 처리한 경우 세포독성이 나타나지 않음을 확인하였다.

실험예 3. PI3K 및 AKT 신호경로의 활성화 확인

상기 실시예 1에서 제조된 본 발명의 [화학식 1]로 표시되는 HM-chromanone의 포도당 흡수에 관련된 PI3K/AKT 신호전달경로를 분석하기 위해, 포도당 흡수에 중요한 IRS-1, PI3K 및 AKT에 대한 효과를 확인하기 위하여, 다음과 같이 실험을 수행하였다.

상기 실시예 1에서 제조된 본 발명의 HM-chromanone을 농도 별로 처리한 근육세포 L6를 lysis buffer (250 mM Nacl, 25 mM Tris-HCl, 1% v/v NP-40, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, protease inhibitor cocktail)를 첨가하여 얼음에 보관하면서 1시간 동안 볼텍스(vortex)한 후, 4 ℃에서 13,000 rpm으로 15분 동안 원심분리 하여 그 상층액을 취하였다. 상기 상층액의 단백질 농도는 Bio-rad 단백질 정량 시약을 사용하여 정량하고 laemmli sample buffer와 mercapto methanol을 혼합하여 sample을 만들어 웨스턴 블롯(western blot)으로 단백질 발현을 측정하였으며, 인슐린 100 μM을 양성대조군으로 사용하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4를 참조하면, 상기 실시예 1에서 제조된 [화학식 1]의 HM-chromanone을 각각 10 및 20 μM을 처리하였을 때, 티로신 인산화 수용체 기질인 IRS-1의 인산화가 대조군(control)과 비교하여 125.0% 및 181.0%가 증가하였고(A), PI3K의 활성정도는 대조군에 비교하여 각각 101.6% 및 167.2% 증가(B)하였다. 또한, 상기 HM-chromanone을 각각 10 및 20 μM을 처리하였을 때, AKT의 인산화가 대조군과 비교하여 137.7% 및 211.7% 증가하였다(C). 상기 결과로부터, 본 발명의 HM-chromanone은 IRS-1 및AKT를 인산화시키고, PI3K를 활성화시키는 것을 확인할 수 있다.

실험예 4. AMPK 신호경로의 활성화 확인

상기 실시예 1에서 제조된 본 발명의 [화학식 1]로 표시되는 HM-chromanone의 AMPK 인산화 효과를 확인하기 위하여, AMPK 인산화 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 실시하여 상기 단백질의 발현 양상을 확인하였다. 상기 AMPK 활성화에 대한 양성 대조군으로 0.5mM AICAR를 이용하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5를 참조하면, 상기 실시예 1에서 제조된 [화학식 1]의 HM-chromanone에 의해서 혈당조절 주요 단백질인 AMPK의 인산화가 농도 의존적으로 근육세포에서 상당히 증가되는 것을 확인할 수 있다(도 5A). 또한, 10 및 20 μM의 농도를 갖는 HM-chromanone에서 AMPK 인산화 수준은 대조군과 비교하여 각각 154.3% 및 246.1%로 증가하였으며, 20 μM의HM-chromanone가 처리된 경우 양성 대조군으로 사용된 AICAR (214.3%)과 비교하여 1.14배 높은 활성을 나타내었다. 게다가, HM-chromanone을 각각10 및 20 μM을 처리하였을 때, ACC의 인산화가 대조군 보다 141.6% 및 253.9% 증가하였으며(도 5B), 20 μM의 HM-chromanone가 처리된 경우 양성 대조군으로 사용된 AICAR (255.8%)와 유사한 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, 상기 결과로부터, 본 발명의 HM-chromanone으로 유도된 포도당 흡수가 증가된 AMPK 활성화에 주로 기인함을 확인할 수 있다.

실험예 5. 원형질막-GLUT4 발현 효과 확인

포도당 흡수는 당 수송체에 의해서 이루어지는데 이중 glucose transporter 4 (GLUT4)는 골격근, 지방조직 그리고 심장근에 주로 존재하며 인슐린에 매우 민감하게 작용한다.

상기 실시예 1에서 제조된 본 발명의 [화학식 1]로 표시되는 HM-chromanone의 포도당 흡수 증가효과가 세포 내에서 원형질막(plasma membrane, PM)으로 GLUT4 전이를 증가시켜 포도당 흡수능을 증가시키는지 확인하기 위하여, GLUT4 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 실시하여 상기 단백질의 발현을 확인하였다. 상기 실시에 2에서 분화된 근육세포 L6의 원형질막을 이용하여 웨스턴 블롯을 실시하였으며, 상기 HM-chromanone 처리로 인한 원형질막으로 GLUT4 전이와 PI3K/AKT 및 AMPK 경로의 연관성을 증명하기 위해 compound C(AMPK 저해제) 및 wortmannine (PI3K 저해제)을 처리하여 확인하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6을 참조하면, 상기 실시예 1에서 제조된 [화학식 1]의 HM-chromanone의 처리는 농도 의존적으로 원형질막-GLUT4의 발현을 상당히 증가시켰고, 원형질막-GLUT4의 발현은 인슐린을 가한 양성 대조군과 매우 유사하게 증가하였으며, 상기 HM-chromanone이 GLUT4의 세포막 이동을 유도하는 것을 확인하였다. 또한, 상기 20 μM의 HM-chromanone이 처리된근육세포 L6에 PI3K/AKT 및 AMPK 경로의 저해제인 상기 compound C 및 wortmannin을 각각 처리하였을 때 원형질막-GLUT4의 발현이 각각 117.1% 및 120.0%로 유의적으로 억제되는 것을 확인하였다.

상기 결과로부터, 본 발명의 HM-chromanone이 근육세포 L6에서 PI3K/AKT 및 AMPK 경로를 통한 GLUT4의 발현을 증가시켜 세포 내 포도당 흡수를 증가시키는 것을 확인하였으며, 특히 증가된 AMPK 활성화에 주로 기인함을 입증하였다.

실험예 6. 저해제 처리 및 포도당 흡수능 확인

상기 실시예 1에서 제조된 본 발명의 [화학식 1]로 표시되는 HM-chromanone의 포도당 흡수능을 인슐린 및 경구혈당강하제인 로지글리타존, 메트포민과 비교하였다. 또한, 상기 HM-chromanone이 근육세포 L6에서 PI3K/AKT 및 AMPK 경로를 통한 포도당 흡수능 증가를 확인하기 위해 PI3K/AKT 및 AMPK 경로의 저해제인 상기 compound C(AMPK 저해제) 및 wortmannin(PI3K 저해제)을 각각 처리하여 포도당 흡수능을 분석하였다.

상기 실시예 1에서 분화된 근육세포 L6를 96 well plate에 1Ⅹ10⁴cells/well로 48시간 동안 배양하고 실험에 사용하였다. 48시간 동안 배양한 후, 각 well에 20 μM HM-chromanone, 20 μM HM-chromanone+10 μM compound C, 20 μM HM-chromanone+20 μM wortmanine, 양성 대조군인 인슐린 0.1 μM, 경구혈당강하제인 로지글리타존 10 μM, 메트포민 1 mM을 각각 24시간 동안 배양한 뒤 PBS로 2회 세척하였다. 그리고, 각 well에 80 μM의 2-NBDG를 첨가하고, 1시간 후 빙냉(Ice-cold) PBS로 2회 세척하였다. 마지막으로, 1% 우태아혈청이 들어간 DMEM을 첨가한 뒤 형광흡광도를 이용하여 측정하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7을 참조하면, 상기 실시예 1에서 제조된 [화학식 1]의 HM-chromanone 20 μM에서 최대 포도당 흡수 촉진 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 상기 HM-chromanone 20 μM에서 대조군에 비해 2.99배 증가하였으며, 상기 20 μM의 HM-chromanone가 처리된 경우 양성 대조군으로 사용된 인슐린 보다 1.05배, 경구혈당강하제인 로지글리타존 보다 1.19배 높은 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터, 본 발명의 HM-chromanone은 근육세포 L6에서 PI3K/AKT 및 AMPK 경로를 통해 포도당 흡수를 증진 시키는 효과가 있는 것을 확인하였으며, 특히 AMPK 활성화에 주로 기인함을 입증하였다.

이상 설명으로부터, 본 발명에 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다.

Claims

하기 [화학식 1]로 표시되는 쇠비름 에탄올 추출물에서 분리된 HM-chromanone((E)-5-hydroxy-7-methoxy-3-(2-hydroxybenzyl)-4-chromanone)을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 AMPK(Adenosine monophosphate-activated protein kinase; AMP-activated protein kinase)의 활성화가 필요한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
상기 AMPK 활성화가 필요한 질환은 제2형 당뇨병, 대사증후군, 고혈압, 심혈관질환, 비알코올성 지방간 또는 비만으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 AMPK 활성화가 필요한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
[화학식 1]
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하기 [화학식 1]로 표시되는 쇠비름 에탄올 추출물에서 분리된 HM-chromanone((E)-5-hydroxy-7-methoxy-3-(2-hydroxybenzyl)-4-chromanone)을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 AMPK(Adenosine monophosphate-activated protein kinase; AMP-activated protein kinase)의 활성화가 필요한 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품로서,
상기 AMPK 활성화가 필요한 질환은 제2형 당뇨병, 대사증후군, 고혈압, 심혈관질환, 비알코올성 지방간 또는 비만으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 AMPK 활성화가 필요한 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
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