JP2022524789A - 没食子酸、エピカテキン、及びエピガロカテキンの含量が増加したカテキン酵素処理物及びその製造方法 - Google Patents

没食子酸、エピカテキン、及びエピガロカテキンの含量が増加したカテキン酵素処理物及びその製造方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、没食子酸、エピカテキン(EC)、及びエピガロカテキン(EGC)の含量が増加したカテキン酵素処理物の製造方法、上記製造方法により製造されたカテキン酵素処理物及びその使用に関する。

Description

本発明は、没食子酸、エピカテキン(EC)、及びエピガロカテキン(EGC)の含量が増加したカテキン酵素処理物の製造方法、上記製造方法により製造されたカテキン酵素処理物及びその使用に関する。
チャノキ(Camella sinensis L)は、ツバキ科に属する多年生常緑潅木樹であり、中国とインド地域で初めて裁培され、それ以降、ジャバ、セイロン、ミャンマー、タイなどの東南アジア地域と韓国、日本の東アジア地域に伝播され、主に、北緯35度以下のアジア地域で裁培されている。
チャノキから若葉を採取して水分含量を5％以下に乾燥させた後、茶葉の抽出過程で酸化する色相によって白茶、紅茶、緑茶などに区分されて用いられており、韓国内では毎年約250万トン規模以上の緑茶が智異山の渓谷や蟾津江流域、そして済州島の西帰浦地域など、年平均気温15℃以上と年平均降雨量が1,500mm以上である自然環境で栽培されている。
このような茶の主な効能成分の一つとしてポリフェノール系化合物であるカテキンが挙げられる。具体的には、緑茶カテキンの主要成分としては、エピガロカテキンガレート(EGCG)、エピカテキンガレート(ECG)、エピガロカテキン(EGC)、エピカテキン(EC)、没食子酸(Gallic Acid)がある。
カテキンは、コレステロール上昇抑制作用やα-アミラーゼ活性阻害作用などを有することが知られている(韓国公開特許第10-2007-0019395号（特許文献1）、韓国登録特許第10-0891393号(特許文献2))。エピカテキン(EC)は、老人性筋疾患の治療と予防に効能があり(韓国公開特許第10-2018-0009938号(特許文献3))、エピガロカテキン(EGC)は抗酸化活性があり(韓国公開特許第10-2012-0021407号(特許文献4))、没食子酸は抗酸化、皮膚美白、保湿、シワ予防及び改善に卓越した効果があり、特に、肥満の治療と予防に効能がある(Anjali Pandey et al. Advances in Research 2(10): 556-570, 2014(非特許文献1))ことが報告された。
エピガロカテキンガレート(EGCG)及びエピカテキンガレート(ECG)はタンニンと共に苦味、渋味を出し、水溶化状態で沈殿を引き起こして消化酵素を阻害する短所があり、これを改善するために酵素を用いてEGCG及びECGからEGC及びECに転換する過程が必要である。
大部分の酵素は、恒常性を維持するために、反応後に生産された反応産物により活性阻害を引き起こす。しかし、特定酵素は、高い反応基質の濃度により活性阻害が起きるが、これは、酵素の結合部位に基質が競争的に結合することにより発生することが知られている。この場合、基質による活性阻害を防止するための方法として酵素の濃度を増加させたり反応溶液の体積を増加させる方法が用いられている。
しかし、従来の技術では工程が長時間要され、タンナーゼのようなガレート分解酵素は低い反応基質濃度でも活性が阻害される特徴を有しており、商業的に高濃度の基質を処理できる方法がない問題があった。
韓国公開特許第10-2007-0019395号 韓国登録特許第10-0891393号 韓国公開特許第10-2018-0009938号 韓国公開特許第10-2012-0021407号
Anjali Pandey et al. Advances in Research 2(10): 556-570, 2014
本発明者らは、酵素の不活性化なしに安定的にカテキンのEGCG及びECGを分解する方法を発明するために鋭意努力した結果、タンナーゼ溶液にカテキン溶液を添加する段階及びカテキン溶液の追加なしにカテキンとタンナーゼとを反応させる段階を連続して繰り返すことにより、反応に用いられる総基質の量を増加させながらも酵素活性の阻害なしに短時間内に酵素反応を完了し、EGCG及びECG含量は減少し、没食子酸、EC及びEGCの含量を増加させたカテキン酵素処理物を大量に生産できることを確認し、本発明を完成した。
本発明の一つの目的は、タンナーゼ溶液を準備する第1段階;タンナーゼ溶液にカテキン溶液をさらに追加する第2段階;第2段階の溶液に含まれるカテキンとタンナーゼを反応させる第3段階;及び第2段階及び第3段階を連続して繰り返す第4段階を含むカテキン酵素処理物の製造方法を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、没食子酸、エピガロカテキンガレート(EGCG)、エピカテキンガレート(ECG)、エピガロカテキン(EGC)及びエピカテキン(EC)の和100重量部を基準に上記エピガロカテキンガレート(EGCG)及びエピカテキンガレート(ECG)の和を1重量部未満で含むカテキン酵素処理物を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、上記カテキン酵素処理物を含む肥満または筋肉減弱症の予防または治療用薬学的組成物を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、上記カテキン酵素処理物を含む肥満または筋肉減弱症の予防または改善用食品組成物を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、肥満又は筋肉減弱症の予防又は治療のための、上記カテキン酵素処理物の使用を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、上記カテキン酵素処理物を、これを必要とする個体に投与する段階を含む肥満又は筋肉減弱症の予防又は治療方法を提供することにある。
本発明は、タンナーゼ溶液にカテキン溶液を添加する段階及びカテキン溶液の追加なしにカテキンとタンナーゼとを反応させる段階を連続して繰り返すことにより、EGCG及びECGの含量が減少したカテキン酵素処理物を製造することができる。上記製造方法を用いれば、酵素活性の阻害なしに短時間内に酵素反応を完了することができ、本発明は、カテキンをタンナーゼで処理して有用な産物を生産する大規模な工程に広く活用され得る。また、上記カテキン酵素処理物は、没食子酸、EC及びEGCの含量が増大し、肥満または筋肉減弱症の予防または治療効果を有することができる。
タンナーゼ酵素処理を通じた緑茶カテキンの成分転換を示したものである。 緑茶カテキン酵素処理物の製造工程の模式図である。 溶液比タンナーゼ濃度4unitで添加されたカテキンの総量が12％になるように粉末カテキンを1％ずつ連続添加した結果であり、カテキン及びタンナーゼ反応液のEGCG含量を30分間の間隔で測定して示したグラフである。グラフ上に記載された数値(％)は累積したカテキンの添加量を示す。 溶液比タンナーゼ濃度4unitで1分当たり添加されるカテキンの量が0.1％(カテキン3g/3000mL)、添加されるカテキンの総量が12％(カテキン360g/3000mL)になるようにカテキン溶液を1分当たり8.3mlずつ連続添加した結果であり、カテキン及びタンナーゼ反応液のEGCG含量を15分間の間隔で測定して示したグラフである。グラフ上に記載された数値(％)は累積したカテキンの添加量を示す。 溶液比タンナーゼ濃度4unitで1分当たり添加されるカテキンの量が0.07％(カテキン2g/3000mL)、添加されるカテキンの総量が12％(カテキン360g/3000mL)になるようにカテキン溶液を1分当たり6mlずつ連続添加した結果であり、カテキン及びタンナーゼ反応液のEGCG含量を15分間の間隔で測定して示したグラフである。グラフ上に記載された数値(％)は累積されたカテキンの添加量を示す。 溶液比タンナーゼ濃度4unitで1分当たり添加されるカテキンの量が0.1％(カテキン3g/3000mL)、添加されるカテキンの総量が12％(カテキン360g/3000mL)になるようにカテキン溶液を1分当たり8.3mlずつ5分間添加して10分間反応させる過程を繰り返した結果であり、カテキン及びタンナーゼ反応液のEGCG含量を15分間の間隔で測定して示したグラフである。グラフ上に記載された数値(％)は累積したカテキンの添加量を示す。 溶液比タンナーゼ濃度4unitで1分当たり添加されるカテキンの量が0.1％(カテキン3g/3000mL)、添加されるカテキンの総量が12％(カテキン360g/3000mL)になるようにカテキン溶液を1分当たり8.3mlずつ10分間添加して5分間反応させる過程を繰り返した結果であり、カテキン及びタンナーゼ反応液のEGCG含量を15分間の間隔で測定して示したグラフである。グラフ上に記載された数値(％)は累積したカテキンの添加量を示す。 溶液比タンナーゼ濃度4unitで1分当たり添加されるカテキンの量が0.1％(カテキン3g/3000mL)、添加されるカテキンの総量が20％(カテキン600g/3000mL)になるようにカテキン溶液を1分当たり8.3mlずつ5分間添加して10分間反応させる過程を繰り返した結果であり、カテキン及びタンナーゼ反応液のEGCG含量を30分間の間隔で測定して示したグラフである。グラフ上に記載された数値(％)は累積したカテキンの添加量を示す。 本発明の比較例1及び実施例1により製造された緑茶カテキン酵素処理物の成分を分析したHPLCクロマトグラムである。 本発明の比較例1及び実施例1により製造された緑茶カテキン酵素処理物をC2C12筋肉前駆細胞に処理した結果であり、分化された筋肉細胞の筋繊維直径を示したグラフである。 本発明の比較例1及び実施例1により製造された緑茶カテキン酵素処理物をC2C12筋肉前駆細胞に処理した結果であり、分化された筋肉細胞の筋繊維長さを示したグラフである。 本発明の比較例1及び実施例1により製造された緑茶カテキン酵素処理物をC2C12筋肉前駆細胞に処理した結果であり、AMPK活性及び筋肉成長因子の発現を示すウェスタンブロット写真である。 本発明の比較例1及び実施例1により製造された緑茶カテキン酵素処理物を3T3-L1脂肪前駆細胞にそれぞれ25ug/ml及び50ug/mlずつ処理した結果であり、脂肪細胞の脂肪蓄積率を示したグラフである。 本発明の比較例1及び実施例1により製造された緑茶カテキン酵素処理物を3T3-L1脂肪前駆細胞に処理した結果であり、脂肪細胞のAMPK活性を示すウェスタンブロット写真である。 本発明の比較例1及び実施例1により製造された緑茶カテキン酵素処理物を3T3-L1脂肪前駆細胞に処理した結果であり、白色脂肪の褐色脂肪化に関与する遺伝子であるUCP1、PRDM16及びPGC1aのmRNA発現程度を示すグラフである。 本発明の比較例1及び実施例1により製造された緑茶カテキン酵素処理物を処理したマウスの体重変化を示したグラフである。対照群1は正常食餌のみを供給した正常対照群、対照群2は高脂肪食餌のみ供給した陰性対照群、処理群1は高脂肪食餌を供給して実施例1により製造された緑茶カテキン酵素処理物50mg/kgを投与した実験群、処理群2は高脂肪食餌を供給して実施例1により製造された緑茶カテキン酵素処理物100mg/kgを投与した実験群、処理群3は高脂肪食餌を供給して実施例1により製造された緑茶カテキン酵素処理物200mg/kgを投与した実験群、比較群1は高脂肪食餌を供給して比較例1により製造された緑茶カテキン酵素処理物300mg/kgを投与した実験群である。
上記目的を達成するための本発明の一つの様態は、タンナーゼ溶液を準備する第1段階;タンナーゼ溶液にカテキン溶液をさらに添加する第2段階;第2段階の溶液に含まれたカテキンとタンナーゼとを反応させる第3段階;及び第2段階及び第3段階を連続して繰り返す第4段階を含む、カテキン酵素処理物の製造方法を提供する。
本発明は、タンナーゼ溶液にカテキン溶液を添加する段階及びカテキン溶液の追加なしにカテキン及びタンナーゼを反応させる段階を連続して繰り返すことにより、反応に用いられる総基質の量を増加させながらも酵素活性の阻害なしに短時間内に酵素反応を完了し、EGCG及びECG含量は減少し、没食子酸、EC及びEGCの含量を増加させたカテキン酵素処理物を大量生産することができる。
本発明の用語「カテキン酵素処理物」とは、カテキンと酵素を反応させて得られた物質を意味し、具体的には、カテキンとガレート分解酵素であるタンナーゼを反応させて得られたものであってもよいが、これに制限されない。このような酵素処理物はそのまま用いられたり、減圧濃縮または凍結乾燥させて液状または粉末状として用いられる。
本発明の用語「カテキン」は、フラボノイドグループのflavan-3-olsに属するもので、ポリフェノールの一種を意味する。カテキンとしては、具体的には、エピガロカテキンガレート(EGCG)、エピカテキンガレート(ECG)、エピガロカテキン(EGC)、エピカテキン(EC)、または没食子酸(Gallic Acid)などがある。
本発明の用語「カテキン溶液」とは、液状カテキンを意味し、カテキンを溶媒に溶解させたものであってもよい。具体的には、上記溶媒はカテキンを溶解させ、溶解したカテキンとタンナーゼとが反応できる限り、種類に制限されないが、具体的には精製水であってもよい。
本発明で用いられるカテキンは、純度100％のカテキンだけでなく、他の物質とカテキンの混合物であってもよい。具体的には、上記混合物においてカテキンの含量は1～99％、1～80％、1～75％、20～99％、20～80％、20～75％、30～75％であってもよく、より具体的には33～75％であってもよいが、これに制限されない。
本発明において、カテキンは販売されるものを購入したりカテキンを含有した植物から抽出及び/又は分画して得ることができる。
本発明の一実施様態において、カテキンはカテキンを含有した緑茶抽出物またはその分画物であってもよいが、これに制限されない。本発明の一実施例では、Anhui Redstar Pharmaceutical Corp. Ltd.から購入した緑茶カテキンを用いてカテキン酵素処理物を製造することができる。
本発明の用語「抽出物」とは、目的とする物質を多様な溶媒に浸漬した後、常温または加温状態で一定時間抽出して得られた液状成分、上記液状成分から溶媒を除去して得られた固形分等の結果物を意味することができる。それだけでなく、上記結果物に加えて、上記結果物の希釈液、これらの濃縮液、これらの粗精製物、精製物などをいずれも含むことと包括的に解釈され得る。上記抽出物を得るための方法は、緑茶カテキンを得ることができる限り、特にこれに制限されず、当該技術分野において通常に用いる方法により抽出することができる。上記抽出方法の非制限的な例としては、熱水抽出法、超音波抽出法、濾過法、還流抽出法などが挙げられ、これらは単独で行われたり、2種以上の方法を併用して行われ得る。具体的には、茶葉を、精製水を低温濃縮抽出器に入れて抽出する方法を用いることができる。
本発明において上記緑茶抽出物は、その分画物で製造されて用いられてもよい。
本発明の用語「分画物」とは、多様な構成成分を含む混合物から特定成分または特定成分グループを分離するために分画を行って得られた結果物を意味する。
本発明において、上記分画物を得る分画方法は特に制限されず、当該技術分野において通常に用いる方法により行われ得る。多様な溶媒を処理して行う溶媒分画法、一定の分子量カットオフ値を有する限外濾過膜を通過させて行う限外濾過分画法、多様なクロマトグラフィ(大きさ、電荷、疎水性または親和性による分離のために製作されたもの)を行うクロマトグラフィ分画法、及びこの組合わせなどになり得る。本発明において上記分画物を得るのに用いられる溶媒の種類は、特に制限されず、当該技術分野において公知となった任意の溶媒を用いることができる。上記分画溶媒の非制限的な例としては、水、有機溶媒またはこれらの混合溶媒などを使用することができ、上記有機溶媒は、炭素数1～4のアルコールや、エチルアセテートまたはアセトンなどの極性溶媒、ヘキサンまたはジクロロメタンの非極性溶媒またはこれらの混合溶媒を用いることができる。また、具体的には水、炭素数1～4のアルコール、エチルアセテートまたはこれらの混合溶媒を用いることができ、より具体的にはエタノールまたはエチルアセテートを用いることができる。
上記緑茶抽出物または分画物のカテキン含量は、抽出物または分画物の全重量に対して1～99％、1～80％、1～75％、20～99％、20～80％、20～75％、30～75％であってもよく、より具体的には33～75％であってもよいが、これに制限されない。本発明の一実施例ではカテキン含量が34.5％である緑茶抽出物のエタノール分画物770g、カテキン含量が62.1％である緑茶抽出物のエチルアセテート分画物430g、カテキン含量が74.1％である中国産緑茶カテキン360gをそれぞれ2Lの精製水に溶解させて緑茶カテキン溶液を製造した。このように製造された緑茶カテキン追加溶液を1分当たり16.6mlが追加されるように定量ポンプを用いてタンナーゼ溶液に5分間添加して10分間反応させる方式を繰り返した。基質添加後に30分間ごとにサンプリングしてEGCG含量を測定し、その結果、緑茶抽出物のカテキン含量に関係なく7時間内に全部酵素反応が完了することを確認した。
本発明の用語「タンナーゼ」とは、タンニン加水分解酵素であり、タンニン、または没食子酸メチルなどのエステル結合を加水分解する酵素を意味する。具体的には、本発明においてタンナーゼはエピカテキンガレート(ECG)をエピカテキン(EC)及び没食子酸に分解することができ、エピガロカテキンガレート(EGCG)をエピガロカテキン(EGC)及び没食子酸に分解することができる。本発明の一実施例ではkikoman酵素を用いたが、これに制限されない。
本発明の用語「タンナーゼ溶液」とは、タンナーゼを含む溶液を意味し、具体的には、タンナーゼだけでなく未反応のカテキンまたは反応生成物を含み得る。本発明の一実施例においてタンナーゼ溶液は第2段階以降の反応液であってもよい。
上記第1段階は、タンナーゼ溶液を準備する段階である。具体的には、精製水にタンナーゼを入れて攪拌して準備することができるが、これに制限されない。
上記カテキン溶液とタンナーゼを反応させる第1段階においてタンナーゼの濃度はタンナーゼ溶液の体積及び第2段階で添加されるカテキン溶液の体積の和である総溶液の体積比1～50Unit/ml、1～45Unit/ml、1～40Unit/ml、1～35Unit/ml、より具体的には1～20Unit/ml、1～16Unit/ml、1～10Unit/ml、1～5Unit/ml、さらに具体的には4Unit/mlであってもよいが、これに制限されない。
上記総溶液の体積は、第2段階が1回以上繰り返された第2段階溶液の最終体積であってもよい。
上記第1段階はタンナーゼを活性化させる段階をさらに含んでもよい。具体的にはタンナーゼ及び精製水を反応器に入れて20～60℃で5分間～1時間100～300rpmで攪拌して活性化させたり、より具体的には40℃で30分間200rpmで攪拌して活性化させることができるが、これに制限されない。
上記第1段階は20～60℃で行われてもよく、具体的には、25～60℃、20～55℃、30～60℃、20～50℃、25～55℃、30～50℃、より具体的には35～45℃で行われてもよいが、これに制限されない。
上記第1段階は、pH3～6で行われてもよく、具体的には、pH3.5～6、3～5.5、4～6、4～5、3.5～5.5、4～5.5、3.5～5、より具体的にはpH4.5～5.5の範囲で行われてもよいが、これに制限されない。
上記第1段階は0.1～1000rpmの速度で攪拌して行われてもよく、具体的には、10～1000rpm、0.1～900rpm、100～900rpm、150～900rpm、100～800rpm、100～700rpm、100～600rpm、100～500rpm、100～400rpm、より具体的に100～300rpmの速度で攪拌して行われてもよいが、これに制限されない。
上記第1段階は1～60分間行われてもよく、具体的には4～60分間、1～40分間、4～40分間、1～20分間、より具体的には5～20分間行われてもよいが、これに制限されない。
上記第2段階はタンナーゼ溶液にカテキン溶液を添加する段階である。
第2段階においてタンナーゼ溶液はタンナーゼを含む溶液であってもよく、具体的にはタンナーゼだけでなく未反応のカテキンまたは反応生成物を含み得る。本願発明の一実施例においてタンナーゼ溶液は第2段階以降の反応液であってもよい。
上記第2段階において1分当たり添加されるカテキンの量は、第1段階のタンナーゼ溶液の体積及び第2段階で添加されるカテキン溶液の体積の和である総溶液の体積を基準に0.01～20％(w/v)であってもよく、具体的には0.01～15％(w/v)、0.01～10％(w/v)、0.01～5％(w/v)、0.01～1％(w/v)であってもよく、より具体的には0.01～0.8％(w/v)、0.01～0.6％(w/v)、0.01～0.4％(w/v)、0.01～0.2％(w/v)、さらに具体的には0.1％(w/v)であってもよいが、これに制限されない。
第2段階は1～60分間行われてもよく、具体的には4～60分間、1～40分間、4～40分間、1～20分間、より具体的には5～20分間行われてもよいが、これに制限されない。
上記第2段階で添加される総カテキンの量は、第1段階のタンナーゼ溶液の体積及び第2段階で添加されるカテキン溶液の体積の和である総溶液の体積を基準に0.01～40％(w/v)であってもよく、具体的には0.01～35％(w/v)、0.01～30％(w/v)、0.01～25％(w/v)、0.01～20％(w/v)、0.01～15％(w/v)、0.01～10％(w/v)、0.3～40％(w/v)、0.3～35％(w/v)、0.3～30％(w/v)、0.3～25％(w/v)、0.3～20％(w/v)、0.3～15％(w/v)、0.3～10％(w/v)であってもよく、より具体的には0.01～2％(w/v)、0.01～1.5％(w/v)、0.3～2％(w/v)、0.3～1.5％(w/v)、0.4～1.1％(w/v)、さらに具体的には0.5％(w/v)であってもよいが、これに制限されない。
上記総溶液の体積は、第2段階が1回以上繰り返された第2段階溶液の最終体積であってもよい。
上記第3段階はカテキン溶液の追加なしに第2段階の溶液に含まれたカテキンとタンナーゼとを反応させる段階である。
上記第3段階は1～60分間行われてもよい。具体的には第3段階は4～60分間、1～40分間、4～40分間、1～20分間、1～11分間、4～11分間、より具体的には10分間行われてもよいが、これに制限されない。
上記第3段階の反応温度、pH及び攪拌速度は、上記第1段階の反応温度、pH及び攪拌速度の通りである。
上記第4段階は、上記第2段階及び第3段階を連続して繰り返す段階である。
上記第2段階及び第3段階を連続して繰り返す第4段階は、第2段階で添加されたカテキンの量が第1段階のタンナーゼ溶液の体積及び第2段階で添加されるカテキン溶液の体積の和である総溶液の体積を基準に1～90％(w/v)になるまで行われてもよく、具体的には5～90％(w/v)、10～90％(w/v)、1～21％(w/v)、1～40％(w/v)、1～60％(w/v)、5～21％(w/v)、5～40％(w/v)、5～60％(w/v)、10～40％(w/v)、10～60％(w/v)、10～21％(w/v)、より具体的には12％(w/v)になるまで行われてもよいが、これに制限されない。
本発明の一実施例では、精製水2000gを反応器に入れてクエン酸と重炭酸ナトリウムをそれぞれ発酵槽の酸、アルカリポンプに添加した後、酵素処理のための適正pHである5.0に設定した。精製水にタンナーゼ(Tannase KTFH, 500U/g)24gを入れて40℃で30分間200rpmで攪拌して活性化させた(第1段階)。緑茶カテキンを反応器に添加するために緑茶カテキン360gを精製水に溶解させて1Lの緑茶カテキン溶液を製造した。このように製造された緑茶カテキン溶液を1分当たり8.3mlの速度で定量ポンプを通じてタンナーゼ溶液に5分間添加した(第2段階)。即ち、上記第2段階では1分当たり3gの緑茶カテキンが添加されることで、1分当たり0.1％(=
Figure 2022524789000002
 )のカテキンを添加し、上記第2段階で5分間添加される総カテキンの量は0.5％(=
Figure 2022524789000003
 )であった。緑茶カテキン溶液の添加後、第2段階の溶液に含まれた緑茶カテキンとタンナーゼを10分間反応させた(第3段階)。続けて1分当たり3g(0.1％の緑茶カテキン)の緑茶カテキンが添加される速度で緑茶カテキン溶液を上記緑茶カテキン及びタンナーゼ反応液に5分間添加した後、10分間反応させる過程を繰り返した。添加された緑茶カテキンの総量が360g(12％(=
Figure 2022524789000004
 )の緑茶カテキン)になるまで第2段階及び第3段階を繰り返した(第4段階)。基質追加による酵素不活性化抑制効果を確認するために、反応液を15分ごとにサンプリングしてEGCG含量を測定する手順を6時間繰り返して経時変化を観察した。カテキン追加が完了した後にも30分間EGCG含量の変化を観察した。その結果、6時間30分で酵素反応が完了し、緑茶カテキンの添加が完了した後にも酵素が不活性化されていないことを確認した(図6)。
本発明の他の一実施例では、精製水2000gを反応器に入れてクエン酸と重炭酸ナトリウムをそれぞれ発酵槽の酸、アルカリポンプに添加した後、酵素処理のための適正pHである5.0に設定した。その後、反応器にタンナーゼ(Tannase KTFH, 500U/g)24gを入れて40℃で30分間200rpmで攪拌して活性化させた。緑茶カテキンを反応器に添加するために緑茶カテキン360gを精製水に溶解させて1Lの緑茶カテキン溶液を製造した。このように製造された緑茶カテキン溶液を1分当たり8.3mlの速度で定量ポンプを通じてタンナーゼ溶液に10分間添加した(第2段階)。即ち、上記第2段階では1分当たり3gの緑茶カテキンが添加されることで、1分当たり0.1％(=
Figure 2022524789000005
 )のカテキンを添加し、上記第2段階で10分間添加される総カテキンの量は1％(=
Figure 2022524789000006
 )であった。緑茶カテキン溶液の添加後、第2段階の溶液に含まれた緑茶カテキンとタンナーゼとを5分間反応させた(第3段階)。続けて1分当たり3g(0.1％の緑茶カテキン)の緑茶カテキンが添加される速度で緑茶カテキン溶液を上記緑茶カテキン及びタンナーゼ反応液に10分間添加した後、5分間反応させる過程を繰り返した。添加された緑茶カテキンの総量が360g(12％(=
Figure 2022524789000007
 )の緑茶カテキン)になるまで第2段階及び第3段階を繰り返した(第4段階)。基質追加による酵素不活性化抑制効果を確認するために、反応液を15分ごとにサンプリングしてEGCG含量を測定する手順を3時間繰り返して経時変化を観察した。カテキン添加が完了した後にも3時間EGCG含量の変化を観察した。その結果、6時間で酵素反応が完了し、緑茶カテキンの添加が完了した後にも酵素が不活性化されていないことを確認した(図7)。
上記カテキン酵素処理物の製造方法には、タンナーゼを不活性化する段階;及び／又は反応液を濾過、濃縮及び／又は乾燥させる段階をさらに含むことができる。
タンナーゼを不活性化させる方法は、当業界において公知となった多様な方法を用いることができ、具体的には熱処理を利用することができるが、これに制限されない。一つの具体例として、上記カテキン酵素処理物の製造方法は第4段階以降、反応液を5分間～4時間、80～120℃で熱処理してタンナーゼを不活性化させる段階をさらに含んでもよい。具体的には、反応液を10分間?30分間、90～100℃で熱処理してタンナーゼを不活性化させることができるが、これに制限されない。
また、各段階の反応液を濾過、濃縮及び／又は乾燥させる方法は、当業界において公知となった多様な方法を利用することができる。一つの具体例として、上記カテキン酵素処理物の製造方法は、第4段階が完了した反応液を濾過、濃縮または乾燥させる段階をさらに含んでもよい。上記方法において、濾過はろ過紙を用いたり減圧濾過器を用いることができるが、これに制限されず、濃縮は具体的に回転蒸発濃縮機を用いることができるが、これに制限されない。また、上記乾燥は具体的に減圧乾燥、真空乾燥、沸騰乾燥、噴霧乾燥または凍結乾燥することができるが、これに制限されない。より具体的には、本発明の一実施例では4段階の反応が完了した反応液を80℃で30分間熱処理して酵素を不活性化させた後、反応液を凍結乾燥した。
上記カテキン酵素処理物の製造方法により製造されたカテキン酵素処理物は、没食子酸、エピガロカテキンガレート(EGCG)、エピカテキンガレート(ECG)、エピガロカテキン(EGC)及びエピカテキン(EC)の和100重量部を基準に上記エピガロカテキンガレート(EGCG)及びエピカテキンガレート(ECG)の和を1重量部未満で含むカテキン酵素処理物であってもよい。
本発明のもう一つの様態は、上記カテキン酵素処理物の製造方法により製造されたカテキン酵素処理物として、没食子酸、エピガロカテキンガレート(EGCG)、エピカテキンガレート(ECG)、エピガロカテキン(EGC)及びエピカテキン(EC)の和100重量部を基準に上記エピガロカテキンガレート(EGCG)及びエピカテキンガレート(ECG)の和を1重量部未満で含むカテキン酵素処理物を提供する。
具体的には、上記カテキン酵素処理物の製造方法により製造されたカテキン酵素処理物は、没食子酸、エピガロカテキンガレート(EGCG)、エピカテキンガレート(ECG)、エピガロカテキン(EGC)及びエピカテキン(EC)の和100重量部を基準に上記エピガロカテキンガレート(EGCG)及びエピカテキンガレート(ECG)の和を0.9重量部未満、0.8重量部未満、0.7重量部未満、0.6重量部未満、0.5重量部未満、0.4重量部未満、0.3重量部未満、0.2重量部未満、0.1重量部未満で含むことができるが、これに制限されない。本発明の一実施例では、上記カテキン酵素処理物の製造方法により製造されたカテキン酵素処理物においてエピガロカテキンガレート(EGCG)及びエピカテキンガレート(ECG)の含量が測定されなかった(表4)。
このように、上記カテキン酵素処理物の製造方法により製造されたカテキン酵素処理物は苦味、渋味を出し、消化酵素を阻害するエピガロカテキンガレート(EGCG)及びエピカテキンガレート(ECG)含量は減少し、没食子酸、エピカテキン(EC)及びエピガロカテキン(EGC)の含量は増加した効果を奏する。
本発明のもう一つの様態は、上記カテキン酵素処理物を含む肥満または筋肉減弱症の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
本発明のもう一つの態様は、肥満又は筋肉減弱症の予防又は治療のための、上記カテキン酵素処理物の使用を提供する。
この時、上記「カテキン酵素処理物」とは、前述した通りである。
本発明の用語「肥満」とは、エネルギー不均衡により過多な体脂肪を有する状態(condition)または疾患(disease)を意味する。
本発明の一実施例では、緑茶カテキン酵素処理物を添加して3T3-L1脂肪前駆細胞を培養した結果、脂肪前駆細胞の脂肪細胞分化及び中性脂肪生成抑制効果、AMPK活性化効果が奏されたところ、緑茶カテキン酵素処理物は肥満を予防または治療する薬学的組成物として用いられることを確認した(図13及び14)。
本発明の他の一実施例では、緑茶カテキン酵素処理物を添加して3T3-L1脂肪前駆細胞を培養した結果、白色脂肪の褐色脂肪化を引き起こすUCP1及びPRDM16の発現が増加する効果が奏されたところ、緑茶カテキン酵素処理物は肥満を予防または治療する薬学的組成物として用いられることを確認した(図15)。
本発明の更に他の一実施例では、高脂肪食餌を摂取するマウスに緑茶カテキン酵素処理物を経口投与した結果、正常食餌を摂取した対照群と同様の水準に体重が増加したところ、緑茶カテキン酵素処理物は肥満を予防または治療する薬学的組成物として用いられることを確認した(図16)。
本発明の用語「筋肉減弱症(sarcopenia)」とは、筋肉の密度と機能が漸次弱まるとを意味し、その原因としては、脊髄神経や間脳にある運動神経細胞または筋肉細胞の進行性変性及び破壊が知られている。
本発明の一実施例では、緑茶カテキン酵素処理物を添加してC2C12筋肉細胞を培養した結果、筋肉細胞分化促進、p-AMPK活性化、及びポリスタチン発現増加効果が奏されたところ、緑茶カテキン酵素処理物は筋肉減弱症を予防または治療する薬学的組成物として用いられることを確認した(図10～図12)。
本発明の用語「予防」とは、本発明の薬学的組成物の投与を通じて肥満または筋肉減弱症を抑制または遅延させる全ての行為を意味し、本発明の用語「治療」とは、本発明の薬学組成物を投与することにより肥満または筋肉減弱症が好転または緩和されたり、有益に変更される全ての行為を意味する。
本発明の用語「薬学的組成物」とは、疾病の予防または治療を目的として製造されたものを意味し、それぞれ常法により多様な形態に剤形化して用いられる。例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップなどの経口型剤形に剤形化することができ、外用剤、及び滅菌注射溶液の形態に剤形化して用いることができる。
本発明の薬学的組成物は、薬学的組成物の製造に通常用いる適切な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含む肥満または筋肉減弱症(sarcopenia)の予防または治療用薬学組成物の形態に製造され得るが、上記担体は、非自然的担体(non-naturally occuring carrier)を含み得る。具体的には、上記薬学組成物は、それぞれ常法により散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの経口型剤形、外用剤、坐剤及び滅菌注射溶液の形態に剤形化して用いられる。本発明において、上記薬学組成物に含み得る担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート及び鉱物油などを挙げることができる。製剤化する場合には、普通用いる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調剤される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、少なくとも1つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、カルシウムカーボネート(calcium carbonate)、スクロース(sucrose)またはラクトース(1actose)、ゼラチンなどを混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤以外にマグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も用いられる。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、よく用いられる単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に種々の賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれ得る。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤には、プロピレングリコール(propylene glycol)、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが用いられる。坐剤の基剤としては、ウィテプゾール(witepsol)、マクロゴール、ツイン(tween)61、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが用いられる。
本発明による薬学的組成物の具体的な投与量は、製剤化方法、患者の状態及び体重、患者の性別、年齢、疾病の程度、薬物形態、投与経路及び期間、排泄速度、反応感応性等のような要因により当業者により多様に選択され得、投与量及び回数はいかなる面でも本発明の範囲を制限するわけではない。
本発明の薬学的組成物は、ラット、マウス、家畜、ヒトなどの哺乳動物に多様な経路を通じて投与され得る。投与の全ての方式は予想することができ、目的によって点眼投与、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経皮パッチ投与、経口投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与等の経路を通じて投与され得る。
本発明のもう一つの様態は、上記カテキン酵素処理物を含む肥満または筋肉減弱症の予防または改善用食品組成物を提供する。
本発明の用語「カテキン酵素処理物」、「肥満」、「筋肉減弱症」、及び「予防」は前述した通りである。
本発明の用語「改善」とは、上記組成物の投与により肥満または筋肉減弱症が好転する全ての行為を意味する。
本発明の用語「食品」とは、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディ類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料水、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料、ビタミン複合剤、健康機能食品及び健康食品などがあり、通常の意味の食品を全て含む。
上記健康機能(性)食品(functional food)とは、特定保健用食品(food for special health use, FoSHU)と同一の用語であり、栄養供給以外にも生体調節機能が効率よく示されるように加工された医学、医療効果の高い食品を意味する。ここで「機能(性)」とは、人体の構造及び機能に対して栄養素を調節したり生理学的作用等のような保健用途に有用な効果を得ることを意味する。本発明の食品は、当業界において通常に用いられる方法により製造可能であり、上記製造時には当業界において通常に添加する原料及び成分を添加して製造することができる。また、上記食品の剤形も食品として認められる剤形であれば、制限なく製造され得る。本発明の食品用組成物は、多様な形態の剤形に製造され得、一般の薬品とは異なって食品を原料として薬品の長期服用時に発生し得る副作用などがない長所があり、携帯性に優れ、本発明の食品は免疫増進効果を増進させるための補助剤として摂取が可能である。
上記健康食品(health food)とは、一般の食品に比べて積極的な健康維持や増進効果を奏する食品を意味し、健康補助食品(health supplement food)とは、健康補助目的の食品を意味する。場合によって、健康機能食品、健康食品、健康補助食品の用語は互用される。
具体的には、上記健康機能食品は、カテキン酵素処理物を飲料、お茶類、香辛料、ガム、菓子類等の食品素材に添加したり、カプセル化、粉末化、懸濁液などに製造した食品であり、これを摂取する場合、健康上、特定の効果をもたらすことを意味するが、一般の薬品とは異なって食品を原料にして薬品の長期服用時に発生し得る副作用がない長所がある。
本発明の食品組成物は、日常的に摂取することが可能であるため、高い免疫増進効果を期待することができ、非常に有用である。
上記組成物は、生理学的に許容可能な担体をさらに含み得るが、担体の種類は特に制限されず、当該技術分野において通常に用いられる担体であれば、いずれのものでも用いることができる。
また、上記組成物は、食品組成物に通常用いられ、臭覚、味覚、視覚などを向上させる追加成分を含み得る。例えば、ビタミンA、C、D、E、B1、B2、B6、B12、ナイアシン(niacin)、ビオチン(biotin)、葉酸(folate)、パントテン酸(panthotenic acid)などを含み得る。また、亜鉛(Zn)、鉄(Fe)、カルシウム(Ca)、クロム(Cr)、マグネシウム(Mg)、マンガン(Mn)、銅(Cu)、などのミネラルを含み得る。また、リシン、トリプトファン、システイン、バリンなどのアミノ酸を含み得る。
また、上記組成物は防腐剤(ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、サリチル酸、デヒドロ硝酸ナトリウム等)、殺菌剤(さらし粉と高度さらし粉、次亜塩素酸ナトリウム等)、酸化防止剤(ブチルヒドロキシアニソール(BHA)、ブチルヒドロキシトルエン(BHT)等)、着色剤(タール色素等)、発色剤(亜硝酸ナトリウム、亜酢酸ナトリウム等)、漂白剤(亜硫酸ナトリウム)、調味料(MSGグルタミン酸ナトリウム等)、甘味料(ズルチン、シクラメート、サッカリン、ナトリウム等)、香料(バニリン、ラクトン類等)、膨張剤(明礬、D-酒石酸水素カリウム等)、強化剤、乳化剤、増粘剤(糊料)、被膜剤、ガム基剤、消泡剤、溶剤、改良剤等の食品添加物(food additives)を含み得る。上記添加物は、食品の種類に応じて選別され、適切な量で用いられる。
上記カテキン酵素処理物をそのまま添加したり、他の食品または食品成分と共に用いられ、常法により好適に用いられる。有効成分の混合量はその使用目的(予防、健康または治療的処置)に応じて適切に決定され得る。しかし、健康及び衛生を目的として長期間摂取する場合には、上記範囲以下の含量を含み得、安全性の面で何ら問題がないため、有効成分は、上記範囲以上の量でも用いられる。
本発明の食品組成物の一例として健康飲料組成物としても用いられ、この場合、通常の飲料のように様々な香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含有することができる。上述した天然炭水化物は、ブドウ糖、果糖のようなモノサッカライド;マルトース、スクロースのようなジサッカライド;デキストリン、シクロデキストリンのようなポリサッカライド; キシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールであってもよい。甘味剤は、ソーマチン、ステビア抽出物のような天然甘味剤;サッカリン、アスパルテームのような合成甘味剤などを用いることができる。
上記以外に健康飲料組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸、ペクチン酸の塩、アルギン酸、アルギン酸の塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、pH調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコールまたは炭酸化剤などを含有し得る。その他に天然果物ジュース、果物ジュース飲料、または野菜飲料の製造のための果肉を含有し得る。このような成分は独立にまたは混合して用いることができる。
本発明の食品組成物は、肥満または筋肉減弱症の予防または改善効果を奏することができれば、多様な重量％で含み得るが、具体的には、カテキン酵素処理物を食品組成物の全重量比0.00001～100重量％または0.01～80重量％で含み得る。
本発明のもう一つの態様は、上記カテキン酵素処理物を、これを必要とする個体に投与する段階を含む肥満又は筋肉減弱症(sarcopenia)の予防又は治療方法を提供する。
本発明の用語「カテキン酵素処理物」、「肥満」、「筋肉減弱症」、「予防」、「治療」及び「投与」は、前述の通りである。
本発明の用語、「個体」とは、肥満又は筋肉減弱症が生じ、又は発生する可能性のあるヒトを含むすべての動物を意味し得る。上記動物はヒトのみならず、これと類似する症状の治療を必要とする牛、馬、羊、豚、山羊、ラクダ、カモシカ、犬、猫等の哺乳動物であってもよいが、これに制限されるものではない。
本発明の上記の予防又は治療方法は、具体的には肥満又は筋肉減弱症が発生し、又は発生するおそれがある個体に上記組成物を薬学的に有効な量で単一又は多重投与する段階を含むことができる。
以下、実施例を通じて本発明の構成及び効果をより詳細に説明する。これら実施例は、専ら本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれにより限定されるものではない。
本発明で用いられたカテキンは緑茶カテキンであり、Anhui Redstar Pharmaceutical Corp. Ltd.から購入して用い、緑茶カテキン分解酵素であるタンナーゼ(tannase)は500Unit/gのTannase-KTFHをKikkomanから購入して用いた。
《比較例1:追加でカテキンを添加しない緑茶カテキン酵素処理物の製造》
反応器に緑茶カテキン360g及び精製水3000gを投入し、クエン酸と重炭酸ナトリウムを添加しながら酵素処理を行うための適正pHであるpH5.0に調整した後、5分間60rpmで攪拌した。反応液にタンナーゼを24g添加した後、40℃で6時間反応を進行し、80℃で30分間反応させ、酵素を不活性化して酵素処理物を製造した。
《比較例2:緑茶カテキン酵素処理物の製造及びEGCG含量の測定》
《比較例2-1:粉末カテキンを1％ずつ連続して添加し、添加されたカテキンの総量が12％である条件》
精製水500gにクエン酸と重炭酸ナトリウムを添加して酵素処理を行うための適正pHである5.0に調整した後、タンナーゼ4gを添加して40℃で5分間60rpmで攪拌して活性化させた。タンナーゼ溶液に緑茶カテキン5gを添加して40℃で反応させ、30分間ごとにサンプリングしてEGCG含量を測定した。
その結果、図3に示した通り酵素濃度4U/mlでカテキン濃度1％を30分間で分解完了し、9％まで4時間30分間で酵素処理を完了し、溶液比カテキン濃度10％からは1％を分解するのに1時間ずつかかり、総カテキン濃度12％を7時間30分にわたって分解を完了した。
《比較例2-2:1分当たり添加されるカテキンの量が0.1％(カテキン3g/3000mL)になるようにカテキン溶液を1分当たり8.3mlずつ連続して添加し、添加されたカテキンの総量が12％(カテキン360g/3000mL)である条件》
精製水2000gを反応器に入れてクエン酸と重炭酸ナトリウムをそれぞれ発酵槽の酸、アルカリポンプに添加した後、酵素処理を行うための適正pHである5.0に設定する。精製水にタンナーゼ24gを入れて40℃で30分間200rpmで攪拌して活性化させた。緑茶カテキンを反応器に添加するために緑茶カテキン360gを精製水に溶解させて1Lの緑茶カテキン溶液を製造した。このように製造された緑茶カテキン溶液を1分当たり3g(基質0.1％)のカテキンが追加される速度で定量ポンプを通じて2時間連続して添加し、15分ごとに反応液をサンプリングしてEGCG含量を測定した。カテキン添加が完了した後にも3時間EGCG含量の変化を観察した。
その結果、図4に示した通り、カテキン添加開始後45分間の区間まではEGCG含量が増加しないが、1時間の区間からEGCGが蓄積され始め、カテキン添加が終わった2時間の区間(基質12％)で酵素が完全に不活性化されることを確認した。また、1時間30分間の区間から基質添加量比蓄積されるEGCGの量が同一に維持されるという事実に基づいて、上記実験条件で酵素活性が完全に阻害される基質阻害臨界点がEGCG含量基準で4mg/ml～8mg/mlの間で形成され、その後の区間で継続して基質が添加される場合、酵素が完全に不活性化されることと判断される。
《比較例2-3:1分当たり添加されるカテキンの量が0.07％(カテキン2g/3000mL)になるようにカテキン溶液を1分当たり6mlずつ連続して添加し、添加されたカテキンの総量が12％(カテキン360g/3000mL)である条件》
精製水2000gを反応器に入れてクエン酸と重炭酸ナトリウムをそれぞれ発酵槽の酸、アルカリポンプに添加した後、酵素処理を行うための適正pHである5.0に設定する。精製水にタンナーゼ24gを入れて40℃で30分間200rpmで攪拌して活性化させた。緑茶カテキンを反応器に添加するために緑茶カテキン360gを精製水に溶解させて1Lの緑茶カテキン溶液を製造した。このように製造された緑茶カテキン溶液を1分当たり2g(基質0.07％)のカテキンが追加される速度で定量ポンプを通じて3時間連続して添加し、15分ごとに反応液をサンプリングしてEGCG含量を測定した。カテキン添加が完了した後にも3時間EGCG含量の変化を観察した。
図5に示した通り、基質添加開始後1時間の区間からEGCGが蓄積され始めて基質添加が終わる3時間の区間(12％)までEGCG含量が継続して増加したが、基質添加完了後にも酵素が不活性化されず、5時間の区間で酵素処理が完了することを確認した。上記実験結果を通じて基質阻害臨界点に到達してEGCGが引き続き蓄積されても非可逆的酵素不活性化の濃度を超えない場合、十分な時間を与えると、酵素活性が維持されて蓄積されている基質の処理が可能であることを確認した。しかし、基質添加終了時点のEGCG含量が7mg/mlで非可逆的酵素不活性化の区間には入らないが、基質阻害臨界点に含まれており、大量工程時に酵素不活性化の危険があり得る点を確認した。
《実施例1:緑茶カテキン酵素処理物の製造》
精製水2000gを反応器に入れてクエン酸と重炭酸ナトリウムをそれぞれ発酵槽の酸、アルカリポンプに添加した後、酵素処理のための適正pHである5.0に設定した。反応液にタンナーゼ24gを入れて40℃で30分間200rpmで攪拌して活性化させた。緑茶カテキンを反応器に添加するために緑茶カテキン360gを精製水に溶解させて1Lの緑茶カテキン溶液を製造した。このように製造された緑茶カテキン溶液を1分当たり3g(基質0.1％)のカテキンが添加される速度で定量ポンプを通じて5分間添加して10分間反応させる方式を繰り返し6時間反応を進行した。反応液を80℃で30分間反応させて酵素を不活性化させた後、反応液の凍結乾燥を進行した。
《実施例2:緑茶カテキン酵素処理物の製造及びEGCG含量の測定》
本発明で用いられたカテキンは緑茶カテキンであり、Anhui Redstar Pharmaceutical Corp. Ltd.から購入して用い、緑茶カテキン分解酵素であるタンナーゼ(tannase)は500Unit/gのTannase-KTFHをKikkomanから購入して用いた。
下記表1に示した条件で実施例2-1～2-3を実施した。
Figure 2022524789000008
《実施例2-1:1分当たり添加されるカテキンの量が0.1％(カテキン3g/3000mL)になるようにカテキン溶液を1分当たり8.3mlずつ5分間添加し、10分間反応させて添加されたカテキンの総量が12％(カテキン360g/3000mL)の条件》
精製水2000gを反応器に入れてクエン酸と重炭酸ナトリウムをそれぞれ発酵槽の酸、アルカリポンプに添加した後、酵素処理のための適正pHである5.0に設定した。精製水にタンナーゼ24gを入れて40℃で30分間200rpmで攪拌して活性化させた。緑茶カテキンを反応器に添加するために緑茶カテキン360gを精製水に溶解させて1Lの緑茶カテキン溶液を製造した。このように製造された緑茶カテキン溶液を1分当たり3g(基質0.1％)のカテキンが添加される速度で定量ポンプを通じて5分間添加して10分間反応させる方式を繰り返した。基質追加による酵素不活性化抑制効果を確認するために反応液を15分間ごとにサンプリングしてEGCG含量を測定する手順を6時間繰り返して経時変化を観察した。カテキン追加が完了した後にも30分間EGCG含量の変化を観察した。
その結果、図6に示した通り、緑茶カテキンの添加開始後3時間15分間の区間からEGCGが蓄積され始めて緑茶カテキンの添加が終わる6時間の区間(12％)までEGCG含量が継続して増加した。しかし、緑茶カテキンの添加が終わって30分後にEGCG含量が0に収束したところ、分解反応が完了し、緑茶カテキンの添加が終わった後にも酵素が不活性化されていないことを確認した。また、蓄積されたEGCGの最大含量は1mg/mlであり、基質阻害臨界点の区間である4mg/ml～8mg/mlより低いことを確認した。
《実施例2-2:1分当たり添加されるカテキンの量が0.1％(カテキン3g/3000mL)になるようにカテキン溶液を1分当たり8.3mlずつ10分間添加し、5分間反応させて添加されたカテキンの総量が12％(カテキン360g/3000mL)である条件》
精製水2000gを反応器に入れてクエン酸と重炭酸ナトリウムをそれぞれ発酵槽の酸、アルカリポンプに添加した後、酵素処理のための適正pHである5.0に設定した。その後、反応器にタンナーゼ24gを入れて40℃で30分間200rpmで攪拌して活性化させた。緑茶カテキンを反応器に添加するために緑茶カテキン360gを精製水に溶解させて1Lの緑茶カテキン溶液を製造した。このように製造された緑茶カテキン溶液を1分当たり3g(基質0.1％)のカテキンが添加される速度で定量ポンプを通じて10分間添加して5分間反応させる方式を繰り返した。基質追加による酵素不活性化抑制効果を確認するために反応液を15分間ごとにサンプリングしてEGCG含量を測定する手順を3時間繰り返して経時変化を観察した。カテキン添加が完了した後にも3時間EGCG含量の変化を観察した。
その結果、図7に示した通り、緑茶カテキン添加開始後1時間30分間の区間からEGCGが蓄積され始めて緑茶カテキンの添加が終わる3時間の区間までEGCG含量が継続して増加した。しかし、緑茶カテキンの添加が終わって1時間30分後にEGCG含量が0に収束したところ、分解反応が完了し、緑茶カテキンの添加が終わった後にも酵素が不活性化されていないことを確認した。
《実施例2-3:1分当たり添加されるカテキンの量が0.1％(カテキン3g/3000mL)になるようにカテキン溶液を1分当たり8.3mlずつ5分間添加し、10分間反応させて添加されたカテキンの量が20％(カテキン600g/3000mL)である条件》
精製水1400gを反応器に入れてクエン酸と重炭酸ナトリウムをそれぞれ発酵槽の酸、アルカリポンプに添加した後、酵素処理のための適正pHである5.0に設定した。その後、反応器にタンナーゼ24gを入れて40℃で30分間200rpmで攪拌して活性化させた。緑茶カテキンを反応器に添加するために緑茶カテキン600gを精製水に溶解させて1.6Lの緑茶カテキン溶液を製造した。このように製造された緑茶カテキン溶液を1分当たり3g(基質0.1％)のカテキンが添加される速度で定量ポンプを通じて5分間添加して10分間反応させる方式を繰り返した。基質追加による酵素不活性化抑制効果を確認するために反応液を30分間ごとにサンプリングしてEGCG含量を測定する手順を10時間繰り返して経時変化を観察した。カテキン添加が完了した後にも30分間EGCG含量の変化を観察した。
その結果、図8に示した通り、基質添加開始後4時間30分間の区間からEGCGが蓄積され始めて基質添加が終わる10時間まで(20％)EGCG含量が継続して増加して酵素が完全に不活性化されることを確認した。
《実施例3:緑茶抽出物のカテキン含量別の酵素反応完了時間の測定》
緑茶抽出物のカテキン含量と関係なく本願発明による緑茶カテキン酵素処理物の製造方法を適用させることができることを確認するために、下記のような方法で酵素反応完了時間を測定した。
《実施例3-1:緑茶抽出物のエタノール分画物の製造》
緑茶の葉5kg及び精製水50Lを低温濃縮抽出器に入れて80℃で6時間抽出した。当該抽出液を5μmのフィルタ濾過後、25Lまで濃縮した後、25Lの濃縮液に37.5Lのエタノールを添加して3回にわたり分画を実施した。分離したエタノール層を集めて濃縮及び乾燥を進行した結果、乾燥物約1.1kgを得た。
《実施例3-2:緑茶抽出物のエチルアセテート(EA)分画物の製造》
緑茶の葉5kg及び精製水50Lを低温濃縮抽出器に入れて80℃で6時間抽出した。当該抽出液を5μmのフィルタ濾過後、25Lまで濃縮した後、25Lの溶液に37.5LのEAを添加して3回にわたり分画を実施した。分離したEA層を集めて濃縮及び乾燥を進行した結果、乾燥物約0.9kgを得た。
《実施例3-3:カテキン含量別の緑茶カテキン酵素処理物の製造及び酵素反応完了時間の測定》
精製水1Lを反応器に入れてクエン酸と重炭酸ナトリウムをそれぞれ発酵槽の酸、アルカリポンプに添加した後pHを5.0に設定した。その後、反応器にタンナーゼ24gを入れて40℃で30分間200rpmで攪拌して活性化させた。1分当たり添加される緑茶カテキンの量を同一に合せるために実施例3-1により製造された緑茶抽出物のエタノール分画物770g、実施例3-2により製造された緑茶抽出物のEA分画物430g、及び中国産カテキン360gを精製水に溶解させて2Lの緑茶カテキン溶液を製造した。このように製造された緑茶カテキン溶液を1分当たり16.6mlが追加されるように定量ポンプを用いて5分間添加して10分間反応させる方式を繰り返した。酵素処理完了時間を確認するために基質添加後、30分間ごとにサンプリングしてEGCGの含量を測定し、EGCGの含量が0に収束する時、反応が完了したことと判断した。
その結果、表2に示した通り緑茶抽出物のカテキン含量に関係なく7時間以内にいずれも酵素反応が完了することを確認した。
Figure 2022524789000009
《実施例4:酵素濃度別の最大基質処理濃度の測定》
用いられる酵素濃度による酵素の最大基質処理濃度の変化を確認するために、次のような方法で酵素濃度別の最大基質処理濃度を測定した。
精製水1Lを反応器に入れてクエン酸と重炭酸ナトリウムをそれぞれ発酵槽の酸、アルカリポンプに添加した後、pHを5.0に設定した。添加される緑茶カテキン溶液の体積とタンナーゼ溶液の体積和(3L)を基準に1、4、8、16、32u/mlの酵素濃度を製造するために、反応器にそれぞれタンナーゼ(Tannase KTFH, 500U/g)6、24、48、96、192gを添加し、40℃で30分間200rpmで攪拌して酵素を活性化させた。
緑茶カテキンを反応器にさらに添加するために緑茶カテキン200、400、600、800、1000gを精製水に溶解させて2Lの緑茶カテキン追加溶液を製造した。ここで、緑茶カテキン追加溶液のそれぞれの基質濃度は添加する緑茶カテキン溶液の体積とタンナーゼ溶液の体積和(3L)を基準に6、13、20、26、33％に該当する。
酵素濃度別の最大基質処理量を調べるために、製造されたそれぞれの緑茶カテキン追加溶液をそれぞれの酵素濃度に1分当たり16.6mlのカテキン溶液が追加されるように定量ポンプを用いて5分間添加して10分間反応させる方式を繰り返した。その後、反応完了如何を確認するために30分間ごとに反応液をサンプリングしてEGCG含量変化を観察し、EGCG含量が0に収束する時、反応が完了したことと判断した。各酵素濃度及び基質濃度別に酵素反応を進行し、反応が完了した場合、表3にoで表した。
その結果、表3に示した通り、酵素濃度が増加すれば、最大基質処理濃度も増加するが、酵素単位(U/ml)当たりの基質処理濃度は減少することを確認した。
Figure 2022524789000010
《実験例1:緑茶カテキン酵素処理物の有効成分の分析》
EGCG及びECGの分解如何を確認するために、比較例1及び実施例1の緑茶カテキン酵素処理物の有効成分の含量を測定した。
具体的には、比較例1及び実施例1の緑茶カテキン酵素処理物の有効成分であるEGCG、ECG、EGC、EC及び没食子酸の含量を測定するために高性能液体クロマトグラフィ(Infinity 1260, Agilent, USA)を用い、カラムはPoroshell 120EC-C18(4.6x50 mm)を用い、検出スペクトルはUV 280nmで測定した。移動相Aは0.1％のリン酸を含有した蒸溜水を用い、移動相Bは100％ACNを用いた。時間に応じた移動相の条件は0～4分に移動相Aを90％から85％、4～8分に移動相Aを85％から73％に変更して分析し、流速は1ml/min、試料量は3μlとした。標準物質の製造は、有効成分及び前駆体標準品30mgを50ml容量のフラスコに入れてメタノールに溶かして標準溶液とし、濃度別に希釈して分析後に検量線を作成し、各有効成分の含量を測定した。
その結果、HPLCクロマトグラムを図9で示し、以下の表4に示した通り、比較例1及び実施例1の酵素処理物のEGCG及びECGはタンナーゼ処理により、いずれもEGC、EC及び没食子酸に転換されたことを確認した。
Figure 2022524789000011
《実験例2:タンナーゼ酵素処理による筋肉増加促進効果の検証》
《実験例2-1:筋肉細胞の分化促進の確認》
本発明の方法によりタンナーゼ酵素処理による筋肉細胞の筋繊維への分化促進能力を確認するために筋繊維直径及び長さを測定した。
具体的には、C2C12筋肉細胞を American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA)から分譲を受けて用いた。C2C12筋肉細胞は筋肉細胞の代謝過程の研究に広く用いられる細胞株であり、上記細胞の分化が活発に起きるほど筋繊維への転換が活発に起きる。上記米国細胞株バンク(ATCC)から受けた細胞株は、20％ Fetal bovine serum(FBS, Gibco, Grand Island, NY, USA)と1％ penicillin-streptomycin(P/S, Gibco, Grand Island, NY, USA)が含まれたDulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, Lonza, Allendale, NJ, USA)であり、5％ CO2, 37℃が維持された条件で培養した。安定化したC2C12筋肉細胞を24 well plateに1×105 cells/mlの密度で分注し、培養して80％ confluent時点まで維持させた。そして2％ Horse Serum(HS, Gibco, Grand Island, NY, USA) DEME 培地に2日間筋肉細胞分化を誘導し、その後、6日間2日ごとに2％ HS DMEM培地を交替して培養した。筋肉細胞分化過程の間、酵素転換緑茶カテキン抽出物を各培養液にそれぞれ20μl/mlの濃度で処理し、分化が完成する時点である8日目に筋肉細胞分化程度を観察した。
その結果、図10及び図11に示した通り、実施例1の緑茶カテキン酵素処理物を処理した時、筋繊維直径は82.28μmであり、筋繊維長さは1523.72μmであった。比較例1の場合、筋繊維直径は82.28μmであり、筋繊雑長さは1523.72μmであったため、実施例1の緑茶カテキン酵素処理物を処理した時、筋肉細胞の分化がさらによく起きることを確認した。これは、実施例1の緑茶カテキン酵素処理物に老人性筋肉疾患の治療と予防に効能があるECの含量がさらに高いことを意味する。
《実験例2-2:緑茶カテキン酵素処理物のC2C12細胞でp-AMPK及び筋肉成長因子の発現確認》
本発明による緑茶カテキン酵素処理物の筋肉増加効果を確認するために、AMPK活性化効能及び筋肉生成を調節するfollistatinの発現を測定した。
具体的には、C2C12細胞を6 wellプレートに接種し、20％ FBSを含むDMEM培地を用いて培養した後、分化を誘導するために2％ HSを含むDMEM培地で交替し、緑茶カテキン酵素処理物を添加して培養した。SDS sample bufferで収穫した後にSonicationを通じてprotein lysateを得た。そして10％ SDS-PAGE 電気泳動を実施し、semi-dry transfer機器を用いてPVDF transfer membraneにタンパク質をtransferした。上記Transferされたタンパク質を5％ skim milkで1時間常温でblockingした後、total AMPKとphospho-AMPK(Thr172), Follistatin抗体を用いて4℃で一晩中インキュベーションした。0.1％ tween-20が添加されたTBS bufferで3回洗浄後にanti-mouse HRP secondary antibodyを用いてimmunoblotを行った。
その結果、図12に示した通り、実施例1の緑茶カテキン酵素処理物を処理したC2C12細胞で強いp-AMPKとfollistatin活性を確認した。
《実験例3:緑茶カテキン酵素処理物の肥満予防または治療効果の確認》
《実験例3-1:緑茶カテキン酵素処理物の脂肪細胞への分化抑制の確認》
本発明による緑茶カテキン酵素処理物の脂肪前駆細胞増殖抑制能を確認するために脂肪前駆細胞で脂肪蓄積率を測定した。
具体的には、3T3-L1 脂肪前駆細胞を American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)から分譲を受けて用いた。3T3-L1脂肪前駆細胞は脂肪細胞の代謝過程研究に広く用いられる細胞株であり、上記細胞の分化が活発に起きるほど脂肪細胞内の脂肪の蓄積も活発に起きる。上記米国細胞株バンク(ATCC)から受けた細胞株は10％ Bovine calf serum(BCS, Gibco, Grand Island, NY, USA)と1％ penicillin-streptomycin(P/S, Gibco, Grand Island, NY, USA)が含まれた Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, Lonza, Allendale, NJ, USA)であり、5％ CO2, 37℃が維持された条件で培養した。安定化した3T3-L1脂肪前駆細胞は24 well plateに1×105 cells/mlの密度で分注し、培養して100％ confluent 時点になれば、2日間さらに維持させた。そして、0.5mM IBMX (3-isobutyl-1-methylzanthine, Sigma, St. Louis, Mo, USA) 1μM Dexamethasone(Sigma, St. Louis, MO, USA), 10μg/ml Insulin(Gibco, Grand Island, NY, USA)を含む10％ Fetal Bovine Serum(FBS, Gibco, Grand Island, NY, USA) DEME培地で2日間脂肪細胞分化を誘導し、培養2日後、10μg/ml Insulin を含む10％ FBS DMEM培地で2日間さらに培養した。その後、4日間2日ごとに10％ FBS DMEM培地を交替して培養した。脂肪細胞分化過程の間、比較例1及び実施例1により製造された緑茶カテキン酵素処理物を各培養液にそれぞれ25、50μl/mlの濃度で処理し、分化が完成する時点である10日目に脂肪細胞分化の程度を観察した。
比較例1及び実施例1の緑茶カテキン酵素処理物が3T3-L1脂肪前駆細胞の脂肪細胞への分化抑制及び脂肪生成抑制効果を奏するかどうかを確認するために中性脂肪を特異的に染色させる Oil Red O 染色を進行した。
具体的には、脂肪細胞分化を誘導した細胞から培地を除去し、PBS(Phosphate Buffered Saline)で2回洗浄した後、4％ formaldehydeで30分間常温で固定した。固定後、60％ isopropanolで洗浄して0.2％ oil red O染色薬(dissolved in 60％ isopropanol)で1時間常温で染色した。染色後に蒸溜水で洗浄した後、光学顕微鏡で観察した。また、染色した細胞はisopropanolで溶解した後、ELIZA reader機を用いて570nmで吸光度を測定した。脂肪細胞における脂肪の蓄積率を下記数式1で計算した。
Figure 2022524789000012
その結果、図13に示した通り、実施例1の緑茶カテキン酵素処理物は50μg/mlの濃度でMDI中性脂肪蓄積率が60％で比較例1に比べて低く示され、統計学的に有意な差を示した。従って、本発明の緑茶カテキン酵素処理物は、脂肪前駆細胞の脂肪細胞の分化及び中性脂肪の生成を効率よく抑制して肥満の予防または治療効果を奏することを確認した。
《実験例3-2:緑茶カテキン酵素処理物の3T3-L1細胞でAMPK活性化効果の確認》
本発明による緑茶カテキン酵素処理物の体脂肪減少効果を確認するためにAMPK活性化効能を測定した。エネルギー代謝過程でAMPK活性の増加は ACCs(acetyl-CoA carboxylase 1及び2)のリン酸化を増加させることが知られている。
具体的には、3T3-L1細胞を6wellプレートに接種し、10％ BSCを含むDMEM培地を用いて培養した後、分化を誘導するために1％ FBSを含むDMEM培地で交替し、緑茶カテキン酵素処理物を添加して培養した。SDS sample bufferで収穫後にSonicationを通じてprotein lysateを得た。そして10％ SDS-PAGE電気泳動を実施し、semi-dry transfer機器を用いてPVDF transfer membraneにタンパク質をtransferした。上記Transferされたタンパク質を5％ skim milkで1時間常温でblockingした後、total AMPKとphospho-AMPK(Thr172) 抗体を用いて4℃で一晩中インキュベーションした。0.1％ tween-20が添加されたTBS bufferで3回洗浄後にanti-mouse HRP secondary antibodyを用いてimmunoblotを行った。
その結果、図14に示した通り、対照群及び比較例1に比べて実施例1の緑茶カテキン酵素処理物を処理した細胞で強いAMPK活性を示すことを確認した。
《実験例3-3:緑茶カテキン酵素処理物の3T3-L1細胞において白色脂肪の褐色脂肪への転換確認》
本発明による緑茶カテキン酵素処理物の体脂肪減少効果を確認するために白色脂肪の褐色脂肪化を引き起こすUCP1及びPRDM16の活性を測定した。脂肪組織は脂肪貯蔵を主要機能とする白色脂肪(white adipose tissue)と脂肪燃焼を通じた発熱を主要機能とする褐色脂肪(brown adipose tissue)に分類され得る。白色脂肪の褐色化は肥満治療効果及びエネルギー代謝機能正常化効果があることが報告されている。
具体的には、3T3-L1細胞を6 wellプレートに接種し、10％ BSCを含むDMEM培地を用いて培養した後、分化を誘導するために1％ FBSを含むDMEM培地で交替し、緑茶カテキン酵素処理物を添加して培養した。細胞にTRI reagentで収穫後にSonicationを通じてRNA lysateを得た。上記抽出されたRNAにUCP1とPRDM16プライマーを付着してリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を行い、RNA発現を測定した。
その結果、図15に示した通り、比較例1に比べて実施例1の緑茶カテキン酵素処理物を処理した細胞においてUCP1及びPRDM16の発現が大きく示されることを確認した。
《実験例3-4:緑茶カテキン酵素処理物の体重減少効果の確認》
本発明による緑茶カテキン酵素処理物の体重減少効果を確認するために高脂肪食餌で肥満が誘導された動物モデルの体重変化を測定した。
具体的には、雄性C57BL/6マウスを対象に実験を進めた。5週齢のC57BL/6マウスは(株)オリエントバイオから購入して用いた。1週間の検疫及び適応過程を経た後、体重減少のない健康な動物を選別して実験に用いた。実験動物は温度23±3℃、相対湿度50±10％、換気回数10～15回/時間、照明時間12時間、照度150～300Luxで設定された飼育環境で飼育した。試験の全期間に実験動物は固形飼料(株)カーギルアグリピュリナと飲水を自由摂取させた。1週間の適応期間を経た後、健康な動物を選別して亂塊法に基づいて対照群1、対照群2、処理群1、処理群2、処理群3に分類し、各試験群当たり10匹の実験動物を用いた。処理群の場合、混合物をマウス用ゾンデ(feeding needle)を用いて実施例1の緑茶カテキン酵素処理物を50mg/kg、100mg/kgまたは200mg/kgの量で経口投与した。対照群の場合、純水のみを経口投与して媒体対照群と設定した。試験全期間の間、対照食餌群と高脂肪食餌群には Research Diets, Inc. (New Brunswick, NJ, USA)から購入した対照食餌(エネルギー比率kcal％;タンパク質:炭水化物:脂肪=20:70:10)と高脂肪食餌(エネルギー比率kcal％;タンパク質: 炭水化物:脂肪=20:20:60)をそれぞれ供給し、食餌と飲水を自由に摂取させた。対照食餌と高脂肪食餌の食餌組成は表5に示した。試験物質は生理食塩水に溶かして8週間一定時間に経口投与し、対照群1と対照群2は試験物質が含まれていない生理食塩水を他の試験群と同一に経口投与した。全ての動物に対して投与開始時及び試験期間中、投与直前に週1回にわたり体重を測定し、8週間投与終了後に体重の変化量を計算し、食餌効率(Food efficiency ratio, FER)は試験期間に成長した体重増加量を同一期間摂取した食餌の量で除して全体食餌効率で定量して測定した。
Figure 2022524789000013
その結果、下記表6及び図16に示した通り、対照群2の場合、対照群1と比較して体重が急激に増加したことに対し、処理群1、2及び3の場合、給与1週間後から対照群1と同様の水準に体重が増加した。
上記結果を数値化して各群を比較した結果、下記表6に示した通り、実施例1の投与により体重増加量は半分に示され、体重増加が抑制されたことを確認した。食餌効率(摂取量比体重増加量)は、高脂肪食餌群が正常食餌群と比較して約3倍程増加し、総体重増加量が最も少ない処理群3と比較群1の食餌効率が他の処理群に比べて有意に低かった。また、比較例1を300mg/kg処理したマウスと実施例1を200mg/kg処理したマウスの食餌効率が同様であるため、本発明の方法で製造された緑茶カテキン酵素処理物の体重減少効果がより大きいことを確認した。
Figure 2022524789000014
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されることが理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は上記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈すべきである。

Claims (14)

  1. タンナーゼ溶液を準備する第1段階;
    タンナーゼ溶液にカテキン溶液を添加する第2段階;
    第2段階の溶液に含まれたカテキンとタンナーゼとを反応させる第3段階;及び
    第2段階及び第3段階を連続して繰り返す第4段階を含む、カテキン酵素処理物の製造方法。
  2. カテキンは、緑茶抽出物またはその分画物である、請求項1に記載のカテキン酵素処理物の製造方法。
  3. 上記緑茶抽出物またはその分画物のカテキン含量は1～99％である、請求項2に記載のカテキン酵素処理物の製造方法。
  4. 第1段階でタンナーゼの濃度は、第1段階のタンナーゼ溶液の体積及び第2段階で添加されるカテキン溶液の体積の和である総溶液の体積比1～50Unit/mlである、請求項1に記載のカテキン酵素処理物の製造方法。
  5. 第2段階で1分当たり添加されるカテキンの量は、第1段階のタンナーゼ溶液の体積及び第2段階で添加されるカテキン溶液の体積の和である総溶液の体積を基準に0.01～20％(w/v)である、請求項1に記載のカテキン酵素処理物の製造方法。
  6. 第2段階で添加される総カテキンの量は、第1段階のタンナーゼ溶液の体積及び第2段階で添加されるカテキン溶液の体積の和である総溶液の体積を基準に0.01～40％(w/v)である、請求項1に記載のカテキン酵素処理物の製造方法。
  7. 第3段階は1～60分間行われる、請求項1に記載のカテキン酵素処理物の製造方法。
  8. 第4段階は、第2段階で添加されるカテキンの量が第1段階のタンナーゼ溶液の体積及び第2段階で添加されるカテキン溶液の体積の和である総溶液の体積を基準に1～90％(w/v)になるまで第2段階及び第3段階を連続して繰り返す、請求項1に記載のカテキン酵素処理物の製造方法。
  9. タンナーゼを不活性化させる段階;及び／又は反応液を濾過、濃縮及び／又は乾燥させる段階をさらに含む、請求項1に記載のカテキン酵素処理物の製造方法。
  10. 上記カテキン酵素処理物は、没食子酸、エピガロカテキンガレート(EGCG)、エピカテキンガレート(ECG)、エピガロカテキン(EGC)及びエピカテキン(EC)の和100重量部を基準に上記エピガロカテキンガレート(EGCG)及びエピカテキンガレート(ECG)の和を1重量部未満で含む、請求項1～9のいずれか一項に記載のカテキン酵素処理物の製造方法。
  11. 請求項10に記載の製造方法により製造されたカテキン酵素処理物を含む肥満又は筋肉減弱症(sarcopenia)の予防又は治療用薬学的組成物。
  12. 請求項10に記載の製造方法により製造されたカテキン酵素処理物を含む肥満又は筋肉減弱症(sarcopenia)の予防又は改善用食品組成物。
  13. 肥満又は筋肉減弱症(sarcopenia)の予防又は治療のための、請求項10に記載の製造方法により製造されたカテキン酵素処理物の使用。
  14. 請求項10に記載の製造方法により製造されたカテキン酵素処理物を、これを必要とする個体に投与する段階を含む肥満又は筋肉減弱症(sarcopenia)の予防又は治療方法。
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