KR20180034874A - 카테킨 함유 녹차 추출물을 포함하는 손상 근육의 재생을 촉진하는 약학 조성물 - Google Patents

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황은숙
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Abstract

본 발명은 카테킨의 새로운 용도인 근질환 또는 근육손상의 예방 또는 치료용도에 관한 것으로, 카테킨 또는 녹차 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 TAZ의 핵내 이동을 유도하고 TAZ를 활성화하여 근육 분화를 촉진하고 지방 분화를 억제함으로써 근질환 또는 근육손상의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

카테킨 함유 녹차 추출물을 포함하는 근질환 예방 또는 치료용 조성물{Composition for Preventing or Treating Muscle Diseases Comprising Catechins Green Tea Extracts}
본 발명은 카테킨 함유 녹차 추출물을 포함하는 근질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 카테킨 또는 이를 함유하는 녹차 추출물이 TAZ의 핵내 이동을 유도하고 TAZ를 활성화하여 근육 분화를 촉진하고 지방 분화를 억제함으로써 근질환을 예방 또는 치료하는 조성물에 관한 것이다.
노화가 진행됨에 따라 일반적으로 지방이 증가하고 근육량이 감소하는 것으로 알려져 있다. 노화방지를 위한 근육량 유지의 중요성이 대두되면서 근육 형성을 유도하는 물질 개발에 대한 연구가 활발하게 일어나고 있고, 녹차 추출물 등이 근육 형성과 기능향상에 효과가 있는 것으로 밝혀졌다(Stephen E. Always et al. J Appl Physiol, 118, 319-330 (2015)).
근육 손상의 회복을 위해서는 근육줄기세포(satellite cells)가 근육세포 증식과 재생에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이 세포는 골격근이 손상되었을 때 활성화되어 MyoD, 마오게닌(myogenin)과 같은 근육조절인자(MRFs) 을 발현하고 근육으로의 분화를 유도한다(R.N. Cooper et al., J Cell Sci, 112, 2895-2901 (1999); D.D.W. Cornelison et al., Dev Biol, 191, 270-283 (1997); Kyuson Yun et al., Curr Opin Cell Biol 8, 877-889 (1996); Michael A. Rudnicki et al., Cell 75, 1351-1359 (1993)).
전사조절인자인 TAZ는 히포(Hippo) 신호과정의 구성요소인 Lats1/2 키나제(kinase)에 의해 Ser89 부위가 인산화되면 14-3-3와 결합하여 세포질에 존재하게 되고, 핵에서는 다양한 전사인자와 작용하여 표적 유전자들의 발현 및 세포적 기능을 조절한다. 또한 TAZ는 중간엽 줄기세포의 분화를 조절하며(Jeong-Ho Hong et al., Science, 309, 1074-1078 (2005)), 특히 MyoD와 결합하여 근육분화를 유도하고 PPARγ와 작용하여 지방분화를 억제한다(Hana Jeong et al., Faseb J 24, 3310-3320 (2010); Jeong-Ho Hong et al., Science, 309, 1074-1078 (2005)).
한편, 노화에 따른 근육감소증은 일상생활 활동장애를 유발할 뿐만 아니라 감소한 근육의 자리를 지방이 채우게 되면서 인슐린 저항성 증가와 당뇨, 비만, 심혈관 질환 등 2차 노인성질환을 일으킨다. 근육감소증의 보다 구체적인 원인으로는 체내 단백질 합성 능력의 감소, 근육 유지에 필요한 단백질의 감소, 뇌에서 근육으로 신호를 내보내는 신경세포의 노화 그리고 성장호르몬과 성호르몬의 감소 등을 꼽을 수 있다.
기존에 시행되고 있는 대표적인 약물치료를 살펴보면, 뇌하수체에서 아데노코티코트로핀 호르몬(adenocorticotropic hormone, ACTH)의 분비를 촉진시키는 펩타이드인 유로코르틴가 있고, 폐경으로 오는 호르몬 감소시 근육밀도를 강화시켜 주고 단기간의 복부지방 감소와 뼈의 손실을 예방할 수 있는 호르몬대체치료법(Hormone replacement therapy, HRT)이 알려져 있으나 이는 장기 복용시 암을 유발하거나 그 외에 건강상에 문제를 일으키는 부작용이 있다. 이 밖에 남성호르몬보조제(testosterone supplement), 성장호르몬보조제(growth hormone supplement), 인슐린저항, 비만, 고혈압 치료제 등이 근육감소증에 어느 정도 효과가 있는 것으로 알려져 있으나 이들은 근육감소증의 직접적인 치료제가 아니라는 한계가 있다. 이에 노인성 근육감소증(Sarcopenia) 뿐만 아니라 자극에 의한 근육 손상을 직접적으로 개선할 수 있는 표적치료제의 개발이 반드시 필요한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 근육의 증식과 근육줄기세포의 분화를 촉진하는 약물의 기작을 밝혀내어 궁극적인 근육 재생 촉진물을 개발하고자 예의 노력한 결과, 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate, EGCG), 특히 에피갈로카테킨-3-갈레이트(epigallocatechin-3-gallate)를 함유하고 있는 녹차 추출물을 섭취할 경우, TAZ를 활성화하여 근육 분화를 촉진하고 지방 분화를 억제하고, 손상된 근육의 재생과정에서 활성화된 근육줄기세포에 작용하여 근육으로 분화시키는 효과가 뛰어나 노화가 진행됨에 따른 근감소증과 비만 현상을 동시에 개선할 수 있어 지방 증가를 동반한 노인성 근육감소증의 개선 뿐만 아니라 근육 손상의 치료에도 효과적인 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 카테킨 또는 카테킨 함유 녹차 추출물을 유효성분으로 함유하는 근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 목적은 카테킨 또는 카테킨 함유 녹차 추출물을 유효성분으로 함유하는 근질환 예방 또는 개선용 식품을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 카테킨을 유효성분으로 함유하는 근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 카테킨을 유효성분으로 함유하는 근질환 예방 또는 개선용 식품을 제공한다.
본 발명은 또한, 녹차 추출물을 유효성분으로 함유하는 근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 녹차 추출물을 유효성분으로 함유하는 근질환 개선용 식품을 제공한다.
본 발명에 따른 카테킨 함유 녹차 추출물은 TAZ의 핵내 이동을 유도함으로써 TAZ를 활성화하여 근육 분화를 촉진하고 지방 분화를 억제하는 효과가 있으며, 특히 EGCG는 노화가 진행됨에 따라 관찰되는 근감소증과 비만 현상을 동시에 개선할 수 있어, 약물 개발에 있어서 경쟁력이 높고, 손상된 근육의 재생과정에서 활성화된 근육줄기세포에 작용하여 근육으로 분화시키는 효과가 뛰어난 것으로 나타나 지방 증가를 동반한 노인성 근육감소증의 개선뿐만 아니라 외부자극에 의한 근육감소 및 근육손상의 치료에도 효과적이다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에 의하여 EGCG 처리 농도에 따른 TAZ 단백질과 근육분화 표지단백질인 MHC 및 미오게닌(myogenin)의 발현을 웨스턴 블롯팅(western blotting) 분석법으로 측정한 도면이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1에 의하여 TAZ 유전자와 근육분화 표지유전자인 미오게닌(myogenin) 및 MCK의 발현 변화를 정량 실시간 PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)로 측정한 도면이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1에 의하여 EGCG 첨가에 의한 근원섬유의 형성이 증가한 것을 광학현미경으로 관찰한 사진과 면역형광법(immunofluorescence) 후 공초점현미경으로 관찰한 사진이다.
도 4는 본 발명의 실시예 2에 의하여 EGCG에 의한 MHC와 미오게닌(myogenin)의 양적 변화를 웨스턴 블롯팅(western blotting) 분석법으로 측정한 도면이다.
도 5는 본 발명의 실시예 2에 의하여 근육분화 표지유전자인 미오게닌(myogenin) 및 MCK의 발현 변화를 qRT-PCR로 측정한 도면이다.
도 6은 본 발명의 실시예 2에 의하여 EGCG 첨가에 의한 근원섬유의 형성이 증가한 것을 광학현미경으로 관찰한 사진과 면역형광법(immunofluorescence) 후 공초점현미경으로 관찰한 사진이다.
도 7은 본 발명의 실시예 3에 의하여 EGCG에 의한 TAZ와 PAX7의 양적 변화를 웨스턴 블롯팅(western blotting) 분석법으로 측정한 도면이다.
도 8은 본 발명의 실시예 3에 의하여 Myf5 , PAX7 및 TAZ 유전자의 발현 변화를 qRT-PCR로 측정한 도면이다.
도 9는 본 발명의 실시예 3에 의하여 EGCG에 의한 TAZ, Myf5 및 PAX7의 양적 변화를 웨스턴 블롯팅(western blotting) 분석법으로 측정한 도면이다.
도 10은 본 발명의 실시예 3에 의하여 Myf5 , PAX7 및 TAZ 유전자의 발현 변화를 qRT-PCR로 측정한 도면이다.
도 11은 본 발명의 실시예 3에 의하여 근육조직의 H&E 염색법 결과를 도시한 도면이다.
도 12는 본 발명의 실시예 4에 의하여 EGCG에 의한 TAZ의 핵내 이동을 면역형광법(immunofluorescence) 후 공초점현미경으로 관찰한 사진이다.
도 13은 본 발명의 실시예 5에 의하여 TAZ 넉다운 세포에서 EGCG 처리에 따른 TAZ와 MHC 단백질의 발현을 웨스턴 블롯팅(western blotting) 분석법으로 측정한 도면이다.
도 14는 본 발명의 실시예 5에 의하여 TAZ, Myogenin , MCK 유전자의 발현 변화를 qRT-PCR로 측정한 도면이다.
도 15는 본 발명의 실시예 5에 의하여 TAZ 넉다운 세포에서 EGCG 첨가에 의한 근원섬유의 형성 증가가 일어나지 않음을 광학현미경으로 관찰한 사진이다.
도 16은 본 발명의 실시예 6에 의하여 EGCG 처리에 따른 지방분화 억제능을 오일 레드 O(Oil Red O) 염색법으로 확인한 도면이다.
도 17은 본 발명의 실시예 6에 의하여 EGCG에 의한 TAZ단백질과 지방분화 표지단백질인 PPARγ, C/EBPα의 발현을 웨스턴 블롯팅(western blotting) 분석법으로 측정한 도면이다.
도 18은 본 발명의 실시예 6에 의하여 EGCG 처리 후 TAZ, PPARγ, aP2, 아디포넥틴(adiponectin) 및 C/EBPα 유전자의 발현 변화를 qRT-PCR로 측정한 도면이다.
도 19는 본 발명의 실시예 7에 의하여 EGCG에 의한 TAZ의 핵내 이동을 면역형광법(immunofluorescence) 후 공초점현미경으로 관찰한 사진이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 카테킨 또는 카테킨 함유 녹차 추출물을 섭취할 경우 TAZ를 활성화하여 근육 분화를 촉진하고 지방 분화를 억제함을 확인하였으며, 특히, EGCG가 노화가 진행됨에 따라 관찰되는 근감소증과 비만 현상을 동시에 개선할 수 있고, 또한 손상된 근육의 재생과정에서 활성화된 근육줄기세포에 작용하여 근육으로 분화시키는 효과가 뛰어난 것을 확인할 수 있었다. 따라서 이 약물은 지방 증가를 동반한 노인성 근육감소증의 개선뿐만 아니라 노화나 외부 자극에 의한 근육 손상의 치료에도 효과가 있어 노화나 외부 자극에 의한 근육감소 및 손상의 치료제 개발에 이용될 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서 카테킨을 유효성분으로 함유하는 근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 근질환은 노인성 근육감소증인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 근위축증 또는 미사용으로 기능이 저하된 근육의 개선에 이용할 수 있다. 또한 질환이나 외부 자극에 의해 손상된 근육의 재생에 효과가 있으므로, 근육 줄기세포 활성화를 통해 근육 재생을 치료 방향으로 하는 모든 근질환의 치료에 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 카테킨은 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate), 바람직하게는 에피갈로카테킨-3-갈레이트(epigallocatechin-3-gallate)일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 카테킨은 TAZ를 활성화하여 근육 분화를 촉진하고 지방 분화를 억제할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 카테킨은 1250~25000㎍/㎖, 바람직하게는 카테킨은 2500~12500㎍/㎖의 농도로 포함할 수 있으며, 상기 카테킨은 녹차로부터 유래한 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 카테킨을 함유하는 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가적으로 포함할 수 있다. 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 카테킨을 함유하는 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 환제, 과립제, 캡슐제, 현탁액, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수용액제, 현탁액, 동결 건조제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 60, 카카오지, 라우린지, 글리세로 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 건강상태, 체중, 연령, 성별, 식이, 배설율, 질병의 정도, 약물형태, 투여시간, 투여경로 및 투여기간에 따라 그 범위가 다양하지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물은 1일 5~100mg/kg으로, 바람직하게는 25~50mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 고콜레스테롤혈증의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 카테킨을 유효성분으로 함유하는 근질환 예방 또는 개선용 식품에 관한 것이다.
본 발명의 식품은, 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 건강기능 식품은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 라말린을 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치즈 등), 식용식물유지, 마가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 라말린을 첨가하여 제조할 수 있다.
상기 건강기능식품 또한, 식품조성물로서 기능성 식품, 영양보조제, 건강 식품, 식품 첨가제 등의 다양한 형태를 포함하는 것이며, 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태, 예컨대, 앞서 언급한 라말린을 차, 쥬스, 드링크의 형태로 제조하거나, 과립화, 캡슐화, 분말화 하거나, 이러한 화합물 또는 추출물을 음료, 과실 및 가공식품, 어류, 육류 및 그 가공식품, 빵류, 면류, 조미료 등 각종 식품에 첨가하여 제조함으로써 제공될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 녹차 추출물을 유효성분으로 함유하는 근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 녹차 추출물을 유효성분으로 함유하는 근질환 예방 또는 개선용 식품에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서 카테킨 또는 녹차 추출물을 유효성분으로 함유하는 근질환의 예방 또는 치료에 사용하는 용도에 관한 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예]
실시예 1: 에피갈로카테킨 -3- 갈레이트(EGCG)의 근육분화 촉진능 확인
생쥐 근육 모세포의 세포주인 C2C12에 2% 말혈청(horse serum) DMEM 배지를 사용하여 3일 동안 근관세포(myotube)로의 분화를 유도하였다. 단백질을 추출하여 EGCG 처리 농도에 따른 TAZ 단백질과 근육분화 표지단백질인 MHC 및 미오게닌(myogenin)의 발현을 웨스턴 블롯팅(western blotting) 분석법으로 확인하여 도 1에 나타내었다. 도 1에서 EGCG 처리 농도가 증가함에 따라 MHC 및 미오게닌(myogenin)의 단백질 발현이 증가하였고, TAZ 단백질은 크게 변화하지 않았다.
정량 실시간 PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR) 기술을 이용해 TAZ 유전자와 근육분화 표지유전자인 미오게닌(myogenin) 및 MCK의 발현 변화를 측정하여 도 2에 나타내었다. 도 2에서 EGCG 처리 농도가 증가함에 따라 MHC 및 미오게닌(myogenin)의 유전자 발현이 증가하였고, TAZ 유전자의 발현은 거의 일정한 수준을 유지했다.
광학현미경을 이용한 관찰과 면역형광법(immunofluorescence) 후 공초점현미경을 이용한 관찰을 통해 EGCG 첨가에 의한 근관세포(myotube) 형성 증가를 확인하였다(도 3).
실시예 2: 근육줄기세포(satellite cells)에서 EGCG의 근육분화 촉진능 확인
8주령 수컷 생쥐의 뒷다리 근육에 0.1 mg/ml의 심장독(cardiotoxin)을 주입하여 손상을 유도한 3일 후, 근육줄기세포를 분리하였다. 근육줄기세포에 2% 말혈청(horse serum) DMEM 배지를 사용하여 근관세포(myotube)로의 분화를 유도하였다. 세포에서 단백질을 추출하여 EGCG에 의한 MHC와 미오게닌(myogenin)의 양적 증가를 웨스턴 블롯팅(western blotting) 분석법으로 확인하여 도 4에 나타내었다.
qRT-PCR 기술을 이용해 EGCG에 의한 미오게닌(myogenin) 및 MCK 유전자의 발현 증가를 도 5에 나타내었다. 현미경 관찰을 통해, EGCG 처리 후 근육줄기세포에서 근관세포(myotube)로의 분화 유도를 확인하여 도 6에 나타내었다.
실시예 3: 생쥐의 근육 재생 과정에서 EGCG의 근육분화 촉진능 확인
8주령 수컷 생쥐의 양쪽 뒷다리 근육에 각각 1㎍의 심장독(cardiotoxin)을 주입하여 손상을 유도하였다. 다음날부터 매일 복강내 주사(IP injection)을 통해 EGCG를 주입하였다. EGCG 최적 농도를 결정하기 위해 각각 다른 농도의 EGCG를 주입하였다. 재생 8일째 생쥐를 잡아 근육조직을 분석하였다. 조직에서 단백질을 추출하여 EGCG에 의한 TAZ와 PAX7의 양적 변화를 웨스턴 블롯팅(western blotting) 분석법으로 확인하여 도 7에 나타내었다. qRT-PCR 기술을 이용해 EGCG에 의한 Myf5 , PAX7, TAZ 유전자의 발현 정도를 비교하여 도 8에 나타내었다. 그 결과 근육 재생과정 중 EGCG에 의해 TAZ의 단백질과 유전자 발현이 증가하였고, Myf5 , PAX7 , TAZ 유전자의 발현 증가 양상을 참고하여 EGCG 최적 농도는 25 mg/kg 마우스(mouse)로 결정하였다.
실시예 2에서와 동일한 방법으로 8주령 수컷 생쥐의 양쪽 뒷다리 근육에 각각 1㎍의 심장독(cardiotoxin)을 주입하여 손상시킨 후, 다음 날부터 DMSO 혹은 EGCG를 최적 농도인 25mg/kg 마우스(mouse)로 매일 주입하여 근육 재생을 유도하였다. 재생 3일째 생쥐를 잡아 근육조직에서 단백질을 추출하여 EGCG에 의한 TAZ와 Myf5, PAX7의 양적 변화를 웨스턴 블롯팅(western blotting) 분석법으로 확인하여 도 9에 나타내었다. qRT-PCR 기술을 이용해 EGCG에 의한 Myf5 , PAX7 , TAZ 유전자의 발현 정도를 비교하여 도 10에 나타내었다. 그 결과 EGCG를 주입한 그룹에서 근육 재생과정 중 Myf5와 TAZ의 단백질과 유전자 발현이 현저하게 증가하였다.
재생 5일째 생쥐를 잡아 근육조직을 얻은 후 H&E 염색법을 통해 실제로 근육이 재생된 정도를 비교하고 정량화하였다. 근육줄기세포(satellite cells)에 의해 새로 생겨난 화이버(fiber)의 크기를 비교하여 도 11에 나타내었다. 그 결과 EGCG를 주입한 그룹에서 근육 재생이 더 잘 일어나 화이버(fiber)의 크기가 큰 것을 관찰하였다.
실시예 4: 근육분화 과정 중 EGCG에 의한 TAZ의 활성화 확인
C2C12를 이용해 3일 동안 근관세포(myotube)로의 분화를 유도하였다. TAZ 특이적인 항체를 이용해 면역형광법(immunofluorescence) 후 공초점현미경을 이용한 관찰을 통해 EGCG에 의한 TAZ의 핵내 이동을 확인하고 정량화하여 도 12에 나타내었다. 도 12에서 EGCG는 분화중인 C2C12 세포에서 TAZ의 핵내 이동을 유도하여 활성화하는 것을 관찰하였다.
실시예 5: TAZ를 통한 EGCG의 근육분화 촉진능 확인
레트로 바이러스를 이용하여 TAZ 넉다운된 C2C12 세포주를 제작하였다. 2% 말혈청(horse serum) DMEM 배지를 사용하여 3일 동안 근관세포(myotube)로 분화시킨 후, 웨스턴 블롯팅(western blotting) 분석법을 이용하여 대조군과 TAZ 넉다운 세포에서 EGCG 처리에 따른 TAZ와 MHC 단백질의 발현을 비교하여 도 13에 나타내었다. TAZ 넉다운된 세포에서는 EGCG의 처리에 의해 MHC 단백질의 발현이 증가하지 않았다.
qRT-PCR 기술을 이용해 대조군과 TAZ 넉다운 세포에서 EGCG에 의한 TAZ, Myogenin, MCK 유전자의 발현 변화를 측정하여 도 14에 나타내었다. TAZ 넉다운된 세포에서는 EGCG의 처리에 의해 TAZ, Myogenin , MCK 유전자의 발현이 증가하지 않았다.
광학현미경을 이용한 관찰을 통해, 대조군과 TAZ 넉다운 세포에서 EGCG 첨가에 의한 근관세포(myotube) 형성 증가 정도를 도 15에 나타내었다. TAZ 넉다운된 세포에서는 EGCG의 처리에 의해 근관세포(myotube) 형성이 증가하지 않았다. 이를 통해 EGCG에 의한 근육분화 촉진능은 TAZ를 통한 것임을 알 수 있다.
실시예 6: EGCG의 지방분화 억제능 확인
생쥐 배아 섬유아세포인 C3H10T1/2에 인슐린, 트로글리타존, 덱사메타손을 처리하여 지방 세포로의 분화를 유도하였다. 오일 레드 O(Oil Red O) 염색법을 이용해 EGCG 처리에 따른 지방분화 억제능을 확인하여 도 16에 나타내었다. 단백질을 추출하여 EGCG에 의한 TAZ단백질과 지방분화 표지단백질인 PPARγ, C/EBPα의 발현 감소를 웨스턴 블롯팅(western blotting) 분석법으로 확인하였다(도 17).
EGCG 처리 후 TAZ 유전자 발현의 증가와 PPARγ, aP2, 아디포넥틴(adiponectin), C/EBPα 유전자의 발현 감소를 qRT-PCR 을 이용해 분석하여 도 18에 나타내었다.
실시예 7: 지방분화 과정 중 EGCG에 의한 TAZ의 활성화 확인
C3H10T1/2를 이용해 6일 동안 지방세포로의 분화를 유도하였다. TAZ 특이적인 항체를 이용해 면역형광법(immunofluorescence) 후 공초점현미경을 이용한 관찰을 통해 EGCG에 의한 TAZ의 핵내 이동을 확인하고 정량화하여 도 19에 나타내었다.
본 발명에 의한 EGCG는 TAZ의 핵내 이동을 유도함으로써 TAZ를 활성화하여 근육 분화를 촉진하고 지방 분화를 억제하는 효과가 있는 것을 확인하였으며, 손상된 근육의 재생과정에서 활성화된 근육줄기세포에 작용하여 근육으로 분화시키는 효과가 뛰어난 것으로 나타나 지방 증가를 동반한 노인성 근육감소증의 개선뿐만 아니라 외부자극에 의한 근육감소 및 근육손상의 치료에 효과적인 것을 알 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (16)

  1. 카테킨을 유효성분으로 함유하는 근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 카테킨은 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate)인 것을 특징으로 하는 근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 카테킨은 에피갈로카테킨-3-갈레이트(epigallocatechin-3-gallate)인 것을 특징으로 하는 근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서, TAZ를 활성화하여 근육 분화를 촉진하고 지방 분화를 억제하는 것을 특징으로 하는 근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 카테킨은 1250~25000㎍/㎖의 농도로 포함하는 근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 카테킨은 녹차 유래인 것을 특징으로 하는 근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 카테킨을 유효성분으로 함유하는 근질환 예방 또는 개선용 식품.
  9. 제8항에 있어서, 상기 카테킨은 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate)인 것을 특징으로 하는 근질환 예방 또는 개선용 식품.
  10. 제9항에 있어서, 상기 카테킨은 에피갈로카테킨-3-갈레이트(epigallocatechin-3-gallate)인 것을 특징으로 하는 근질환 예방 또는 개선용 식품.
  11. 제8항에 있어서, TAZ를 활성화하여 근육 분화를 촉진하고 지방 분화를 억제하는 것을 특징으로 하는 근질환 예방 또는 개선용 식품.
  12. 제8항에 있어서, 상기 카테킨은 1250~25000㎍/㎖의 농도로 포함하는 근질환 예방 또는 개선용 식품.
  13. 제8항에 있어서, 상기 카테킨은 녹차 유래인 것을 특징으로 하는 근질환 예방 또는 개선용 식품.
  14. 제8항에 있어서, 식품학적으로 허용되는 첨가제, 부형제 또는 향미제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 근질환 예방 또는 개선용 식품.
  15. 녹차 추출물을 유효성분으로 함유하는 근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  16. 녹차 추출물을 유효성분으로 함유하는 근질환 예방 또는 개선용 식품.
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KR20200109434A (ko) * 2019-03-12 2020-09-23 주식회사 비티씨 갈릭산, 에피카테킨(ec), 및 에피갈로카테킨(egc)의 함량이 증가된 카테킨 효소처리물 및 이의 제조방법

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