KR101487761B1 - 아르테미시닌을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

아르테미시닌을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아르테미시닌을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 상기 아르테미시닌은 조골세포를 증식시키고, 파골세포의 형성 및 활성을 유의적으로 억제하는 효과를 나타냄으로, 상기 아르테미시닌을 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

아르테미시닌을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical Composition for the prevention or treatment of osteoporosis comprising Artemisinin}
본 발명은 아르테미시닌(artemisinin)을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
골은 석회화된 견고한 표면과 골수로 불리는 내부의 세포 성분이 결합된 특수조직이다. 생리적으로 상이한 이 두 구조의 결합은 일생을 두고 지속되는 골의 재형성(bone remodeling) 과정에 기인한 것인데,이는 골에 가해지는 호르몬이나 물리적 자극에 의해 골수에 있는 파골세포(osteoclast)들이 골의 표면으로 모여 골을 파들어가면서 파괴하는 골흡수(bone resorption)가 일어난 자리에 모여든 조골세포(osteoblast)에 의한 골기질의 합성(bone formation)으로 설명된다(Park JS, Natl. Nutr., 215, pp25-31, 2000).
골표면에 위치하는 조골세포는 세포막에 당단백 효소인 알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase, ALP)를 가지고 있으며 Ⅰ형 콜라겐(type I Collagen, Col ), 오스테오칼신(osteocalcin, OCN), 오스테오폰틴(osteopontin, OPN), 뼈 시알로단백(bone sialoprotein, BSP)과 같은 골기질 물질을 분비하고 석회화시키는 역할을 한다(Collier FM et al., Endocrinology, 139(3), pp1258-1267, 1998). 골은 조골세포와 파골세포 활성의 균형을 유지함으로 골량이 일정하게 유지되며 이들의 활성으로 골의 재생이 지속적으로 일어난다. 그러나 조골세포보다 파골세포의 활성이 증가할 때 골량이 감소하여 골다공증을 유발하고, 폐경기 이후의 여성은 혈중 에스트로겐농도 감소로 골다공증을 유발한다.
골다공증은 현재 가장 중요한 사회적 문제 중 하나로 그 증세 자체보다는 골의 약화에 따라 용이하게 초래되는 각종 골절, 특히 대퇴골 골절 또는 척추골절 등이 장기간 활동을 제한하여 건강한 생활을 영위할 수 없고, 결과적으로 노인층 사망의 15%에 대한 원인제공을 하는 것으로 알려져 있다. 골량은 유전적 요인, 영양 섭취, 호르몬의 변화, 운동 및 생활 습관의 차이 등 여러 가지 요인들에 의해 영향을 받으며, 골다공증의 원인으로는 노령, 운동 부족, 저체중, 흡연, 저칼슘 식이, 폐경, 난소 절제 등이 알려져 있다. 한편 개인차는 있지만 백인보다는 흑인이 골 재흡수 수준(bone resorption level)이 낮아 골량이 더 높으며, 대개 골량은 14~18세에 가장 높고 노후에는 1년에 약 1%씩 감소한다. 특히 여성의 경우 30세 이후부터 골 감소가 지속적으로 진행되며, 폐경기에 이르면 호르몬 변화에 의해 골 감소가 급격히 진행된다. 이와 같이 골다공증은 정도에 차이는 있으나 노년층, 특히 폐경기 이후의 여성에게 있어서는 피할 수 없는 증상으로, 선진국에서는 인구가 노령화됨에 따라 골다공증 및 그 치료제에 대한 관심이 점차 증가되고 있다. 또한, 전세계적으로 골질환 치료와 관련되어 약 1,300억 달러의 시장이 형성되어 있는 것으로 알려져 있으며 앞으로 더 증가할 것으로 예상되기 때문에, 세계적인 각 연구 기관과 제약회사에서는 골 질환 치료제 개발에 많은 투자를 하고 있고 현재 골 흡수 억제제의 개발이 활발히 진행되고 있다. 골다공증과 관련하여 과거에는 주로 골의 무기질, 즉 칼슘과 인의 대사이상을 중심으로 그 연구가 진행되어 왔으나, 이의 발병 기전 규명에는 큰 진전을 보지 못하였다.
현재 골다공증 치료제로 사용되고 있는 물질로는 에스트로겐(estrogen), 남성화 스테로이드 호르몬(androgenic anabolic steroid), 칼슘 제제, 인산염, 불소 제제, 이프리플라본(Ipriflavone), 비타민 D3 등이 있다. 에스트로겐은 조골세포의 세포고사를 억제하여 세포의 생존기간을 증가시키고 파골세포의 세포고사를 촉진하여 세포의 생존기간을 감소시켜 폐경증상의 치료와 골밀도 유지에 어느 정도 효과적인 방법이나 유방암, 자궁내막 증식증 등을 유발하는 부작용이 있다. 따라서 세계적으로 에스트로겐의 긍정적인 치료 효과만을 갖는 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자(selective estrogen receptor modulators, sERMs)를 개발하여 에스트로겐 대체 치료에 이용하려는 연구가 활발히 진행되고 있고 같은 맥락에서 최근에 상대적으로 골에 분포도가 높은 에스트로겐 수용체 아형(subtype)인 ERβ에 대한 관심이 집중되고 있다. 골의 재흡수를 억제하는 약물이고 SERMs, fluoride 등이 있는데 이들 약물은 단기간(~ 5년 정도)의 치료에는 골밀도 증가에 효과적이나 장기간의 투여시 골량의 증가가 촉진되지 않으며 오히려 장기간의 투여에 따른 부작용을 초래한다. 따라서 장기간의 투여에도 지속적인 골밀도 증가 효과를 나타내고 부작용이 적은 안전한 예방 및 치료제 개발이 요구되고 있다. 이외에도 골다공증 파골세포의 활성을 억제하여 골파괴를 억제시키거나 조골세포의 증식을 통해 골재생 단위의 활성을 증가시키는 약물로 1,25(OH)2D3(calcitriol)(칼시토닌), 부갑상선호르몬(parathyroid hormone, PTH), 비스포스포네이트(bisphosphonate) 제제 등이 있다.
그러나 기존 골다공증 치료약제들은 골흡수만을 차단시키거나 골형성을 촉진시키는 효능만을 갖으며 장기간 투여시 많은 부작용을 유발하고 있다. 따라서 장기간 투여에도 지속적인 골밀도 증가 효과를 나타내고 부작용이 적은 안전한 예방 및 치료제 개발이 요구되고 있다.
한편, 개똥쑥(Artemisia annua L.)은 쌍떡잎식물 초롱꽃목 국화과의 한해살이풀로서, 국화과에 속하며 한국·일본·타이완·몽골·시베리아 등지 분포되어 있는 것으로, 잔잎쑥·개땅쑥이라고도 한다. 길가나 빈터, 강가에서 자라는 것으로 높이가 약 1m이며, 풀 전체에 털이 없고 특이한 냄새가 나는 식물로서, 한방에서는 발열 감기·학질·소아경기·소화불량·이질 등의 치료에 사용되며, 서양에서는 마취제, 양념, 식초의 방향제로 쓰여져 왔다.
개똥쑥(Artemisia annua L.)에 포함되어 있는 성분으로는 아르테미시닌(Artemisinin), 아르테아뉴인 B(arteannuin B), 아르테미신닌 산(artemisininic acid), 디하이드로아테미신닌 산(Dihydroartmisinic acid), 알파-에폭시디하이드
로아르테미신닌 산(a-Epoxydihydroartemisinic acid), 아르테아뉴인 L(Arteannuin L), 아테아뉴인 N(ArteannuinN), 디하이드로아르테아뉴인 B(Dihydroarteannuin B), 3,3',7-트리메틸케르세틴(3,3',7-Trimethylquercetin), 3,4',7-트리메틸케르세틴(3,4',7-Trimethylquercetin)이 있으며, 개똥쑥이 함유하고 있는 아르테미시닌(artemisinin) 물질은 항암효과가 매우 뛰어나 기존의 항암제보다도 1200 배나 효능이 있다고 보고되어 있다(Choi SR et al., 2008; Xu Q et al., 1989). 또한, 고혈압, 당뇨 등 성인병에도 효과가 있다고 알려져 있으며, 말라리아나 결핵, 이질 등을 치료하는데에도 효능이 있다고 보고되고 있다(Klayman DL et al., 1984). 아울러, 허혈을 다스리거나 종기, 가려움증, 설사, 기생충 제거, 체력개선 및 면역력(Han HS et al., 2008; Singh NP et al., 2001) 강화에 효능이 있다고 보고되고 있으나, 아르테미시닌을 포함하는 개똥숙이 골다공증 예방 및 치료에 어떠한 영향을 미치는지는 알려진 바 없다.
이에, 본 발명자들은 아르테미시닌의 골다공증 예방 및 치료 효과에 대하여 규명하고자 노력한 결과, 아르테미시닌은 조골세포를 증식시키고, 파골세포의 형성 및 활성을 유의적으로 억제하는 효과를 나타냄을 확인함으로써, 상기 아르테미시닌을 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명 목적은 아르테미시닌(artemisinin)을 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 아르테미시닌(artemisinin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 아르테미시닌 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.
본 발명은 아르테미시닌(artemisinin)을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 아르테미시닌은 조골세포를 증식시키고, 파골세포의 형성 및 활성을 유의적으로 억제하는 효과를 나타냄으로써, 상기 아르테미시닌을 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 아르테미시닌이 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP) 활성에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 2는 아르테미시닌이 파골 세포 분화에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 3은 아르테미시닌이 ALP(alkaline phosphatase, ALP) 활성에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 4는 아르테미시닌이 조골 세포 분화에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 아르테미시닌(artemisinin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 아르테미시닌을 개똥쑥 추출물로부터 분리된 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 아르테미시닌을 하기 [화학식 1]로 표시되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
[화학식 1]
Figure 112013100852318-pat00001

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 5 내지 6주령 C57BL/6 마우스에서 경골과 대퇴골을 분리하여 골수 세포를 수득하였다. 상기 수득된 골수세포로부터 파골세포로 분화 유도하는 동안 아르테미시닌의 효과를 확인하기 위하여, 주석산염저항산성인산분해효소(tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP) 염색 방법을 이용하여 아르테미시닌의 효과를 확인한 결과, 아르테미시닌을 처리한 골수세포에서 농도의존적으로 파골세포로의 분화를 억제하는 것을 확인하였고(도 1 참조), 현미경 관찰에서도 아르테미시닌을 농도의존적으로 골수세포를 파골세포로의 분화를 유의적으로 억제하는 것을 확인하였다(도 2참조).
또한, C2C12 세포에 BMP-2를 처리하여 조골세포로 분화를 유도하는 동안, 아르테미시닌(artemisinin)이 미치는 영향을 알칼리 포스파타제 활성 측정 및 염색을 통해 확인한 결과, 각각 0.3 μM, 1 μM, 3 μM 및 10 μM 아르테미시닌을 처리한 골수세포에서 농도의존적으로 조골세포로 분화하는 것을 확인하였고(도 3 참조), 현미경 관찰에서도 아르테미시닌을 농도의존적으로 골수세포를 조골세포의 분화를 유의적으로 촉진하는 것을 확인하였다(도 4 참조).
따라서, 본 발명의 에 따른 아르테미시닌(artemisinin)은 조골세포를 증식시키고, 파골세포의 형성 및 활성을 유의적으로 억제하는 효과를 나타냄으로, 상기 아르테미시닌 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 아르테미시닌을 함유하는 조성물은 상기 성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 ~ 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
즉, 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 아르테시미닌에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 아스퍼질러스 테리우스 추출물의 양을 기준으로 0.0001 내지 100 mg/kg이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 mg/kg이며, 하루 1 ~ 6 회 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 염증성 질환의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 아르테미시닌은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산, 아세트산, 안식향산, 구연산, 젖산, 말레인산, 글루콘산, 메탄설폰산, 4-톨루엔설폰산, 주석산, 푸마르산과 같은 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.
본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 화학식 1의 유도체를 유기용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤, 메틸렌클로라이드, 아세토니트릴 등에 녹이고 유기산 또는 무기산을 가하여 생성된 침전물을 여과, 건조하여 제조되거나, 용매와 과량의 산을 감압 증류한 후 건조하거나 유기용매 하에서 결정화시켜셔제조할 수 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속 염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
또한, 본 발명은 아르테미시닌(artemisinin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.
상기 아르테미시닌을 개똥쑥 추출물로부터 분리된 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 아르테미시닌을 하기 [화학식 1]로 표시되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
[화학식 1]
Figure 112015001814442-pat00009
본 발명의 에 따른 아르테미시닌(artemisinin)은 조골세포를 증식시키고, 파골세포의 형성 및 활성을 유의적으로 억제하는 효과를 나타냄으로, 상기 아르테미시닌 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 골다공증 예방 및 개선용 건강식품 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용할 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 과자류, 빵류, 면류 등과 같은 각종 식품류, 물, 청량음료, 과실음료 등의 드링크류, 껌, 차, 비타민 복합제, 조미료류, 건강기능 식품류 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명의 테레인은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강식품 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 5 중량%로 가할 수 있으며 건강음료 조성물에는 100 을 기준으로 0.01 내지 5.0 g, 바람직하게는 0.01 내지 1.0 g의 비율로 첨가할 수 있다. 그러나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어, 말토스, 수크로즈 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어, 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리스리톨 등의 당알코올이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마킨, 스테비아 추출물 등), 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탄 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 당 일반적으로 약 0.1 내지 2.0 g, 바람직하게는 약 0.1 내지 1.0 g이다.
상기 외에 본 발명의 테레인은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 중점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 아스퍼질러스 테리우스 추출물 또는 이의 분획물은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 아스퍼질러스 테리우스 추출물 또는 이의 분획물 100 중량부 당 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명은 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 개똥쑥 추출물로 부터 아르테미시닌 ( artemisinin ) 분리
개똥쑥 추출물로 부터 분리된 아르테미시닌을 Enzo Life Sciences(Cat #: ALX-350-219-G001) 에서 구입하였다.
< 실시예 2> 아르테미시닌 ( artemisinin )에 의한 파골세포 분화 억제 효과 확인
<2-1> 파골세포 배양
5 내지 6주령 C57BL/6 마우스에서 경골과 대퇴골을 분리하여 골수 세포를 수득하였다. 상기 분리된 골수세포는 10% fetal bovine serum(FBS) 및 50 ng/ml M-CSF가 포함된 α- 최소 필수 배지(α- minimum essential medium,α- MEM)에서 3일 동안 배양한 후 부유 세포는 제거하고 부착된 세포를 대식세포(bone marrow macrophages, BMMs)로 사용하였다. 그런 다음, 상기 대식 세포를 50 ng/ml M-CSF 및 100 ng/ml RANKL이 포함된 배지에 4일 동안 배양하였다. 주석산염저항산성인산분해효소(tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP)를 이용하여 염색하고, TRAP 양성 다핵 형 세포를 파골세포로 간주하여 사용하였다.
<2-2> TRAP ( tartrate - resistant acid phosphatase ) 활성 측정
상기 실시예 <2-1>에 기재된 방법으로 골수세포로부터 파골세포로 분화 유도하는 동안 아르테미시닌의 효과를 확인하기 위하여, 주석산염저항산성인산분해효소(tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP) 염색 방법을 이용하여 아르테미시닌의 효과를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <2-1>에 기재된 방법으로 배양한 골수세포에 M-CSF 및 RANKLE을 처리하여 파골세포로 분화하는 동안 아르테미시닌을 농도별로 처리한 후, 4일 동안 배양하였다. 배양 후, 배지를 제거하고 PBS를 사용하여 상기 세포를 세척하였다. 그런 다음, 상기 세포를 10 % 포르말린으로 5분 동안 고정시킨 후, 증류수로 3번 세척하였다. 발색반응 물질(Chromogenic substrate)을 상기 세포에 50 μl씩 첨가하고 37 ℃에서 30분 동안 염색한 후 현미경을 통해 관찰하였다(도 2). 또한, TRAP 활성은 배양 상측액(culture supernatants)에 170 μl씩 발색반응 물질/테트라를 포함한 버퍼(chromogenic substrate/ tartrate-containing buffer)를 첨가하고 37 ℃에서 3 시간 동안 반응시킨 후, 엘라이저 리더기(ELISA reader)(Molecular Devices, CA, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 아르테미시닌을 처리한 골수세포에서 농도의존적으로 파골세포로의 분화를 억제하는 것을 확인하였다(도 1).
또한, 도 2에 나타낸 바와 같이, 현미경관찰에서도 아르테미시닌은 농도의존적으로 골수세포를 파골세포로의 분화를 유의적으로 억제하는 것을 확인하였다(도 2).
< 실시예 3> 아르테미시닌 ( artemisinin )에 의한 조골세포 분화 확인
<3-1> 조골세포 배양
C2C12 세포를 10% FBS(fetal bovine serum, Gibco Invitrogen, Grand Island, NY, USA) 및 항생제(100 U/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신(Gibco Invitrogen))가 포함된 DMEM 배지(DMEM, Hyclone, Logan, UT, USA)를 사용하여 계대 배양하였다. 그런 다음, C2C12 세포를 96-웰 플레이트(96-well plate)에 2 x 104 세포/ml 농도로 200 μl씩 분주한 후, 10% FBS가 포함된 DMEM 배지를 사용하여 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양 후, 배양액을 제거하고 5% DMEM 배지를 첨가하였다. 그런 다음, 100 ng/ml BMP-2를 상기 세포에 처리하고 4일 동안 배양하여 조골세포로 분화를 유도하였다.
<3-2> Alkaline phosphatase ( ALP ) 활성 측정
상기 실시예 <3-1>에 기재된 방법으로 C2C12 세포에 BMP-2를 처리하여 조골세포로 분화를 유도하는 동안, 아르테미시닌(artemisinin)이 미치는 영향을 알칼리 포스파타제 활성 측정 및 염색을 통해 확인하였다. 혈청효소인 알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase, ALP)는 골 형성의 지표가 되는 효소로써 조골세포의 분화 중기에 생성된다(Zhao Y et al., Biol. Pharm. Bull., 28(8), pp1371-1376, 2005).
구체적으로, 상기 실시예 <3-1>에 기재된 방법으로 BMP-2(10 ng/ml) 및 아르테미시닌을 처리한 후, 10 mM Tris, 0.5 mM MgCl2 , 0.1% Triton X-10이 포함된 완충용액(lysis buffer)을 사용하여 상기 세포를 용해시키고 13,000 rpm에서 20분간 원심분리를 한 후 상측액을 수득하였다. 상기 수득된 상측액 20 μl를 96 웰 플레이트(well plate)에 분주하고 60 μl씩 pNPP(p-nitrophenyl phosphate) 용액을 첨가한 후 37℃ 배양기에서 1시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 세포가 노란색으로 발색한 것을 확인한 후, 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 또는 3.7% 포르말린(formalin)을 사용하여 상기 세포를 고정 한 후알카리 포스파타제 키트( alkaline phosphatase kit, Sigma; St. Louis, MO, USA)를 이용하여 염색한 후, 현비경을 통해 확인하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, C2C12 세포에 BMP-2를 처리하여 조골세포로 분화하는 동안 아르테미시닌을 농도별로 처리하여 상기 세포에 대한 조골세포 분화에 미치는 영향을 확인한 결과, 각각 0.3 μM, 1 μM, 3 μM 및 10 μM 아르테미시닌을 처리한 골수세포에서 농도의존적으로 조골세포로 분화하는 것을 확인하였다(도 3).
또한, 도 4에 나타낸 바와 같이, 현미경관찰에서도 아르테미시닌은 농도의존적으로 골수세포를 조골세포의 분화를 유의적으로 촉진하는 것을 확인하였다(도 4).

Claims (7)

  1. 아르테미시닌(artemisinin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 아르테미시닌은 개똥쑥 추출물(Artemisia annua L.)로부터 분리된 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 아르테미시닌을 하기 [화학식 1]로 표시되는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112013100852318-pat00003
    .
  4. 제 1항에 있어서, 상기 아르테미시닌은 파골세포의 분화를 억제하는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 아르테미시닌은 조골세포의 분화를 촉진하는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  6. 아르테미시닌 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 개선용 건강식품.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 아르테미시닌을 하기 [화학식 1]로 표시되는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 개선용 건강식품 :
    [화학식 1]
    Figure 112015001814442-pat00010
    .













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