KR20200079203A

KR20200079203A - 블루베리 추출물을 함유하는 골질환 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20200079203A
Application number: KR1020190172758A
Authority: KR
Inventors: 임병우; 이영민
Original assignee: 건국대학교 글로컬산학협력단
Priority date: 2018-12-24
Filing date: 2019-12-23
Publication date: 2020-07-02
Also published as: KR102334305B1

Abstract

본 발명은 블루베리 추출물을 포함하는 파골세포 분화 억제 및 골다공증 등 골질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것으로, 본 발명은 블루베리 추출물을 포함하는 조성물은 세포 독성이 없고, NFATc1(nuclear factor of activated T cells cytoplasmic 1), c-Fos의 발현을 억제, TRAP 효소의 활성을 억제하여 단핵구에서 파골세포로의 분화를 억제하므로, 골다공증을 비롯한 골 질환의 예방, 치료 또는 개선에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

블루베리 추출물을 함유하는 골질환 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating bon disease comprising extract of blueberry}

본 발명은 블루베리 추출물을 포함하는 파골세포 분화 억제 및 골다공증 등 골질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.

골은 석회화된 견고한 표면과 골수로 불리는 내부의 세포 성분이 결합된 특수조직이다. 생리적으로 상이한 이 두 구조의 결합은 일생을 두고 지속되는 골의 재형성(bone remodeling) 과정에 기인한 것인데，이는 골에 가해지는 호르몬이나 물리적 자극에 의해 골수에 있는 파골세포(osteoclast)들의 골의 표면으로 모여 골을 파들어가면서 파괴하는 골흡수(bone resorption)가 일어난 자리에 모여든 조골세포(osteoblast)에 의한 골기질의 합성(bone formation)으로 설명된다.

골은 조골세포와 파골세포 활성의 균형을 유지함으로 골량이 일정하게 유지되며 이들의 활성으로 골의 재생이 지속적으로 일어난다. 그러나 조골세포보다 파골세포의 활성이 증가할 때 골량이 감소하여 골다공증을 유발한다.

골 질환 중 현재 가장 중요한 사회적 문제 중 하나인 골다공증은 낮은 골양과 골기질의 파괴로 골절의 위험과 골의 취약성이 증가되는 골격질환을 말한다. 골다공증은 폐경기 이후 여성에서 특히 빈번하게 발생하며 이는 에스트로겐의 분비 감소에 의하여 뼈의 양이 현저하게 감소되는 질환이다. 뼈의 양 감소는 개인차, 또는 다른 여러 가지 원인으로 인해 그 정도의 차이가 있지만, 병적으로 과다하게 뼈의 양이 감소하여 일정치 이하로 저하되면 작은 충격에도 쉽게 골절이 생기게 된다. 골다공증은 그 증세 자체보다는 뼈의 약화에 따라 초래되는 각종 골절, 특히 대퇴골 골절 또는 척추골절 등으로 장기간 활동을 제한하여 건강한 생활을 영위할 수 없고, 결과적으로 노인층 사망의 15%에 대한 원인이 되는 것으로 알려져 있다.

현재 골다공증 치료제로 사용되고 있는 물질로는 에스트로겐(estrogen), 남성화 스테로이드 호르몬(androgenic anabolic steroid), 칼슘 제제, 인산염, 불소 제제, 이프리플라본(Ipriflavone), 비타민 D3 등이 있다. 에스트로겐이나 골다공증 치료제로 알려진 Estradiol은 조골세포의 세포고사를 억제하여 세포의 생존기간을 증가시키고 파골세포의 세포고사를 촉진하여 세포의 생존기간을 감소시켜 폐경증상의 치료와 골밀도 유지에 어느 정도 효과적인 방법이나 유방암, 자궁내막 증식증 등을 유발하는 부작용이 있다.

골다공증은 약물의 단기 투여만으로는 치료할 수 없고 약물의 장기 투여가 필수적인 질환이므로, 약물을 장기 투여할 때에도 상기와 같은 부작용이 없고 에스트로겐을 대체할 수 있을 만큼 우수한 약효를 갖는 새로운 물질의 개발이 요구되고 있다. 이에 따라, 콩 및 콩 가공품 등 식품에 함유된 제니스테인(genistein)이나 다이드제인(daidzein) 등의 피토에스트로겐(phytoestrogen)을 응용하여 장기간 복용할 수 있고 상대적으로 부작용이 적은 골다공증 예방 및 치료제를 개발하고자 많은 연구가 진행중이다.

이에, 본 발명자들은 골다공증을 포함한 골 질환을 예방하고 치료할 수 있는 부작용이 적은 골 질환 치료제를 개발하기 위한 연구를 수행한 결과, 블루베리 추출물 및 머위 뿌리 추출물을 혼합사용하는 경우, 각각 단독으로 사용하는 경우보다 TRAP효소 억제 활성, c-Fos 및 NFATc1의 발현을 현저하게 억제하는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

한국등록특허 제10-0703180호

본 발명의 목적은 블루베리(blueberry) 추출물을 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 블루베리(blueberry) 추출물을 포함하는 골 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 블루베리(blueberry) 추출물을 포함하는 골 질환의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 블루베리(blueberry) 추출물을 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 블루베리(blueberry) 추출물을 포함하는 골 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

나아가 본 발명은 블루베리(blueberry) 추출물을 포함하는 골 질환의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.

본 발명은 블루베리 추출물을 포함하는 조성물은 세포 독성이 없고, NFATc1(nuclear factor of activated T cells cytoplasmic 1), c-Fos의 발현을 억제, TRAP 효소의 활성을 억제하여 단핵구에서 파골세포로의 분화를 억제하므로, 골다공증을 비롯한 골 질환의 예방, 치료 또는 개선에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 블루베리 추출물 및 머위 뿌리 추출물 처리에 의한 세포독성을 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 블루베리 추출물 및 머위 뿌리 추출물에 의한 TRAP 활성도를 측정한 결과이다.
도 3은 본 발명의 블루베리 추출물 및 머위 뿌리 추출물 처리에 의한 파골세포 분화 과정에서 핵심적인 역할을 하는 전사인자의 발현 억제를 확인한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

본 발명은 블루베리 추출물을 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 약학적 조성물은 머위(Petasites japonicus) 뿌리 추출물을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 건조된 블루베리 분말 및 건조된 머위 뿌리 분말을 6 내지 8 : 2 내지 4의 중량비로 혼합하고, 상기 건조된 블루베리 분말 및 건조된 머위 뿌리 분말 총 중량의 5 내지 10배에 달하는 추출용매로 추출하여 제조할 수 있고, 바람직하게는 건조된 블루베리 분말 및 건조된 머위 뿌리 분말을 7 : 3의 중량비로 혼합하여, 상기 건조된 블루베리 분말 및 건조된 머위 뿌리 분말 총 중량의 7배에 달하는 추출용매로 추출하여 제조할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "추출물(extract)"은 추출 대상을 적절한 침출액으로 짜내고 침출액을 증발시켜 농축한 제제를 의미하는 것으로, 이에 제한되지는 않으나, 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 이들의 조정제물 또는 정제물일 수 있다. 상기 블루베리 추출물 또는 머위 뿌리 추출물은 통상의 기술분야에 공지된 일반적인 추출방법, 분리 및 정제방법을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 추출방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게 열탕 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 추출용매는 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매 등을 사용할 수 있으며, 상기 유기용매는 탄소수 1 내지 4의 알코올이나, 에틸아세테이트 또는 아세톤 등의 극성용매, 헥산 또는 디크로로메탄의 비극성용매 또는 이들의 혼합용매를 사용할 수 있다. 또한, 바람직하게는 물, 탄소수 1 내지 탄소수 4의 알코올 또는 이들의 혼합용매를 사용할 수 있으며, 더 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합용매를 사용할 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 건조된 블루베리 분말 또는 건조된 머위 뿌리 분말을 상기 용매로서 70% 에탄올 수용액을 이용하여 추출한 뒤 감압 농축하여 추출물을 제조하였다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 골 질환의 예로는 골다공증(osteoprosis), 골감소증, 골연화증, 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 치주질환(periodontal disease), 파제트병(Paget disease) 또는 골이영양증(osteodystrophy)일 수 있으며, 골다공증(osteoprosis)인 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 골다공증의 예로는 제1형 골다공증(폐경 후 골다공증), 제2형 골다공증(노인성 골다공증), 특발성 골다공증, 내분비질환에 의한 골다공증, 소화기계 질환에 의한 골다공증, 악성질환에 의한 골다공증, 음주에 의한 골다공증, 흡연에 의한 골다공증 또는 약물에 의한 골다공증일 수 있다.

본 발명에 따른 상기 블루베리 추출물은 뼈의 손실을 억제 또는 회복시키고, 골밀도의 감소를 억제하고, 파골세포 분화를 억제하여 골 질환에 대한 예방, 개선 또는 치료 효과를 나타내는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명에 따른 블루베리 추출물은 세포 독성이 없고, NFATc1(nuclear factor of activated T cells cytoplasmic 1), c-Fos의 발현을 억제, TRAP 효소의 활성을 억제하여 단핵구에서 파골세포로의 분화를 억제하는 것을 확인하였다(실험예 1 내지 3 참조).

본 발명에서 사용되는 용어 "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 골 질환의 발생, 확산 및 재발을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 골 질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "치료"란 본 발명의 블루베리 추출물을 포함하는 조성물의 투여로 골 질환의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 본원의 조성물이 효과가 있는 질환의 정확한 기준을 알고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.

본 발명의 블루베리 추출물은 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있으며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.

경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명의 블루베리 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 블루베리 추출물의 인체에 대한 효과적인 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로 약 0.01-1000 mg/kg/일이며, 바람직하게는 0.1-500 mg/kg/일 수 있고, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 유효성분으로서 블루베리 추출물 이외에 공지된 골 질환 치료제를 추가로 포함할 수 있고, 이들 질환의 치료를 위해 공지된 다른 치료와 병용될 수 있다.

골 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 또는 건강식품 조성물

본 발명은 블루베리 추출물을 포함하는 골 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 또는 건강식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 조성물은 머위(Petasites japonicus) 뿌리 추출물을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 추출물의 추출용매는 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매 등을 사용할 수 있으며, 상기 유기용매는 탄소수 1 내지 4의 알코올이나, 에틸아세테이트 또는 아세톤 등의 극성용매, 헥산 또는 디크로로메탄의 비극성용매 또는 이들의 혼합용매를 사용할 수 있다. 또한, 바람직하게는 물, 탄소수 1 내지 탄소수 4의 알코올 또는 이들의 혼합용매를 사용할 수 있으며, 더 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합용매를 사용할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 건조된 블루베리 분말 또는 건조된 머위 뿌리 분말을 상기 용매로서 70% 에탄올 수용액을 이용하여 추출한 뒤 감압 농축하여 추출물을 제조하였다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 골다공증의 예로는 제1형 골다공증(폐경 후 골다공증), 제2형 골다공증(노인성 골다공증), 특발성 골다공증, 내분비질환에 의한 골다공증, 소화기계 질환에 의한 골다공증, 악성질환에 의한 골다공증, 음주에 의한 골다공증, 흡연에 의한 골다공증 또는 약물에 의한 골다공증일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 NFATc1(nuclear factor of activated T cells cytoplasmic 1) 및 c-Fos의 발현을 억제하여 파골세포 분화를 억제하는 효과를 갖는다.

본 발명의 블루베리 추출물을 건강기능식품 및 건강식품 조성물로 사용하는 경우, 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 본 발명의 블루베리 추출물을 첨가할 수 있는 건강기능식품의 예로는 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 형태일 수 있으며, 건강식품의 예로는 각종 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 캔디류, 스넥류, 면류, 아이스크림, 유제품, 스프, 이온음료, 음료수, 알코올 음료, 껌, 차 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품 및 건강식품 조성물을 모두 포함한다.

본 발명에 따른 블루베리 추출물을 함유하는 건강기능식품 및 건강식품 조성물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 블루베리 추출물의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강기능식품 및 건강식품 조성물 중의 상기 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 유지를 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 블루베리 추출물은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 건강기능식품 및 건강식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명 블루베리 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트라이톨 등의 당알코올이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강기능식품 및 건강식품 조성물 100 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 블루베리 추출물을 함유하는 건강기능식품 및 건강식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강기능식품 및 건강식품 조성물은 천연 과일쥬스 및 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 블루베리 추출물을 함유하는 건강기능식품 및 건강식품 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 블루베리 추출물의 제조

블루베리를 건조시킨 후, 건조된 블루베리 100g 당 70% 에탄올을 700ml씩 첨가한 뒤, 90℃에서 3시간 동안 3회 환류추출하여 추출액을 수득하였다. 상기 추출액을 여과하고 40℃에서 감압 농축하였다. 농축 후 -80 내지 -110℃로 7일 동안 동결건조하여 최종 블루베리 추출물(Blueberry extract, BBE)을 제조하였다.

<실시예 2> 블루베리 및 머위 뿌리 추출물의 제조

건조된 블루베리, 건조된 머위 뿌리 분말을 7:3의 중량비로 혼합하고, 총 혼합분말 100g당 70% 에탄올을 700ml씩 첨가한 뒤, 90℃에서 3시간 동안 3회 환류추출하여 추출액을 수득하였다. 상기 추출액을 여과하고 40℃에서 감압 농축하였다. 농축 후 -80 내지 -110℃로 7일 동안 동결건조하여 블루베리 및 머위 추출물을 제조하였다.

<비교예 1> 머위 뿌리 추출물의 제조

머위(Petasites japonicus) 뿌리의 건조 분말 100g당 70% 에탄올을 700ml씩 첨가한 뒤, 90℃에서 3시간 동안 3회 환류추출하여 추출액을 수득하였다. 상기 추출액을 여과하고 40℃에서 감압 농축하였다. 농축 후 -80 내지 -110℃로 7일 동안 동결건조하여 머위 추출물을 제조하였다.

<준비예> 파골세포 분화

파골세포 분화 유도를 위한 마우스 대식 세포주 RAW264.7 세포를 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin(100 U/㎖, 100 ㎍/㎖)이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지로 5% CO₂, 37℃의 배양기(incubator)에서 계대 배양한다. 상기 RAW264.7 세포는 96-well plate에 1×10⁴ cells/well 농도로 분주하여 5% CO₂ incubator에서 24시간 동안 안정화시킨다. 파골세포 분화 유도를 위하여 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin이 함유된 α-MEM (Gaithersburg, MD)에 RANKL (PeproTech EC, London, England) 50ng/㎖을 첨가한 뒤 3일간 분화하여 분화제를 제조한다. 이때, 시료처리군은 분화제와 실시예 1 내지 2 및 비교예 1을 함께 처리하였다.

<실험예 1> 세포생존율 측정

3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT, Amresco, Solon, OH, USA) 환원 방법을 이용하여 블루베리 추출물 및 머위 뿌리 추출물의 파골세포에 대한 세포 독성 정도를 측정하였다. 이를 위하여 세포배양용 6 well plate에 RAW 264.7 세포를 적정 수로 분주하여 24시간 동안 안정화시킨 블루베리 추출물 및 머위 뿌리 추출물을 50, 100, 200, 300, 500 ㎍/㎖ 농도별로 처리하였다. 48시간 후 배지를 제거하고 MTT 시약을 0.5 mg/ml 농도로 희석하여 200 ㎕ 씩 분주하고 5% CO₂37℃ 배양기에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 다음 MTT 시약을 제거하고 DMSO를 1 ㎖씩 각 well에 분주하여 생성된 formazan을 DMSO (dimethyl sulfoxide, Sigma-Aldrich)으로 녹인 후 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

세포독성 측정 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 블루베리 추출물, 실시예 2의 블루베리 추출물 및 머위 뿌리 추출물 및 비교예 1의 머위 뿌리 추출물 모두 200㎍/㎖ 이하의 처리조건에서는 세포독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다.

<실험예 2> TRAP 활성도 측정

TRAP는 포유류에서 발현되는 글리코실화된 단량체 금속 단백질 효소(glycosylated monomeric metalloprotein enzyme)의 일종으로 전구효소(pro-enzyme) 형태로 합성되어 단백질 분해성 절단(proteolytic cleavage)과 환원반응(reduction)에 의해 활성화된다[Ljusberg et al., 2005; Ljusberg et al., 1999]. 특히 TRAP는 파골세포 분화의 표현형 마커(phenotypic marker)로 인식되고 파골세포에서 높게 발현되는 리소좀에서 골 흡수 활성을 나타내기 때문에[An et al., 2016; Fardellone et al., 2014], TRAP의 발현이 높다는 것은 상대적으로 파골세포의 활성이 증대되어 있음을 의미한다.

파골세포 분화정도를 정량적으로 측정하기 위하여 분화유도제 RANKL (50 ng/mL)와 블루베리 추출물 및 머위 뿌리 추출물을 처리하여 3일간 배양된 세포를 cold lysis buffer(90 mM citrate, pH 4.8, 0.1% Triton X-100, 80 mM sodium tartrate)로 처리 후 substrate solution (20 mM p-nitrophenyl phosphate)을 5% CO₂ 37℃ 배양기에서 20분간 반응시켰다. 그 후 0.5 N NaOH로 반응을 중지시킨 다음 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. TRAP 활성은 시료의 흡광도를 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 나타내었다.

TRAP 활성을 측정한 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 블루베리 추출물, 실시예 2의 블루베리 추출물 및 머위 뿌리 추출물 및 비교예 1의 머위 뿌리 추출물이 처리된 세포에서 처리 농도가 증가할 수록 TRAP 활성이 억제되는 것을 확인하였다. 또한, 실시예 1의 블루베리 추출물 또는 비교예 1의 머위 뿌리 추출물을 처리하는 경우보다, 실시예 2의 블루베리 추출물 및 머위 뿌리 추출물을 처리할 경우, TRAP 활성 억제 효과가 현저히 우수한 것을 확인하였다.

<실험예 3> 파골세포 분화 관련 전사인자 및 단백질 발현량 확인

상기 실시예 1 및 실시예 2의 파골세포 분화 억제능을 확인하기 위하여, 파골세포 분화 관련 단백질 발현 변화를 확인하였다. RANKL(50ng/ml)로 파골세포 분화를 유도한 뒤, 실시예 1의 블루베리 추출물, 실시예 2의 블루베리 추출물 및 머위 뿌리 추출물 및 비교예 1의 머위 뿌리 추출물을 200㎍/㎖ 처리하여 배양한 후 세포를 150mM NaCl, 1% NP40, 0.5% 소듐 데옥시콜레이트(Sodium Deoxycholate), 0.1% SDS 및 50mM Tris-Cl을 포함하는 용해 완충액을 사용하여 용해시켰다. 그 후, BSA를 표준으로 하여, Bio-Rad Protein Assay(Bio-Rad, California, USA)로 상기 용해물 상층액의 단백질 함량을 측정하여 각 시료의 총 단백질 함량을 조정하였다. 그 후 전기영동을 위해, 8-15 % SDS-PAGE 겔에 상기 시료들을 각각 30㎍의 단백질량이 되도록 로딩하고, 니트로셀룰로스 멤브레인으로 옮겼다. 상기 멤브레인을 5% 탈지유로 블록킹한 후, 각 검증 단백질에 대한 항체를 가하여 overnight했다. 그 다음 2차 항체를 반응시키고 ECL detection reagents and analysis system (Amersham Biosciences Buckinghamshire, UK)를 이용하여 표적단백질을 확인하였다.

RANKL 신호계에 의한 파골세포로의 분화 유도에서 전사인자로서 가장 중요하게 작용하는 유전자 중의 하나가 NFATc1이다. 따라서 RANKL에 RAW 264.7 단핵구의 파골세포 분화억제에 상기 실시예 1 또는 실시예 2의 추출물이 NFATc1의 발현을 억제할 수 있는지의 여부를 조사하였다. 또한, 인산화 된 MAPKs의한 파골세포 분화 및 활성화에 필요한 중요한 전사 인자이며 NFATc1의 유도에 관여하는 c-Fos의 발현 변화에 미치는 영향을 확인하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 블루베리 추출물 또는 비교예 1의 머위 뿌리 추출물을 각각 단독으로 처리하는 경우 보다, 실시예 2의 블루베리 및 머위 뿌리 추출물을 혼합하여 사용하는 경우, c-Fos 및 NFATc1의 발현을 현저히 억제하는 것을 확인하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

블루베리(blueberry) 추출물을 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 머위(Petasites japonicus) 뿌리 추출물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 탄소수 4의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 골 질환은 골다공증(osteoprosis), 골감소증, 골연화증, 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 치주질환(periodontal disease), 파제트병(Paget disease) 및 골이영양증(osteodystrophy)으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제4항에 있어서,
상기 골 질환은 골다공증(osteoprosis)인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제5항에 있어서,
상기 골다공증은 제1형 골다공증(폐경 후 골다공증), 제2형 골다공증(노인성 골다공증), 특발성 골다공증, 내분비질환에 의한 골다공증, 소화기계 질환에 의한 골다공증, 악성질환에 의한 골다공증, 음주에 의한 골다공증, 흡연에 의한 골다공증 및 약물에 의한 골다공증으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 NFATc1(nuclear factor of activated T cells cytoplasmic 1) 및 c-Fos의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
블루베리(blueberry) 추출물을 포함하는 골 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
블루베리(blueberry) 추출물을 포함하는 골 질환의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물.
제8항 또는 제9항에 있어서,
상기 조성물은 머위(Petasites japonicus) 뿌리 추출물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제8항 또는 제9항에 있어서,
상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 탄소수 4의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제8항에 있어서,
상기 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 형태의 식품인 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
제9항에 있어서,
상기 건강식품은 각종 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 캔디류, 스넥류, 면류, 아이스크림, 유제품, 스프, 이온음료, 음료수, 알코올 음료, 껌, 차 및 비타민 복합제에서 선택되는 것을 특징으로 하는 건강식품 조성물.