KR102141426B1 - 플로레틴-4-o-글로코시드를 포함하는 골질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 플로레틴-4-O-글로코시드를 포함하는 골다공증 개선 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 상기 플로레틴-4-O-글루코시드은 TRAP 효소활성을 억제하여 파골세포의 증식을 억제시키며, Carbonic anhydrase Ⅱ와 Integrin β3 단백질의 발현을 감소시키고 ASK1/MAPK 신호전달경로를 조절함으로써 파골세포의 골 흡수 능력을 감소시켜 파골세포의 활성 억제를 효과적으로 유도하여, 파골 세포의 분화 및 골 흡수를 억제하는 효과가 있다.

Description

플로레틴-4-O-글로코시드를 포함하는 골질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 {Pharmacieutical composition comprising Phloretin 4-O-glucoside for prevention and treatment of bone diseases}
본 발명은 플로레틴-4-O-글로코시드를 포함하는 골질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
골다공증은 조골세포와 파골세포의 평형이 무너져 골 흡수가 골 형성보다 항진됨으로써 유발되는 질병으로, 골 조직의 석회가 감소되어 뼈의 치밀질이 엷어지고 그로 인해 골수강이 넓어지게 되며, 증세가 진전됨에 따라 뼈가 약해지기 때문에 작은 충격에도 골절되기 쉽다. 골다공증의 원인으로는 노령, 운동 부족, 저체중, 흡연, 저칼슘 식이, 폐경, 난소 절제 등이 알려져 있는데, 특히 여성의 경우 30세 이후부터 골 감소가 지속적으로 진행되며, 폐경기에 이르면 호르몬의 변화에 의해 골 감소가 급격히 진행된다. 즉, 골다공증은 정도의 차이는 있으나 노년층, 특히 폐경기 이후의 여성에게 있어서는 피할 수 없이 나타나는 증상으로, 선진국에서는 인구가 노령화됨에 따라 골다공증 및 그 치료제에 대한 관심이 점차 증가되고 있다. 골다공증은 크게 3가지 유형으로 나눌 수 있는데, 첫째는 원인불명의 골다공증, 둘째는 폐경기 이후 여성호르몬 부족에 의해 나타나는 타입 Ⅰ 골다공증, 셋째는 고령화된 노인층의 남녀에게 발견되는 타입 Ⅱ골다공증이다.
현재 사용되고 있는 골다공증 치료제는 대부분 에스트로겐 계통의 물질로서, 이들은 장기 투여할 경우 암, 담석, 혈전증 등의 부작용이 나타나는 문제점이 있다. 골다공증은 약물의 단기 투여만으로는 치료할 수 없고 약물의 장기 투여가 필수적인 질환이므로, 약물을 장기 투여할 때에도 상기와 같은 부작용이 없고 에스트로겐을 대체할 수 있을 만큼 우수한 약효를 갖는 새로운 물질의 개발이 요구되고 있다. 따라서, 콩 및 콩 가공품 등 식품에 함유된 제니스테인(genistein)이나 다이드제인(daidzein) 등의 피토에스트로겐(phytoestrogen)을 응용하여 장기간 복용할 수 있고 상대적으로 부작용이 적은 골다공증 예방 및 치료제를 개발하고자 많은 연구가 진행 중이다. 또한, 골다공증 치료제의 주요 타겟은 조골세포의 골 형성능을 촉진시키거나 파골세포의 골 흡수를 억제시키면서 무너진 파골세포와 조골세포의 평형을 맞추는 것이다. 이를 해결하기 위해 조골세포의 골 형성을 촉진시키는 알렌드로네이트나 파골세포의 골 흡수를 억제하는 비스포스포네이트계열의 같은 약들이 개발되어져 왔다. 하지만, 양쪽 모두에 대해 효능을 가지는 약의 개발은 어려움이 있어 이들에 대한 연구는 진행 중이다.
파골세포는 조골세포에서 생산 및 분비되는 M-CSF와 RANKL을 조혈모세포로부터 분화되어진 대식세포 전구세포들이 인지하고, 분화하며 형성된다. 파골세포는 분화 동안 단핵세포 들이 융합하여 다핵세포로 전환되는 특징을 가지며 TRAP 효소의 활성을 가지게 되는 특징이 있다. 파골세포를 동정할 때에는 TRAP염색을 하여 다핵세포의 TRAP 양성 세포를 관측함으로써 알아낼 수 있다. 또한 파골세포가 다핵세포로 전환될 때 나타나는 또 하나의 특징으로 Actin ring이라는 특이적인 구조체가 형성되어진다. Actin ring의 확인은 F-actin의 형광염색을 통한 관찰이 일반적이며, 다핵세포의 확인을 위하여 핵의 염색을 통하여서, 핵의 개수가 3개 이상인 것을 다핵세포로 정의 내린다. RANKL에 의해 분화되어진 파골세포는 Integrin β3 단백질 발현증가와 함께 골의 표면에 달라붙게 되고 Carbonic anhydrase Ⅱ 단백질의 발현증가 및 활성화로 인하여 세포내 수소이온을 세포 밖으로 배출시켜 주변 환경을 산성조건으로 만들어낸다. 이후 골이 산성 조건에 노출되어 파괴되는 것으로 골다공증이 진행되어진다.
식물 유래의 여러 가지 파이토케미칼 (phytochemical) 중에서, 플라보노이드 (flavonoid)는 식품에 널리 분포하는 노란색 계통의 색소로, 페닐기 2개가 C3 사슬에 결합하여 C6-C3-C6형 탄소 골격구조로 되어 있으며, 이것이 여러 당류와 글리코시드 결합 (glycosidic linkage)을 통해 배당체 (glycoside)의 형태로 존재하는 경우가 많다. 플라보노이드는 항균, 항암, 항바이러스, 항알레르기 및 항염증 활성이 있고, 의약분야에서는 새로운 플라보노이드 물질이 추출됨에 따라 치료 대상 질환이 다양해져서 간질환, 당뇨병, 류마티스 관절염, 각종 암, 진통, 바이러스성 질환, 알레르기성 질환, 동맥경화 등 혈관계 질환, 심근 관련 질환, 스트레스 및 우울증 등에 약리활성이 있다는 것이 알려지면서 물질의 개발 및 활용에 관한 관심이 커지고 있다. 예를 들어 한국공개특허번호 제 10-2009-0069063호에는 복분자 추출물을 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물을 개시하고 있고, 한국공개특허번호 제 10-2016-0018984호에는 센티페드그라스 추출물을 유효성분으로 함유하는 골 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 개시하고 있습니다. 식물 유래의 천연물인 플라보노이드 (flavonoid)는 유용한 생리활성을 바탕으로 다양한 의약품, 건강 및 식품 보조제로 개발되어 있다. 플라보노이드, 안트라퀴논 등 식물계 페놀릭 화합물들은 이미 항혈전제, 항위궤양, 항위암 전문치료제, 치매 예방 및 치료제 등 이들을 이용한 전문 의약품이 개발되어 있으며, 의약품 및 건강기능성 식품 시장에 있어서 페놀릭 화합물에 대한 수요는 계속 증가하고 있어 관련 물질의 발굴 및 개발에 대한 필요성이 지속적으로 요구되고 있다.
플로레틴은 C6-C3-C6의 골격을 가진 디하이드로칼콘의 하나로 플로레틴은 사과 껍질 및 사과잎 등에 풍부하게 있고, 플로레틴의 당화 유도체는 가수분해효소에 의해 대부분 유리형으로 전환된다. 플로레틴은 항산화, 항암활성을 포함한 많은 생물학적 기능을 가지며, 골다공증의 개선과 관련하여 파골세포의 분화를 억제하는 것으로 알려져 있다. 플로레틴 처리가 RANKL에 의해 파골세포로 분화된 마우스 유래 대식세포주인 RAW264.7 cells에서 TRAP 효소의 활성을 감소시키고 Actin ring의 형성을 억제하는 것으로 확인되었다. 또한 플로레틴은 C57BL/6 암컷 마우스의 난소를 절제하여 만들어진 여성 폐경기형 골다공증 동물모델에서도 파골세포의 분화를 억제하는 하는 방향으로 골다공증을 개선하는 것으로 알려졌다. 그러나 플로레틴의 배당체 중에 하나인 플로레틴-4-O-글루코시드에 대한 골다공증 개선 효과에 대해서는 아직 연구되어지지 않았다.
본 발명자들은 플로레틴-4-O-글루코시드에 대한 골질환 효과를 연구한 결과, 플로레틴-4-O-글루코시드는 TRAP 효소활성을 억제하여 파골세포의 증식을 억제시키며, Carbonic anhydrase Ⅱ와 Integrin β3 단백질의 발현을 감소시키고 ASK1/MAPK 신호전달경로를 조절함으로써 파골세포의 골 흡수 능력을 감소시켜 파골세포의 활성 억제를 효과적으로 유도하여, 파골 세포의 분화 및 골 흡수를 억제하여 골다공증의 개선 또는 치료 효과가 있는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명자들은 플로레틴-4-O-글루코시드를 RANKL에 의해 파골세포로 분화된 마우스 유래 대식세포주인 RAW264.7 cells에 처리한 결과, TRAP 효소의 활성을 감소시키고 Actin ring의 형성을 억제하여 파골세포의 증식을 감소시키며, RANKL에 의해 분화되어진 파골세포의 Carbonic anhydrase Ⅱ 및 Integrin β3 단백질 발현증가를 감소시키고, ASK1/MAPK 신호전달경로를 조절함으로써 파골세포의 골 흡수 능력을 감소시켜, 파골 세포의 분화 및 골 흡수를 억제하여 골다공증의 개선 또는 치료효과가 있는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 플로레틴-4-O-글루코시드를 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는데 있다.
[화학식 1]
Figure 112018108125279-pat00001
본 발명의 또 다른 목적은 하기 화하식 1로 표시되는 플로레틴-4-O-글루코시드를 포함하는 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품조성물을 제공하는데 있다.
[화하식 1]
Figure 112018108125279-pat00002
상기의 목적을 달성하기 위해. 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 플로레틴-4-O-글루코시드를 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112018108125279-pat00003
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 골질환은 골다공증(osteoporosis), 골감소증(osteopenia) 및 골위축(bone atrophy)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 파골세포의 분화 또는 골 흡수를 억제할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 과립제, 정제, 환제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 및 에어로졸로 구성된 군으로부터 선택되는 경구형 제형, 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 플로레틴 4-O-글루코시드는 0.1 내지 40 μM 농도일 수 있다.
본 발명은 또한 플로레틴-4-O-글루코시드를 포함하는 골질환의 예방 또는 개선용 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품조성물을 제공할 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112018108125279-pat00004
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 골질환은 골다공증(osteoporosis), 골감소증(osteopenia) 및 골위축(bone atrophy)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 파골세포의 분화 또는 골 흡수를 억제할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 플로레틴 4-O-글루코시드를 0.1 내지 40 μM의 농도일 수 있다.
본 발명의 플로레틴-4-O-글루코시드은 종래 합성 약제 조성물이 유발하는 부작용이 없으며, TRAP 효소활성을 억제시켜 파골세포의 증식 억제를 유도하며, Carbonic anhydrase Ⅱ와 Integrin β3 단백질의 발현을 감소시키고 ASK1/MAPK 신호전달경로를 조절함으로써 파골세포의 골 흡수 능력을 감소하게 하여 파골세포의 활성 억제를 효과가 있다. 플로레틴-4-O-글루코시드는 골다공증 예방 또는 개선 효과가 있다.
도 1은 플로레틴과 플로레틴-4-O-글루코시드의 구조를 나타내는 것이다.
도 2는 플로레틴-4-O-글루코시드를 마우스유래 대식세포 (RAW264.7 Cells)에 처리하여 배양하고, MTT assay법으로 플로레틴-4-O-글루코시드의 세포독성을 확인한 그래프를 나타내는 것이다.
도 3은 플로레틴-4-O-글루코시드의 마우스유래 대식세포 (RAW264.7 Cells)로부터 분화되어진 파골세포의 분화 억제능을 TRAP 효소활성과 staining을 통하여서 측정한 결과이다. A는 TRAP 효소 활성을 측정한 결과이고, B는 TRAP staining 결과를 현미경으로 확인한 결과이다.
도 4는 플로레틴-4-O-글루코시드를 농도별로 처리한 파골세포의 Actin ring 형성 억제를 형광현미경으로 촬영한 결과이다.
도 5는 플로레틴-4-O-글루코시드를 파골세포에 농도별로 처리 한 후, 웨스턴 블럿 방법을 이용하여 Carbonic anhydrase Ⅱ와 Integrin β3의 변화를 나타내는 것이다.
도 6은 플로레틴-4-O-글루코시드를 파골세포에 농도별로 처리 한 후, 웨스턴 블럿 방법을 이용하여 ASK1/MAPK의 변화를 나타나는 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
상술한 바와 같이, 파골세포와 조골세포의 평형 붕괴로 인한 골다공증을 개선하거나 회복시킬 수 있는 약제는 드물고, 골다공증을 개선시키는 합성 또는 천연 약제들은 부작용이 있어, 실제 사용하기에는 어려움이 있다. 이에 본 발명자들은 플로레틴-4-O-글루코시드를 RANKL에 의해 파골세포로 분화된 마우스 유래 대식세포주인 RAW264.7 cells에 처리한 결과, TRAP 효소의 활성을 감소시키고 Actin ring의 형성을 억제하여 파골세포의 증식을 감소시키며 (도 3 및 도 4), RANKL에 의해 분화되어진 파골세포의 Carbonic anhydrase Ⅱ 및 Integrin β3 단백질 발현증가를 감소시키고 (도 5), ASK1/MAPK 신호전달경로를 조절함으로써 (도 6) 파골세포의 골 흡수 능력을 감소시켜, 파골 세포의 분화 및 골 흡수를 억제하여 골다공증의 개선 또는 치료효과가 있는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 플로레틴-4-O-글루코시드를 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112018108125279-pat00005
상기 플로레틴-4-O-글루코시드는 플로레틴의 당유도체 플라보노이드로서, 플로레틴은 식물유래의 천연물 질로 전통 동양의학에서 오랫동안 사용되어 왔으며, 수많은 식물의 열매와 껍질에서 자연 상태에서 발견할 수 있다. 또한, 플로레틴은 사 과나 배 등에도 존재한다고 보고된 플라보노이드 화합물이다. 플로레틴-4-O-글루코시드에 대한 골질환, 특히 골다공증, 개선 활성에 대하여 현재까지 연구되거나 보고된 바가 없다. 따라서 본 발명자들은 플로레틴에 글루코시드를 도입하여 제조된 플로레틴-4-O-글루코시드의 신규한 생리활성인 골 질환의 개선 활성을 밝혀냄으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 골질환은 골다공증(osteoporosis), 골감소증(osteopenia) 및 골위축(bone atrophy)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 본 발명의 용어 “골 질환의 개선”이란, 생체내 파골세포와 조골세포 간의 불균형이 이루어지고 이로 인하여 골이 손실되어지는 작용을 저해하거나, 골의 형성을 촉진하는 것을 의미한다.
상기 조성물은 파골세포의 분화 또는 골 흡수를 억제할 수 있다.
본 발명의 조성물은 TRAP 효소의 활성을 감소시키는 것으로 확인되어 파골세포의 분화를 저해하는 것일 수 있다. 구체적으로 유효성분인 플로레틴-4-O-글루코시드는 농도 의존 적으로 파골세포의 TRAP 효소 활성을 저해하는 것으로, 골 흡수능을 현저히 감소시킨다.
본 발명의 조성물은 Carbonic anhydrase Ⅱ및 Integrin β3의 발현량을 억제 시키는 것일 수 있다. 구체적으로 유효성분인 플로레틴-4-O-글루코시드는 농도 의존적으로 CA2 및 Integrin β3의 발현을 억제시켜 골의 손실을 막을 수 있다. 본 발명의 실시예에서 나타난 바와 같이. 마우스 유래 대식세포에 RANKL을 처리하여 파골세포로 분화시키고 플로레틴-4-O-글루코시드를 처리함으로써 파골세포의 Carbonic anhydrase Ⅱ와 Integrin β3의 발현량이 감소하였다.
또한 본 발명의 조성물은 ASK1/MAP K 신호전달경로를 조절하는 것일 수 있다. 구체적으로 유효성분인 플로레틴-4-O-글루코시드는 농도 의존적으로 p38과 JNK의 인산화를 활성 화시켜 마우스 유래 대식세포로부터 분화되어진 파골세포의 세포사멸을 유도할 수 있다. 이를 통해, 플로레틴-4-O-글루코시드가 골다공증 개선용 조성물로써 사용될 수 있음을 알 수 있다.
플로레틴-4-O-글루코시드를 포함하는 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오즈, 덱스트로오즈, 수크로오 즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰 로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸 히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스 테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출액에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들 면, 전분, 칼슘 카보네이트 (calcium carbonate), 수크로오즈 (sucrose) 또는 락토 오즈 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁 제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리 퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제 라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 플로레틴-4-O-글루코시드를 포함하는 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데. 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 설하, 골수내, 비강내, 경막내 또는 경피 투여일 수 있다.
또한 본 발명의 화합물의 인체에 대한 투여량는 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여 형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 60 ㎏인 성 인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.001 ~ 1,000 ㎎/일 이며, 바람직하게는 0.01 ~ 500 ㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.
상기 플로레틴-4-O-글루코시드를 0.1 내지 40μM 의 농도일 수 있고, 바람직하게는 0.1 내지 20μM일 수 있고, 더 바람직하게는 5 내지 20μM일 수 있다.
본 발명은 또한 하기 화학식 1로 표시되는 플로레틴-4-O-글루코시드 포함하는 골 질환 예방 또는 개선 용 건강기능식품조성물을 제공할 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112018108125279-pat00006
본 발명의 플로레틴 4-O-글루코시드이 첨가되는 식품의 종류에는 특별한 제한이 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명의 플로레틴 4-O-글루코시드은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강기능식품 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 건강식품 조성물이 음료 조성물인 경우, 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 건강식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할수 있다. 그 밖에 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 제한되지 않으나, 본 발명의 플로레틴 4-O-글루코시드 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
상기 골질환은 골다공증(osteoporosis), 골감소증(osteopenia) 및 골위축(bone atrophy)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며 가장 바람직하게는 골다공증일 수 있다. 상기 골질환은 골다공증(osteoporosis), 골감소증(osteopenia) 및 골위축(bone atrophy)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하 나 이상일 수 있다. 본 발명의 용어 “골 질환의 개선”이란, 생체내 파골세포와 조골세포간의 불균형이 이루어지고 이로 인하여 골이 손실되어지는 작용을 저해하거나, 골의 형성을 촉진하는 것을 의미한다 .
상기 플로레틴 4-O-글루코시드를 0.1 내지 40μM 의 농도일 수 있고, 바람직하게는 0.1 내지 20μM일 수 있고, 더 바람직하게는 5 내지 20μM일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
실시예 1. 세포 독성 측정 (MTT assay)
마우스 유래 대식세포주인 RAW264.7 cell을 10% fetal bovine serum (Gibco-BRL, USA)과 1% Penicillin Streptomycin(+5,000 Units/ml Penicillin, +5,000 μg/μl Streptomycin, Gibco-BRL, USA)을 넣은 DMEM 배양액으로 5% CO2 가 공급되는 배양기에서 37℃ 조건으로 배양하였다. RAW264.7 cell을 1x105cells/ml로 96-well plates (SPL, Korea) 에 100 μl씩 첨가하여 24시간 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양한 후, 플로레틴 4-O-글루코시드를 각각 5, 10, 20 μM의 농도로 제조하여 RAW264.7 cell에 처리하였다. 또한 파골세포로 분화과정 중의 독성을 알아보기위해 α-MEM 배양액에 50 ng/mL의 RANKL과 플로레틴 4-O-글루코시드를 각각 5, 10, 20 μM의 농도로 제조하여 RAW264.7 cell에 처리하였다. 48시간 동안 배양한 후, 각 well에 PBS 완충액에 녹인 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT, 5 mg/ml) 용액을 20 μl씩 첨가하여 다시 4시간동안 배양시켰다. Formazan 형성을 확인한 후, 배지를 완전히 제거하고, well 바닥에 형성된 formazan을 녹이기 위해 200 μl의 DMSO를 첨가한 후, ELISA reader를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 플로레틴 4-O-글루코시드 20 μM농도 까지는 대식세포와 대식세포로부터 분화되어진 파골세포에 대한 독성이 거의 없는 것으로 확인되었다. 따라서 본 실험에서는 플로레틴 4-O-글루코시드를 20 μM농도까지 사용하기로 정하였다 (도 2).
실시예 2. TRAP 효소활성 측정 및 염색
플로레틴 4-O-글루코시드의 파골세포 분화능을 조사하기 위해 TRAP 효소활성 측정과 TRAP 염색을 시행하여 RAW264.7 세포의 파골세포 분화 정도를 측정하였다. TRAP staining은 파골세포의 분화 척도를 측정하는 염색법이다. TRAP (tartrate-resistant acid phosphatase)는 파골세포에서 특이적으로 만들어지는 분화 marker로 산성 리소좀 효소로서 산성환경에서 알칼리성 인산효소와 유사한 역할을 수행하는 여러 단백질들을 칭한다. 플로레틴 4-O-글루코시드가 파골세포의 분화를 억제시키는지 확인하기 위해 마우스 대식세포 (RAW264.7 cell)를 24-웰 플레이트에서 24시간 동안 배양하고, α-MEM 배양액에 50 ng/ml의 RANKL과 플로레틴 4-O-글루코시드를 5, 10, 20 μM의 농도로 세포에 5일간 처리하였으며, 시료의 처리 및 배양액의 교체는 48시간마다 진행하였다. 5일이 지난 후 PBS 세척하고 RAW264.7 파골세포에 플로레틴 4-O-글루코시드를 농도 (5, 10, 20 μM)별로 처리한 군과 분화를 시키지 않은 군 사이의 생성된 파골세포의 분화정도를 Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit (Sigma, USA)로 염색한 및 405 nm에서 흡광도를 측정한 결과를 대조군 100 %로 하여 비교하였다 (도 3A). 그 결과 도 3과 같이, 플로레틴 4-O-글루코시드를 처리하였을 때 농도의존적으로 TRAP의 활성 및 파골 세포의 분화가 감소하는 것을 확인하였다.
실시예 3. Actin ring 염색을 통한 파골세포의 분화억제 저시
플로레틴 4-O-글루코시드가 파골세포의 분화를 억제시키는지 확인하기 위해 마우스 대식세포 (RAW264.7 cell)를 24-웰 플레이트에서 24시간 동안 배양하고, α-MEM 배양액에 50 ng/ml의 RANKL과 플로레틴 4-O-글루코시드를 5, 10, 20 μM의 농도로 세포에 5일간 처리하였으며, 시료의 처리 및 배양액의 교체는 48시간마다 진행하였다. 5일이 지난 후 PBS 세척하고 RAW264.7 파골세포에 플로레틴 4-O-글루코시드를 농도 (5, 10, 20 μM)별로 처리한 군과 분화를 시키지 않은 군 사이의 Actin ring의 크기 감소 및 파골세포 수의 감소를 확인하였다. Actin ring 염색에는 Rhodamin phalloidin을 이용하였고, 핵의 염색에는 DAPI를 이용하였다. 파골세포로 분화된 세포는 핵이 3개이상 염색된 다핵세포를 파골세포로 판단하였다. 이후 이것을 형광현미경을 이용하여 촬영한 결과 파골세포의 형성 수와 크기가 플로레틴 4-O-글루코시드를 처리하였을 때 농도의존적으로 감소하는 것을 확인하였다 (도 4).
실시예 4. Western blot 법에 의한 파골세포의 단백질 발현량 변화 조사
플로레틴 4-O-글루코시드의 마우스 대식세포 (RAW264.7 cells)에 대한 면역증강 기전을 조사하기 위해 ASK1/MAPK 신호전달경로를 통한 면역증강 기전을 웨스턴 블럿 방법으로 조사하였다. ASK1은 MAP3K (mitogen-activated protein kinase kinase kinase)의 하나로 p38과 JNK를 활성화시키는 신호전달 매개체이다. MAPK (p38과 JNK) 신호전달경로는 세포 생존에 관여하는 대표적인 신호전달 경로로 알려져 있다. 또한 파골세포의 분화와 관련된 p-Erk 단백질과 골 흡수와 관련된 단백질인 Carbonic Anhydrase Ⅱ 및 Integrin β3의 발현량을 확인하였다. 마우스 대식세포 (RAW264.7 cell)를 6-웰 플레이트에서 24시간 동안 배양하고, α-MEM 배양액에 50 ng/ml의 RANKL과 플로레틴 4-O-글루코시드를 5, 10, 20 μM의 농도로 세포에 5일간 처리하였으며, 시료의 처리 및 배양액의 교체는 48시간마다 진행하였다. 5일이 지난 후 PBS 세척하고 세포를 수득하였다. 각각 60 μl의 용해 버퍼를 첨가한 후에 30분 동안 얼음 상에서 반응시키고 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리 하여 단백질을 수확하였다. 브래드포드 분석법을 이용하여 단백질을 정량하고 샘플 로딩 버퍼를 넣고 95℃에서 5분 동안 변성 시킨 뒤에 SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) 겔을 이용하여 전기영동 하였다. 니트로셀룰로즈 (Nitrocellulose; NC) 막에 전송 한 뒤 5% 탈지분유로 실온에서 1시간 동안 블로킹 (blocking) 한 후 1차 항체 (1:1000)를 5% 탈지분유에 각각의 비율로 희석한 후 4℃에서 밤새 반응시켰다. TBST (TBS, 0.1% Tween 20)로 10분마다 3번 세척하고 HRP (horeseradish peroxidase)-컨쥬게이티드 2차 항체를 5% 탈지분유에 1:2000으로 희석한 후 실온에서 1시간동안 반응시켰다. 위와 같은 방법으로 TBST로 3차례 세척한 후 ECL (Enchanced Chemiluminescence) 기질 용액을 막에 1분 동안 반응시킨 후에 X-ray 필름에 현상하였다. 그 결과, 플로레틴 4-O-글루코시드을 농도별로 처리한 후, ASK1과 MAPK중 p38과 JNK의 인산화를 측정한 결과, 아무것도 처리하지 않은 대조군과 비교하였을 때 ASK1, p38 및 JNK의 인산화가 농도 의존적으로 증가됨을 확인하였다. 또한 Carbonic Anhydrase Ⅱ 및 Integrin β3의 발현량 감소를 통해 파골세포의 골 흡수가 억제됨을 확인하였다 (도 6). 이 결과를 통해, 플로레틴 4-O-글루코시드가 마우스 파골세포에서 파골세포의 분화에 관여하는 ASK1/MAPK신호전달경로를 활성화시킴으로서 골 흡수 저해가 일어난다는 것을 알 수 있었다.

Claims (9)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 플로레틴-4-O-글루코시드를 포함하며, 파골세포의 분화 또는 골 흡수를 억제하는, 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112020029902211-pat00007
    .
  2. 제 1항에 있어서, 상기 골질환은 골다공증(osteoporosis), 골감소증(osteopenia) 및 골위축(bone atrophy)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 과립제, 정제, 환제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 및 에어로졸로 구성된 군으로부터 선택되는 경구형 제형, 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화된, 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 플로레틴 4-O-글루코시드는 0.1 내지 40 μM 농도인, 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 하기 화학식 1로 표시되는 플로레틴-4-O-글루코시드를 포함하는, 파골세포의 분화 또는 골 흡수를 억제하는 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112020029902211-pat00008
    .
  7. 제 6항에 있어서, 상기 골질환은 골다공증(osteoporosis), 골감소증(osteopenia) 및 골위축(bone atrophy)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품조성물.
  8. 삭제
  9. 제 6항에 있어서, 상기 플로레틴 4-O-글루코시드는 0.1 내지 40 μM 농도인, 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품조성물.
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논문1: PHYTOCHEM. REV.

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