KR102281263B1 - 갈릭산, 에피카테킨(ec), 및 에피갈로카테킨(egc)의 함량이 증가된 카테킨 효소처리물 및 이의 제조방법 - Google Patents

갈릭산, 에피카테킨(ec), 및 에피갈로카테킨(egc)의 함량이 증가된 카테킨 효소처리물 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 갈릭산, 에피카테킨(EC), 및 에피갈로카테킨(EGC)의 함량이 증가된 카테킨 효소처리물의 제조방법, 상기 제조방법에 의해 제조된 카테킨 효소처리물 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

갈릭산, 에피카테킨(EC), 및 에피갈로카테킨(EGC)의 함량이 증가된 카테킨 효소처리물 및 이의 제조방법 {Enzyme treated catechin product containing increased gallic acid, epicatechin and epigallocatechin content and preparation method thereof}
본 발명은 갈릭산, 에피카테킨(EC), 및 에피갈로카테킨(EGC)의 함량이 증가된 카테킨 효소처리물의 제조방법, 상기 제조방법에 의해 제조된 카테킨 효소처리물 및 이의 용도에 관한 것이다.
차나무(Camella sinensis L)는 동백나무과에 속하는 다년생 상록 관목수로 중국과 인도 지역에서 처음으로 재배되었으며, 그 이후 자바, 실론, 미얀마, 태국 등의 동남아 지역과 한국, 일본의 동아시아 지역으로 전파되어 왔고 주로 북위 35℃이하 아시아 지역에서 재배되고 있다.
차나무에서 어린잎을 채취하여 수분 함량을 5% 이하로 건조시킨 다음, 찻잎의 추출과정에서 산화되는 색상에 따라 백차, 홍차, 녹차 등으로 구분되어 사용되고 있으며, 국내에서는 매년 약 250만 톤 규모 이상의 녹차가 지리산 계곡이나 섬진강 유역 그리고 제주도 서귀포 지역 등 연 평균기온 15℃ 이상과 연 평균 강우량이 1,500mm 이상인 자연환경에서 재배되고 있다.
이러한 차의 주 효능 성분 중 하나로 폴리페놀계 화합물인 카테킨을 들 수 있다. 구체적으로, 녹차 카테킨의 주요성분으로는 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG), 에피카테킨 갈레이트(ECG), 에피갈로 카테킨(EGC), 에피카테킨(EC), 갈릭산(Gallic Acid)이 있다.
카테킨은 콜레스테롤 상승 억제 작용이나 α-아밀라아제 활성 저해 작용 등을 갖는 것이 알려져 있다(한국공개특허 제10-2007-0019395호, 한국등록특허 제10-0891393호). 에피카테킨(EC)은 노인성 근육 질환의 치료와 예방에 효능이 있고(한국공개특허 제10-2018-0009938호), 에피갈로 카테킨(EGC)은 항산화 활성이 있으며(한국공개특허 제10-2012-0021407호), 갈릭산은 항산화, 피부 미백, 보습, 주름 예방 및 개선에 탁월한 효과가 있고 특히, 비만의 치료와 예방에 효능이 있는 것 (Anjali Pandey et al. Advances in Research 2(10): 556-570, 2014)으로 보고되었다.
에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG) 및 에피카테킨 갈레이트(ECG)는 탄닌과 함께 쓰고 떫은맛을 내고, 수용화 상태에서 침전을 일으키며 소화효소를 저해하는 단점이 있어, 이를 개선하기 위해 효소를 이용하여 EGCG및 ECG로부터 EGC및 EC로 전환하는 과정이 필요하다.
대부분의 효소는 항상성을 유지하기 위해 반응 후 생산된 반응산물에 의해 활성저해를 일으킨다. 그러나, 특정 효소는 높은 반응기질의 농도에 의해 활성저해가 일어나는데, 이는 효소의 결합 부위에 기질들이 경쟁적으로 결합함으로써 발생하는 것으로 알려져 있다. 이런 경우 기질에 의한 활성저해를 막기 위한 방법으로 효소의 농도를 증가시키거나 반응용액의 부피를 증가시키는 방법이 사용되고 있다.
그러나, 종래의 기술로는 공정이 장시간 소요되며, 탄나아제와 같은 갈레이트 분해효소는 낮은 반응기질 농도에서도 활성이 저해되는 특징을 가지고 있어 상업적으로 고농도의 기질을 처리할 수 있는 방법이 없는 문제점이 있었다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 효소의 불활성화 없이 안정적으로 카테킨의 EGCG 및 ECG를 분해하는 방법을 발명하기 위하여 예의 노력한 결과, 탄나아제 용액에 카테킨 용액을 첨가하는 단계 및 카테킨 용액의 추가 없이 카테킨과 탄나아제를 반응시키는 단계를 연속적으로 반복함으로써, 반응에 사용될 수 있는 총 기질의 양을 증가시키면서도 효소 활성 저해 없이 짧은 시간 안에 효소 반응을 완료하여, EGCG 및 ECG함량은 감소하고, 갈릭산, EC 및 EGC의 함량을 증가시킨 카테킨 효소처리물을 대량생산 할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 탄나아제 용액을 준비하는 제1단계; 탄나아제 용액에 카테킨 용액을 추가로 첨가하는 제2단계; 제2단계의 용액에 포함된 카테킨과 탄나아제를 반응시키는 제3단계; 및 제2단계 및 제3단계를 연속적으로 반복하는 제4단계를 포함하는 카테킨 효소처리물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 갈릭산, 에피갈로카테킨갈레이트(EGCG), 에피카테킨갈레이트(ECG), 에피갈로카테킨(EGC) 및 에피카테킨(EC)의 합 100 중량부를 기준으로 상기 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG) 및 에피카테킨 갈레이트(ECG)의 합을 1 중량부 미만으로 포함하는 카테킨 효소처리물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 카테킨 효소처리물을 포함하는 비만 또는 근육감소증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 카테킨 효소처리물을 포함하는 비만 또는 근육감소증의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 탄나아제 용액을 준비하는 제1단계; 탄나아제 용액에 카테킨 용액을 추가로 첨가하는 제2단계; 제2단계의 용액에 포함된 카테킨과 탄나아제를 반응시키는 제3단계; 및 제2단계 및 제3단계를 연속적으로 반복하는 제4단계를 포함하는, 카테킨 효소처리물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 탄나아제 용액에 카테킨 용액을 첨가하는 단계 및 카테킨 용액의 추가 없이 카테킨 및 탄나아제를 반응시키는 단계를 연속적으로 반복함으로써, 반응에 사용될 수 있는 총 기질의 양을 증가시키면서도 효소 활성 저해 없이 짧은 시간 안에 효소 반응을 완료하여, EGCG 및 ECG함량은 감소하고, 갈릭산, EC 및 EGC의 함량을 증가시킨 카테킨 효소처리물을 대량생산 할 수 있다.
본 발명의 용어 "카테킨 효소처리물"은 카테킨과 효소를 반응시켜 얻어진 물질을 의미하며, 구체적으로 카테킨과 갈레이트 분해효소인 탄나아제를 반응시켜 얻어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 효소처리물은 그대로 이용되거나, 감압농축 또는 동결건조시켜 액상 또는 분말상으로 이용될 수 있다.
본 발명의 용어 "카테킨"은 플라보노이드 그룹의 flavan-3-ols에 속하는 것으로, 폴리페놀의 일종을 의미한다. 카테킨에는 구체적으로 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG), 에피카테킨 갈레이트(ECG), 에피갈로 카테킨(EGC), 에피카테킨(EC), 또는 갈릭산(Gallic Acid) 등이 있다.
본 발명의 용어 "카테킨 용액"은 액상 카테킨을 의미하며, 카테킨을 용매에 용해시킨 것 일 수 있다. 구체적으로, 상기 용매는 카테킨을 용해시키고, 용해된 카테킨과 탄나아제가 반응할 수 있는 한 종류에 제한되지 않으나, 구체적으로 정제수 일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 카테킨은 순도 100%의 카테킨 뿐만 아니라, 다른 물질과 카테킨의 혼합물 일 수 있다. 구체적으로, 상기 혼합물에서 카테킨의 함량은 1 내지 99%, 1 내지 80%, 1 내지 75%, 20 내지 99%, 20 내지 80%, 20 내지 75%, 30 내지 75%일 수 있고, 보다 구체적으로는 33 내지 75%일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 카테킨은 판매되는 것을 구입하거나 카테킨을 함유한 식물로부터 추출 및/또는 분획하여 얻을 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에서 카테킨은 카테킨을 함유한 녹차 추출물 또는 이의 분획물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 Anhui Redstar Pharmaceutical Corp. Ltd.에서 구입한 녹차 카테킨을 이용하여 카테킨 효소처리물을 제조할 수 있다.
본 발명의 용어 "추출물"은 목적하는 물질을 다양한 용매에 침지한 다음, 상온 또는 가온 상태에서 일정시간 동안 추출하여 수득한 액상성분, 상기 액상성분으로부터 용매를 제거하여 수득한 고형분 등의 결과물을 의미할 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 결과물에 더하여, 상기 결과물의 희석액, 이들의 농축액, 이들의 조정제물, 정제물 등을 모두 포함하는 것으로 포괄적으로 해석될 수 있다. 상기 추출물을 수득하기 위한 방법은 녹차 카테킨을 수득할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법의 비제한적인 예로는, 열수 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다. 구체적으로 찻잎을 정제수를 저온농축추출기에 넣고 추출하는 방법을 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 녹차 추출물은 이의 분획물로 제조되어 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "분획물"은 다양한 구성 성분들을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 성분 그룹을 분리하기 위하여 분획을 수행하여 얻어진 결과물을 의미한다.
본 발명에서 상기 분획물을 얻는 분획 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수행될 수 있다. 다양한 용매를 처리하여 수행하는 용매 분획법, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 수행하는 한외여과 분획법, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)를 수행하는 크로마토그래피 분획법, 및 이의 조합 등이 될 수 있다. 본 발명에서 상기 분획물을 얻는 데에 사용되는 용매의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 분획 용매의 비제한적인 예로는 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매 등을 사용할 수 있으며, 상기 유기용매는 탄소수 1 내지 4의 알코올이나, 에틸 아세테이트 또는 아세톤 등의 극성용매, 헥산 또는 디크로로메탄의 비극성용매 또는 이들의 혼합용매를 사용할 수 있다. 또한, 구체적으로 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 에틸 아세테이트 또는 이들의 혼합용매를 사용할 수 있으며, 보다 구체적으로는 에탄올 또는 에틸 아세테이트를 사용할 수 있다.
상기 녹차 추출물 또는 분획물의 카테킨 함량은 추출물 또는 분획물의 총 중량에 대하여 1 내지 99%, 1 내지 80%, 1 내지 75%, 20 내지 99%, 20 내지 80%, 20 내지 75%, 30 내지 75%일 수 있고, 보다 구체적으로는 33 내지 75%일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 카테킨 함량이 34.5%인 녹차 추출물의 에탄올 분획물 770g, 카테킨 함량이 62.1%인 녹차 추출물의 에틸 아세테이트 분획물 430g, 카테킨 함량이 74.1%인 중국산 녹차 카테킨 360g을 각각 2L 정제수에 용해시켜 녹차카테킨 용액을 제조하였다. 이렇게 제조된 녹차 카테킨 추가용액을 분당 16.6ml가 추가되도록 정량펌프를 이용해 탄나아제 용액에 5분간 첨가하고 10분간 반응시키는 방식을 반복하였다. 기질 첨가 후 30분 마다 샘플링하여 EGCG 함량을 측정하였고, 그 결과, 녹차 추출물의 카테킨 함량에 관계 없이 7시간 내에 모두 효소반응이 완료됨을 확인하였다.
본 발명의 용어 "탄나아제"는 탄닌 가수분해 효소로서, 탄닌, 또는 갈산메틸 등의 에스테르 결합을 가수분해하는 효소를 의미한다. 구체적으로, 본 발명에서 탄나아제는 에피카테킨 갈레이트(ECG)를 에피카테킨(EC) 및 갈릭산으로 분해할 수 있고, 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG)를 에피갈로 카테킨(EGC) 및 갈릭산으로 분해할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 kikoman 효소를 사용하였으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "탄나아제 용액"은 탄나아제를 포함하는 용액을 의미하고, 구체적으로 탄나아제 뿐만 아니라 미반응된 카테킨 또는 반응 생성물을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 탄나아제 용액은 제2단계 이후의 반응액일 수 있다.
상기 제1단계는 탄나아제 용액을 준비하는 단계이다. 구체적으로, 정제수에 탄나아제를 넣고 교반하여 준비할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 카테킨 용액과 탄나아제를 반응시키는 제1단계에서 탄나아제의 농도는 탄나아제 용액 부피 및 제2단계에서 첨가되는 카테킨 용액의 부피의 합인 총 용액 부피 대비 1 내지 50 Unit/ml, 1 내지 45 Unit/ml, 1 내지 40 Unit/ml, 1 내지 35 Unit/ml, 보다 구체적으로는 1 내지 20 Unit/ml, 1 내지 16 Unit/ml, 1 내지 10 Unit/ml, 1 내지 5 Unit/ml, 더욱 구체적으로는 4 Unit/ml일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 총 용액 부피는 제2단계가 1회 이상 반복된 제2단계 용액의 최종 부피일 수 있다.
상기 제1단계는 탄나아제를 활성화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 탄나아제 및 정제수를 반응기에 넣고 20 내지 60℃에서 5분 내지 1시간 동안 100 내지 300 rpm으로 교반하여 활성화시키거나, 보다 구체적으로 40℃에서 30분간 200 rpm으로 교반하여 활성화시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 제1단계는 20 내지 60℃에서 수행될 수 있고, 구체적으로 25 내지 60℃, 20 내지 55℃, 30 내지 60℃, 20 내지 50℃, 25 내지 55℃, 30 내지 50℃, 보다 구체적으로는 35 내지 45℃에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 제1단계는 pH 3 내지 6에서 수행될 수 있고, 구체적으로 pH 3.5 내지 6, 3 내지 5.5, 4 내지 6, 4 내지 5, 3.5 내지 5.5, 4 내지 5.5, 3.5 내지 5, 보다 구체적으로 pH 4.5 내지 5.5의 범위에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 제1단계는 0.1 내지 1000rpm의 속도로 교반하여 수행될 수 있고, 구체적으로 10 내지 1000rpm, 0.1 내지 900rpm, 100 내지 900rpm, 150 내지 900rpm, 100 내지 800rpm, 100 내지 700rpm, 100 내지 600rpm, 100 내지 500rpm, 100 내지 400 rpm, 보다 구체적으로 100 내지 300rpm의 속도로 교반하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 제1단계는 1 내지 60분 동안 수행될 수 있고, 구체적으로 4 내지 60분, 1 내지 40분, 4 내지 40분, 1 내지 20분, 보다 구체적으로는 5 내지 20분 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 제2단계는 탄나아제 용액에 카테킨 용액을 첨가하는 단계이다.
제2단계에서 탄나아제 용액은 탄나아제를 포함하는 용액일 수 있고, 구체적으로 탄나아제 뿐만 아니라 미반응된 카테킨 또는 반응 생성물을 포함할 수 있다. 본원발명의 일 실시예에서 탄나아제 용액은 제2단계 이후의 반응액일 수 있다.
상기 제2단계에서 분당 첨가되는 카테킨의 양은 제1단계의 탄나아제 용액 부피 및 제2단계에서 첨가되는 카테킨 용액의 부피 합인 총 용액 부피를 기준으로 0.01 내지 20%(w/v)일 수 있고, 구체적으로 0.01 내지 15%(w/v), 0.01 내지 10%(w/v), 0.01 내지 5%(w/v), 0.01 내지 1%(w/v)일 수 있으며, 보다 구체적으로 0.01 내지 0.8%(w/v), 0.01 내지 0.6%(w/v), 0.01 내지 0.4%(w/v), 0.01 내지 0.2%(w/v), 더욱 구체적으로 0.1%(w/v)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
제2단계는 1 내지 60분 동안 수행될 수 있고, 구체적으로 4 내지 60분, 1 내지 40분, 4 내지 40분, 1 내지 20분, 보다 구체적으로는 5 내지 20분 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 제2단계에서 첨가되는 총 카테킨의 양은 제1단계의 탄나아제 용액 부피 및 제2단계에서 첨가되는 카테킨 용액의 부피 합인 총 용액 부피를 기준으로 0.01 내지 40%(w/v)일 수 있고, 구체적으로 0.01 내지 35%(w/v), 0.01 내지 30%(w/v), 0.01 내지 25%(w/v), 0.01 내지 20%(w/v), 0.01 내지 15%(w/v), 0.01 내지 10%(w/v), 0.3 내지 40%(w/v), 0.3 내지 35%(w/v), 0.3 내지 30%(w/v), 0.3 내지 25%(w/v), 0.3 내지 20%(w/v), 0.3 내지 15%(w/v), 0.3 내지 10%(w/v)일 수 있으며, 보다 구체적으로 0.01 내지 2%(w/v), 0.01 내지 1.5%(w/v), 0.3 내지 2%(w/v), 0.3 내지 1.5%(w/v), 0.4 내지 1.1%(w/v), 더욱 구체적으로 0.5%(w/v)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 총 용액 부피는 제2단계가 1회 이상 반복된 제2단계 용액의 최종 부피일 수 있다.
상기 제3단계는 카테킨 용액의 추가 없이 제2단계의 용액에 포함된 카테킨과 탄나아제를 반응시키는 단계이다.
상기 제3단계는 1 내지 60분 동안 수행될 수 있다. 구체적으로, 제3단계는 4 내지 60분, 1 내지 40분, 4 내지 40분, 1 내지 20분, 1 내지 11분, 4 내지 11분, 보다 구체적으로는 10분 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 제3단계의 반응 온도, pH, 및 교반속도는 상기 제1단계의 반응 온도, pH, 및 교반속도와 같다.
상기 제4단계는 상기 제2단계 및 제3단계를 연속적으로 반복하는 단계이다.
상기 제2단계 및 제3단계를 연속적으로 반복하는 제4단계는 제2단계에서 첨가된 카테킨의 양이 제1단계의 탄나아제 용액 부피 및 제2단계에서 첨가되는 카테킨 용액의 부피 합인 총 용액 부피를 기준으로 1 내지 90%(w/v)가 될 때까지 수행될 수 있고, 구체적으로 5 내지 90%(w/v), 10 내지 90%(w/v), 1 내지 21%(w/v), 1 내지 40%(w/v), 1 내지 60%(w/v), 5 내지 21%(w/v), 5 내지 40%(w/v), 5 내지 60%(w/v), 10 내지 40%(w/v), 10 내지 60%(w/v), 10 내지 21%(w/v), 보다 구체적으로 12%(w/v)가 될 때까지 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는, 정제수 2000g을 반응기에 넣고 구연산과 중탄산나트륨을 각각 발효조의 산, 알칼리 펌프에 첨가한 후 효소처리를 위한 적정 pH인 5.0으로 설정하였다. 정제수에 탄나아제(Tannase KTFH, 500U/g) 24g을 넣고 40℃에서 30분간 200rpm으로 교반하여 활성화시켰다 (제1단계). 녹차 카테킨을 반응기에 첨가하기 위해 녹차 카테킨 360g을 정제수에 용해시켜 1L의 녹차 카테킨 용액을 제조하였다. 이렇게 제조된 녹차 카테킨 용액을 분당 8.3ml의 속도로 정량펌프를 통해 탄나아제 용액에 5분간 첨가하였다 (제2단계). 즉, 상기 제2단계에서는 분당 3g의 녹차 카테킨이 첨가되는 것으로, 분당 0.1% (=
Figure 112019025439311-pat00001
)의 카테킨을 첨가하였고, 상기 제2단계에서 5분간 첨가되는 총 카테킨의 양은 0.5%(=
Figure 112019025439311-pat00002
)였다. 녹차 카테킨 용액 첨가 후, 제2단계 용액에 포함된 녹차 카테킨과 탄나아제를 10분간 반응시켰다 (제3단계). 이어서 분당 3g (0.1%의 녹차 카테킨)의 녹차 카테킨이 첨가되는 속도로 녹차 카테킨 용액을 상기 녹차 카테킨 및 탄나아제 반응액에 5분간 첨가한 후, 10분간 반응시키는 과정을 반복하였다. 첨가된 녹차 카테킨의 총량이 360g (12%(=
Figure 112019025439311-pat00003
)의 녹차 카테킨)이 될 때까지 제2단계 및 제3단계를 반복하였다 (제4단계). 기질 추가에 따른 효소 불활성화 억제 효과를 확인하기 위해 반응액을 15분마다 샘플링하여 EGCG함량을 측정하는 절차를 6시간 동안 반복하며 경시 변화를 관찰하였다. 카테킨 추가가 완료된 후에도 30분 동안 EGCG 함량 변화를 관찰하였다. 그 결과, 6시간 30분만에 효소 반응이 완료되었으며, 녹차 카테킨의 첨가가 완료된 후에도 효소가 불활성화 되지 않았음을 확인하였다 (도 6).
본 발명의 다른 일 실시예에서는, 정제수 2000g을 반응기에 넣고 구연산과 중탄산나트륨을 각각 발효조의 산, 알칼리 펌프에 첨가한 후 효소처리를 위한 적정 pH인 5.0으로 설정하였다. 이후 반응기에 탄나아제(Tannase KTFH, 500U/g) 24g을 넣고 40℃에서 30분간 200rpm으로 교반하여 활성화시켰다. 녹차 카테킨을 반응기에 첨가하기 위해 녹차 카테킨 360g을 정제수에 용해시켜 1L의 녹차 카테킨 용액을 제조하였다. 이렇게 제조된 녹차 카테킨 용액을 분당 8.3ml의 속도로 정량펌프를 통해 탄나아제 용액에 10분간 첨가하였다 (제2단계). 즉, 상기 제2단계에서는 분당 3g의 녹차 카테킨이 첨가되는 것으로, 분당 0.1% (=
Figure 112019025439311-pat00004
)의 카테킨을 첨가하였고, 상기 제2단계에서 10분간 첨가되는 총 카테킨의 양은 1%(=
Figure 112019025439311-pat00005
)였다. 녹차 카테킨 용액 첨가 후, 제2단계 용액에 포함된 녹차 카테킨과 탄나아제를 5분간 반응시켰다 (제3단계). 이어서 분당 3g (0.1%의 녹차 카테킨)의 녹차 카테킨이 첨가되는 속도로 녹차 카테킨 용액을 상기 녹차 카테킨 및 탄나아제 반응액에 10분간 첨가한 후, 5분간 반응시키는 과정을 반복하였다. 첨가된 녹차 카테킨의 총량이 360g (12%(=
Figure 112019025439311-pat00006
)의 녹차 카테킨)이 될 때까지 제2단계 및 제3단계를 반복하였다 (제4단계). 기질 추가에 따른 효소 불활성화 억제 효과를 확인하기 위해 반응액을 15분마다 샘플링하여 EGCG함량을 측정하는 절차를 3시간 동안 반복하며 경시 변화를 관찰하였다. 카테킨 첨가가 완료된 후에도 3시간 동안 EGCG 함량 변화를 관찰하였다. 그 결과, 6시간 만에 효소 반응이 완료되었으며, 녹차 카테킨의 첨가가 완료된 후에도 효소가 불활성화 되지 않았음을 확인하였다 (도 7).
상기 카테킨 효소처리물 제조방법은 제4단계 이후 반응액을 5분 내지 4시간 동안, 80 내지 120℃에서 열처리하여 탄나아제를 불활성화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 반응액을 10분 내지 30분 동안, 90 내지 100℃에서 열처리하여 탄나아제를 불활성화시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 카테킨 효소처리물 제조방법은 제4단계가 완료된 반응액을 여과, 농축 또는 건조시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법에 있어서, 여과는 여과지를 이용하거나 감압여과기를 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 농축은 구체적으로 회전증발농축기를 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기　건조는 구체적으로 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조　또는　동결건조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 보다 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 4단계 반응이 완료된 반응액을 80℃에서 30분간 열처리하여 효소를 불활성화 시킨 후, 반응액을 동결 건조하였다.
상기 카테킨 효소처리물에 의해 제조된 카테킨 효소처리물은 갈릭산, 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG), 에피카테킨 갈레이트(ECG), 에피갈로 카테킨(EGC) 및 에피카테킨(EC)의 합 100 중량부를 기준으로 상기 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG) 및 에피카테킨 갈레이트(ECG)의 합을 1 중량부 미만으로 포함하는 카테킨 효소처리물일 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 카테킨 효소처리물의 제조방법에 의해 제조된 카테킨 효소처리물로서, 갈릭산, 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG), 에피카테킨 갈레이트(ECG), 에피갈로 카테킨(EGC) 및 에피카테킨(EC)의 합 100 중량부를 기준으로 상기 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG) 및 에피카테킨 갈레이트(ECG)의 합을 1 중량부 미만으로 포함하는 카테킨 효소처리물을 제공한다.
구체적으로, 상기 카테킨 효소처리물의 제조방법에 의해 제조된 카테킨 효소처리물은, 갈릭산, 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG), 에피카테킨 갈레이트(ECG), 에피갈로 카테킨(EGC) 및 에피카테킨(EC)의 합 100 중량부를 기준으로 상기 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG) 및 에피카테킨 갈레이트(ECG)의 합을 0.9 중량부 미만, 0.8 중량부 미만, 0.7 중량부 미만, 0.6 중량부 미만, 0.5 중량부 미만, 0.4 중량부 미만, 0.3 중량부 미만, 0.2 중량부 미만, 0.1 중량부 미만으로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는, 상기 카테킨 효소처리물의 제조방법에 의해 제조된 카테킨 효소처리물에서 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG) 및 에피카테킨 갈레이트(ECG)의 함량이 측정되지 않았다(표 4).
이와 같이 상기 카테킨 효소처리물의 제조방법에 따라 제조된 카테킨 효소처리물은 쓰고 떫은맛을 내며 소화효소를 저해하는 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG) 및 에피카테킨 갈레이트(ECG) 함량은 감소하고, 갈릭산, 에피카테킨(EC) 및 에피갈로 카테킨(EGC)의 함량은 증가된 효과를 나타낸다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 카테킨 효소처리물을 포함하는 비만 또는 근육감소증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
이때, 상기 "카테킨 효소처리물"은 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어 "비만"이란, 에너지 불균형에 의하여 과다한 체지방을 가진 상태(condition) 또는 질환(disease)을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서는, 녹차 카테킨 효소처리물을 첨가하여 3T3-L1 지방전구세포를 배양한 결과, 지방전구세포의 지방세포 분화 및 중성지방 생성 억제 효과, AMPK 활성화 효과가 나타난 바, 녹차 카테킨 효소처리물은 비만을 예방 또는 치료하는 약학적 조성물로 사용될 수 있음을 확인하였다(도 13 및 14).
본 발명의 다른 일 실시예에서는, 녹차 카테킨 효소처리물을 첨가하여 3T3-L1 지방전구세포를 배양한 결과, 백색지방의 갈색지방화를 일으키는 UCP1 및 PRDM16의 발현이 증가하는 효과가 나타난 바, 녹차 카테킨 효소처리물은 비만을 예방 또는 치료하는 약학적 조성물로 사용될 수 있음을 확인하였다(도 15).
본 발명의 또 다른 일 실시예에서는, 고지방식이를 섭취하는 마우스에 녹차 카테킨 효소처리물을 경구 투여한 결과, 정상식이를 섭취한 대조군과 비슷한 수준으로 체중이 증가한 바, 녹차 카테킨 효소처리물은 비만을 예방 또는 치료하는 약학적 조성물로 사용될 수 있음을 확인하였다(도 16).
본 발명의 용어 "근육감소증(sarcopenia)"이란, 근육의 밀도와 기능이 점차적으로 약화되는 것을 의미하며, 그 원인으로는 척수 신경이나 간뇌에 있는 운동신경세포 또는 근육세포의 진행성 변성 및 파괴가 알려져 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 녹차 카테킨 효소처리물을 첨가하여 C2C12 근육세포를 배양한 결과, 근육세포 분화 촉진, p-AMPK 활성화, 및 폴리스타틴 발현 증가 효과가 나타난 바, 녹차 카테킨 효소처리물은 근육감소증을 예방 또는 치료하는 약학적 조성물로 사용될 수 있음을 확인하였다 (도 10 내지 도 12).
본 발명의 용어 "예방"은 본 발명의 약학적 조성물의 투여를 통해 비만 또는 근육감소증을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, 본 발명의 용어 "치료"는 본 발명의 약학 조성물을 투여함으로써 비만 또는 근육감소증이 호전 또는 완화되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어 "약학적 조성물"은 질병의 예방 또는 치료를 목적으로 제조된 것을 의미하며, 각각 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨대, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 제형화할 수 있고, 외용제, 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는　비만 또는 근육감소증(sarcopenia)의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 형태로 제조될 수 있는데, 상기 담체는 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 구체적인 투여량은 제제화 방법, 환자의 상태 및 체중, 환자의 성별, 연령, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간, 배설 속도, 반응 감응성 등과 같은 요인들에 따라 당업자에 의해 다양하게 선택될 수 있으며, 투여량 및 횟수는 어떠한 면에서든 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있으며, 예를 들어 경구, 정맥, 근육 또는 피하 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 카테킨 효소처리물을 포함하는 비만 또는 근육감소증의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "카테킨 효소처리물", "비만", "근육감소증", 및 "예방"은 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어 "개선"은, 상기 조성물의 투여로 비만 또는 근육감소증이 호전되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어 "식품"은, 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스텍류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강 기능　식품　및 건강　식품　등이 있으며, 통상적인 의미의　식품을 모두 포함한다.
상기 건강기능(성)　식품(functional food)이란, 특정보건용　식품(food for special health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은　식품을 의미한다. 여기서 "기능(성)"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의　식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기　식품의 제형 또한　식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의　식품용　조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리　식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의　식품은 면역증진 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
상기 건강　식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는　식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)는 건강보조 목적의　식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능　식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 호용된다.
구체적으로, 상기 건강 기능　식품은 카테킨 효소처리물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의　식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한　식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리　식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.
본 발명의　식품　조성물은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 높은 면역증진 효과를 기대할 수 있어 매우 유용하다.
상기　조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.
또한, 상기　조성물은　식품　조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.
또한, 상기　조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의　식품　첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은　식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
상기 카테킨 효소처리물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는　식품　성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 함량을 포함할 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의　식품　조성물의 일 예로 건강음료　조성물으로 사용될 수 있으며, 이 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.
상기 외에 건강음료　조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명의　식품　조성물은 비만 또는 근육감소증의 예방 또는 개선 효과를 나타낼 수 있다면 다양한 중량%로 포함할 수 있으나, 구체적으로 카테킨 효소처리물을　식품　조성물의 총중량 대비 0.00001 내지 100 중량% 또는 0.01 내지 80 중량%로 포함할 수 있다.
본 발명은 탄나아제 용액에 카테킨 용액을 첨가하는 단계 및 카테킨 용액의 추가 없이 카테킨과 탄나아제를 반응시키는 단계를 연속적으로 반복함으로써, EGCG 및 ECG함량이 감소한 카테킨 효소처리물을 제조할 수 있다. 상기 제조방법을 이용하면 효소 활성 저해 없이 짧은 시간 안에 효소 반응을 완료할 수 있어, 본 발명은 카테킨을 탄나아제로 처리하여 유용한 산물을 생산하는 대규모 공정에 널리 활용될 수 있다. 또한, 상기 카테킨 효소처리물은 갈릭산, EC 및 EGC의 함량이 증대되어, 비만 또는 근육감소증의 예방 또는 치료효과를 가질 수 있다.
도 1은 탄나아제 효소 처리를 통한 녹차 카테킨의 성분 전환을 나타낸 것이다.
도 2는 녹차 카테킨 효소처리물의 제조 공정 모식도이다.
도 3은 용액 대비 탄나아제 농도 4 unit에서 첨가된 카테킨의 총량이 12%가 되도록 분말 카테킨을 1%씩 연속 첨가한 결과로서, 카테킨 및 탄나아제 반응액의 EGCG 함량을 30분 간격으로 측정하여 나타낸 그래프이다. 그래프 상에 기재된 수치(%)는 누적된 카테킨의 첨가량을 나타낸다.
도 4는 용액 대비 탄나아제 농도 4 unit에서 분당 첨가되는 카테킨의 양이 0.1% (카테킨 3g/3000mL), 첨가되는 카테킨의 총량이 12% (카테킨 360g/3000mL)가 되도록 카테킨 용액을 분당 8.3ml씩 연속 첨가한 결과로서, 카테킨 및 탄나아제 반응액의 EGCG 함량을 15분 간격으로 측정하여 나타낸 그래프이다. 그래프 상에 기재된 수치(%)는 누적된 카테킨의 첨가량을 나타낸다.
도 5는 용액 대비 탄나아제 농도 4 unit에서 분당 첨가되는 카테킨의 양이 0.07% (카테킨 2g/3000mL), 첨가되는 카테킨의 총량이 12% (카테킨 360g/3000mL)가 되도록 카테킨 용액을 분당 6ml씩 연속 첨가한 결과로서, 카테킨 및 탄나아제 반응액의 EGCG 함량을 15분 간격으로 측정하여 나타낸 그래프이다. 그래프 상에 기재된 수치(%)는 누적된 카테킨의 첨가량을 나타낸다.
도 6은 용액 대비 탄나아제 농도 4 unit에서 분당 첨가되는 카테킨의 양이 0.1% (카테킨 3g/3000mL), 첨가되는 카테킨의 총량이 12% (카테킨 360g/3000mL)가 되도록 카테킨 용액을 분당 8.3ml씩 5분간 첨가하고 10분간 반응시키는 과정을 반복한 결과로서, 카테킨 및 탄나아제 반응액의 EGCG 함량을 15분 간격으로 측정하여 나타낸 그래프이다. 그래프 상에 기재된 수치(%)는 누적된 카테킨의 첨가량을 나타낸다.
도 7은 용액 대비 탄나아제 농도 4 unit에서 분당 첨가되는 카테킨의 양이 0.1% (카테킨 3g/3000mL), 첨가되는 카테킨의 총량이 12% (카테킨 360g/3000mL)가 되도록 카테킨 용액을 분당 8.3ml씩 10분간 첨가하고 5분간 반응시키는 과정을 반복한 결과로서, 카테킨 및 탄나아제 반응액의 EGCG 함량을 15분 간격으로 측정하여 나타낸 그래프이다. 그래프 상에 기재된 수치(%)는 누적된 카테킨의 첨가량을 나타낸다.
도 8은 용액 대비 탄나아제 농도 4 unit에서 분당 첨가되는 카테킨의 양이 0.1% (카테킨 3g/3000mL), 첨가되는 카테킨의 총량이 20% (카테킨 600g/3000mL)가 되도록 카테킨 용액을 분당 8.3ml씩 5분간 첨가하고 10분간 반응시키는 과정을 반복한 결과로서, 카테킨 및 탄나아제 반응액의 EGCG 함량을 30분 간격으로 측정하여 나타낸 그래프이다. 그래프 상에 기재된 수치(%)는 누적된 카테킨의 첨가량을 나타낸다.
도 9는 본 발명의 비교예 1 및 실시예 1에 따라 제조된 녹차 카테킨 효소처리물의 성분을 분석한 HPLC 크로마토그램이다.
도 10은 본 발명의 비교예 1 및 실시예 1에 따라 제조된 녹차 카테킨 효소처리물을 C2C12 근육전구세포에 처리한 결과로서, 분화된 근육세포의 근섬유 직경을 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명의 비교예 1 및 실시예 1에 따라 제조된 녹차 카테킨 효소처리물을 C2C12 근육전구세포에 처리한 결과로서, 분화된 근육세포의 근섬유 길이를 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명의 비교예 1 및 실시예 1에 따라 제조된 녹차 카테킨 효소처리물을 C2C12 근육전구세포에 처리한 결과로서, AMPK 활성 및 근육성장인자의 발현을 나타내는 웨스턴 블롯 사진이다.
도 13은 본 발명의 비교예 1 및 실시예 1에 따라 제조된 녹차 카테킨 효소처리물을 3T3-L1 지방전구세포에 각각 25 ug/ml 및 50 ug/ml씩 처리한 결과로서, 지방세포의 지방축적율을 나타낸 그래프이다.
도 14는 본 발명의 비교예 1 및 실시예 1에 따라 제조된 녹차 카테킨 효소처리물을 3T3-L1 지방전구세포에 처리한 결과로서, 지방세포의 AMPK 활성을 나타내는 웨스턴 블롯 사진이다.
도 15는 본 발명의 비교예 1 및 실시예 1에 따라 제조된 녹차 카테킨 효소처리물을 3T3-L1 지방전구세포에 처리한 결과로서, 백색지방의 갈색지방화에 관여하는 유전자인 UCP1, PRDM16 및 PGC1a의 mRNA 발현 정도를 나타내는 그래프이다.
도 16은 본 발명의 비교예 1 및 실시예 1에 따라 제조된 녹차 카테킨 효소처리물을 처리한 마우스의 체중 변화를 나타낸 그래프이다. 대조군 1은 정상식이만 공급한 정상대조군, 대조군 2는 고지방식이만 공급한 음성대조군, 처리군 1은 고지방식이를 공급하고 실시예 1에 따라 제조된 녹차 카테킨 효소처리물 50mg/kg을 투여한 실험군, 처리군 2는 고지방식이를 공급하고 실시예 1에 따라 제조된 녹차 카테킨 효소처리물 100mg/kg을 투여한 실험군, 처리군 3은 고지방식이를 공급하고 실시예 1에 따라 제조된 녹차 카테킨 효소처리물 200mg/kg을 투여한 실험군, 비교군 1은 고지방식이를 공급하고 비교예 1에 따라 제조된 녹차 카테킨 효소처리물 300mg/kg을 투여한 실험군이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이에 의해 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용된 카테킨은 녹차 카테킨으로, Anhui Redstar Pharmaceutical Corp. Ltd.에서 구입하여 사용하였고, 녹차 카테킨 분해효소인 탄나아제(tannase)는 500 Unit/g의 Tannase-KTFH를 Kikkoman에서 구입하여 사용하였다.
비교예 1: 추가로 카테킨을 첨가하지 않는 녹차 카테킨 효소처리물 제조
반응기에 녹차 카테킨 360g 및 정제수 3000g을 투입하고, 구연산과 중탄산나트륨을 첨가하면서 효소처리를 하기 위한 적정 pH인 pH 5.0으로 조정한 후, 5분 동안 60rpm으로 교반하였다. 반응액에 탄나아제를 24g 첨가한 후, 40℃에서 6시간 동안 반응을 진행하고, 80℃에서 30분간 반응시켜 효소를 불활성화 하여 효소처리물을 제조하였다.
비교예 2: 녹차 카테킨 효소처리물 제조 및 EGCG 함량 측정
비교예 2-1: 분말 카테킨을 1%씩 연속 첨가하여, 첨가된 카테킨의 총량이 12%인 조건
정제수 500g에 구연산과 중탄산나트륨을 첨가하여 효소처리를 하기 위한 적정 pH인 5.0으로 조정한 후, 탄나아제 4g을 첨가하고 40℃에서 5분 동안 60rpm으로 교반하여 활성화시켰다. 탄나아제 용액에 녹차 카테킨 5g을 첨가하여 40℃에서 반응시키고, 30분마다 샘플링하여 EGCG 함량을 측정하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 효소 농도 4U/ml에서 카테킨 농도 1%를 30분 만에 분해 완료하여 9%까지 4시간 30분 만에 효소처리를 완료했으며, 용액 대비 카테킨 농도 10%부터는 1%를 분해하는데 1시간씩 걸려 총 카테킨 농도 12%를 7시간 30분에 걸쳐 분해를 완료하였다.
비교예 2-2: 분당 첨가되는 카테킨의 양이 0.1% (카테킨 3g/3000mL)가 되도록 카테킨 용액을 분당 8.3ml씩 연속 첨가하여, 첨가된 카테킨의 총량이 12%(카테킨 360g/3000mL)인 조건
정제수 2000g을 반응기에 넣고 구연산과 중탄산나트륨을 각각 발효조의 산, 알칼리 펌프에 첨가한 후 효소처리를 하기 위한 적정 pH인 5.0으로 설정한다. 정제수에 탄나아제 24g을 넣고 40℃에서 30분간 200rpm으로 교반하여 활성화시켰다. 녹차 카테킨을 반응기에 첨가하기 위해 녹차 카테킨 360g을 정제수에 용해시켜 1L의 녹차 카테킨 용액을 제조하였다. 이렇게 제조된 녹차 카테킨 용액을 분당 3g (기질 0.1%)의 카테킨이 추가되는 속도로 정량펌프를 통해 2시간 동안 연속 첨가하였고, 15분마다 반응액을 샘플링하여 EGCG함량을 측정하였다. 카테킨 첨가가 완료된 후에도 3시간 동안 EGCG 함량 변화를 관찰하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 카테킨 첨가 시작 후 45분 구간까지는 EGCG 함량이 증가하지 않다가 1시간 구간부터 EGCG가 축적되기 시작하여, 카테킨 첨가가 끝난 2시간 구간(기질 12%)에서 효소가 완전히 불활성화 됨을 확인하였다. 또한, 1시간 30분 구간부터 기질 첨가량 대비 쌓이는 EGCG의 양이 동일하게 유지된다는 사실을 바탕으로, 상기 실험 조건에서 효소 활성이 완전히 저해되는 기질 저해 임계점이 EGCG 함량 기준으로 4mg/ml 내지 8mg/ml 사이에서 형성되며, 이후 구간에서 계속 기질이 첨가될 경우 효소가 완전히 불활성화 되는 것으로 판단된다.
비교예 2-3: 분당 첨가되는 카테킨의 양이 0.07% (카테킨 2g/3000mL)가 되도록 카테킨 용액을 분당 6ml씩 연속 첨가하여, 첨가된 카테킨의 총량이 12%(카테킨 360g/3000mL)인 조건
정제수 2000g을 반응기에 넣고 구연산과 중탄산나트륨을 각각 발효조의 산, 알칼리 펌프에 첨가한 후 효소처리를 하기 위한 적정 pH인 5.0으로 설정한다. 정제수에 탄나아제 24g을 넣고 40℃에서 30분간 200rpm으로 교반하여 활성화시켰다. 녹차 카테킨을 반응기에 첨가하기 위해 녹차 카테킨 360g을 정제수에 용해시켜 1L의 녹차 카테킨 용액을 제조하였다. 이렇게 제조된 녹차 카테킨 용액을 분당 2g (기질 0.07%)의 카테킨이 추가되는 속도로 정량펌프를 통해 3시간 동안 연속 첨가하였고, 15분마다 반응액을 샘플링하여 EGCG함량을 측정하였다. 카테킨 첨가가 완료된 후에도 3시간 동안 EGCG 함량 변화를 관찰하였다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 기질 첨가 시작 후 1시간 구간부터 EGCG가 축적되기 시작하여 기질 첨가가 끝나는 3시간 구간(12%)까지 EGCG 함량이 꾸준히 증가하였지만, 기질 첨가 완료 후에도 효소가 불활성화되지 않아 5시간 구간에서 효소 처리가 완료됨을 확인하였다. 상기 실험 결과를 통해 기질 저해 임계점에 도달하여 EGCG가 계속해서 쌓이더라도 비가역적 효소 불활성화 농도를 넘지 않을 경우 충분한 시간을 주면 효소 활성이 유지되어 쌓여있던 기질의 처리가 가능한 것을 확인하였다. 그러나 기질 첨가 종료시점의 EGCG 함량이 7 mg/ml로 비가역적 효소 불활성화 구간에는 들어가지 않지만, 기질 저해 임계점에 포함되고 있어 대량 공정 시 효소 불활성화의 위험이 있을 수 있는 점을 확인하였다.
실시예 1: 녹차 카테킨 효소처리물 제조
정제수 2000g을 반응기에 넣고 구연산과 중탄산나트륨을 각각 발효조의 산, 알칼리 펌프에 첨가한 후 효소처리를 위한 적정 pH인 5.0으로 설정하였다. 반응액에 탄나아제 24g을 넣고 40℃에서 30분간 200rpm으로 교반하여 활성화시켰다. 녹차 카테킨을 반응기에 첨가하기 위해 녹차 카테킨 360g을 정제수에 용해시켜 1L의 녹차 카테킨 용액을 제조하였다. 이렇게 제조된 녹차 카테킨 용액을 분당 3g (기질 0.1%)의 카테킨이 첨가되는 속도로 정량펌프를 통해 5분간 첨가하고 10분간 반응시키는 방식을 반복하여 6시간 동안 반응을 진행하였다. 반응액을 80℃에서 30분간 반응시켜 효소를 불활성화 시킨 후, 반응액의 동결 건조를 진행하였다.
실시예 2: 녹차 카테킨 효소처리물 제조 및 EGCG 함량 측정
본 발명에서 사용된 카테킨은 녹차 카테킨으로 Anhui Redstar Pharmaceutical Corp. Ltd.에서 구입하여 사용하였고, 녹차 카테킨 분해효소인 탄나아제(tannase)는 500 Unit/g의 Tannase-KTFH를 Kikkoman에서 구입하여 사용하였다.
하기 표 1에 나타낸 조건으로 실시예 2-1 내지 2-3을 실시하였다.
단계 세부항목 실시예 2-1 실시예 2-2 실시예 2-3
탄나아제 용액을 준비하는 제1단계 정제수 (g) 2,000 2,000 1,400
탄나아제 (g) 24 24 24
카테킨 용액을 첨가하는 제2단계 첨가되는 카테킨 용액의 농도 (g/L) 360 360 375
첨가되는 카테킨의 분당 첨가량 (g) 3 3 3
첨가되는 카테킨의 분당 첨가량 (% (w/v)) 0.1 0.1 0.1
제2단계 소요 시간 (분) 5 10 5
제2단계에서 첨가되는 총 카테킨의 양 (% (w/v)) 0.5 1 0.5
카테킨과 탄나아제를 반응시키는 제3단계 제3단계 소요 시간 (분) 10 5 10
제2단계 및 제3단계를 연속적으로 반복하는 제4단계 카테킨의 첨가 횟수 (회) 24 12 40
제2단계 내지 제4단계 소요 시간 (시간) 6 3 10
첨가된 기질의 총량 (% (w/v)) 12 12 20
실시예 2-1: 분당 첨가되는 카테킨의 양이 0.1% (카테킨 3g/3000mL)가 되도록 카테킨 용액을 분당 8.3ml씩 5분간 첨가하고, 10분간 반응시켜 첨가된 카테킨의 총량이 12%(카테킨 360g/3000mL)인 조건
정제수 2000g을 반응기에 넣고 구연산과 중탄산나트륨을 각각 발효조의 산, 알칼리 펌프에 첨가한 후 효소처리를 위한 적정 pH인 5.0으로 설정하였다. 정제수에 탄나아제 24g을 넣고 40℃에서 30분간 200rpm으로 교반하여 활성화시켰다. 녹차 카테킨을 반응기에 첨가하기 위해 녹차 카테킨 360g을 정제수에 용해시켜 1L의 녹차 카테킨 용액을 제조하였다. 이렇게 제조된 녹차 카테킨 용액을 분당 3g (기질 0.1%)의 카테킨이 첨가되는 속도로 정량펌프를 통해 5분간 첨가하고 10분간 반응시키는 방식을 반복하였다. 기질 추가에 따른 효소 불활성화 억제 효과를 확인하기 위해 반응액을 15분마다 샘플링하여 EGCG함량을 측정하는 절차를 6시간 동안 반복하며 경시 변화를 관찰하였다. 카테킨 추가가 완료된 후에도 30분 동안 EGCG 함량 변화를 관찰하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 녹차 카테킨의 첨가 시작 후 3시간 15분 구간부터 EGCG가 축적되기 시작하여 녹차 카테킨의 첨가가 끝나는 6시간 구간(12%)까지 EGCG 함량이 꾸준히 증가하였다. 그러나, 녹차 카테킨 첨가가 끝나고 30분 후에 EGCG 함량이 0으로 수렴한바, 분해 반응이 완료되었으며 녹차 카테킨 첨가가 끝난 후에도 효소가 불활성화 되지 않았음을 확인하였다. 또한, 축적된 EGCG의 최대 함량은 1mg/ml로, 기질 저해 임계점 구간인 4mg/ml 내지 8mg/ml보다 낮음을 확인하였다.
실시예 2-2: 분당 첨가되는 카테킨의 양이 0.1% (카테킨 3g/3000mL)가 되도록 카테킨 용액을 분당 8.3ml씩 10분간 첨가하고, 5분간 반응시켜 첨가된 카테킨의 총량이 12%(카테킨 360g/3000mL)인 조건
정제수 2000g을 반응기에 넣고 구연산과 중탄산나트륨을 각각 발효조의 산, 알칼리 펌프에 첨가한 후 효소처리를 위한 적정 pH인 5.0으로 설정하였다. 이후 반응기에 탄나아제 24g을 넣고 40℃에서 30분간 200rpm으로 교반하여 활성화시켰다. 녹차 카테킨을 반응기에 첨가하기 위해 녹차 카테킨 360g을 정제수에 용해시켜 1L의 녹차 카테킨 용액을 제조하였다. 이렇게 제조된 녹차 카테킨 용액을 분당 3g (기질 0.1%)의 카테킨이 첨가되는 속도로 정량펌프를 통해 10분간 첨가하고 5분간 반응시키는 방식을 반복하였다. 기질 추가에 따른 효소 불활성화 억제 효과를 확인하기 위해 반응액을 15분마다 샘플링하여 EGCG함량을 측정하는 절차를 3시간 동안 반복하며 경시 변화를 관찰하였다. 카테킨 첨가가 완료된 후에도 3시간 동안 EGCG 함량 변화를 관찰하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 녹차 카테킨 첨가 시작 후 1시간 30분 구간부터 EGCG가 축적되기 시작하여 녹차 카테킨의 첨가가 끝나는 3시간 구간까지 EGCG 함량이 꾸준히 증가하였다. 그러나, 녹차 카테킨 첨가가 끝나고 1시간 30분 후에 EGCG 함량이 0으로 수렴한바, 분해 반응이 완료되었으며 녹차 카테킨 첨가가 끝난 후에도 효소가 불활성화 되지 않았음을 확인하였다.
실시예 2-3: 분당 첨가되는 카테킨의 양이 0.1% (카테킨 3g/3000mL)가 되도록 카테킨 용액을 분당 8.3ml씩 5분간 첨가하고, 10분간 반응시켜 첨가된 카테킨의 양이 20%(카테킨 600g/3000mL)인 조건
정제수 1400g을 반응기에 넣고 구연산과 중탄산나트륨을 각각 발효조의 산, 알칼리 펌프에 첨가한 후 효소처리를 위한 적정 pH인 5.0으로 설정하였다. 이후 반응기에 탄나아제 24g을 넣고 40℃에서 30분간 200rpm으로 교반하여 활성화시켰다. 녹차 카테킨을 반응기에 첨가하기 위해 녹차 카테킨 600g을 정제수에 용해시켜 1.6L의 녹차 카테킨 용액을 제조하였다. 이렇게 제조된 녹차 카테킨 용액을 분당 3g (기질 0.1%)의 카테킨이 첨가되는 속도로 정량펌프를 통해 5분간 첨가하고 10분간 반응시키는 방식을 반복하였다. 기질 추가에 따른 효소 불활성화 억제 효과를 확인하기 위해 반응액을 30분마다 샘플링하여 EGCG함량을 측정하는 절차를 10시간 동안 반복하며 경시 변화를 관찰하였다. 카테킨 첨가가 완료된 후에도 30분 동안 EGCG 함량 변화를 관찰하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 기질 첨가 시작 후 4시간 30분 구간부터 EGCG가 쌓이기 시작하여 기질 첨가가 끝나는 10시간까지(20%) EGCG 함량이 꾸준히 증가하여 효소가 완전히 불활성화 됨을 확인하였다.
실시예 3: 녹차 추출물의 카테킨 함량 별 효소반응 완료 시간 측정
녹차 추출물의 카테킨 함량과 무관하게 본원발명에 따른 녹차 카테킨 효소처리물의 제조방법을 적용시킬 수 있음을 확인하기 위하여, 하기와 같은 방법으로 효소 반응 완료시간을 측정하였다.
실시예 3-1: 녹차 추출물의 에탄올 분획물 제조
녹차잎 5kg 및 정제수 50L를 저온농축추출기에 넣고 80℃에서 6시간 동안 추출하였다. 해당 추출액을 5μm 필터 여과 후 25L까지 농축한 후, 25L 농축액에 37.5L의 에탄올을 첨가하고 3회에 걸쳐 분획을 실시하였다. 분리한 에탄올 층을 모아 농축 및 건조를 진행한 결과, 건조물 약 1.1kg을 수득하였다.
실시예 3-2: 녹차 추출물의 에틸 아세테이트(EA) 분획물 제조
녹차잎 5kg 및 정제수 50L를 저온농축추출기에 넣고 80℃에서 6시간 추출하였다. 해당 추출액을 5μm 필터 여과 후 25L까지 농축한 후, 25L 용액에 37.5L의 EA를 첨가하고 3회에 걸쳐 분획을 실시하였다. 분리한 EA 층을 모아 농축 및 건조를 진행한 결과, 건조물 약 0.9kg을 수득하였다.
실시예 3-3: 카테킨 함량 별 녹차 카테킨 효소처리물 제조 및 효소반응 완료 시간 측정
정제수 1L를 반응기에 넣고 구연산과 중탄산나트륨을 각각 발효조의 산, 알칼리 펌프에 첨가한 후 pH를 5.0으로 설정하였다. 이후 반응기에 탄나아제 24g을 넣고 40℃에서 30분간 200rpm으로 교반하여 활성화시켰다. 분당 첨가되는 녹차 카테킨 양을 동일하게 맞추기 위해 실시예 3-1에 따라 제조된 녹차 추출물의 에탄올 분획물 770g, 실시예 3-2에 따라 제조된 녹차 추출물의 EA 분획물 430g, 및 중국산 카테킨 360g을 정제수에 용해시켜 2L의 녹차 카테킨 용액을 제조하였다. 이렇게 제조된 녹차 카테킨 용액을 분당 16.6ml가 추가되도록 정량펌프를 이용해 5분간 첨가하고 10분간 반응시키는 방식을 반복하였다. 효소처리 완료시간을 확인하기 위해 기질 첨가 후 30분 마다 샘플링하여 EGCG의 함량을 측정하고, EGCG 함량이 0으로 수렴할 때 반응이 완료된 것으로 판단하였다.
그 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이 녹차 추출물의 카테킨 함량에 관계없이 7시간 내에 모두 효소 반응이 완료됨을 확인하였다.
카테킨 종류 정제시 카테킨 함량(%) 총 기질 첨가 농도 (%) 효소 반응 완료시간(h)
녹차 추출물의 에탄올 분획물 34.5 26 7
녹차 추출물의 EA 분획물 62.1 14 6
중국산 녹차 카테킨 74.1 12 6
실시예 4: 효소 농도 별 최대 기질 처리 농도 측정
사용되는 효소 농도에 따른 효소의 최대 기질 처리 농도의 변화를 확인하기 위하여, 다음과 같은 방법으로 효소 농도 별 최대 기질 처리 농도를 측정하였다.
정제수 1L를 반응기에 넣고 구연산과 중탄산나트륨을 각각 발효조의 산, 알칼리 펌프에 첨가한 후 pH를 5.0으로 설정하였다. 첨가될 녹차카테킨 용액의 부피와 탄나아제 용액의 부피 합(3L)을 기준으로 1, 4, 8, 16, 32u/ml의 효소 농도를 제조하기 위해, 반응기에 각각 탄나아제(Tannase KTFH, 500U/g) 6, 24, 48, 96, 192g을 첨가하고, 40℃에서 30분간 200rpm으로 교반하여 효소를 활성화시켰다.
녹차 카테킨을 반응기에 추가로 첨가하기 위해 녹차 카테킨 200, 400, 600, 800, 1000g을 정제수에 용해시켜 2L의 녹차 카테킨 추가용액을 제조하였다. 여기서, 녹차 카테킨 추가 용액 각각의 기질 농도는 첨가할 녹차카테킨 용액의 부피와 탄나아제 용액의 부피 합(3L)을 기준으로 6, 13, 20, 26, 33%에 해당한다.
효소 농도 별 최대 기질 처리량을 알아보기 위해, 제조된 각각의 녹차 카테킨 추가용액을 각각의 효소 농도에 분당 16.6ml의 카테킨 용액이 추가되도록 정량펌프를 이용해 5분간 첨가하고 10분간 반응시키는 방식을 반복하였다. 이후 반응 완료 여부를 확인하기 위해 30분마다 반응액을 샘플링하여 EGCG 함량 변화를 관찰하였고, EGCG 함량이 0으로 수렴할 때 반응이 완료된 것으로 판단하였다. 각 효소 농도 및 기질 농도 별로 효소 반응을 진행하고, 반응이 완료된 경우, 표 3에 o로 표시하였다.
그 결과, 표 3에 나타낸 바와 같이 효소 농도가 증가하면 최대 기질 처리 농도도 증가하지만, 효소 단위(U/ml)당 기질 처리 농도는 감소하는 것을 확인하였다.
　 기질 농도(%)
6 13 20 26 33
효소 농도
u/ml		 1 o - - - -
4 o o - - -
8 o o o - -
16 o o o o -
32 o o o o o
실험예 1: 녹차 카테킨 효소처리물의 유효성분 분석
EGCG 및 ECG 분해 여부를 확인하기 위하여 비교예 1 및 실시예 1의 녹차 카테킨 효소처리물의 유효성분 함량을 측정하였다.
구체적으로, 비교예 1 및 실시예 1의 녹차 카테킨 효소처리물의 유효성분인 EGCG, ECG, EGC, EC 및 갈릭산의 함량을 측정하기 위하여 고성능 액체크로마토그래피(Infinity 1260, Agilent, USA)를 사용하였고, 컬럼은 Poroshell 120EC-C18(4.6x50 mm)을 사용하였으며, 검출 스펙트럼은 UV 280nm에서 측정하였다. 이동상 A는 0.1% 인산을 함유한 증류수를 사용하였고, 이동상 B는 100% ACN을 사용하였다. 시간에 따른 이동상의 조건은 0~4분에 이동상 A를 90%에서 85%, 4~8분에 이동상 A를 85%에서 73%로 변경하여 분석하였고, 유속은 1㎖/min, 시료량은 3㎕로 하였다. 표준물질 제조는 유효성분 및 전구체 표준품 30㎎을 50㎖ 용량 플라스크에 넣고 메탄올에 녹여 표준용액으로 하고 농도별로 희석하여 분석 후 검량선을 작성하여 각 유효성분의 함량을 측정하였다.
그 결과, HPLC 크로마토그램을 도 9에 나타내었으며, 아래 표 4에 나타낸 바와 같이 비교예 1 및 실시예 1의 효소처리물의 EGCG 및 ECG는 탄나아제 처리에 의해 모두 EGC, EC 및 갈릭산으로 전환되었음을 확인하였다.
유효성분 함량 갈릭산 (mg/g) EGC (mg/g) EC (mg/g) EGCG (mg/g) ECG (mg/g)
비교예 1 9.81 82.24 55.12 439.57 97.47
실시예 1 209.29 337.35 103.74 N.D N.D
N.D: Not determined
실험예 2: 탄나아제 효소 처리에 따른 근육 증가 촉진 효과 검증
실험예 2-1: 근육세포의 분화 촉진 확인
본 발명의 방법으로 탄나아제 효소 처리에 따른 근육세포의 근섬유로의 분화 촉진 능력을 확인하기 위해 근섬유 직경 및 길이를 측정하였다.
구체적으로, C2C12 근육세포를 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA)으로부터 분양받아 사용하였다. C2C12 근육세포는 근육 세포의 대사 과정 연구에 널리 이용되는 세포주로서, 상기 세포의 분화가 활발히 일어날수록 근 섬유로의 전환이 활발히 일어난다. 상기 미국 세포주 은행(ATCC)에서 받은 세포주는 20% Fetal bovine serum(FBS, Gibco, Grand Island, NY, USA)과 1% penicillin-streptomycin(P/S, Gibco, Grand Island, NY, USA)이 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, Lonza, Allendale, NJ, USA)으로, 5% CO2, 37℃가 유지되는 조건에서 배양하였다. 안정화된 C2C12 근육세포를 24 well plate 에 1X105 cells/㎖의 밀도로 분주하고 배양하여 80% confluent 시점까지 유지시켰다. 그리고 2% Horse Serum(HS, Gibco, Grand Island, NY, USA) DEME 배지로 2일 동안 근육세포 분화를 유도하였고, 그 후, 6일 동안 2일마다 2% HS DMEM 배지를 교체하며 배양하였다. 근육세포 분화 과정 동안 효소전환 녹차 카테킨 추출물을 각 배양액에 각각 20 ㎕/㎖의 농도로 처리하였고, 분화가 완성되는 시점인 8일째에 근육세포 분화 정도를 관찰하였다.
그 결과, 도 10 및 도 11에 나타낸 바와 같이 실시예 1의 녹차 카테킨 효소처리물을 처리하였을 때 근섬유 직경은 82.28μm였으며, 근섬유 길이는 1523.72 μm였다. 비교예 1의 경우, 근섬유 직경은 82.28μm였으며, 근섬유 길이는 1523.72 μm였으므로, 실시예 1의 녹차 카테킨 효소처리물을 처리하였을 때 근육세포의 분화가 더 잘 일어남을 확인하였다. 이는 실시예 1의 녹차 카테킨 효소처리물에 노인성 근육 질환의 치료와 예방에 효능이 있는 EC의 함량이 더 높음을 의미한다.
실험예 2-2: 녹차 카테킨 효소처리물의 C2C12 세포에서 p-AMPK 및 근육 성장인자의 발현 확인
본 발명에 따른 녹차 카테킨 효소처리물의 근육 증가 효과를 확인하기 위해 AMPK 활성화 효능 및 근육생성을 조절하는 follistatin의 발현을 측정하였다.
구체적으로, C2C12 세포를 6 well 플레이트에 접종하고 20% FBS를 포함하는 DMEM 배지를 사용하여 배양한 후 분화를 유도하기 위하여 2% HS를 포함하는 DMEM 배지로 교체하고, 녹차 카테킨 효소처리물을 첨가하여 배양하였다. SDS sample buffer로 수확 후 Sonication을 통하여 protein lysate를 얻었다. 그리고 10% SDS-PAGE 전기영동을 실시하고 semi-dry transfer 기기를 이용하여 PVDF transfer membrane에 단백질을 transfer하였다. 상기 Transfer 된 단백질을 5% skim milk로 1시간 동안 상온에서 blocking한 후 total AMPK와 phospho-AMPK(Thr172), Follistatin 항체를 이용하여 4℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 0.1% tween-20이 첨가된 TBS buffer로 3번 세척 후 anti-mouse HRP secondary antibody를 이용하여 immunoblot을 수행하였다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이 실시예 1의 녹차 카테킨 효소처리물을 처리한 C2C12 세포에서 강한 p-AMPK와 follistatin 활성을 확인하였다.
실험예 3: 녹차 카테킨 효소처리물의 비만 예방 또는 치료효과 확인
실험예 3-1: 녹차 카테킨 효소처리물의 지방세포로의 분화 억제 확인
본 발명에 따른 녹차 카테킨 효소처리물의 지방전구세포 증식 억제능을 확인하기 위해 지방전구세포에서 지방축적율을 측정하였다.
구체적으로, 3T3-L1 지방전구세포를 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)으로부터 분양 받아 사용하였다. 3T3-L1 지방전구세포는 지방 세포의 대사 과정 연구에 널리 이용되는 세포주로서, 상기 세포의 분화가 활발히 일어날수록 지방 세포 내의 지방 축적도 활발히 일어난다. 상기 미국 세포주 은행(ATCC)에서 받은 세포주는 10% Bovine calf serum(BCS, Gibco, Grand Island, NY, USA)과 1% penicillin-streptomycin(P/S, Gibco, Grand Island, NY, USA)이 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, Lonza, Allendale, NJ, USA)으로, 5% CO2, 37℃가 유지되는 조건에서 배양하였다. 안정화된 3T3-L1 지방전구세포는 24 well plate 에 1X105 cells/㎖의 밀도로 분주하고 배양하여 100% confluent 시점이 되면 2일간 더 유지시켰다. 그리고, 0.5mM IBMX (3-isobutyl-1-methylzanthine, Sigma, St. Louis, Mo, USA) 1μM Dexamethasone(Sigma, St. Louis, MO, USA), 10μg/ml Insulin(Gibco, Grand Island, NY, USA)을 포함하는 10% Fetal Bovine Serum(FBS, Gibco, Grand Island, NY, USA) DEME 배지로 2일 동안 지방세포 분화를 유도하였고, 배양 2일 후 10μg/ml Insulin을 포함하는 10% FBS DMEM 배지로 2일 간 더 배양하였다. 그 후, 4일 동안 2일마다 10% FBS DMEM 배지를 교체하며 배양하였다. 지방세포 분화 과정 동안 비교예 1 및 실시예 1에 따라 제조된 녹차 카테킨 효소처리물을 각 배양액에 각각 25, 50 ㎕/㎖의 농도로 처리하였고, 분화가 완성되는 시점인 10일째에 지방세포 분화 정도를 관찰하였다.
비교예 1 및 실시예 1의 녹차 카테킨 효소처리물이 3T3-L1 지방전구세포의 지방세포로의 분화 억제 및 지방생성 억제 효과를 갖는지 확인하기 위하여 중성지방을 특이적으로 염색시키는 Oil Red O 염색을 진행하였다.
구체적으로, 지방세포 분화를 유도한 세포로부터 배지를 제거하고, PBS(Phosphate Buffered Saline)로 2회 세척한 후 4% formaldehyde로 30분 동안 상온에서 고정하였다. 고정 후 60% isopropanol로 세척하고 0.2% oil red O 염색약(dissolved in 60% isopropanol)으로 1시간 동안 상온에서 염색하였다. 염색 후 증류수로 세척한 후 광학현미경으로 관찰하였다. 또한 염색한 세포는 isopropanol로 용해한 다음 ELIZA reader기를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 지방세포에서의 지방 축적율을 하기 수학식 1로 계산하였다.
[수학식 1]
지방 축적율(%) = (시료처리군의 흡광도 / 대조군의 흡광도) × 100
그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이 실시예 1의 녹차 카테킨 효소처리물은 50㎍/ml 농도에서 MDI 중성지방축적률이 60%로 비교예 1에 비해 낮게 나타났으며, 통계학적으로 유의적인 차이를 보였다. 따라서, 본 발명의 녹차 카테킨 효소처리물은 지방전구세포의 지방세포의 분화 및 중성지방의 생성을 효율적으로 억제하여 비만의 예방 또는 치료 효과를 나타냄을 확인하였다.
실험예 3-2: 녹차 카테킨 효소처리물의 3T3-L1 세포에서 AMPK 활성화 효과 확인
본 발명에 따른 녹차 카테킨 효소처리물의 체지방 감소 효과를 확인하기 위해 AMPK 활성화 효능을 측정하였다. 에너지 대사과정에서 AMPK 활성의 증가는 ACCs(acetyl-CoA carboxylase 1 및 2)의 인산화를 증가시키는 것으로 알려져 있다.
구체적으로, 3T3-L1 세포를 6 well 플레이트에 접종하고 10% BSC를 포함하는 DMEM 배지를 사용하여 배양한 후 분화를 유도하기 위하여 1% FBS를 포함하는 DMEM 배지로 교체하고, 녹차 카테킨 효소처리물을 첨가하여 배양하였다. SDS sample buffer로 수확 후 Sonication을 통하여 protein lysate를 얻었다. 그리고 10% SDS-PAGE 전기영동을 실시하고 semi-dry transfer 기기를 이용하여 PVDF transfer membrane에 단백질을 transfer하였다. 상기 Transfer 된 단백질을 5% skim milk로 1시간 동안 상온에서 blocking한 후 total AMPK와 phospho-AMPK(Thr172) 항체를 이용하여 4℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 0.1% tween-20이 첨가된 TBS buffer로 3번 세척 후 anti-mouse HRP secondary antibody를 이용하여 immunoblot을 수행하였다.
그 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이 대조군 및 비교예 1에 비해 실시예 1의 녹차 카테킨 효소처리물을 처리한 세포에서 강한 AMPK활성을 나타냄을 확인하였다.
실험예 3-3: 녹차 카테킨 효소처리물의 3T3-L1 세포에서 백색지방의 갈색지방으로의 전환 확인
본 발명에 따른 녹차 카테킨 효소처리물의 체지방 감소 효과를 확인하기 위해 백색지방의 갈색지방화를 일으키는 UCP1 및 PRDM16의 활성을 측정하였다. 지방조직은 지방저장을 주요 기능으로 하는 백색지방(white adipose tissue)과 지방 연소를 통한 발열을 주요 기능으로 하는 갈색지방(brown adipose tissue)으로 분류될 수 있다. 백색지방의 갈색화는 비만 치료효과 및 에너지 대사기능 정상화 효과가 있음이 보고된바 있다.
구체적으로, 3T3-L1 세포를 6 well 플레이트에 접종하고 10% BSC를 포함하는 DMEM 배지를 사용하여 배양한 후 분화를 유도하기 위하여 1% FBS를 포함하는 DMEM 배지로 교체하고, 녹차 카테킨 효소처리물을 첨가하여 배양하였다. 세포에 TRI reagent로 수확 후 Sonication을 통하여 RNA lysate를 얻었다. 상기 추출된 RNA에 UCP1과 PRDM16 프라이머를 부착하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하고, RNA 발현을 측정하였다.
그 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이 비교예 1에 비해 실시예 1의 녹차 카테킨 효소처리물을 처리한 세포에서 UCP1 및 PRDM16의 발현이 크게 나타남을 확인하였다.
실험예 3-4: 녹차 카테킨 효소처리물의 체중 감소 효과 확인
본 발명에 따른 녹차 카테킨 효소처리물의 체중 감소 효과를 확인하기 위해 고지방식이로 비만이 유도된 동물모델의 체중 변화를 측정하였다.
구체적으로, 수컷 C57BL/6 마우스를 대상으로 실험을 진행하였다. 5주령의 C57BL/6 마우스는 (주)오리엔트바이오에서 구입하여 사용하였다. 1 주일 간의 검역 및 적응과정을 거친 뒤 체중 감소 없는 건강한 동물을 선별하여 실험에 사용하였다. 실험동물은 온도 23±3℃, 상대습도 50±10 %, 환기회수 10~15 회/시간, 조명시간 12시간, 조도 150~300 Lux로 설정된 사육환경에서 사육하였다. 시험 전 기간 동안 실험동물은 고형사료 (주)카길애그리퓨리나와 음수를 자유 섭취하도록 하였다. 1주간의 적응기간을 거친 후 건강한 동물을 선별하여 난괴법에 의거하여 대조군 1, 대조군 2, 처리군 1, 처리군 2, 처리군 3으로 분류하였으며 각 시험군 당 10마리의 실험동물을 사용하였다. 처리군의 경우 혼합물을 생쥐용 존대(feeding needle)을 이용하여 실시예 1의 녹차 카테킨 효소처리물을 50mg/kg, 100mg/kg 또는 200mg/kg의 양으로 경구 투여하였다. 대조군의 경우 순수한 물만을 경구 투여하여 매체대조군으로 설정하였다. 시험 전 기간 동안 대조식이군과 고지방식이군에는 Research Diets, Inc. (New Brunswick, NJ, USA)에서 구입한 대조식이(에너지비율 kcal %; 단백질 : 탄수화물 : 지방 = 20 : 70 : 10)와 고지방식이(에너지 비율 kcal %; 단백질 : 탄수화물 : 지방 = 20 : 20 : 60)를 각각 공급하였고, 식이와 음수를 자유로이 섭취하도록 하였다. 대조식이와 고지방식이의 식이 조성은 표 5에 나타내었다. 시험물질은 생리식염수에 녹여 8주 동안 일정시간에 경구 투여하였으며 대조군 1과 대조군 2은 시험물질이 함유되지 않은 생리식염수를 다른 시험군과 동일하게 경구 투여하였다. 모든 동물에 대하여 투여 개시시 및 시험기간 중 투여 직전 주 1회에 걸쳐 체중을 측정하였으며 8주간 투여 종료 후 체중의 변화량을 계산하였고 식이효율(Food efficiency ratio, FER)은 시험기간에 성장한 체중 증가량을 동일기간 섭취한 식이의 양으로 나누어 전체 식이효율로 정량하여 측정하였다.
실험적 식이의 조성물 (g/Kg diet)
대조식이 (10 kcal % fat) 고지방식이 (60 kcal % fat)
g kcal g kcal
Casein, 80 Mesh 200 800 200 800
L-Cystine 3 12 3 12
Corn starch 315 1,260 0 0
Maltodextrin 10 35 140 125 500
Sucrose 350 1,400 68.8 275
Cellulose 50 0 50 0
Soybean oil 25 225 25 225
Lard* 20 180 245 2,205
Mineral mix 10 0 10 0
Dicalcium phosphate 13 0 13 0
Calcium carbonate 5.5 0 5.5 0
Potassium citrate, 1H2O 16.5 0 16.5 0
Vitamin mix 10 40 10 40
Choline bitartrate 2 0 2 0
Total 1,055 4,057 773.8 4,057
그 결과, 하기 표 6 및 도 16에 나타낸 바와 같이, 대조군 2의 경우 대조군 1과 비교하여 체중이 급격하게 증가한 것에 반해 처리군 1, 2 및 3의 경우 급여 일주일 후부터 대조군 1과 비슷한 수준으로 체중이 증가하였다.
상기 결과를 수치화하여 각 군을 비교한 결과 하기 표 6에 나타낸 바와 같이 실시예 1의 투여에 의해 체중 증가량은 절반으로 나타나 체중 증가가 억제되었음을 확인하였다. 식이효율(섭취량 대비 체중 증가량)은 고지방 식이군이 정상식이군과 비교하여 약 3배 가량 증가하였으며, 총 체중 증가량이 가장 적은 처리군 3과 비교군 1의 식이효율이 다른 처리군에 비하여 유의하게 낮았다. 또한, 비교예 1을 300mg/kg 처리한 마우스와 실시예 1을 200mg/kg 처리한 마우스의 식이효율이 같으므로 본 발명의 방법으로 제조된 녹차 카테킨 효소처리물의 체중 감소 효과가 더 큰 것을 확인하였다.
Initial body weight(g) 1) Final body weight(g) 1) Body weight gain(g) 1) FER(%) 2)
대조군 1 정상식이 20.5±0.4 27.6±0.6 7.1±0.8 0.051±0.006
대조군 2 고지방식이 20.9±0.3 40.9±0.8### 20.1±1.0### 0.149±0.009###
처리군 1 실시예 1 50mg/kg 20.6±0.4 34.7±0.8*** 14.1±0.9*** 0.115±0.007***
처리군 2 실시예 1 100mg/kg 20.6±0.4 33.4±1.2*** 12.9±0.9*** 0.109±0.007***
처리군 3 실시예 1 200mg/kg 20.8±0.4 31.1±0.7*** 10.3±0.5*** 0.089±0.004***
비교군
1		 비교예 1
300mg/kg		 20.6±0.3 30.9±1.2*** 10.2±1.0*** 0.095±0.007***
1) Significant (t-Test) : * p < 0.05, ** p <0.01, *** p < 0.001 vs 대조군 1
Significant (t-Test) : # p < 0.05, ## p <0.01, ### p < 0.001 vs 대조군 2
2) FER(%) ; Feed efficiency ratio, Body weight gain (g) / Food intake (g)
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (12)

  1. 탄나아제 용액을 준비하는 제1단계;
    카테킨 용액을 준비하는 제2단계;
    상기 탄나아제 용액에 상기 카테킨 용액을 1 내지 20분 동안 첨가하는 제3단계로서,
    분당 첨가되는 카테킨의 양은 제3단계에서 첨가되는 탄나아제 용액 및 카테킨 용액의 부피 합인 총 용액 부피를 기준으로 0.01 내지 5%(w/v)이며,
    첨가되는 총 카테킨의 양은 제3단계에서 첨가되는 탄나아제 용액 부피 및 카테킨 용액의 부피 합인 총 용액 부피를 기준으로 0.01 내지 10%(w/v)인, 단계;
    제3단계의 용액에 포함된 카테킨과 탄나아제를 1 내지 40분 동안 반응시키는 휴지단계인 제4단계; 및
    제3단계에서 첨가되는 카테킨의 양이 제3단계에서 첨가되는 탄나아제 용액 부피 및 카테킨 용액의 부피 합인 총 용액 부피를 기준으로 1 내지 40%(w/v)가 될 때까지 첨가하여 제3단계 및 제4단계를 연속적으로 반복하는 제5단계를 포함하는, 카테킨 효소처리물의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 카테킨은 녹차 추출물 또는 이의 분획물인, 카테킨 효소처리물의 제조방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 녹차 추출물 또는 이의 분획물의 카테킨 함량은 상기 녹차 추출물 또는 이의 분획물의 총 중량에 대하여 1 내지 99% 인, 카테킨 효소처리물의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 제1단계에서 탄나아제의 농도는 제3단계의 탄나아제 용액 및 카테킨 용액의 부피 합인 총 용액 부피 대비 1 내지 50 Unit/ml인, 카테킨 효소처리물의 제조방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 반응액을 여과, 농축 또는 건조시키는 단계를 추가로 포함하는, 카테킨 효소처리물의 제조방법.
  10. 제1항 내지 제4항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 카테킨 효소처리물은 갈릭산, 에피갈로카테킨갈레이트(EGCG), 에피카테킨갈레이트(ECG), 에피갈로카테킨(EGC) 및 에피카테킨(EC)의 합 100 중량부를 기준으로 상기 에피갈로카테킨갈레이트(EGCG) 및 에피카테킨갈레이트(ECG)의 합을 1 중량부 미만으로 포함하는 것인, 카테킨 효소처리물의 제조방법.
  11. 제1항 내지 제4항 및 제9항 중 어느 한 항의 제조방법에 의해 제조된 카테킨 효소처리물을 포함하는 비만 또는 근육감소증(sarcopenia)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 카테킨 효소처리물은 갈릭산, 에피갈로카테킨갈레이트(EGCG), 에피카테킨갈레이트(ECG), 에피갈로카테킨(EGC) 및 에피카테킨(EC)의 합 100 중량부를 기준으로 상기 에피갈로카테킨갈레이트(EGCG) 및 에피카테킨갈레이트(ECG)의 합을 1 중량부 미만으로 포함하는 것인, 약학적 조성물.
  12. 제1항 내지 제4항 및 제9항 중 어느 한 항의 제조방법에 의해 제조된 카테킨 효소처리물을 포함하는 비만 또는 근육감소증(sarcopenia)의 예방 또는 개선용 식품 조성물로서,
    상기 카테킨 효소처리물은 갈릭산, 에피갈로카테킨갈레이트(EGCG), 에피카테킨갈레이트(ECG), 에피갈로카테킨(EGC) 및 에피카테킨(EC)의 합 100 중량부를 기준으로 상기 에피갈로카테킨갈레이트(EGCG) 및 에피카테킨갈레이트(ECG)의 합을 1 중량부 미만으로 포함하는 것인, 식품 조성물.
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