KR20130066323A

KR20130066323A - 비만 예방 및 치료용 조성물과 기능성 식품

Info

Publication number: KR20130066323A
Application number: KR1020110133107A
Authority: KR
Inventors: 이서영; 이혜진; 김진희; 박서영; 황종현
Original assignee: 주식회사 퓨리바이오
Priority date: 2011-12-12
Filing date: 2011-12-12
Publication date: 2013-06-20
Also published as: KR101368723B1

Abstract

본 발명은 침향 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물 및 기능성 식품에 관한 것으로, 침향 추출물은 과도한 지질 생성, 지방 세포의 분화 및 지방의 축적을 억제하여, 비만 및 과도한 지질생성에 관련된 다양한 질환, 예컨대, 고지혈증 또는 지방간의 예방 및 치료에 유용하다.

Description

비만 예방 및 치료용 조성물과 기능성 식품{Composition and functional food for prevention and treatment of obesity}

본 발명은 비만을 비롯한 과도한 지질형성 및 축적에 기인되는 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

비만은 열량 섭취와 소비의 불균형으로 지방 조직이 과다하게 축적된 상태로서, 당뇨병, 고지혈증, 고혈압 및 관상동맥질환과는 밀접한 연관 관계가 있어 광범위하고 심각한 질병의 원인으로 알려져 있다. 또한, 비만이 대장암, 전립선암, 담낭암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 유방암 등의 유병률 및 사망율을 증가시키는 것으로 보고되었으며, 담석 및 담관질환, 골관절염, 월경불순 및 과월경증, 심리적 장애 등 많은 건강상의 문제를 야기할 수 있다(Garfinkel L. Overweight and cancer. Ann Intern Med, 103: 1034-6, 1985). 따라서, 비만을 치료하는 것은 성인병의 치료와 예방에 매우 효과적인 수단으로 판단되고 있다(이흥규, 비만과 관련된 질환, 한국영양학회지, 23;5 pp341-346,1990; William BK, Ralph BD, Janet LC. Effect of weight on cardiovascular disease, AM J Clin Nutr, 63;419S-9S, 1996).

비만 환자는 지방조직(adipose tissue)이 매우 발달 되어 있고, 지방세포(adipocyte)의 숫자와 크기가 정상인에 비해 현저히 증가 되어 있다. 이러한 지방세포의 숫자 및 크기의 증가는 영양 과잉 시에 중성지방을 저장하는 능력을 증가시킨다. 따라서, 지방세포의 분화를 억제하거나 과잉 섭취된 영양분을 흡수하여 지방으로 축적하는 기능을 억제한다면 비만을 치료 또는 예방하는데 유익한 수단을 제공할 수 있게 된다.

지방세포는 지방을 많이 저장하여 비만의 원인으로 작용하며, 내분비세포로서 호르몬, 성장인자, 사이토카인 등을 분비하여 비만으로 인한 합병증을 유발하기도 한다. 지방세포에 의해 분비되는 인자들은 아디포사이토카인이라고 지칭된다.

지방세포에서 발현되는 대표적인 아디포사이토카인인 렙틴은 지방세포 분화의 지표 물질로서, 그 발현 및 분비는 비만을 억제하는 효과가 있다. 렙틴은 주로 시상하부에 작용하여 식욕증진(orexigenic) 펩타이드의 발현을 감소시켜 관련 신경인 NPY(neuroopeptide Y)의 활성을 억제하고, 식욕부진(anorexigenic) 펩타이드의 발현을 증가시켜 관련 신경인 POMC(Pro-opiomelanocortin)을 흥분시켜 음식 섭취를 조절함으로써, 식욕과 체중증가를 억제한다 (Ahima RS, Filer JS, Leptin. Annu Rev Physiol 62:413-437, 2002; Kolaczynski JW, Ohannesian J, Considine RV. Response to leptin to short-term and prolonged overfeeding in humans. J Clin Endocrinol Metab 81:4162-4165, 1996). 비만 쥐 모델인 ob/ob 마우스의 경우 렙틴 유전자가 결핍되어 렙틴 단백질의 발현이 일어나지 않게 되는데, 그 결과 ob/ob 마우스는 음식물 섭취증가, 몸무게 증가, 체지방량 증가가 나타나며, 에너지소모 감소, 면역기능 감소, 성불능 등의 병리현상을 나타낸다 (Jeffery M, Friedman Jeffery L, Halaas: Nature 395:763-770, 2000). 그 밖에 지방세포가 분비하는 아디포사이토카인에는 TNF-알파, IL-6, 마크로파지 콜로니-자극 인자 (macrophage colony-stimulating factor; MCSF), 플라스미노겐 활성자 저해제 (plasminogen activator inhibitor-1; PAI-1), 안지오텐시노겐, 조직 인자 (tissue factor), 전환 성장 인자 (transforming growth factor-β; TGF-β), 아디포넥틴 (adiponectin), 레지스틴 (resistin) 등이 알려져 있으며, 이들의 작용으로 비만 환자에서 혈전증 증가, 동맥경화증 증가, 당뇨병 증가, 고지혈증 증가 등 다양한 합병증이 발생하고 있다.

지방세포 분화와 에너지 흡수 및 지질 생성을 증가시키는 데 필요한 대표적 전사인자는 퍼옥시좀 증식제 활성화 수용체 (Peroxisome proliferator activated receptors; PPARs)로 알려진 PPAR 감마이다. 이는 핵 호르몬 수용체 슈퍼패밀리의 일종으로 PPAR 알파 및 PPAR 델타와 같은 계열의 종류로 알려져 있으며, 이들 PPAR 전사인자들은 레티노이드 X 수용체 (Retinoid X receptor; RXR)알파와 헤테로다이머를 이루어, 표적 유전자의 프로모터 또는 인핸서에 존재하는 퍼옥시좀 증식제 반응 요소 (peroxisome proliferator response element; PPRE)를 인지하고 표적 유전자의 발현을 조절해 나간다. 이들은 비만시에 지방세포에서 발현이 증가한다. 또한, C/EBP 알파도 지방세포의 분화 및 크기 증가에 작용하는 중요한 전사인자로서, C/EBP 알파와 PPAR 감마가 증가하면, 지방세포 특이 단백질인 LPL, aP2, FAS, GPDH 및 GLUT4 등의 발현이 촉진되어 비만이 촉진된다 (Stephens JM, Pekala PH, Transcriptional repression of the GLUT 4 and C/EBP genes in 3T3-L1 adipocytes by tumor necrosis factor-α. J Biol Chem 266:21839-21845,1991). 이와 함께 FATP-1, FAS, CTP-1, ACS-1 등은 지질의 흡수 및 대사과정을 통해 지방세포에 지방을 축적시키는 역할을 수행한다. 또한, HMG 코엔자임 리덕타제 (HMG coenzymeA reductase)는 콜레스테롤을 생합성하는 중요한 효소이다. 따라서, 이와 같은 인자들의 발현을 억제하면 지방조직에 지방산 및 콜레스테롤 축적이 억제되어 비만치료 및 예방 효과를 나타내게 된다.

침향나무(Aquilaria agallocha Roxb.)는 인도, 베트남, 라오스, 중국 등 동남아시아 지역에 분포하는 팥꽃나무과 (Thymelaeaceae) 아킬라리아속(Aquilaria)의 상록교목으로, 상처가 나거나 세균, 곰팡이가 침입하였을 때 방어 작용으로 수지성분을 생성하며, 이 수지 성분이 침착된 수간목이 침향이다. 침향은 오랫동안 약재나 향료로 사용되어 왔으며, 한방에서는 진정, 건위, 통기, 소화불량, 식욕부진, 구토, 기관지천식, 조루, 정력부족 등에 사용되어 왔다. 침향의 약리활성으로서, 중추신경계에 대한 억제작용(Okugawa H., Ueda R., Matsumoto K., Kawanishi K., Kato A.: Effects of agarwood extracts on the central nervous system in mice, Planta Medica, 59, p32, 1993)과 사하작용(Kakino M, Tazawa S, Maruyama H, Truruma K, Araki Y, Shimazawa M, Hara H, Laxative effects of agarwood on low-fiber diet-induced costipation in rats, BMC Compementary and Alternative Medicine, 10, Art. No. 68, 2010)이 보고되었으며, 이밖에 항균효과(Dash M, Patra JK, Panda PP, Phytochemical and antimicrobial screening of extracts of Aquilaria agallocha Roxb, African J. of Biotechnology, 7(20), pp 3531-3534, 2008), 항암효과(Gunasekera S.P., Kinghorn A.D., Cordell G.A., Farnsworth N.R., Plant anticancer agents. XIX. Constituents of Aquilaria Malaccensis. J. of Natural Products, 44(5), pp569-572, 1981), 항염증효과(Antinociceptive and anti-inflammatory activiteies of Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg. Leaves extract, Zhou MH, Wang HG, Suolangjiba, Kou JP, Yu BY, J. of Ethnopharmacology, 117(2), pp 345-350), 항알레르기 효과(Effect of the aqueous extract of Aquilaria agalloch stems on the immediate hypersensitivity reactions, J. of Ethnopharmacology, 58(1), pp31-38, Kim YC, Lee EH, Lee YM, Kim HK, Song BK, Lee EJ, Kim HM)가 보고되었다. 침향은 다른 생약재와 혼합하여 강장용 한방주나 한방음료(대한민국 등록 특허 제0701336호), 혈액순환 촉진용 건강식품(대한민국 등록 특허 제0376306호), 아토피 예방(대한민국 등록 특허 제0894439호)이나 콜라겐 합성 촉진 등의 효과가 있는 화장품(대한민국 등록 특허 제0309071호), 심장질환 및 우울증 완화용 한방 음료(대한민국 등록 특허 제0931880호), 살충제(대한민국 등록 특허 제0486819호)로 개발되어 왔다. 그러나 침향의 항비만 활성에 대해 연구되거나, 보고된 바 없다.

현재, 비만치료제 개발을 위한 많은 연구가 수행되고 있으며, 식욕을 억제하거나 (예, 시부트라민 성분의 리덕틸), 췌장 지방분해효소를 저해하여 지방흡수를 억제 (예, 오르스타트 성분의 제니칼)하여 비만을 치료하는 약제들이 시판되어 우수한 효과를 나타내고 있다. 그러나, 이러한 우수한 효과에도 불구하고, 일부 환자에게 뇌졸증과 심장발작, 위장장애, 과민증, 담즙분비장애, 지용성 비타민 흡수억제 등의 부작용이 보고되고 있다 (Peter C. et al., 2001, Br. J. Clin. Pharmacol. 51:135-141). 따라서 최근에는 부작용이 없는 식품 또는 천연물을 활용하여 항비만 소재를 개발하려는 노력들이 계속되고 있다. 예를 들어, 식욕억제에 관여하는 물질로서 하이드록시시트르산 (HCA), 치커리, 이눌린 등의 식이섬유 등이 있으며, 지방의 소화 및 흡수를 저해하는 물질로서 키토산, 플라보노이드 등이 있다. 그 외 열 발생을 유도하여 지방 축적을 억제하는 물질로서 고추의 캅사이신, 녹차의 카테킨 등이 있고, 지질대사를 조절하는 L-카르티틴, 공액 리놀레산(conjugated linoleic acid; CLA), 우유 칼슘과 관련 단백질 등이 보고되어 있다. 생약재로는 지실, 양하, 결명자, 녹차, 소나무 잎, 괴화, 천궁, 오수유 등이 체중조절에 효과가 있다는 결과가 보고되었다(Kim M. H., 2004, Korean J. Heath Psychol. 9:493-509, Reddy P. et al., 1998, Formulary 33:943-959, Burns A. A. et al., 2002, Eur. J. Clin. Nutr. 56:368-377, Delzenne N. M. et al., 2005, Br. J. Nutr. 1:157-161, Zacour A. C. et al, 1992, J. Nutr. Sci. Vitamilol. 38:609-613, Griffiths D. W. et al., 1986, Adv. Exp. Med. Biol. 1999:509-516). 따라서 소비자들은 약효가 뛰어나면서도 부작용이 적은 천연물 소재 비만치료제에 더 많은 관심이 있으며, 이러한 요구에 부응하고자 안전하고 효능이 우수한 천연약제의 개발이 요망되고 있는 실정이다.

본 발명자들은 놀랍게도 침향이 지방세포 분화, 과도한 지질형성 및 지방축적을 억제하여, 비만 등 과도한 지질형성에 비롯된 질환의 치료 및 예방용 의약품 또는 건강기능식품으로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록 특허 제0701336호 (2006년 12월 20일 공개) 대한민국 등록 특허 제0376306호 (2003년 3월 17일 등록공고) 대한민국 등록 특허 제0894439호 (2009년 4월 22일 등록공고) 대한민국 등록 특허 제0309071호 (2000년 4월 6일 공개) 대한민국 등록 특허 제0931880호(2009년 12월 15일 등록공고) 대한민국 등록 특허 제0486819호 (2002년 11월 23일 공개)

Garfinkel L. Overweight and cancer. Ann Intern Med, 103: 1034-6, 1985 이흥규. 비만과 관련된 질환, 한국영양학회지, 23;5 pp341-346,1990 William BK, Ralph BD, Janet LC. Effect of weight on cardiovascular disease, AM J Clin Nutr, 63;419S-9S, 1996 Ahima RS, Filer JS, Leptin. Annu Rev Physiol 62:413-437, 2002 Kolaczynski JW, Ohannesian J, Considine RV. Response to leptin to short-term and prolonged overfeeding in humans. J Clin Endocrinol Metab 81:4162-4165, 1996 Jeffery M, Friedman Jeffery L, Halaas: Nature 395:763-770, 2000 Stephens JM, Pekala PH, Transcriptional repression of the GLUT 4 and C/EBP genes in 3T3-L1 adipocytes by tumor necrosis factor-α, J Biol Chem 266:21839-21845, 1991 Okugawa H., Ueda R., Matsumoto K., Kawanishi K., Kato A.: Effects of agarwood extracts on the central nervous system in mice, Planta Medica, 59, p32, 1993 Kakino M, Tazawa S, Maruyama H, Truruma K, Araki Y, Shimazawa M, Hara H, Laxative effects of agarwood on low-fiber diet-induced costipation in rats, BMC Compementary and Alternative Medicine, 10, Art. No. 68, 2010 Dash M, Patra JK, Panda PP, Phytochemical and antimicrobial screening of extracts of Aquilaria agallocha Roxb, African J. of Biotechnology, 7(20), pp 3531-3534, 2008 Gunasekera S.P., Kinghorn A.D., Cordell G.A., Farnsworth N.R., Plant anticancer agents. XIX. Constituents of Aquilaria Malaccensis. J. of Natural Products, 44(5), pp569-572, 1981 Zhou MH, Wang HG, Suolangjiba, Kou JP, Yu BY, Antinociceptive and anti-inflammatory activiteies of Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg. Leaves extract, J. of Ethnopharmacology, 117(2), pp 345-350 Kim YC, Lee EH, Lee YM, Kim HK, Song BK, Lee EJ, Kim HM, Effect of the aqueous extract of Aquilaria agalloch stems on the immediate hypersensitivity reactions, J. of Ethnopharmacology, 58(1), pp31-38 Peter C. et al., 2001, Br. J. Clin. Pharmacol. 51:135-141 Kim M. H., 2004, Korean J. Heath Psychol. 9:493-509, Reddy P. et al., 1998, Formulary 33:943-959 Burns A. A. et al., 2002, Eur. J. Clin. Nutr. 56:368-377 Delzenne N. M. et al., 2005, Br. J. Nutr. 1:157-161 Zacour A. C. et al, 1992, J. Nutr. Sci. Vitamilol. 38:609-613 Griffiths D. W. et al., 1986, Adv. Exp. Med. Biol. 1999:509-516

본 발명은 안전하고 효능이 우수한 천연약제로 된 비만 치료 및 예방용 조성물 및 기능성 식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 침향 또는 침향 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만, 고지혈증 및 지방간으로 이루어진 군에서 선택되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 침향은 아킬라리아 (Aquilaria) 속 식물에서 유래된 것을 사용할 수 있으며, 예컨대, 아킬라리아 카시아나 (A. khasiana), 아킬라리아 아피쿠리나 (A. apiculina), 아킬라리아 블리로닐 (A. blillonil), 아킬라리아 바네온시스 (A. baneonsis), 아킬라리아 브라키안타 (A. brachyantha), 아킬라리아 컨밍이아나 (A. cunmingiana), 아킬라리아 필라리아 (A. filaria), 아킬라리아 그란디플로라 (A. grandiflora), 아킬라리아 힐라타 (A. hilata), 아킬라리아 마이크로카파 (A. microcapa), 아킬라리아 로스트라타 (A. rostrata), 아킬라리아 아갈로차 (A. agallocha), 아킬라리아 말라센시스 (A. malaccensis), 아킬라리아 시넨시스 (A. sinensis), 또는 아킬라리아 크라사나 (A. crassna) 등의 줄기 또는 뿌리, 보다 바람직하게는 수지가 침착된 줄기 또는 뿌리를 사용할 수 있다.

본 발명에 의한 침향 추출물은 통상의 제조방법에 따라, 침향을 냉수추출, 열수추출, 유기용매추출 또는 증류 등의 방법으로 추출한 다음, 수득한 추출액을 그대로 사용하거나, 감압 농축 또는 동결 건조함으로써 제조할 수 있다. 예컨대, 침향을 물, 저급 알콜 및 이들의 혼합 용액으로 이루어진 군에서 선택되는 용매로 추출하여 수득한다. 또는 침향을 증류하여 그 증류액을 냉각한 후 오일층만을 취하여 침향오일 분획을 제조할 수 있다. 본 발명의 침향 추출물은 침향으로부터 물 또는 특정 용매를 사용하여 추출하여 수득한 물질 그 자체를 의미할 뿐만 아니라, 때때로 상기 추출하여 수득된 물질을 균주를 통하여 발효시키거나, 에테르 등의 유기 용매로 더욱 분별 추출하거나, 컬럼 (column)을 통하여 분획하는 등의 가공 처리를 거친 추출 가공물 등을 의미할 수 있다. 구체적으로 다음과 같이 제조될 수 있다.

먼저, 선별하여 적절한 크기로 다듬어진 침향을 중량 기준으로 약 1 내지 50배 분량의 물, 에탄올, 메탄올 등과 같은 C₁ 내지 C₄의 저급 알코올, 또는 이들의 혼합용매로, 예컨대 5℃ 내지 100℃에서 약 1 내지 100시간 동안 교반추출, 열탕 추출, 냉침 추출, 환류 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법을 사용하여 수득한 추출액을 여과, 농축 또는 건조하여 침향 추출물을 얻을 수 있다. 필요한 경우, 상기 추출물을 물 또는 저급 알콜, 에테르 등의 유기 용매로 더 추출하여 사용할 수 있다.

또는 침향 또는 침향나무를 잘게 분쇄하여 1일~15일 정도 물에 담그어 불린 다음 증류기에 넣고, 물과 함께 서서히 가열하여 나온 증기를 냉각기를 통하여 냉각하여 증류된 오일과 물을 분리하여 침향오일을 얻을 수 있다. 이렇게 하여 수득한 침향오일에는 침향의 휘발성 물질들을 주로 함유하고 있는데 침향 총추출물을 에테르나 헥산으로 추출한 분획과 성분과 약효가 비슷하다.

본 발명의 침향 추출물은 하기 실험예에 나타낸 바와 같이, PPAR 감마나 C/EBP, FATP-1, SREBP-1, CTP-1 등 지질의 흡수 및 대사과정과 지방세포의 분화에 관여하는 인자의 유전자 발현을 감소시켜, 과도한 지질 형성, 지방 세포의 분화 및 지방의 축적을 현저히 억제한다.

한편, 본 발명에 따른 침향 추출물을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물 또는 기능식품은 통상의 제형화 방법을 통하여 제조할 수 있다. 이때, 침향 추출물 이외에 필요에 따라 다양한 보조 생약제, 비타민, 미네랄, 식이섬유 및 기타 의약용-식품용 보조제(예컨대, 부형제, 증강제, 코팅제 등)등이 함유될 수 있다.

본 발명에 따른 의약 조성물은 침향 추출물 등을 함유함으로써, 비만을 비롯하여, 과도한 지질생성에 관련된 다양한 질환, 예컨대, 고지혈증 또는 지방간의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 침향 추출물을 그 유효성분으로 포함할 수 있고, 당업계에 공지된 의약품 제조 방법에 따라 약학적으로 허용 가능한 담체가 첨가될 수도 있다. 본 발명에서 사용가능한 담체의 예로는, 락토오스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 리파아제 억제제는 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등이 추가로 포함될 수 있다. 본 발명에 따른 의약 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 침향추출물을 함유하는 의약 조성물은 비만의 예방 및 치료, 혈중 중성 지방의 조절, 콜레스테롤 수치의 저하, 혈압 개선, 고지혈증 및 당뇨병의 치료를 위하여 임상적으로 이용될 수 있다. 본 발명에 의한 침향 추출물의 환자 투여량, 투여 횟수 및 투여시간 등은 환자의 성별, 나이, 상태, 체중, 환경 등의 조건에 따라 선택적으로 가감하고 조절할 수 있지만, 일반적으로는 1일 3회 식간에 투여하며, 0.1 mg 내지 1000 mg의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.

본 발명에 따른 기능성 식품은 침향 추출물 등을 함유함으로써, 비만 억제, 고지혈증, 지방간 등에 대한 개선 효과를 발휘할 수 있다. 본 발명에 있어서, 식품이란 직접 섭취가능한 상태의 것뿐 아니라, 식료품, 식품첨가물, 식품재료 등을 포함하는 총괄적인 개념이다. 본 발명에 따른 기능성 식품은 상기 침향 추출물을 단독으로 직접 첨가하여 사용할 수도 있으나, 비만, 고지혈증 등을 예방, 치료하는데 사용되는 공지의 물질 또는 새로운 물질을 첨가하여 상승작용을 나타낼 수도 있다. 또한, 식용색소, 식용향료, 생약초, 과일, 올리고당, 키토산, 구연산 등의 일반적인 첨가제를 사용하여, 좋은 맛과 향을 내도록 할 수도 있다.

본 발명의 침향 추출물이 포함된 기능성 식품으로는 빵, 떡류, 건과류, 캔디류, 초콜릿류, 츄잉껌, 쨈류와 같은 과자류; 아이스크림류, 빙과류, 아이스크림 분말류와 같은 아이스크림 제품류; 우유류, 저지방 우유류, 유당분해우유, 가공유류, 산양유, 발효유류, 버터유류, 농축유류, 유크림류, 버터유, 자연치즈, 가공치즈, 분유류, 유청류와 같은 유가공품류; 식육가공품, 알가공품, 햄버거와 같은 식육제품류; 어묵, 햄, 소세지, 베이컨 등의 어육가공품과 같은 어육제품류; 라면류, 건면류, 생면류, 유탕면류, 호화건먼류, 개량숙면류, 냉동면류, 파스타류와 같은 면류; 과실음료, 채소류음료, 탄산음료, 두유류, 요구르트 등의 유산균음료, 혼합음료와 같은 음료; 간장, 된장, 고추장, 춘장, 청국장, 혼합장, 식초, 소스류, 토마토케첩, 카레, 드레싱과 같은 조미식품; 마가린, 쇼트닝; 및 피자를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 침향 추출물은 과도한 지질 생성, 지방 세포의 분화 및 지방의 축적을 억제하여, 비만 및 과도한 지질생성에 관련된 다양한 질환, 예컨대, 고지혈증 또는 지방간의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 분화 전 지방 세포에 침향 메탄올 추출물(ACR-M), 부탄올 추출물(ACR-B), 물 추출물(ACR-W), 에테르 추출물(ACR-E), 침향오일(ACR-O)을 각각 첨가하여 분화시킨 후의 지방 세포 내에 축적된 지방 입자들의 이미지 결과이다 (대조군: 침향 추출물 미첨가).
도 2는 침향 추출물이 3T3-L1 지방세포의 생존에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 3은 침향 추출물이 렙틴의 유전자 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다 (ND: 분화 전 3T3-L1 지방세포, D: 침향 추출물이 미첨가된 분화 후 3T3-L1 지방세포, ACR-E: 침향 추출물이 첨가된 분화 후 3T3-L1 지방 세포).
도 4는 침향 추출물이 PPAR 감마의 유전자 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다 (ND: 분화 전 3T3-L1 지방세포, D: 침향 추출물이 미첨가된 분화 후 3T3-L1 지방세포, ACR-E: 침향 추출물이 첨가된 분화 후 3T3-L1 지방 세포).
도 5는 침향 추출물이 LPL 유전자 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다 (ND: 분화 전 3T3-L1 지방세포, D: 침향 추출물이 미첨가된 분화 후 3T3-L1 지방세포, ACR-E: 침향 추출물이 첨가된 분화 후 3T3-L1 지방 세포).
도 6은 침향 추출물이 C/EBP 알파 유전자 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다 (ND: 분화 전 3T3-L1 지방세포, D: 침향 추출물이 미첨가된 분화 후 3T3-L1 지방세포, ACR-E: 침향 추출물이 첨가된 분화 후 3T3-L1 지방 세포).
도 7은 침향 추출물이 ACS-1의 유전자 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다(ND: 분화 전 3T3-L1 지방세포, D: 침향 추출물이 미첨가된 분화 후 3T3-L1 지방세포, ACR-E: 침향 추출물이 첨가된 분화 후 3T3-L1 지방 세포).
도 8은 침향 추출물이 FAS 유전자 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다 (ND: 분화 전 3T3-L1 지방세포, D: 침향 추출물이 미첨가된 분화 후 3T3-L1 지방세포, ACR-E: 침향 추출물이 첨가된 분화 후 3T3-L1 지방 세포).
도 9는 침향 추출물이 FATP-1 유전자 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다(ND: 분화 전 3T3-L1 지방세포, D: 침향 추출물이 미첨가된 분화 후 3T3-L1 지방세포, ACR-E: 침향 추출물이 첨가된 분화 후 3T3-L1 지방 세포).
도 10은 침향 추출물이 aP-2유전자 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다 (ND: 분화 전 3T3-L1 지방세포, D: 침향 추출물이 미첨가된 분화 후 3T3-L1 지방세포, ACR-E: 침향 추출물이 첨가된 분화 후 3T3-L1 지방 세포).
도 111은 침향 추출물이 SREBP-1의 유전자 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다 (ND: 분화 전 3T3-L1 지방세포, D: 침향 추출물이 미첨가된 분화 후 3T3-L1 지방세포, ACR-E: 침향 추출물이 첨가된 분화 후 3T3-L1 지방 세포).
도 12는 침향 추출물이 CTP-1효소의 유전자 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다 (ND: 분화 전 3T3-L1 지방세포, D: 침향 추출물이 미첨가된 분화 후 3T3-L1 지방세포, ACR-E: 침향 추출물이 첨가된 분화 후 3T3-L1 지방 세포)

본 명세서에서 사용된 약어의 전체 명칭은 다음과 같다.

PPARγ2: 퍼녹시좀 증식제 활성 수용체 서브타입 γ2

(peroxisome proliferator activated receptor subtype γ2)

SREBP1: 스테롤-조절 요소-결합 단백질

(sterol-regulatory element-binding protein) 1

C/EBP-α: CCAAT/인핸서 결합 단백질-알파

(CCAAT/enhancer binding protein-alpha)

aP2: 증폭 마우스 지방산 결합 단백질

(amplifying mouse fatty acid binding protein; FABP로도 지칭됨) 2

LPL: 리포프로테인 리파제 (Lipoprotein lipase)

FATP-1: FA 수송 단백질 (FA transport protein) 1

FAS: 지방산 합성효소 (Fatty acid synthase)

CTP-1: 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라제 (Carnitine palmitoyltransferase) 1

ACS-1: 아실-CoA 합성효소 (acyl-CoA synthetase)-1

GPDH: 글리세롤 3-인산 디히드로게네이즈(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)

GLUT4: 글루코스 수송체 타입 4 (Glucosr transporter type 4)

실시예1 . 침향 추출물의 제조

침향 400g을 70% 메탄올 5 L에 3시간 동안 환류 추출하는 조작을 3회 반복한 후, 추출액을 농축하여 메탄올 추출물(ACR-M)을 수득하였다. 이 메탄올 추출물에 물과 에테르를 넣어 분별 추출하여 에테르 추출물을 얻고, 남은 물 층에 다시 부탄올을 넣고 분별 추출하여 부탄올 추출물과 물 추출물을 얻었다. 수득된 각 추출물을 각각 감압 농축하여 에테르 추출물(ACR-E), 물 추출물(ACR-W), 부탄올 추출물(ACR-B)을 제조하였다.

실시예2 . 침향 추출물의 제조

침향 100 g을 잘게 분쇄한 후, 물속에 3일 동안 담근 다음, 수증기 증류장치에 넣고 수증기 증류하여 침향오일(ACR-O)을 제조하였다.

하기 실험에서 사용되는 시약 아이소부틸 메틸크산틴, 덱사메타손, 인슐린, MTT는 Sigma (St. Louis, MO)사에서 구입하였다. RNA 추출에 사용된 RNAiso Plus 시약과, cDNA 합성과 실시간 중합 효소 연쇄 반응에 사용된 Primescript TM1ststrandcDNAsynthesis 키트 및 SYBR Premix Ex TaqTMrealtimePCR 키트는 TAKARA BIO Inc. (Otsu, Shiga, JAPAN)사에서 구입하여 사용하였다. 하기 실험들은 3번씩 수행하였으며, 모든 결과는 평균 + 표준 오차 (mean ± SEM(n=3))로 나타내었다. 각 실험의 통계적 유의성을 확인하기 위해 Student's -test를 사용하였고, 유의 확률 0.05 미만일 경우를 유의하다고 정의하였다.

실험예 1. 세포 배양과 지방 세포의 분화

3T3-L1 분화 전 지방세포(American Type Culture Collection 에서 구입)를 10% 우아 혈청 (GIBCO BRL)이 함유된 DMEM 배지에서 (WelGENE, Daegu, KOREA) 배양하였다. 배양기의 온도는 37℃로 유지하며, 5% 이산화탄소 농도를 유지시켰다. 배양 접시에 세포가 꽉 찬 것을 확인하고 이틀 후에 (분화 0일), MDI (아이소부틸 메틸크산틴 1 μg/mL, 덱사메타손 1 μM, 인슐린 1 μg/mL)가 함유된 DMEM 분화 배지로 교환했다. 이로부터 이틀 후 (분화 2일), MDI 배지는 인슐린만 포함된 DMEM 배지로 다시 교환해 주었다. 이틀 후 (분화 4일), 인슐린-DMEM 배지를 10% 우태 혈청(FBS, Lonza, Walkersville, MD USA)이 들어간 DMEM 배지로 교체하고, 5일을 더 배양하였다 (분화 9일). 실시예 1에서 제조한 침향의 메탄올, 부탄올, 물, 에테르 추출물 및 침향오일은 각각 DMSO 또는 물에 녹여 최종 처리 농도가 10 μg/mL이 되도록 하였으며, 분화 기간 동안 배지에 첨가하였다.

분화 전 지방 세포 3T3-L1을 6-웰 플레이트에 2.5×10⁵개 정도 분주하고, 상기 농도의 침향 추출물을 첨가하거나 첨가하지 않은 채 9일 동안 분화시킨 후, 분화된 세포 내에 형성된 지방 입자들의 이미지를 도립 현미경 (Inverted microscope OLYMPUS, IX 51(Olympus Co., Tokyo, JAPAN), 100배율)을 이용해 얻었다. 에테르 추출물(ACR-E)을 가하여 얻어진 이미지를 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 침향 추출물이 첨가되지 않은 대조군의 경우, 다량의 지방 입자가 형성되었지만, 침향 추출물을 첨가한 경우 세포 내 형성된 지방 입자의 수가 현저히 감소하였다. 특히, 침향의 에테르 추출물(ACR-E)과 침향오일(ACR-O)이 지방 세포 분화를 매우 효과적으로 억제함을 알 수 있었다. 이후 가장 효과적인 에테르 추출물(ACR-E)을 사용하여 연구를 수행하여 결과를 도 2 내지 도 12에 표기하였다.

실험예 2. 침향 추출물이 세포 생존에 미치는 효과 ( MTT 검색법)

침향 추출물이 3T3-L1의 생존에 미치는 영향을 테트라졸륨을 이용한 발색 반응(MTT)을 이용하여 알아보았다. 0.5× 10⁵개의 3T3-L1 세포를 24-웰 플레이트에 분주하고, 침향 추출액(ACR-E)을 0.01, 0.1, 1, 10 μg/mL 농도로 첨가하거나, 혹은 첨가하지 않은 조건에서 9일 동안 분화시켰다. 분화된 3T3-L1 세포를 식염수로 2번 세척하고, MTT 용액 100 ml을 첨가한 후 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 1 시간 배양하였다. MTT 용액을 제거한 후 식염수로 1회 세척하고, 100 ml의 DMSO를 넣어 반응액을 추출한 다음, 마이크로 플에이트 리더(GENios A5082, TECAN, Maennedort, Switzerland)를 이용해 570 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

도 2에 나타난 바와 같이 침향 추출물은 지방 세포의 생존에는 거의 영향이 없었다. 세포내 지방 형성을 효과적으로 억제하는 10 μg/mL의 농도에서도 유의성 있는 세포 생존율 감소는 나타나지 않았다. 이로부터, 침향 추출물은 세포 생존에는 영향을 주지 않으면서, 지방 세포로의 분화는 억제하는, 효과적이고 안전한 물질임을 확인할 수 있었다.

실험예 3. RNA 추출과 실시간 중합 효소 연쇄 반응 (Quantitative realtime PCR )

분화 전 3T3-L1 세포를 6-웰 플레이트에 2.5× 10⁵개 분주하고, 10 μg/mL 농도의 침향 추출액(ACR-E)을 첨가하거나 혹은 첨가하지 않은 조건에서 9일 동안 분화시킨 후 총 RNA를 추출하였다. 구체적으로, 분화된 세포를 식염수로 2회 세척하고, RNAiso 시약을 4.00 ㎕ 첨가하여 세포를 용해시켰다. 얻어진 세포 용해액을 원심 분리하여 RNA층을 분리하고, 클로로포름을 가하여 단백질을 제거한 다음, 알코올로 RNA만을 침전시켰다. 얻어진 총 RNA는 NonoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Inc.,RocklandDE)기기를 사용해 농도와 순도를 측정하였다. 1 mg 이하의 총 RNA를 주형으로 사용해서 그에 상보적인 cDNA를 만들었다. cDNA는 PrimeScript^TM 1st strand cDNAsynthsis 키트 (타카라사, 일본)를 이용해 합성하였다. 간략하게, 5 mM 랜덤 6-프라이머, 각 1 mM의 dNTP 용액, 그리고 주형 RNA를 65℃에서 5분간 반응시키고, 얼음으로 옮긴 다음, 반응액에 1 U/ml RNase 저해제, 10 U/ml PrimeCscript^TM역전사 효소, PrimeScript^TM역전사 효소 버퍼를 첨가했다. 이를 30℃에서 10분, 다시 42℃에서 60분간 반응시켰다. 지방 세포의 분화 동안 변화하는 유전자들의 발현 양상을 비교하기 위해, 합성된 cDNA로 실시간 중합 효소 연쇄 반응을 수행하였다. 반응에 SYBR premix Ex Taq^TM 키트 (타카라사, 일본)를 이용하였으며, TAKARA Dice Real Time System 기기로 결과를 분석하였다. 반응 초반, cDNA를 95℃에서 10초간 변성시키고, 95℃에서 5초, 55 - 60℃에서 30초, 40 사이클로 증폭하였다. 증폭된 유전자들의 발현 수준은 β-엑틴 유전자의 전령 RNA 수준과 비교, 분석하였고, 분석 후 1.5% 아가로스 겔에서 전기 영동하여 밴드의 밀도를 이미지로 나타내었다.

지방 세포로의 분화 과정에 관여하는 유전자와 분화 후 유전자 변화가 예상되는 유전자들의 실시간 중합 효소 연쇄 반응에 사용된 각 유전자들의 프라이머들을 하기 표 1에 나타내었다.

상기 각 유전자들의 mRNA 수준을 분석하여 각각 도 3 내지 12에 나타내었다.

도 3은 지방 세포에서 특이적으로 발견되는 아디포사이토카인인 렙틴의 유전자 발현 수준을 나타낸 것이다. 렙틴은 지방세포 분화의 표지 물질로서 여러 실험에 의해 입증된 바와 같이, 지방 세포로 분화됨에 따라 세포내 렙틴의 유전자 발현이 증가되었다(D). 반면, 침향 추출물이 첨가된 세포의 경우(ACR-E), 렙틴의 발현이 거의 분화 전 수준(ND)으로 현저히 억제되었다. 이로써, 침향 추출물은 효과적으로 지방세포로의 분화를 억제함을 확인할 수 있었다.

도 4는 분화된 지방 세포에서 에너지 대사와 지질의 합성에 관여하는 대표적 전사 인자인 PPAR 감마의 유전자 발현 변화를 관찰하여 나타낸 것이다. 분화 배지만을 처리한 세포(D)는 지방 세포로의 분화가 완료되어 분화 전 세포(ND)보다 많은 양의 PPAR 감마가 발현되었으나, 침향 추출물을 첨가한 세포(ACR-E)에서는 지방 세포로의 분화가 약 2.5배 억제되어 대표 인자인 PPAR 감마의 발현이 현저히 억제됨이 확인되었다.

도 5는 LPL의 유전자 발현 정도를 비교하여 나타낸 것이다. LPL은 혈중 지방을 분해하여, 지방 세포에 중성 지방이 축적되도록 하는 효소로서, 예상대로 지방 세포에서 발현양이 증가하였으며(D), 침향 추출물을 처리한 경우(ACR-E), 분화 전 수준(ND)으로 LPL의 유전자 발현이 현저히 억제되었다..

도 6은 분화 과정의 초기 단계에서 조절되는 여러 유전자들의 전사를 조절하는 전사 조절 인자인 C/EBP 알파의 발현 양을 관찰하여 나타낸 것으로서, 침향 추출물을 가한 경우에는, C/EBP 알파의 유전자 발현이 현저히 감소하였다(ACR-E). 반면, 분화 배지만을 처리한 세포는 C/EBP 유전자가 분화 전보다 높은 수준으로 발현되어 분화가 진행되었음을 확인할 수 있었다(D). 즉, 침향 추출물은 지방 세포 분화의 초기 단계에 나타나는 유전자들의 전사를 조절하는 C/EBP 알파를 전사 수준에서 감소시킴을 확인할 수 있었다.

도 7은 침향 추출물에 의한 ACS-1의 유전자 발현 변화를 도시한 것이다. ACS-1은 긴 사슬 지방산을 베타 산화시키시 위해 사립체로 들어가기 전 CoA 유도체로 변환시키는 효소로서, 비만 동물이나 환자의 경우 지방 세포에서 발현양이 포화된 상태로 매우 증가한다. 본 실험 결과에서도 ACS-1의 유전자 발현이 지방 세포로의 분화 후에 매우 증가되어 있으나(D), 침향 추출물을 첨가힌 경우, 그 발현이 현저히 억제됨이 확인되었다(ACR-E).

도 8은 침향 추출물에 의한 FAS 유전자 발현 변화를 도시한 것이다. FAS는 지방산 합성 효소로서, 지방 세포에 지방을 축적시키는데 필요하며, 지방 세포로의 분화 후, 세포 내 발현양이 매우 증가한다. 도 8에서 보인 바와 같이, 침향 추출물이 첨가되는 경우, FAS 발현양이 현저히 감소하였으며(ACR-E), 이로써 지방 세포로의 분화가 억제되었음을 확인할 수 있다.

도 9는 침향 추출물에 의한 FATP-1 유전자 발현 변화를 도시한 것이다. FATP-1는 지방산 운반 단백질로서, 지방산의 흡수를 도와 간이나 지방 조직 또는 세포에 중성 지방이 축적되게 하는 역할을 한다. 당뇨 또는 비만 동물 모델이나 환자의 지방 세포에는 FATP-1의 발현양이 증가해 있음이 보고되었다. 도 9에서 보인 바와 같이, 지방 세포로 분화 후 그 발현양이 증가하나(D), 침향 추출물을 처리한 경우, 그 발현양이 감소하였다(ACR-E).

LPL이나 렙틴 등과 같이 지방 세포 특이적 단백질들 중 하나인 aP-2는 지방 세포 내의 지방산 결합 단백질로서, 세포 내에서 지질 방울들이 나타나게 하는 요인이다.

도 10에 나타난 바와 같이, 분화가 끝난 지방 세포(D)에서는 aP-2의 유전자 발현이 크게 증가된 반면, 침향 추출물을 처리한 경우(ACR-E), 분화 전 수준으로 억제되었다.

도 11은 침향 추출물에 의한 SREBP-1의 유전자 발현 변화를 나타낸 것이다. SREBP-1은 분화된 지방 세포에서 에너지 대사와 지질의 합성에 관여하는 전사 인자로서, 인간 조직이나, 간 세포, 진피 세포, 그리고 지방 세포에 존재하며 포도당, 지방산, 중성 지방 대사에 관여한다. 당뇨나 비만 모델에서 발현양이 증가되는 것으로 알려져 있다. 도 11에서 확인되는 바와 같이, 분화 후 지방 세포(D)에서는 SREBP-1 유전자 발현이 많이 증가되고, 침향 추출물을 처리하는 경우(ACR-E), 분화 세포에 비해, 그 발현양이 2.5배나 감소되었다.

도 12는 CTP-1 효소의 유전자 발현 변화를 나타낸 것으로, CTP-1 효소는 ACS-1처럼 지방산의 베타 산화에 관여한다. 특히, CTP-1 효소는 지방산 산화의 속도를 조절하는 중요한 인자로서, 비만 동물이나 환자의 경우 지방 세포에서 발현양이 포화된 상태로 매우 증가하는 것으로 알려져 있다. 본 실험 결과에서도 도 12에 나타낸 바와 같이, CTP-1의 유전자 발현이 분화 후 지방 세포(D)에서 매우 증가하나, 침향 추출물을 첨가하는 경우(ACR-E), 그 발현양이 감소함을 알 수 있었다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 침향 추출물은 지방 세포의 생존에는 아무런 영향을 나타냄 없이, 지방 세포로의 분화를 억제하여 지질 방울의 축적을 효과적으로 감소시킨다 (도 1 참조). 또한, 도 2 내지 12에서 알 수 있는 바와 같이, 지방 세포에서 포도당, 지방산, 중성 지방의 분해/합성에 관여하는 전사 조절 인자와 그의 영향을 받아 발현하는 대사 효소들의 유전자 발현이 본 발명의 침향 추출물에 의해 현저히 억제됨을 확인하였다. 이로부터, 침향 추출물은 안전하면서도 효과적으로 과도한 지질 생성, 지방 세포의 분화 및 지방의 축적을 억제하여, 비만 및 과도한 지질생성에 관련된 다양한 질환의 치료 및 예방에 활용할 수 있음을 확인할 수 있었다.

Claims

침향 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만, 고지혈증 및 지방간으로 이루어진 군에서 선택되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 침향 추출물은 침향을 물, 저급 알콜 및 이들의 혼합 용액으로 이루어진 군에서 선택되는 용매로 추출하여 수득한 것인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 침향 추출물은 침향을 수증기 증류하여 얻은 침향오일인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 침향은 아킬라리아 (Aquilaria) 속 식물로부터 유래한 것인 조성물.
제4항에 있어서, 상기 침향은 아킬라리아 카시아나 (A. khasiana), 아킬라리아 아피쿠리나 (A. apiculina), 아킬라리아 블리로닐 (A. blillonil), 아킬라리아 바네온시스 (A. baneonsis), 아킬라리아 브라키안타 (A. brachyantha), 아킬라리아 컨밍이아나 (A. cunmingiana), 아킬라리아 필라리아 (A. filaria), 아킬라리아 그란디플로라 (A. grandiflora), 아킬라리아 힐라타 (A. hilata), 아킬라리아 마이크로카파 (A. microcapa), 아킬라리아 로스트라타 (A. rostrata), 아킬라리아 아갈로차 (A. agallocha), 아킬라리아 말라센시스 (A. malaccensis), 아킬라리아 시넨시스 (A. sinensis), 또는 아킬라리아 크라사나 (A. crassna) 로부터 유래한 것인 조성물.
침향 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만, 고지혈증 및 지방간으로 이루어진 군에서 선택되는 질환의 예방 또는 개선용 기능성 식품.