CN112074284A - 用于肥胖和超重治疗的协同草药组合物 - Google Patents

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特瑞穆尔图卢·戈拉科蒂
基兰·布帕蒂拉朱
文卡特斯瓦鲁·索米帕里
文卡塔克里希那拉朱·埃卢瑞
克里尚努·森古普塔
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Abstract

本发明公开了一种协同草药组合物，其包含选自可可的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第一成分和选自来檬的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第二成分的组合，以获得至少一种选自预防，控制或治疗肥胖和/或超重的健康益处；改善瘦体重，改善白色脂肪组织褐变，改善褐色脂肪组织形成，增加基础代谢率/静息消耗能量，增加产热，改善甲状腺功能，保持健康的体重，增加饱腹感，支持体重减轻，改善脂肪损失并保持健康苗条身材。本发明进一步公开了协同草药组合物，其包含可可和来檬，任选地包含至少一种选自药学上可接受的赋形剂、稀释剂和载体的成分，以及预防和治疗肥胖/超重或改善人或动物的瘦体重或静息能量消耗的治疗方法和用途。

Description

用于肥胖和超重治疗的协同草药组合物
技术领域
本发明涉及协同草药组合物，其包含选自可可的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第一成分和选自来檬的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第二成分的组合，并且任选地包含至少一种选自药学上可接受的赋形剂，稀释剂和载体或它们的混合物的成分，以获得至少一种选自预防，控制或治疗肥胖和/或超重的健康益处；改善瘦体重，改善白色脂肪组织(WAT)的褐变/改善棕色脂肪组织(BAT)的形成，增加基础代谢率(BMR)/静息能量消耗，增加产热，改善甲状腺功能，保持健康的体重，增加饱腹感，支持体重减轻，改善脂肪损失以及保持苗条的身材。本发明还涉及一获得至少一种选自预防，控制或治疗肥胖和/或超重的健康益处的方法；通过使用合适剂量的协同草药组合物来改善瘦体重，改善白色脂肪组织(WAT)的褐变，改善褐色脂肪组织(BAT)的形成，增加基础代谢率(BMR)/静息能量消耗，增加产热，改善甲状腺功能，保持健康的体重，增加人的饱腹感，减轻体重，改善脂肪损失和保持苗条的身材，所述协同草药组合物包含选自可可的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第一成分和选自来檬的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第二成分的组合，并且任选地包含至少一种选自药学上可接受的赋形剂，稀释剂和载体或其混合物的成分。
背景技术
肥胖和超重是全球越来越多的国家中迅速增长的状况。根据世界卫生组织的最新报告，自1975年以来，全世界的肥胖人数增加了两倍。体重指数(BMI)≥30kg/m2的人通常被认为是肥胖，BMI≥25kg/m2则认为是超重。这两种情况都是由于能源摄入和支出之间的不平衡造成的。肥胖与发病率的大幅增加，过早死亡，生活质量受损和较大的医疗费用有关。超重会增加患上糖尿病，代谢综合征，高血压，血脂异常，心肌梗塞，中风，某些癌症，睡眠呼吸暂停和骨关节炎的机会。开发可以减轻体重的治疗剂的主要策略包括减少食物的消耗或吸收，和/或增加能量消耗。许多药剂被商业化以解决肥胖问题，但由于副作用不可接受，大多数药剂被撤出市场。在过去的几十年中，代谢紊乱领域的研究人员已将注意力转向食物衍生成分，尤其是植物和海洋世界中的食物衍生成分，以寻求治疗肥胖/超重和相关疾病的方法。已显示某些草药提取物和食物成分会影响食欲调节，脂肪氧化，能量吸收或生热。然而已知草药成分具有较少副作用的优点，因此其可能代表了肥胖管理的令人关注的补充方法。
公开专利US2016045560 A1公开了一种减肥产品，该产品包含羽衣草(Alchemillavulgaris)，油橄榄(Olea europaea)，枯茗(Cuminum cyminum)和长花薄荷(Menthalongiflora)的混合物(重量比为12：10：5：4)以及选自可可，无水咖啡因，小粒咖啡，中粒咖啡，茶树，巴拉圭茶，瓜拉那和可乐果的附加成分。
专利申请WO2016046375 A1公开了用于治疗受体酪氨酸激酶相关疾病的可可提取物。
专利申请WO2008110853 A1公开了用于牛皮癣和其他皮肤病如痤疮和霉菌病的包含黄瓜(Cucumis sativus)，来檬(Citrus aurantifolia)，月桂(Pimenta racemosa)和彩叶木(Graptophyllum pictum)的水性提取液的组合物。
公开专利AU2006312947B2公开了一种减肥促进饮食补充剂，其包含至少3％的科罗索酸，以及儿茶素和可可提取物的原料。
公开专利US20100112099A1公开了一种通过使用组合物来活化动物中的肌细胞蛋白激酶(AMPK)的方法，所述组合物包含药学上有效剂量的一种或多种选自以下的成分：提取自生姜，黄栌，苦橙，蛇麻酮，乳清分离蛋白，多烟酸铬，六氢异α酸，黄腐酚，Rho-异α酸，接骨草，匙羹藤，茶树，金合欢，苹果，黑加仑，贯叶金丝桃，可可，越桔，狗牙蔷薇，异阿尔法酸，南方蔓越橘，亮氨酸，白毛茛，葡萄，鼠李草，淫羊藿(角质山羊杂草)，姜黄，梨果仙人掌，海南蒲桃和四氢异α酸的植物化学成分或提取物。
另一个公开专利US7329419B2公开了一种减肥片剂，其中包含有效量的绿茶，生姜，咖啡因，可可，钙，玛黛茶，山楂浆果，香菜叶棉花糖根，茴香籽，黄芪根，甘草根，苏马，肉桂，芹菜籽和苜蓿叶。
因此，在本领域中持续需要提供包括用于治疗肥胖和超重的高效草药组合物的替代疗法。另外，迫切需要具有良好耐受性和更有效的草药提取物和组合物以解决肥胖和超重。
发明内容
本发明的目的是提供协同草药组合物，其包含选自可可的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第一成分和选自来檬的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第二成分的组合。用于获得至少一种选自预防，控制或治疗肥胖和/或超重的健康益处；以及改善瘦体重，改善白色脂肪组织(WAT)的褐变，改善褐色脂肪组织(BAT)的形成，增加基础代谢率(BMR)/静息能量消耗，增加产热，改善甲状腺功能，保持健康的体重，增加饱腹感，支持体重减轻，改善脂肪减少和保持苗条的身材。
本发明的另一个目的是提供预防，控制或治疗肥胖和/或超重的方法。改善瘦体重，改善白色脂肪组织(WAT)的褐变，改善褐色脂肪组织(BAT)的形成，增加基础代谢率(BMR)/静息能量消耗，增加产热，改善甲状腺功能，保持健康的体重，增加体重饱足感，减轻体重，改善脂肪损失并保持人或动物的苗条身材，其中所述方法包括向人补充有效剂量的协同草药组合物，所述协同草药组合物包括选自可可的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第一成分和选自来檬的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第二成分的组合。
本发明的又一个目的是提供协同草药组合物的用途，所述组合物包含选自可可的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第一成分和选自来檬的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第二成分的组合，用于获得选自预防，控制或治疗肥胖和/或超重的至少一种健康益处；以及改善瘦体重，改善白色脂肪组织(WAT)的褐变，改善褐色脂肪组织(BAT)的形成，增加基础代谢率(BMR)/静息能量消耗，增加产热，改善甲状腺功能，保持健康的体重，增加饱腹感，支持体重减轻，改善脂肪损失和保持苗条的身材。
本发明提供了一种协同草药组合物，其包含选自可可的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第一成分和选自来檬的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第二成分的组合，以获得至少一种选自预防，控制或治疗肥胖和/或超重的健康益处；以及改善瘦体重，改善白色脂肪组织(WAT)的褐变，改善褐色脂肪组织(BAT)的形成，增加基础代谢率(BMR)/静息能量消耗，增加产热，改善甲状腺功能，保持健康的体重，增加饱腹感，支持体重减轻，改善脂肪损失和保持苗条的身材。
本发明的另一方面提供了一种获得选自预防，控制或治疗肥胖和/或超重的健康益处的方法，以及改善瘦体重，改善白色脂肪组织(WAT)的褐变，改善褐色脂肪组织(BAT)的形成，增加基础代谢率(BMR)/静息能量消耗，增加产热，改善甲状腺功能，保持健康的体重，增加饱腹感，支持体重减轻，改善脂肪损失和维持人体苗条，其中该方法包括向人类补充有效剂量的协同草药组合物，该组合物包括选自可可的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第一成分和选自来檬的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第二成分的组合，其任选地包含至少一种选自药学上可接受的赋形剂，稀释剂及其载体的成分。
本发明的另一方面提供了协同草药组合物的用途，所述协同草药组合物包含选自可可的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第一成分和选自来檬的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第二成分的组合，且包含至少一种选自药学上可接受的赋形剂，稀释剂，载体及其混合物的成分，以获得至少一种选自预防，控制或治疗肥胖和/或超重的健康益处；以及改善瘦体重，改善白色脂肪组织(WAT)的褐变，改善褐色脂肪组织(BAT)的形成，增加基础代谢率(BMR)/静息能量消耗，增加产热，改善甲状腺功能，保持健康的体重，增加饱腹感，支持体重减轻，改善脂肪损失和保持苗条的身材。
本发明的另一方面提供了一种协同草药组合物，其包含选自可可的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第一成分和选自来檬的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第二成分的组合，并且任选地包含选自药学上可接受的赋形剂，稀释剂及其载体的至少一种成分，用于改善代谢过程，如促进脂解，抑制脂肪形成，增加成纤维细胞生长因子21(FGF-21)，增加解偶联蛋白(UCP-1)和β3-肾上腺素能受体(β3-ARs)。
附图说明：
图I：柱状图示意了第1、8、15、22和28天(A)的对照组和治疗组动物的体重。每个柱状表示平均体重±SM。在p<0.05时表现显著；#G1对G2；*G2对治疗组。柱状图显示了对照组和治疗组动物在第28天的体重百分比变化(B)。G1和G2分别代表补充正常食物和高脂饮食的大鼠组；G3，G4和G5分别代表高脂饮食加上100和300mg/kg体重的组合物67，以及补充10mg/kg体重的西布曲明的大鼠。
图II：柱状图示意了补充组合物67的由饮食诱导的肥胖大鼠减少的每日饮食卡路里摄入量。每个柱状表示平均值±SD。G1和G2分别代表补充正常食物和高脂饮食的大鼠组。G3，G4和G5分别代表高脂饮食加上100和300mg/kg体重的组合物67，以及补充10mg/kg体重的西布曲明的大鼠。n＝7；在p<0.05时表现显著；#G1对G2；*G2对治疗组。
图III：柱状图示意了补充组合物67的由饮食诱导的肥胖大鼠中内脏脂肪重量的减少。每个柱状表示平均值±SD。G1和G2分别代表补充正常食物和高脂饮食的大鼠组。G3，G4和G5分别代表高脂饮食加上100和300mg/kg体重的组合物67，以及补充10mg/kg体重的西布曲明的大鼠。n＝7；在p<0.05时表现显著；#G1对G2；*G2对治疗组。
图IV：柱状图示意了补充组合物67的由饮食诱导的肥胖大鼠中附睾脂肪细胞大小的调节。每个柱状均表示脂肪细胞面积的平均值±SE，单位为μm2。G1和G2分别代表补充正常食物和高脂饮食的大鼠组。G3，G4和G5分别代表高脂饮食加上100和300mg/kg体重的组合物67，以及补充10mg/kg体重的西布曲明的大鼠。n＝7；在p<0.05时表现显著；#G1对G2；*G2对治疗组。
图V：柱状图示意了补充组合物67的由饮食诱导的肥胖大鼠中血清瘦素水平的标准化。G1和G2分别代表补充了正常食物和高脂饮食的大鼠组。G3，G4和G5分别代表高脂饮食加上100和300mg/kg体重的组合物67，以及补充10mg/kg体重的西布曲明的大鼠。n＝7；在p<0.05时表现显著；#G1对G2；*G2对治疗组。
图VI：柱状图示意了补充组合物67的由饮食诱导的肥胖大鼠中甲状腺激素平衡的改善。每个柱状表示三碘甲状腺氨酸(T3)和甲状腺素(T4)之比的平均值±SD。G1和G2分别代表补充正常食物和高脂饮食的大鼠组。G3，G4和G5分别代表高脂饮食加上100和300mg/kg体重的组合物67，以及补充10mg/kg体重的西布曲明的大鼠。n＝7；考虑到G1 100％，每个柱上方的数字代表相对T3/T4比率的百分比。
图VII：显微照片显示附睾脂肪组织中UCP-1的免疫组织化学染色。G1和G2分别代表补充正常食物和高脂饮食的大鼠组。G3，G4和G5分别代表高脂饮食加上100和300mg/kg体重的组合物67，以及补充10mg/kg体重的西布曲明的大鼠。柱：50μm。
具体实施方式
现在将结合某些优选和可选的实施方案详细描述本发明，以便可以更充分地理解和领会其各个方面。
术语“脂肪分解”和“脂解”是本领域公认的术语，并且在整个说明书中可互换使用，并且本领域技术人员将同样理解和领会其相同点。同样，褐变，脂肪褐变，米色脂肪和白色脂肪组织(WAT)褐变也可以互换使用。在整个说明书中，术语“草药”和“植物”也可以互换使用。
脂肪生成是前脂肪细胞分化和增殖为成熟脂肪细胞或脂肪细胞的过程。在此过程中，前脂肪细胞或前体脂肪细胞增殖后，这些细胞分化为成熟的脂肪细胞表型。已知核受体PPARγ在脂肪细胞分化和脂肪沉积中起关键作用。脂肪细胞在能量平衡中起着至关重要的作用，并负责维持动物体内甘油三酯等最大的能量储备。脂肪细胞保持动态状态，当能量消耗超过摄入量时它们开始膨胀。这个过程是由这些细胞非常敏感的反调节激素高度调节的。因此，脂肪形成抑制是开发针对肥胖/超重治疗和促进减肥的主要目标之一。
脂肪分解(脂解)是分解代谢过程，导致脂肪细胞中储存的甘油三酯分解并释放脂肪酸和甘油到血流中。这是一个高度受控的过程，可允许适当释放游离脂肪酸以满足能量需求。因此，增加脂肪分解是治疗肥胖/超重和促进减肥的主要目标之一。β3-肾上腺素受体激动剂可以刺激白色脂肪组织中的脂解和棕色脂肪组织中的生热。具有脂解活性的植物提取物，馏分和植物化学物质可用于治疗肥胖，超重和其他代谢性疾病。
因此，本申请的发明人随机筛选了大量植物提取物和馏分的抗脂肪形成和促脂肪分解活性，并发现可可和来檬的提取物和馏分显示出抗脂肪形成和促脂解活性的有效的剂量依赖性，如表3至表7所示。
下文提供了每种植物材料的简要概述。
可可：可可树很小，但在经济上很重要。它属于梧桐科的常绿植物，高4–8m，原产于美洲的热带地区。可可种子是多酚和可可碱的重要来源。种子用于制作可可块，可可粉，糖果，水粉和巧克力。可可提取物或其植物化学物质对防止血小板聚集，高血压，动脉粥样硬化，高血糖和高胆固醇血症，炎症，肝癌发生，DNA损伤和致裂效应具有多种有益作用。可可碱(I)是可可中的主要生物碱(Donald L.Pavia，化学教育杂志，1973，50，791-792)，并且本发明中使用的提取物通过HPLC分析方法被标准化为可可碱。
Figure BDA0002760600750000081
可可碱的化学结构(I)
来檬：来檬是多年生常绿树，可以生长到3-5m的高度。它具有不规则细长的分支，并具有短而僵硬的尖刺或刺。它的花短，有些是白色的，芬芳的。它未成熟的果实是圆形的，直径3-5厘米。成熟时是黄色的。来檬的分类：界(植物界)；亚界(维管植物)；超级组织(种子植物)；组织(开花植物)；类(双子叶植物纲)；子类(蔷薇亚纲)；序(无患子目)；家族(芸香科)；属(柑橘)；种(来檬)。它原产于亚洲和东南亚的热带和亚热带地区，包括印度，中国，并被引入北非，欧洲和世界各地。来檬的方言是青柠(英语)。它不仅用作饮料，工业食品和药物制剂的调味剂，还用作香料的成分。来檬皮通常被用作抗糖尿病的，抗血脂的，抗虫的，抗癌的活性物质。它显示了体外黄嘌呤氧化酶的抑制活性，抗氧化性，细胞毒素的抗病毒活性。已知可将其用于化妆品中，如免晒黑，肥皂等。柠檬苦素(II)被鉴定为来檬中的主要代谢产物，并且本发明的提取物通过HPLC分析方法对柠檬苦素(II)进行了标准化。
Figure BDA0002760600750000082
柠檬苦素(II)的化学结构
用于本发明的草药的来源如下：
1.可可种子是从特兰甘纳州，巴特德里·科塔古德姆区，阿斯瓦罗佩塔曼达尔，阿斯瓦罗佩塔潘查亚特，阿斯瓦罗佩塔村的栽培源中收集的。
2.来檬是在安得拉邦州，贡图尔区，图勒尔曼达拉，拉亚普迪潘查亚特，拉亚普迪村的栽培源中采集的。
将可可种子粉碎后，用水，乙醇水溶液，乙醇，甲醇水溶液和正丁醇等各种溶剂提取粉末，分别得到水提取物(T.C-1)，乙醇水溶液提取物(T.C-2)，乙醇提取物(T.C-3)，甲醇水溶液提取物(T.C-4)和正丁醇提取物(T.C-5)。所述可可种子的提取物通过分析型HPLC方法标准化为可可碱(I)，结果总结于表1中。类似地，将来檬果皮粉碎，并用各种溶剂如乙醇水溶液，乙醇，水，甲醇水溶液和正丁醇制得乙醇水溶液提取物(C.A-1)，乙醇提取物(C.A-2)，水提取物(C.A-3)，甲醇水溶液提取物(C.A-4)和正丁醇提取物(C.A-5)。通过分析型HPLC方法将来檬提取物标准化为柠檬苦素(II)，结果总结于表2。
使用小鼠3T3-L1前脂肪细胞中的体外细胞模型评价了所述可可种子提取物和来檬果皮提取物的抗脂肪形成和促脂肪分解活性。结果表明，所述提取物有效地抑制脂肪生成以及增加脂肪分解活性。例如，可可种子水提取物(T.C-1)在5μg/mL和10μg/mL的处理浓度下分别对脂肪形成具有38.36％和41.10％的抑制作用。来檬果皮乙醇水溶液提取物(C.A-1)在5μg/mL和10μg/mL的处理浓度下，分别对脂肪形成具有25.81％和35.74％的抑制作用，可可种子和来檬果皮的其他溶剂提取物也被发现是有效的。
然后评估这些单独的提取物或其馏分，以探索这些成分之间协同功效的可行性。将可可的提取物或馏分与来檬的提取物或馏分以不同的比例组合以获得组合物-1至65(C-1至C-65)。与相应的单独成分相比，测试了所述组合物(组合物1-65)的脂肪形成抑制活性。当与它们相应的单独成分相比时，来自这些组合物的体外脂肪生成抑制测定的数据出乎意料地显示出更好的抑制脂肪生成的功效，这表明可可的提取物，或馏分或植物化学物质或其混合物，与来檬的提取物或馏分或植物化学物质或其混合物组合时，具有显示协同作用的趋势。
例如，浓度为1.67μg/mL的可可种子水提取物(T.C-1)和浓度为3.33μg/mL的来檬果皮50％乙醇水溶液提取物(C.A-1)分别显示出15.23％和19.47％的脂肪形成抑制。包含1：2比例的可可种子水提取物(T.C-1)和来檬50％果皮乙醇水溶液提取物(C.A-1)的组合物-2在5μg/mL时显示出44.78％的脂肪形成抑制，其效果明显优于由相应的单个成分显示的抑制作用计算得出的累加效果34.7％(15.23％+19.47％)。分别以1：3、1：1、2：1和3：1的比例包含这两种提取物(T.C-1和C.A-1)的组合物1(C-1)和组合物3-5(C-1和C-3至C-5)，与每种相应成分浓度所显示的抑制作用相比，它们也表现出协同作用。总结于表3中。含有可可种子水提取物(T.C-1)与其他来檬皮溶剂提取物(C.A-2-C.A-5)组合的其他组合物(C6至C19)提取物也显示出协同的脂肪生成抑制作用(表3)。
在另一个实例中，0.83μg/mL浓度的可可种子50％的乙醇水溶液提取物(T.C-2)以及1.67μg/mL浓度的来檬50％的乙醇水溶液提取物(C.A-1)分别显示了2.07％和26.46％的脂肪生成抑制作用。以1：2的比例含有可可种子50％的乙醇水溶液(T.C-2)和来檬50％的乙醇水溶液(C.A-1)的组合物-21在2.5μg/mL浓度时显示出40.19％的脂肪形成抑制率，其显著优于相应个体成分的抑制作用所计算出的累加效果28.53％(2.07％+26.46％)。以其它比例含有这两种提取物(T.C-2和C.A-1)的组合物-20和22至24(C-20，C-22至C-24)，以及含有可可种子50％乙醇水溶液提取物(T.C-2)以及来檬果皮的其他溶剂提取物的组合物，与它们各自相应的成分浓度所显示的抑制作用相比，如表4所示，也表现出协同作用。
类似地，与它们各自相应的个体成分浓度的抑制作用相比，可可和来檬的其他溶剂提取物组成的组合物(C-39至C-65)表现出协同作用，如表5所示。
与相应的个体成分相比，使用小鼠3T3-L1前脂肪细胞中的体外细胞模型进一步测试了组合物(组合物1-65)增加脂肪分解的功效。与它们相应的个体成分相比，来自这些组合物的体外脂肪分解试验的数据出乎意料地显示出更好的增加脂肪分解的功效，这表明可可的提取物或馏分或植物化学物质或其混合物具有以下趋势：与来檬提取物或馏分或植物化学成分或其混合物组合时，具有协同作用。
例如，浓度为6.67μg/mL的可可种子水提取物(T.C-1)和浓度为13.33μg/mL的来檬果皮50％乙醇水溶液提取物(C.A-1)的脂肪分解分别增加了29.52％和7.12％。在20μg/mL时以1：2的比例包含可可种子水提取物(T.C-1)和来檬皮50％乙醇水溶液提取物(C.A-1)的组合物-2显示脂肪分解增加47.88％，这明显优于由相应的个体成分显示的增加量计算得出的累加效应36.64％(29.52％+7.12％)。包含其他成分比例的两种提取物(T.C-1和C.A-1)的化合物1和化合物3至5，与表6中汇总的各相应个体成分浓度所显示的增量相比，它们也表现出协同作用。包含可可水提取物(T.C-1)和来檬的其他溶剂提取物(C.A-2-C.A-5)的其他组合物(C6至C19)也显示出协同的促脂肪分解活性(表6)。类似地，由可可和来檬的其他溶剂提取物组成的组合物(C-20至C-65)，与表7所示的各自相应个体成分浓度的增加相比，表现出协同作用。
有趣的是，源自可可种子和来檬果皮的提取物和馏分及其组合物在解决肥胖和超重的其他机制中进一步展现出乎意料的效果，例如脂肪褐变，生热，静息能量消耗，改善甲状腺功能，增加饱腹感，调节导致白色脂肪细胞褐变的分子因子，例如FGF21，UCP-1和β3-AR，如下所述。
褐色脂肪组织(BAT)，白色脂肪组织(WAT)褐变和静息能量消耗：脂肪组织(体脂肪)是源自脂肪细胞前体的脂肪细胞组成的松散结合的结缔组织。在人类中，脂肪组织主要位于皮肤下方(皮下脂肪)和内部器官周围(内脏脂肪)。白色脂肪组织(WAT)，也称为白色脂肪，是在哺乳动物中发现的两种类型的脂肪组织之一。另一种脂肪组织是褐色脂肪组织(BAT)。白色脂肪组织以脂质形式存储能量，并且在肥胖期间会发生病理性扩张。褐色脂肪组织(BAT)是人类和其他哺乳动物中脂肪组织的一种特殊形式。BAT在哺乳动物中进化，通过称为生热的过程将大量化学能作为热量散发。BAT不仅是抵抗体温过低的重要身体防御手段，而且在饮食诱导的生热中也起着重要作用。褐色脂肪细胞具有大量的线粒体，线粒体配有一种特殊的蛋白质，称为解偶联蛋白1(UCP-1)。UCP-1使电子传输链短路，否则该电子传输链通常用于驱动细胞ATP的合成，从而使线粒体膜电位转换给热量(生热作用)，从而使BAT能够改变能量消耗和促进新陈代谢，而不增加运动量。
近年来，褐色脂肪组织的主题已被许多新的研究重新激发，这些研究涉及将白色脂肪组织(WAT)转化为米色脂肪，也称为WAT褐变。来自某些库的WAT响应适当的刺激，可能会经历称为“褐变”的过程，以产生米色脂肪，并通过增加特定的蛋白质表达(例如UCP-1)，多腔的脂质滴及多重线粒体的存在来表现出BAT的特征。由“褐变”刺激诱导的米色脂肪细胞在表型上类似于BAT中的经典褐色脂肪细胞，具有相当数量的线粒体和UCP-1，因此表明它们可能具有与BAT类似的产热能力。成纤维细胞生长因子21(FGF21)在WAT的热量积聚中起着生理作用，其也是褐变的重要调节剂。过氧化物酶体增殖物激活受体γ助激活剂1α(PGC 1α)也是WAT褐变的重要转录调控中心之一。同样，白色脂肪组织褐变是通过去甲肾上腺素(NE)和白色脂肪细胞的β3-肾上腺素能受体(β3AR)参与的交感神经刺激驱动的。β3AR启动信号传导级联反应，导致UCP-1和白色脂肪细胞中的其他产热蛋白的过度表达。这一系列的事件是经过米色或布氏细胞中间阶段的白色脂肪细胞褐变的一部分。此外，甲状腺激素，特别是T3可以正向调节UCP-1的合成，T3可以独立地刺激UCP-1的合成，也可以与交感神经协同作用。T4抑制了T3的活性，因此，在T3和T4之间保持健康的平衡对于白色脂肪细胞的褐变至关重要。
FGF-21：成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)是FGF家族的新成员，主要在肝脏中表达。FGF-21通过调节葡萄糖稳态，胰岛素敏感性，生酮作用和促进脂肪组织“褐变”而参与代谢控制。在过去的十年中，FGF-21被证明是治疗肥胖症和糖尿病的潜在治疗靶标。脂肪组织是FGF-21作用的主要靶标之一，而FGF-21重要的代谢益处之一是“褐变”。越来越多的证据表明，FGF-21通过上调UCP-1和由自分泌-旁分泌轴产生的其他产热基因的表达，在白色脂肪组织的生热和热量积聚中发挥生理作用。FGF21还增强了脂肪组织中的PGC 1α水平。
在小鼠3T3-L1前脂肪细胞的细胞分析中，与相应的个体成分进行了比较，测试了选自组合物-1至组合物65的几种组合物的增加成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)的能力。与它们相应的单个成分相比，这些组合物的体外FGF-21测定数据出乎意料地显示出更好的增加FGF-21的功效，这表明源自于可可的提取物，或馏分或植物化学物质或其混合物在与源自来檬的提取物或馏分或植物化学物质或其混合物组合时，倾向表现出协同作用。
例如，浓度为1.67μg/mL的可可种子水提取物(T.C-1)和浓度为3.33μg/mL的来檬皮50％乙醇水溶液提取物(C.A-1)的FGF-21分别增加了10.08％和18.60％。以比例1：2含有可可水提取物(T.C-1)和来檬皮50％乙醇水溶液提取物(C.A-1)的组合物-2在5μg/mL时显示FGF-21增加44.21％，这显著优于由对应的个体成分的增加量计算得出的28.68％(10.08％+18.60％)。与表8中汇总的每种相应的个体成分浓度所显示的抑制作用相比，以其它比例包含这两种提取物(T.C-1和C.A-1)的组合物-1和组合物-3至5也显示出协同作用。与表8中汇总的各个相应个体成分浓度所显示的增加相比，含有可可水提取物(T.C-1)和来檬其他溶剂提取物(C.A-2-C.A-5)的其他组合物(C-10和C-15)以及含有可可种子和来檬皮的其他溶剂提取物的组合物-20至23、组合物-36至38(C-20-C-23和C36-38)也显示出FGF21活性协同增加作用。
UCP-1：肥胖症和其他代谢性疾病的全球流行促使科学界最近将注意力集中在白色脂肪组织(WAT)及其生物学上。在某些生理和病理生理情况下，WAT可以转化为褐色脂肪样组织。白色脂肪“褐变”现象(其中某些白色脂肪组织库显著增加解偶联蛋白(UCP-1)的基因表达，因此据称具有发热和燃烧脂肪的性能)已引起相当大的关注，因为它使其功能由能量储存转变为能量耗散。UCP-1是在褐色脂肪组织的线粒体内膜中发现的一种整体膜蛋白，可促进哺乳动物体内不颤动的生热过程。因此，研究人员的主要重点是确定能诱导“褐变”反应，增加脂肪组织中UCP-1的表达和活性，最终有助于遏制肥胖和超重的发展，和其他代谢紊乱，并促进能量消耗。
因此，利用小鼠3T3-L1前脂肪细胞，在细胞模型中测试了组合物1至65中的一些选定组合物的解偶联蛋白(UCP-1)表达活性。来自这些组合物的体外UCP-1测定的数据出乎意料地表明，与对照组相比，UCP-1表达显著增加。例如，以1：3、1：2、1：1、2：1的比例包含可可种子水提取物(T.C-1)和来檬果皮50％乙醇水溶液提取物(C.A-1)的组合物-1至5显示出显著的疗效，与对照组相比，UCP-1表达分别增加了38.48％，34.23％，33.81％，30.71％和28.69％。类似地，以1：1和2：1的比例包含可可种子50％甲醇提取物(T.C-4)和来檬果皮50％乙醇水溶液(C.A-1)的组合物-58和59也表现出显著的改善，与对照组相比，UCP-1表达增加了24.63％和11.96％。因此，表9中总结的数据表明，含有可可提取物或馏分以及来檬的提取物或馏分的组合物可能具有上调UCP-1表达的潜力，而UCP-1的表达又与增加脂肪褐变，产热和静息能量消耗有关。。
β3AR：β3-AR是主要位于脂肪组织中的β-肾上腺素能受体。其主要作用包括调节脂解作用和生热作用。典型的BAT库被神经高度支配，并被大脑中枢激活以响应某些刺激，例如冷暴露和暴露于饮食中的某些化学物质，导致从交感神经释放去甲肾上腺素(NE)。当NE与BATβ3-肾上腺素能受体(β3-ARs)结合后，细胞内环AMP(cAMP)含量的增加会促进脂肪分解。甘油三酸酯的分解导致游离脂肪酸的释放，从而上调并激活解偶联蛋白1(UCP-1)。活化的UCP-1使线粒体呼吸解耦，从而导致热量产生，因此β3-AR信号传导增加了呼吸作用，并且不会引起颤动生热，且BAT脂肪细胞在线粒体中非常丰富，除了典型的褐色脂肪细胞(BAT)以外，米色或棕色脂肪细胞也可以表现出相似的作用。这些细胞存在于WAT库，但可以经各种刺激而“褐变”，最显著的是冷暴露或β-AR信号传导的激活剂，和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)激动剂，如罗格列酮。棕色/米色脂肪细胞的激活导致线粒体解偶联增加，类似于BAT中发生的情况。因此，β3-肾上腺素能受体(AR)的激活可导致褐变，生热和静息能量消耗(REE)的增加。
因此，测试了选自组合物-1至65中的一些代表性组合物在脂肪细胞中β3-肾上腺素能受体(β3AR)表达的增加。在β3AR测试中，与用对照组处理的细胞相比，用组合物体外处理的3T3-L1细胞出乎意料地显示β3AR表达显著增加，如表10所示。例如，分别以1：3、1：2和1：1的比例包含可可水提取物(T.C-1)和来檬皮50％乙醇水溶液提取物(C.A-1)的组合物-1、2和3(C-1，C-2和C-3)，其β3AR表达分别比对照组增加36.17％，37.47％和51.02％。同样，分别以1：2和1：1的比例含有可可50％乙醇提取物(T.C-2)和来檬50％乙醇水溶液提取物(C.A-1)的组合物-21和22(C-21和C-22)相对于对照组，其β3AR表达显示分别增加了18.75％和12.66％，如表10中所总结。这些结果表明，包含衍生自可可的提取物与来檬的提取物联合的组合物可以增加β3AR的表达。因此能够增加脂肪褐变，生热和脂解的能力。
配方：本发明还提供了协同草药组合物，其包含至少一种选自可可的提取物，馏分和植物化学物质或其混合物的成分和选自来檬的提取物，馏分和植物化学物质或其混合物的第二成分，并且任选地包含至少一种选自药学上或营养学上或饮食上可接受的赋形剂，载体和稀释剂的组分。
所述组合物包含至少一种选自可可的提取物，馏分和植物化学物质或其混合物中的成分和选自来檬的提取物，馏分和植物化学物质或其混合物中的第二成分，并且任选地包含至少一种选自药学上或营养学上或饮食上可接受的赋形剂，载体和稀释剂；用于预防或控制或治疗肥胖，超重和改善瘦体重，维持体重和保持苗条的身材；其中药学上或营养学上或饮食上可接受的赋形剂，载体和稀释剂选自单糖，例如葡萄糖，右旋糖，果糖，半乳糖等；二糖，例如但不限于蔗糖，麦芽糖，乳糖，乳果糖，海藻糖纤维二糖，壳二糖等；碳水化合物，例如淀粉和改性淀粉，如羟乙酸淀粉钠，预糊化淀粉，可溶性淀粉和其他改性淀粉；由淀粉或糖原水解产生的糊精，例如黄色糊精，白色糊精，麦芽糊精等；多元醇或糖醇，例如但不限于山梨糖醇，甘露糖醇，肌醇，木糖醇，异麦芽酮糖醇等；纤维素基衍生物，例如但不限于微晶纤维素，羟丙基甲基纤维素，羟乙基纤维素等；硅酸盐，例如但不限于硅酸铝镁，铝硅酸镁盐，滑石粉，胶体二氧化硅等；金属硬脂酸盐，例如但不限于硬脂酸钙，硬脂酸镁，硬脂酸锌等；柠檬酸，酒石酸，苹果酸，琥珀酸，乳酸，L-抗坏血酸等有机酸；脂肪酸酯和聚山梨酯的酯类，天然树胶，例如但不限于阿拉伯胶，角叉菜胶，瓜尔胶，黄原胶等；维生素B组，烟酰胺，泛酸钙，氨基酸，蛋白质，例如但不限于酪蛋白，明胶，果胶，琼脂；有机金属盐，例如但不限于氯化钠，氯化钙，磷酸二钙，硫酸锌，氯化锌等；天然色素，调味剂，I级和II级防腐剂以及单独或组合使用上述成分的水性，醇性，水醇，有机溶液。
例如，通过将60g可可种子水提取物(T.C-1)，30g来檬果皮50％乙醇水溶液提取物(C.A-1)，9g麦芽糖糊精和1g二氧化硅混合来制备组合物-66。类似地，通过将53.33g可可种子水提取物(T.C-1)，26.67g来檬果皮50％乙醇水溶液提取物(C.A-1)，18g麦芽糖糊精和2g的乙醇/水存在下的二氧化硅混合，然后干燥来制备组合物-67。此外，组合物-68是通过将53.2g可可种子水提取物(T.C-1)，26.6g来檬果皮50％乙醇水溶液提取物(C.A-1)，18.2g糊精-12D和2g在乙醇/水存在下的二氧化硅混合随后干燥而制备得到的组合物。
高脂饮食(HFD)诱导的肥胖动物体内组合物-67的体内评估：在体外模型中包含可可和来檬的组合物显示的强效抗肥胖特性和协同效应进一步评估了肥胖体内模型。在雄性斯普拉格戴利大鼠中，通过向其补充高脂饮食四周来诱导肥胖。对照组(G1)喂正常食物。四周诱导期后，将肥胖大鼠随机分为G2至G4各组，每组7只动物，属于治疗组的动物每天口服补充100mg/kg(G3)或300mg/kg(G4)的身体重量的组合物-67或每10毫升含0.5％CMC水中的西布曲明(G5)10mg，持续4周。动物的对照组(G2)仅接受媒介物(10mL的含0.5％CMC的水)。每周记录单个动物的体重，并确定每组中动物的平均体重。与开始时的体重相比，在开始治疗后的第一周，第二周，第三周和第四周结束时计算体重增加变化。与HFD对照组(G2)相比，组合物-67在高脂饮食诱导的肥胖大鼠中显著且剂量依赖性地抑制了体重增加。在治疗期结束时，在分别补充100mg/kg和300mg/Kg体重的组合物-67的治疗组中，体重增加减少了99.5％和109.1％。然而，在300mg/Kg剂量组中，经过二周的治疗，该作用开始显示出显著性。图IA和IB总结了治疗组和对照组的体重和最终体重变化百分比的结果。这些结果清楚地表明，组合物-67具有有效的抗肥胖作用。
另外，补充了组合物-67的G3和G4组大鼠的每日平均食物摄入显著降低。食物消耗数据以每日饮食卡路里摄入量(KJ/日)表示在图II中。总之，这些观察结果表明，口服补充组合物-67可以显著降低体重增加并有助于维持HFD大鼠的健康体重。并且还限制了大鼠的饮食卡路里消耗。
在研究结束时实施安乐死后，从大鼠收集内脏(腹膜后疝，附睾，肾周和肠系膜)脂肪组织并称重。与喂食HFD的大鼠相比，添加了67-组合物的组的总脂肪重量显著降低，并且添加了300mg 67-组合物(G4)的组显示出统计学意义(图III)。此外，石蜡包埋的福尔马林固定脂肪组织的显微镜检查显示，与HFD对照组(G2)大鼠相比，补充28天的300mg 67-组合物的G4组的脂肪细胞大小显著减少(图IV)。总而言之，这些观察结果表明，补充组合物-67可以显著降低肥胖大鼠的体脂或身体肥胖。
补充28天后，分析血清样品的循环瘦素水平。如图V所示，与HFD大鼠相比，补充了组合物-67的治疗组的血清瘦素水平显著降低。有趣的是，治疗组中的瘦素水平降低至以食物喂养的对照动物的水平。此数据表明，组合物-67在通过调节饱腹感来调节食物消耗方面具有潜在作用。该观察结果可以解释在研究中补充了67-组合物的大鼠减少饲料消耗量的理论。
此外，一项有趣的观察结果是，与HFD大鼠相比，添加了67-组合物的大鼠表现出改善的T3/T4平衡(图VI)。T3是活性甲状腺激素，由其前体T4通过代谢转化形成。T3是体内能量稳态的主要调节剂；它积极影响身体的基础代谢率或静息能量消耗。此外，T3也是白色至褐色脂肪细胞转化过程的关键因素。在肥胖动物中，T3/T4比值比非肥胖者要低。在我们的实验中，与HFD大鼠相比，添加了67-组合物的大鼠表现出改善的T3/T4比。该观察结果表明草药组合物改善了肥胖大鼠的甲状腺功能。总之，这些观察结果强烈表明，补充67-组合物可诱导褐色脂肪生成，并改善甲状腺功能。总的来说，这些事件通过增加肥胖大鼠的静息能量消耗提供了减少体内脂肪的基础。
对附睾脂肪组织的免疫组织化学研究表明，在补充了67组合物的大鼠中存在UCP-1染色的褐色脂肪细胞(图VII)。用食物喂养(G1)或HFD(G2)的大鼠在附睾脂肪组织中未显示褐色脂肪细胞的存在。因此，本文观察清楚地表明，组合物-67潜在地诱导褐色脂肪的产生。
以上证明了包含选自可可的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第一成分和选自来檬的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第二成分的组合的协同草药组合物，抑制了脂肪生成，加速了脂肪分解，增加FGF21的产生，增加UCP-1的表达，β3-AR增加脂肪的褐变并改善T3/T4的平衡。因此，所述组合物可用于获得选自预防，控制或治疗肥胖和/或超重的至少一种健康益处；改善瘦体重，改善白色脂肪组织(WAT)的褐变，改善棕色脂肪组织(BAT)的形成，增加基础代谢率(BMR)/静息能量消耗，增加产热，改善甲状腺功能，保持健康的体重，增加饱腹感，减轻体重，改善脂肪损失并保持苗条身材。
因此，一个重要的实施方案中，本发明提供了一种协同草药组合物，其包含选自可可的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第一成分和选自来檬的提取物，级分，植物化学物质及其混合物的第二成分的组合。用于从预防，控制或治疗肥胖和/或超重中获得至少一种健康益处；改善瘦体重，改善白色脂肪组织(WAT)的褐)，改善棕色脂肪组织(BAT)的形成，增加基础代谢率(BMR)/静息能量消耗，增加产热，改善甲状腺功能，保持健康的体重，增加体重饱腹感，减轻体重，改善脂肪损失和保持苗条的身材。
在另一个实施方案中，本发明提供了协同草药组合物，其包含选自可可的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第一成分和选自来檬的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第二成分的组合；其中所述第一成分在所述组合物中的浓度在10重量％至90重量％的范围内变化，并且所述第二成分的浓度在90重量％-10重量％的范围内变化。
在其他示例性实施方案中，本发明提供了协同草药组合物，其包含选自可可的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第一成分和选自来檬的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第二成分的组合并含有任选地至少一种选自药学上或营养学上或饮食上可接受的赋形剂，载体和稀释剂的组分。
在另一个实施方案中，本发明提供了协同草药组合物，其包含选自可可的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第一成分和选自来檬提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第二成分的组合，以及任选地包含至少一种选自药学上或营养学上或饮食上可接受的赋形剂，载体和稀释剂的组分；获得至少一种选自预防，控制或治疗肥胖和/或超重的健康益处；改善瘦体重，改善白色脂肪组织(WAT)的褐变，改善棕色脂肪组织(BAT)的形成，增加基础代谢率(BMR)/静息能量消耗，增加产热，改善甲状腺功能，保持健康的体重，增加体重饱腹感，减轻体重，改善脂肪损失和保持苗条的身材；其中药学上或营养学上或饮食上可接受的赋形剂，载体和稀释剂选自单糖，例如葡萄糖，右旋糖，果糖，半乳糖等；二糖，例如但不限于蔗糖，麦芽糖，乳糖，乳果糖，海藻糖纤维二糖，壳二糖等；碳水化合物，例如淀粉和改性淀粉，如羟乙酸淀粉钠，预糊化淀粉，可溶性淀粉和其他改性淀粉；由淀粉或糖原水解产生的糊精，例如黄色糊精，白色糊精，麦芽糊精等；多元醇或糖醇，例如但不限于山梨糖醇，甘露糖醇，肌醇，木糖醇，异麦芽酮糖醇等；纤维素基衍生物，例如但不限于微晶纤维素，羟丙基甲基纤维素，羟乙基纤维素等；硅酸盐，例如但不限于硅酸铝镁，铝硅酸镁盐，滑石粉，胶体二氧化硅等；金属硬脂酸盐，例如但不限于硬脂酸钙，硬脂酸镁，硬脂酸锌等；柠檬酸，酒石酸，苹果酸，琥珀酸，乳酸，L-抗坏血酸等有机酸；脂肪酸酯和聚山梨酯的酯类，天然树胶，例如但不限于阿拉伯胶，角叉菜胶，瓜尔胶，黄原胶等；维生素B组，烟酰胺，泛酸钙，氨基酸，蛋白质，例如但不限于酪蛋白，明胶，果胶，琼脂；有机金属盐，例如但不限于氯化钠，氯化钙，磷酸二钙，硫酸锌，氯化锌等；天然色素，调味剂，I级和II级防腐剂以及单独或组合使用上述成分的水性，醇性，水醇，有机溶液。
在另一个实施方案中，本发明提供了协同草药组合物，其包含选自可可的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第一成分和选自来檬的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第二成分的组合，其中所述提取物或馏分得自以下的至少一种植物部分：叶，茎，嫩茎，嫩枝，地上部分，全果，果皮，种子，头花，根，树皮，硬木或整棵植物或其混合物。
在另一个实施方案中，本发明提供了协同草药组合物，其包含选自可可的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第一成分和选自来檬的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第二成分的组合，其中提取物或馏分是使用至少一种选自C1-C5醇如乙醇，甲醇，正丙醇，异丙醇；酮类，如丙酮，甲基异丁基酮；氯化溶剂，如二氯甲烷和氯仿；水及其混合物；C1-C7烃，例如己烷；如乙酸乙酯的酯类等及其混合物的溶剂制造的。
在另一个实施方案中，本发明提供了协同草药组合物，其包含选自可可的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第一成分和选自来檬的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第二成分的组合，其中将提取物或馏分标准化为提取物或馏分中的至少一种植物化学参考标记化合物或生物活性标记；其中植物化学标记化合物或植物化学化合物组的浓度范围为提取物重量的0.1％至99％。
在另一个实施方案中，本发明提供了协同草药组合物，其包含选自可可的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第一成分和选自来檬的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第二成分的组合；其中可可的提取物或馏分，植物化学物质被标准化为可可碱；其中可可碱的浓度为组合物重量的0.1％至20％。
在另一个实施方案中，本发明提供了协同草药组合物，其包含选自可可的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第一成分和选自来檬的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第二成分的组合；其中来檬的提取物或馏分被标准化为柠檬苦素；其中柠檬苦素的浓度范围为组合物重量的0.1％至10％。
在另一个实施方案中，本发明提供了协同草药组合物，其包含选自可可的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第一成分和选自来檬提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第二成分的组合；其中将组合物配制成选自干粉形式，液体形式，饮料，食品，膳食补充剂或任何合适形式的剂型，例如片剂，胶囊剂，软咀嚼或软糖熊。
在本发明的另一个实施方案中，可以将上述公开的组合物配制成营养/膳食补充剂，可以考虑将其制成健康食品或用于特定健康用途的食品的剂型如巧克力或营养棒的固体食品，如奶油，果酱，凝胶或饮料的半固体食品；例如清凉饮料，乳酸菌饮料，滴剂，糖果，口香糖，软糖，酸奶，冰淇淋，布丁，软红豆冻，果冻，饼干，茶，软饮料，果汁，牛奶，咖啡，谷物，快餐小吃等。
在另一个实施方案中，本发明提供了预防，控制或治疗肥胖和/或超重的方法；改善瘦体重，改善白色脂肪组织(WAT)的褐变，改善褐色脂肪组织(BAT)的形成，增加基础代谢率(BMR)/静息能量消耗，增加产热，改善甲状腺功能，保持健康的体重，增加体重饱食感，减轻体重，改善脂肪损失和保持苗条身材，其中该方法包括向受试者补充合适剂量的协同草药组合物，该组合物包括选自可可的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第一成分和选自来檬的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第二成分的组合；并且任选地包含至少一种选自药学上可接受的赋形剂，稀释剂和载体的附加成分。
在另一个实施方案中，本发明提供了预防，控制或治疗肥胖和/或超重的方法。改善瘦体重，改善白色脂肪组织(WAT)的褐变，改善褐色脂肪组织(BAT)的形成，增加基础代谢率(BMR)/静息能量消耗，增加产热，改善甲状腺功能，保持健康的体重，增加体重饱食感，减轻体重，改善脂肪减少和保持苗条身材，其中该方法包括向受试者补充合适剂量的协同草药组合物，该组合物包括选自可可的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第一成分和选自来檬的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第二成分的组合；以及任选地包含至少一种选自药学上可接受的赋形剂，稀释剂和载体的附加成分；其中，所述肥胖症治疗包括促进脂肪分解，抑制脂肪生成，脂质积聚，成纤维细胞生长因子21(FGF-21)的增加，解偶联蛋白(UCP-1)的增加和β3-肾上腺素能受体(β3-ARs)的增加中的至少一种。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种协同草药组合物的用途，所述组合物包含选自可可的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第一成分和选自衍生自来檬的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第二成分的组合。任选地包含至少一种选自药学上可接受的赋形剂，稀释剂和载体的附加成分，以获得至少一种选自预防，控制或治疗肥胖和/或超重的健康益处；改善瘦体重，改善白色脂肪组织(WAT)的褐变，改善褐色脂肪组织(BAT)的形成，增加基础代谢率(BMR)/静息能量消耗，增加产热，改善甲状腺功能，保持健康的体重，增加饱腹感，减轻体重，改善脂肪损失并保持苗条身材。
在另一个实施方案中，本发明提供了预防，控制或治疗肥胖和/或超重的方法；改善瘦体重，改善白色脂肪组织(WAT)的褐变/改善褐色脂肪组织(BAT)的形成，增加基础代谢率(BMR)/静息能量消耗，增加产热，改善甲状腺功能，保持健康的体重，增加饱腹感，支持体重减轻，改善脂肪损失和保持苗条身材，其中该方法包括向受试者补充合适剂量的协同草药组合物，该组合物包括选自源自可可的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第一成分和选自源自来檬的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第二成分的组合；以及任选地包含至少一种选自药学上可接受的赋形剂，稀释剂和载体的附加成分；其中以合适的剂量补充受试者的形式为控释片剂或通过基于纳米技术，微囊化，胶体载体系统和其他药物递送系统的技术来使用受控释放聚合物基涂层以获得期望的治疗益处。
本领域普通技术人员将理解，可以在不脱离本发明的广泛发明构思的情况下对上述实施例进行改变。因此，应当理解，本发明不限于在此公开的特定实施例或示例，而是旨在覆盖在说明书中所限定的本发明的目的和范围内的修改。给出的实施例说明了本发明，但不应认为它们以任何方式限制本发明的范围。
示例1：可可种子的水提取物制备
将可可干燥种子(100g)粉碎，并将粉末原料在实验室提取器中于室温(rt)下用水(700mL)提取1h。过滤提取物，并在相似条件下用水(2×500mL)将用过的原料再次提取两次。过滤合并的提取物，并在真空下浓缩，得到水提取物的残余物，为粉末(T.C-1；14g)。
示例2：可可种子的乙醇和50％乙醇水溶液提取物制备
将可可干燥种子(100g)粉碎，并将粉末原料在实验室提取器中用50％乙醇水溶液(700mL)在室温下提取1小时。过滤提取物，用过的原料在相似条件下用50％乙醇水溶液(2×500mL)再提取两次。过滤合并的提取物，真空浓缩，得到乙醇提取物残余物(T.C-2；11g)。
可可种子(100g)的乙醇提取物(T.C-3；4.4g)是通过使用乙醇作为提取溶剂，采用与上述相同的方法得到的。
示例3：可可种子的50％甲醇水溶液提取物制备
将可可干燥种子(100g)粉碎，并将粉末原料在实验室提取器中用50％甲醇水溶液(700mL)在室温下提取1h。过滤提取物，用过的原料在相似条件下用50％甲醇(2×500mL)再提取两次。将合并的提取物过滤并在真空下浓缩以获得50％甲醇水溶液提取物的残余物(T.C-4；10g)。
示例4：可可种子正丁醇提取物的制备
将可可干燥种子(100g)粉碎，并将粉末原料在实验室提取器中用正丁醇(700mL)在室温下提取1h。过滤提取物，并在相似条件下用正丁醇(2×500mL)再次提取用过的原料。将合并的提取液过滤并真空浓缩，得到正丁醇提取液的残余物(T.C-5；24.5g)。
示例5：可可种子提取物的标准化
通过分析型HPLC方法将可可种子的各种提取物标准化为可可碱，结果总结于表1。
表1：
Figure BDA0002760600750000231
Figure BDA0002760600750000241
示例6：来檬果皮50％乙醇水溶液和乙醇提取物的制备
将来檬干果皮原料(100g)粉碎成粉末，并在实验室提取器中于室温下用1：1的乙醇/水(700mL)提取1h。过滤提取物，并在相似的提取条件下用1：1的乙醇/水(2×500mL)将用过的原料再次提取两次。将合并的提取物过滤并真空浓缩，得到50％乙醇水溶液的残余物，为褐色粉末(C.A-1；21g)；紫外可见总黄酮：9.92％。
使用乙醇作为提取溶剂，通过类似的步骤获得乙醇提取物(C.A-2；9.5g)。
类似地，对来檬干燥的整个果实原料(100g)进行上述类似的提取步骤，以获得褐色粉末状的50％乙醇水溶液提取物(15g)。
示例7：来檬果皮水提取物的制备
将来檬干果皮(100g)粉碎，并将粉末原料在实验室萃取器中于室温下用水(700mL)萃取1h。过滤提取物，并在相似的提取条件下，用水(2×500mL)将用过的原料再次提取两次。过滤合并的提取物，并在真空下浓缩，得到水提取物残余物，为褐色粉末(C.A-3；21g)。
示例8：来檬果皮50％甲醇水溶液提取物的制备
将来檬干果皮(100g)粉碎，并将粉末原料在实验室提取器中用50％甲醇水溶液(700mL)在室温下提取1小时。过滤提取液，用过的原料在相似条件下用50％甲醇水溶液(2×500mL)再提取两次。将合并的提取物过滤并真空浓缩，得到褐色粉末的50％甲醇水溶液的残余物(C.A-4；30g)。
示例9：来檬果皮丁醇提取物的制备
将来檬干果皮(100g)粉碎，并将粉末原料在实验室萃取器中用正丁醇(700mL)在室温下提取1小时。过滤提取液，并在相似条件下用正丁醇(2×500mL)再次提取用过的原料两次。将合并的提取物过滤并真空浓缩，得到丁醇提取物残余物，为褐色粉末(C.A-5；7g)。
示例10：来檬提取物的标准化
通过分析型HPLC方法将来檬的各种提取物标准化为柠檬苦素，结果总结于表2中。
表2：
Figure BDA0002760600750000251
示例11：可可水提取物(T.C-1)和来檬提取物(C.A-1至C.A-5)的组合物的制备
组合物-1(C-1)：通过将可可水提取物(T.C-1)和来檬50％乙醇水溶液提取物(C.A-1)以1：3的比例组合来制备组合物-1。
组合物2(C-2)：通过将可可水提取物(T.C-1)和来檬50％乙醇水溶液提取物(C.A-1)以1∶2的比例混合来制备组合物-2。
组合物-3(C-3)：通过将可可水提取物(T.C-1)和来檬50％乙醇水溶液提取物(C.A-1)以1：1的比例混合来制备组合物-3。
组合物4(C-4)：通过将可可水提取物(T.C-1)和来檬50％乙醇水溶液提取物(C.A-1)以2∶1的比例混合来制备组合物-4。
组合物-5(C-5)：通过将可可水提取物(T.C-1)和来檬50％乙醇水溶液提取物(C.A-1)以3∶1的比例混合来制备组合物-5。
组合物-6(C-6)：通过将可可水提取物(T.C-1)和来檬乙醇提取物(C.A-2)以1：2的比例组合来制备组合物-6。
组合物7(C-7)：通过将可可水提取物(T.C-1)和来檬乙醇提取物(C.A-2)以1：1的比例混合来制备组合物-7。
组合物8(C-8)：通过将可可水提取物(T.C-1)和来檬乙醇提取物(C.A-2)以2∶1的比例混合来制备组合物-8。
组合物9(C-9)：通过将可可水提取物(T.C-1)和来檬水提取物(C.A-3)以1：3的比例混合来制备组合物-9。
组合物-10(C-10)：通过将可可水提取物(T.C-1)和来檬水提取物(C.A-3)以1：2的比例混合来制备组合物-10。
组合物-11(C-11)：通过将可可水提取物(T.C-1)和来檬水提取物(C.A-3)以1∶1的比例混合来制备组合物-11。
组合物-12(C-12)：通过将可可水提取物(T.C-1)和来檬水提取物(C.A-3)以2∶1的比例混合来制备组合物-12。
组合物-13(C-13)：通过将可可水提取物(T.C-1)和来檬水提取物(C.A-3)以3∶1的比例混合来制备组合物-13。
组合物-14(C-14)：通过将可可水提取物(T.C-1)和来檬50％甲醇水溶液提取物(C.A-4)以1：2的比例混合来制备组合物-14。
组合物-15(C-15)：通过将可可水提取物(T.C-1)和来檬50％甲醇水溶液提取物(C.A-4)以1∶1的比例混合来制备组合物-15。
组合物-16(C-16)：通过将可可水提取物(T.C-1)和来檬50％甲醇水溶液提取物(C.A-4)以2∶1的比例混合来制备组合物-16。
组合物-17(C-17)：通过将可可水提取物(T.C-1)和来檬丁醇提取物(C.A-5)以1：2的比例组合来制备组合物-17。
组合物-18(C-18)：通过将可可水提取物(T.C-1)和来檬丁醇提取物(C.A-5)以1∶1的比例组合来制备组合物-18。
组合物-19(C-19)：通过将可可水提取物(T.C-1)和来檬丁醇提取物(C.A-5)以2∶1的比例组合来制备组合物-19。
示例12：制备可可50％乙醇水溶液提取物(T.C-2)和来檬提取物(C.A-1至C.A-5)的组合物
组合物-20(C-20)：通过将可可50％乙醇水溶液提取物(T.C-2)和来檬50％乙醇水溶液提取物(C.A-1)以1∶3的比例混合来制备组合物-20。
组合物-21(C-21)：通过将可可50％乙醇水溶液提取物(T.C-2)和来檬50％乙醇水溶液提取物(C.A-1)以1∶2的比例混合来制备组合物-21。
组合物22(C-22)：通过将可可50％乙醇水溶液提取物(T.C-2)和来檬50％乙醇水溶液提取物(C.A-1)以1∶1的比例混合来制备组合物-22。
组合物-23(C-23)：通过将可可50％乙醇水溶液提取物(T.C-2)和来檬50％乙醇水溶液提取物(C.A-1)以2∶1的比例混合来制备组合物-23。
组合物-24(C-24)：通过将可可50％乙醇水溶液提取物(T.C-2)和来檬50％乙醇水溶液提取物(C.A-1)以3∶1的比例混合来制备组合物-24。
组合物-25(C-25)：通过将可可50％乙醇水溶液提取物(T.C-2)和来檬乙醇提取物(C.A-2)以1：2的比例混合来制备组合物-25。
组合物26(C-26)：通过将可可50％乙醇水溶液提取物(T.C-2)和来檬乙醇提取物(C.A-2)以1：1的比例混合来制备组合物-26。
组合物27(C-27)：通过将可可50％乙醇水溶液提取物(T.C-2)和来檬乙醇提取物(C.A-2)以2∶1的比例混合来制备组合物-27。
组合物28(C-28)：通过将可可50％乙醇水溶液提取物(T.C-2)和来檬水提取物(C.A-3)以1∶3的比例混合来制备组合物-28。
组合物-29(C-29)：通过将可可50％乙醇水溶液提取物(T.C-2)和来檬水提取物(C.A-3)以1∶2的比例混合来制备组合物-29。
组合物-30(C-30)：通过将可可50％乙醇水溶液提取物(T.C-2)和来檬水提取物(C.A-3)以1∶1的比例混合来制备组合物-30。
组合物31(C-31)：通过将可可50％乙醇水溶液提取物(T.C-2)和来檬水提取物(C.A-3)以2∶1的比例混合来制备组合物-31。
组合物32(C-32)：通过将可可50％乙醇水溶液提取物(T.C-2)和来檬水提取物(C.A-3)以3∶1的比例混合来制备组合物-32。
组合物-33(C-33)：通过将可可50％乙醇水溶液提取物(T.C-2)和来檬50％甲醇水溶液提取物(C.A-4)以1∶2的比例混合来制备组合物-33。
组合物-34(C-34)：通过将可可50％乙醇水溶液提取物(T.C-2)和来檬50％甲醇水溶液提取物(C.A-4)以1∶1的比例混合来制备组合物-34。
组合物-35(C-35)：通过将可可50％乙醇水溶液提取物(T.C-2)和来檬50％甲醇水溶液提取物(C.A-4)以2∶1的比例混合来制备组合物-35。
组合物-36(C-36)：通过将可可50％的乙醇水溶液提取物(T.C-2)和来檬丁醇提取物(C.A-5)以1∶2的比例混合来制备组合物-36。
组合物-37(C-37)：通过将可可50％乙醇水溶液提取物(T.C-2)和来檬丁醇提取物(C.A-5)以1∶1的比例混合来制备组合物-37。
组合物-38(C-38)：通过将可可50％乙醇水溶液提取物(T.C-2)和来檬丁醇提取物(C.A-5)以2∶1的比例混合来制备组合物-38。
示例13：可可提取物(T.C-3，T.C-4和T.C-5)和来檬提取物(C.A-1至C.A-5)的组合物的制备
组合物-39(C-39)：通过以1：2的比例混合可可乙醇提取物(T.C-3)和来檬50％乙醇水溶液提取物(C.A-1)来制备组合物-39。
组合物-40(C-40)：通过以1∶1的比例混合可可乙醇提取物(T.C-3)和来檬50％乙醇水溶液提取物(C.A-1)来制备组合物-40。
组合物-41(C-41)：通过以2：1的比例混合可可乙醇提取物(T.C-3)和来檬50％乙醇水溶液提取物(C.A-1)来制备组合物-41。
组合物-42(C-42)：通过以1∶2的比例混合可可乙醇提取物(T.C-3)和来檬乙醇提取物(C.A-2)来制备组合物-42。
组合物-43(C-43)：通过以1∶1的比例混合可可乙醇提取物(T.C-3)和来檬乙醇提取物(C.A-2)来制备组合物-43。
组合物-44(C-44)：通过以2∶1的比例混合可可乙醇提取物(T.C-3)和来檬乙醇提取物(C.A-2)来制备组合物-44。
组合物-45(C-45)：通过以1：2的比例组合可可乙醇提取物(T.C-3)和来檬水提取物(C.A-3)来制备组合物-45。
组合物-46(C-46)：组合物-46是通过将可可乙醇提取物(T.C-3)和来檬水提取物(C.A-3)以1：1的比例混合而制备的。
组合物-47(C-47)：通过以2∶1的比例混合可可乙醇提取物(T.C-3)和来檬水提取物(C.A-3)来制备组合物-47。
组合物-48(C-48)：通过以1：2的比例混合可可乙醇提取物(T.C-3)和来檬50％甲醇水溶液提取物(C.A-4)来制备组合物-48。
组合物-49(C-49)：通过将可可乙醇提取物(T.C-3)和来檬50％甲醇水溶液提取物(C.A-4)以1：1的比例混合来制备组合物-49。
组合物-50(C-50)：通过以2∶1的比例混合可可乙醇提取物(T.C-3)和来檬50％甲醇水溶液提取物(C.A-4)来制备组合物-50。
组合物-51(C-51)：通过以1：2的比例混合可可乙醇提取物(T.C-3)和来檬丁醇提取物(C.A-5)来制备组合物-51。
组合物52(C-52)：通过以1∶1的比例混合可可乙醇提取物(T.C-3)和来檬丁醇提取物(C.A-5)来制备组合物-52。
组合物53(C-53)：通过以2∶1的比例混合可可乙醇提取物(T.C-3)和来檬丁醇提取物(C.A-5)来制备组合物-53。
组合物-54(C-54)：通过以1∶2的比例混合可可50％甲醇提取物(T.C-4)和来檬水提取物(C.A-3)来制备组合物-54。
组合物55(C-55)：通过将可可50％甲醇提取物(T.C-4)和来檬水提取物(C.A-3)以1：1的比例混合来制备组合物-55。
组合物56(C-56)：通过将可可50％甲醇提取物(T.C-4)和来檬水提取物(C.A-3)以2∶1的比例混合来制备组合物-56。
组合物57(C-57)：通过以1∶2的比例混合可可50％甲醇提取物(T.C-4)和来檬50％乙醇提取物(C.A-1)来制备组合物-57。
组合物58(C-58)：通过将可可50％甲醇提取物(T.C-4)和来檬50％乙醇提取物(C.A-1)以1：1的比例混合来制备组合物-58。
组合物59(C-59)：通过以2∶1的比例混合可可50％甲醇提取物(T.C-4)和来檬50％乙醇提取物(C.A-1)而制备组合物-59。
组合物-60(C-60)：通过以1：2的比例混合可可丁醇提取物(T.C-5)和来檬水提取物(C.A-3)制备组合物-60。
组合物61(C-61)：通过以1：1的比例混合可可丁醇提取物(T.C-5)和来檬水提取物(C.A-3)来制备组合物-61。
组合物-62(C-62)：通过以2∶1的比例组合可可丁醇提取物(T.C-5)和来檬水提取物(C.A-3)来制备组合物-62。
组合物-63(C-63)：通过以1：2的比例混合可可丁醇提取物(T.C-5)和来檬50％乙醇提取物(C.A-1)来制备组合物-63。
组合物-64(C-64)：通过将可可丁醇提取物(T.C-5)和来檬50％乙醇提取物(C.A-1)以1：1的比例混合来制备组合物-64。
组合物-65(C-65)：通过以2∶1的比例混合可可丁醇提取物(T.C-5)和来檬50％乙醇提取物(C.A-1)来制备组合物-65。
示例14：组合物的配方
组合物-66(C-66)：组合物-66是通过将60g可可水提取物(T.C-1)，30g来檬50％乙醇水溶液提取物(C.A-1)，9g麦芽糖糊精和1克二氧化硅混合而制备的。
组合物-67(C-67)：通过混合53.33g可可水提取物(T.C-1)，26.67g来檬50％乙醇水溶液提取物(C.A-1)，18g麦芽糖糊精和2g在乙醇/水存在下的二氧化硅来制备组合物-67，干燥，得到组合物-67。
组合物-68(C-68)：通过将53.2g可可水提取物(T.C-1)，26.6g来檬50％乙醇水溶液提取物(C.A-1)，18.2g麦芽糊精-12D和2g在乙醇/水存在下的二氧化硅混合干燥，得到组合物-68。
示例15：脂肪生成抑制测定的一般程序
将小鼠3T3-L1前脂肪细胞(500μL中的50000细胞/孔)接种到48孔细胞培养板中，并在5％CO2的潮湿气氛中，于37℃保存在含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中。细胞融合后(约2天)，在含有10％FBS的DMEM培养基的包含0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)，1μM地塞米松和500nM胰岛素的分化培养基(DM)中，用不同浓度的测试样品处理细胞，持续48小时。将细胞培养基改为DMEM中含有100nM胰岛素的DM后培养基，且具有10％胎牛血清和各浓度检测样品，每48小时更换新鲜DM后培养基和各浓度检测样品，直到第6天。分化开始8天后对细胞进行油红O染色。
油红O染色：吸出培养基，并向每个孔中加入0.5mL的10％甲醛，并在室温下孵育2小时。从孔中除去甲醛，并加入0.25mL的60％异丙醇，并使培养板完全干燥。加入一百微升的红油O，并在黑暗中于室温下孵育20分钟。抽吸红油O，并将培养板用蒸馏水洗涤4次。将培养板完全干燥，并加入150μL的100％异丙醇，充分混合，然后将75μL转移至96孔测定板中，并在酶标仪5e读板器中于550nm下测量吸光度。使用以下公式计算脂肪生成抑制百分比：
Figure BDA0002760600750000321
通过上述步骤，筛选了所有组合物的脂肪生成抑制作用，结果列于表3、4和5。
表3：含有可可提取物(T.C-1)和来檬提取物(C.A-1至C.A-5)的组合物的脂肪生成活性。
Figure BDA0002760600750000322
Figure BDA0002760600750000331
表4：含有可可提取物(T.C-2)和来檬提取物(C.A-1至C.A-4)的组合物的脂肪生成活性。
Figure BDA0002760600750000332
表5：含有可可提取物(T.C-3，T.C-4，T.C-5)和来檬提取物(C.A-1至C.A-5)的组合物的脂肪生成活性。
Figure BDA0002760600750000341
示例16：脂肪分解增长的测定的一般程序
将小鼠3T3-L1前脂肪细胞(500μL中的50000细胞/孔)接种到48孔细胞培养板中，并在5％CO2的潮湿气氛中，于37℃保持在含有10％FBS的DMEM中。细胞融合后(约2天)，使用含有10％FBS的DMEM中的包含0.5mM IBMX，1μM地塞米松和500nM胰岛素的分化培养基(DM)进行分化48小时。将细胞培养基改为10％FBS的DMEM中含有100nM胰岛素的DM后培养基，每48小时更换新鲜DM后培养基，直到第6天。在第7天，从孔中吸出培养基，并用600μL的无酚红DMEM洗涤。在含有2％BSA(50μL)的无酚红DMEM培养基中，用不同浓度的测试样品(50μL)处理细胞，并在CO2培养箱中于37℃孵育4小时。孵育后，将25μL无细胞上清液从孔中收集到96孔测定板中，并进行甘油测定。
甘油测定：将25微升标准品或样品添加到100μL甘油试剂中[ATP：20.65mg，MgCl2：46.20mg，N-乙基-N-(3-磺丙基)-间-安西丁钠盐：31.10mg，氨基安替比尔：1.90mg，甘油激酶：10.2μL，甘油氧化酶：125μL，HRP：62.5μL溶于50mL 1XPBS中]，于96孔测定板中，并在室温下孵育15分钟。在酶标仪5e读板器中于550nm处测量吸光度。在0.781-50μg/mL范围内生成了7-点甘油标准曲线。使用以下公式估算脂肪分解的百分比增加：
Figure BDA0002760600750000351
通过上述步骤，筛选了所有组合物的脂肪分解增加，结果列于表6和7。
表6：含有可可提取物(T.C-1)和来檬提取物(C.A-1至C.A-4)的组合物的脂肪分解活性。
Figure BDA0002760600750000352
Figure BDA0002760600750000361
表7：含有可可提取物(T.C-2和T.C-3)和来檬提取物(C.A-1和C.A-5)的组合物的脂肪分解活性。
Figure BDA0002760600750000362
Figure BDA0002760600750000371
示例17：FGF21测定的一般程序
将小鼠3T3-L1前脂肪细胞(3mL中的150000细胞/孔)接种到6孔细胞培养板中，并在5％CO2湿润气氛下于37℃下保持在含有10％FBS和4.5g/L葡萄糖的DMEM培养基中。细胞融合后(约2天)，使用10％FBS的DMEM中包含0.5mM IBMX，1μM地塞米松和500nM胰岛素的分化培养基(DM)进行分化48小时。将细胞培养基改为10％FBS的DMEM中含有100nM胰岛素的DM后培养基，每48小时更换新鲜DM后培养基，直到第6天。在第7天，从孔中吸出培养基，并用含1％FBS的DMEM培养基洗涤两次。在含有1％FBS(总体积为1mL)的DMEM培养基中，用不同浓度的测试样品(50μL)处理细胞，并在CO2培养箱中于37℃孵育48小时。孵育后，从孔中收集50μL无细胞上清液，并通过ELISA进行FGF21分析。根据制造商的规程进行FGF21 ELISA(R&DSystems目录号DY2539)。
使用以下公式计算FGF21的增加百分比：
Figure BDA0002760600750000372
通过上述步骤，对所选择的组合物进行了筛选，以使它们的FGF-21增加含量超过对照组，结果总结于表8中。
表8：含有可可提取物和来檬提取物的组合物的FGF 21活性。
Figure BDA0002760600750000373
Figure BDA0002760600750000381
示例18：UCP-1测定的通用程序
将小鼠3T3-L1前脂肪细胞(3mL中的150000细胞/孔)接种到6孔细胞培养板中，并在5％CO2湿润气氛下于37℃下保持在含有10％FBS和4.5g/L葡萄糖的DMEM培养基中。细胞融合后(约2天)，使用含有10％FBS的DMEM中的包含0.5mM IBMX，1μM地塞米松和500nM胰岛素的分化培养基(DM)进行分化48小时。在10％胎牛血清(FBS)的DMEM中，将细胞培养基改为含有100nM胰岛素的DM后培养基，每48小时更换新鲜DM后培养基，直到第6天。在第7天，从孔中吸出培养基，并用含1％FBS的DMEM培养基洗涤两次。在含有1％FBS的DMEM培养基(总体积为1mL)中，用不同浓度的测试样品(50μL)处理细胞，并在CO2培养箱中于37℃孵育48小时。
免疫印迹：
孵育后，将细胞培养板置于冰盘上，并用1XPBS洗涤两次。向每个孔中加入80μL裂解缓冲液(10mM Tris-HCl pH 7.4、150mM NaCl，1mM EDTA，1mM苯甲基磺酰氟，10μg/mL抑肽酶，10μg/mL亮肽素，1％Triton X-100(曲拉通X-100)、1mM NaF，1mM Na3VO4，0.5％脱氧胆酸钠和1μM抑肽素)，并将细胞裂解液收集在各自的微量离心管中。将微量离心管超声处理1分钟。在21952xg离心后收集细胞蛋白。使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒(Thermo ScientificCat#23225)定量蛋白质。对蛋白质样品进行SDS-PAGE，并使用湿印迹法将分解的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。简而言之，将10μg的蛋白质上样至丙烯酰胺凝胶(10％分解)并在100V下运行约1小时40分钟。在运行结束时，在4℃腔室内(100V，2小时)通过转移系统将蛋白质转移至硝酸纤维素膜。转移后，使用抗UCP-1抗体(Thermo Scientific Cat#PA1-24894；1：10000稀释)在4℃下孵育18小时，以探测UCP-1。使用抗β-肌动蛋白抗体(SigmaCat#A4700-100uL；1：10000稀释)在室温下孵育2小时，以探测β-肌动蛋白。加入过氧化物酶亲和纯小鼠抗山羊二抗(Jackson Immuno Research Cat#205-035-108；1：10000稀释)，并在室温下孵育30分钟。最后，使用化学发光底物(Thermo Scientific Cat#34080)显影印迹，并使用Bio-Rad分子成像仪(型号：ChemiDOC XRS+)捕获图像。使用Carestream MI软件计算UCP-1蛋白条带的强度，并使用β-肌动蛋白对其进行归一化以获得相对指数。使用以下公式计算超出对照组的UCP-1表达百分比：
Figure BDA0002760600750000391
通过上述程序，筛选了所选组合物相对于对照组的％UCP-1表达，结果列于表9。
表9：可可提取物和来檬提取物的组合物的UCP-1表达。
Figure BDA0002760600750000401
示例19：β3AR测定的一般程序
将小鼠3T3-L1前脂肪细胞(3mL中的150000细胞/孔)接种到6孔细胞培养板中，并在5％CO2湿润气氛下于37℃保持在含有10％FBS和4.5g/L葡萄糖的DMEM培养基中。细胞融合后(约2天)，使用含有10％FBS的DMEM中的包含0.5mM IBMX，1μM地塞米松和500nM胰岛素的分化培养基(DM)进行分化48小时。在10％胎牛血清(FBS)的DMEM中，将细胞培养基改为含有100nM胰岛素的DM后培养基，每48小时更换新鲜DM后培养基，直到第6天。在第7天，从孔中吸出培养基，并用含1％FBS的DMEM培养基洗涤两次。在含有1％FBS的DMEM培养基(总体积为1mL)中，用不同浓度的测试样品(50μL)处理细胞，并在CO2培养箱中于37℃孵育48小时。
免疫印迹：
孵育后，将细胞培养板置于冰盘上，并用1XPBS洗涤两次。向每个孔中加入80μL裂解缓冲液(10mM Tris-HCl pH 7.4、150mM NaCl，1mM EDTA，1mM苯甲基磺酰氟，10μg/mL抑肽酶，10μg/mL亮肽素，1％Triton X-100(曲拉通X-100)、1mM NaF，1mM Na3VO4，0.5％脱氧胆酸钠和1μM抑肽素)，并将细胞裂解液收集在各自的微量离心管中。将微量离心管超声处理1分钟。在21952xg离心后收集细胞蛋白。使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒(Thermo ScientificCat#23225)定量蛋白质。对蛋白质样品进行SDS-PAGE，并使用湿印迹法将分解的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。简而言之，将10μg的蛋白质上样至丙烯酰胺凝胶(10％分解)并在100V下运行约1小时40分钟。在运行结束时，在4℃腔室内(100V，2小时)通过转移系统将蛋白质转移至硝酸纤维素膜。转移后，使用抗β3AR抗体(Biorbyt Cat#orb221343；1：500稀释)在4℃下孵育18小时，以探测β3AR。使用抗β-肌动蛋白抗体(Sigma Cat#A4700-100uL；1：10000稀释)在室温下孵育2小时，以探测β-肌动蛋白。加入过氧化物酶亲和纯小鼠抗山羊二抗(Jackson Immuno Research Cat#205-035-108；1：10000稀释)，并在室温下孵育30分钟。最后，使用化学发光底物(Thermo Scientific Cat#34080)显影印迹，并使用Bio-Rad分子成像仪(型号：ChemiDOC XRS+)捕获图像。使用Carestream MI软件计算β3AR蛋白条带的强度，并使用β-肌动蛋白对其进行归一化以获得相对指数。
使用以下公式计算超出对照组的β3AR表达百分比：
Figure BDA0002760600750000411
通过上述步骤，筛选了所有组合物相对于对照组的β3AR表达，结果列于表10。
表10：可可和来檬组成的β3AR表达。
Figure BDA0002760600750000412
Figure BDA0002760600750000421
示例20：
含有可可水提取物(T.C-1)和来檬50％乙醇水溶液提取物(C.A-1)，麦芽糊精和二氧化硅的体内抗肥胖活性组合物67的高脂饮食诱导斯普拉格-杜勒大鼠肥胖模型。
诱导：将选定的健康斯普拉格-杜勒大鼠随机分为正常对照组(N＝7)或高脂饮食组(n＝34)。在高脂饮食诱导的肥胖组中的所有动物均在诱导期的前四周通过饲喂高脂饮食来饮食干预使动物实验性肥胖。诱导期结束后，根据体重将肥胖动物随机分为四组(n＝7)。G2-肥胖对照组，G3-组合物-67(100mg/Kg；p.o.)，G4-组合物-67(300mg/Kg；p.o.)和G5-西布曲明(10mg/Kg；p.o.)。
治疗：诱导期4周后，每天给动物口服分配的试验物质或日常媒介物(口服灌胃)，持续4周。向治疗组的动物补充100mg(G3)或300mg/kg(G4)体重的组合物-67(C-67)或10mg/kg体重的10mL含0.5％CMC的水中的西布曲明，持续4周。在此期间，对照组动物仅接受媒介物(10mL含0.5％CMC的水)。在治疗阶段，直到研究结束，为所有动物提供标准的啮齿动物饮食。
评估的参数：在整个研究期间每周记录单个动物的体重，并确定平均体重。与治疗结束时各自的初始体重相比，在治疗阶段每周计算体重增加。结果描述在图IA和IB中。
饮食热量消耗：在研究的治疗阶段，记录了实验大鼠的饲料消耗总量。将28天所消耗的饲料总量平均以估计每日的饲料消耗量(以克为单位)。平均饲料消耗(克)乘以普通饲料(3.43kJ/gram)和高脂饮食(5.15kJ/gram)提供的能量(kJ/gram)。实验组的日平均饮食卡路里消耗量(kJ/day)呈现在图II中。
安乐死后，从大鼠收集内脏(腹膜后疝，附睾，肾周和肠系膜)脂肪组织，并以0.01g灵敏度的电子天平称重(Mettler Toledo,Columbus,OH)。内脏脂肪重量调节的观察结果总结在图III中。
脂肪组织形态：从单个动物收集的附睾脂肪组织固定在10％福尔马林中。将石蜡包埋的组织切成5μm的切片，并按照标准规程处理切片。苏木精-伊红染色的组织切片在显微镜下以20X(Axio Scope A1,Carl Zeiss GmbH,Jena,Germany)观察。估计脂肪细胞的像素大小，并使用每个像素0.1694μm的转换比例来估计每个细胞的面积。脂肪细胞大小数据如图IV所示。
血清生物标记评估：在研究结束时从所有动物中采集血样。从血液样本中分离血清并使用商业ELISA试剂盒(Leptin ELISA试剂盒，EMD Millipore，Billerica，MA；T3和T4ELISA试剂盒，Calbiotech，EL Cajon，CA)分析血清中的瘦素，三碘甲状腺素(T3)和甲状腺素(T4)。按照供应商提供的说明进行测定。图V总结了与对照组相比治疗组的血清瘦素数据。计算了所有动物的甲状腺激素平衡(T3/T4)，结果总结在图VI中。
脂肪细胞免疫组化：根据试剂盒说明书(EMD Millipore，Billerica，MA)，使用DAB染色方法在石蜡包埋的附睾脂肪组织上进行UCP-1的免疫组织化学。使组织切片与UCP-1抗体(Invitrogen,Carlsbad,CA)反应，然后与结合HRP的链霉亲和素反应。最后，与二氨基苯并(DAB)进行了抗体特异性显色反应。使用Axio Observer.Z1显微镜(Carl-Zeiss,Oberkochen,Germany)捕获UCP-1染色的组织切片的图像。UCP-1染色的附睾脂肪组织切片的代表性显微照片如图VII所示。

Claims (16)

1.协同草药组合物，其包含选自可可的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第一成分和选自来檬的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第二成分的组合，以获得至少一种选自预防，控制或治疗肥胖和/或超重的健康益处；改善瘦体重，改善白色脂肪组织(WAT)的褐变，改善棕色脂肪组织(BAT)的形成，增加基础代谢率(BMR)/静息能量消耗，增加产热，改善甲状腺功能，保持健康的体重，增加饱腹感，支持体重减轻，改善脂肪损失以及保持苗条的身材。
2.根据权利要求1所述的协同组合物，其中，在所述提取物或馏分中标准化为所述提取物或馏分中的至少一种植物化学参考标记化合物或生物活性标记；其中植物化学标记化合物或植物化学化合物组的浓度范围为提取物重量的0.1％至99％。
3.根据权利要求2所述的协同组合物，其中，源自可可种子的成分的重量在10％至90％的范围内变化，而源自来檬果皮的成分的重量在90％至10％的范围内变化。
4.根据权利要求3所述的协同组合物，其中，所述可可种子提取物或馏分被标准化为可可碱；其中可可碱的浓度为组合物重量的0.1％至20％。
5.根据权利要求3所述的协同组合物，其中所述来檬果皮提取物或馏分被标准化为柠檬苦素；其中柠檬苦素的浓度范围为组合物重量的0.1％至10％。
6.根据权利要求1所述的协同组合物，其任选地包含至少一种选自药学上或营养学上或饮食上可接受的赋形剂，载体和稀释剂的成分。
7.如权利要求6所述的协同组合物，其中所述药学上或营养学上或饮食上可接受的赋形剂，载体和稀释剂选自单糖，例如葡萄糖，右旋糖，果糖，半乳糖等；二糖，例如但不限于蔗糖，麦芽糖，乳糖，乳果糖，海藻糖纤维二糖，纤维二糖，壳二糖等；碳水化合物，例如淀粉和改性淀粉，如羟乙酸淀粉钠，预糊化淀粉，可溶性淀粉和其他改性淀粉；由淀粉或糖原水解产生的糊精，例如黄色糊精，白色糊精，麦芽糊精，海藻酸盐等；多元醇或糖醇，例如但不限于山梨糖醇，甘露糖醇，肌醇，木糖醇，异麦芽酮糖醇等；纤维素基衍生物，例如但不限于微晶纤维素，羟丙基甲基纤维素，羟乙基纤维素等；硅酸盐，例如但不限于硅酸铝镁，铝硅酸镁盐，滑石粉，胶体二氧化硅等；金属硬脂酸盐，例如但不限于硬脂酸钙，硬脂酸镁，硬脂酸锌等；柠檬酸，酒石酸，苹果酸，琥珀酸，乳酸，L-抗坏血酸等有机酸；脂肪酸酯和聚山梨酯的酯类，天然树胶，例如但不限于阿拉伯胶，角叉菜胶，瓜尔胶，黄原胶等；维生素B组，烟酰胺，泛酸钙，氨基酸，蛋白质，例如但不限于酪蛋白，明胶，果胶，琼脂；有机金属盐，例如但不限于氯化钠，氯化钙，氢氧化钠，氯化钾，氢氧化钾，磷酸二钙，硫酸锌，氯化锌等；天然色素，调味剂，I级和II级防腐剂以及单独或组合使用上述成分的水性，醇性，水醇，有机溶液。
8.根据权利要求1所述的协同组合物，其中所述提取物，馏分或植物化学物质选自至少一种植物部分，所述植物部分选自叶，茎，嫩茎，嫩枝，地上部分，全果皮，果皮，种子，头状花序，根，树皮，硬木或整株植物或其混合物。
9.根据权利要求1所述的协同组合物，其中所述提取物，馏分或植物化学物质是使用至少一种选自包括乙醇，甲醇，正丙醇，异丙醇的C1-C5醇，如丙酮，甲基异丁基酮的酮类，如二氯甲烷和氯仿的氯化溶剂，水，如己烷的C1-C7烃，如乙酸乙酯的酯类等及其混合物的溶剂来制造的。
10.根据权利要求1至9所述的协同组合物，其中将所述组合物配制成选自如片剂，胶囊剂，软咀嚼或软糖熊的干粉形式，液体形式，饮料，水分散性制剂，食品，膳食补充剂或任何合适形式的剂型。
11.根据权利要求1至9所述的协同组合物，其中将所述组合物配制成营养或膳食补充剂，所述营养或膳食补充剂可以考虑或制成健康食品或用于特定健康用途食品的剂型如巧克力或营养棒的固体食品，水分散饮料，如奶油，果酱，凝胶或饮料的半固体食品；例如清凉饮料，乳酸菌饮料，滴剂，糖果，口香糖，软糖，酸奶，冰淇淋，布丁，软红豆冻，果冻，饼干，茶，软饮料，果汁，牛奶，咖啡，谷物，快餐小吃等。
12.根据权利要求1所述的协同组合物，其中所述健康益处选自预防，控制或治疗肥胖和/或超重；改善瘦体重，改善白色脂肪组织(WAT)的褐变，改善褐色脂肪组织(BAT)的形成，增加基础代谢率(BMR)/静息能量消耗，增加产热，改善甲状腺功能，保持健康体重，增加饱腹感，减轻体重，改善脂肪损失和保持苗条的身材，并达到其中的至少之一；促进脂肪分解，抑制脂肪生成，脂质积聚，成纤维细胞生长因子21(FGF-21)的增加，解偶联蛋白(UCP-1)的增加和β3-肾上腺素能受体(β3-ARs)的增加。
13.一种预防，控制或治疗肥胖和/或超重的方法；改善瘦体重，白色脂肪组织(WAT)褐变，改善棕色脂肪组织(BAT)的形成，增加基础代谢率(BMR)/静息能量消耗，增加产热，改善甲状腺功能，保持健康的体重，增加饱腹感，支持体重减轻，改善脂肪损失和维持人或动物的苗条身材，其中该方法包括向受试者补充合适剂量的协同草药组合物，该组合物包括选自可可的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第一成分和选自来檬的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第二成分的组合；并且任选地包含至少一种选自药学上可接受的赋形剂，稀释剂和载体的附加成分。
14.一种促进脂肪分解，抑制脂肪生成，抑制脂质积聚，增加成纤维细胞生长因子21(FGF-21)，增加人或动物中解偶联蛋白(UCP-1)表达和β3-肾上腺素受体(β3-ARs)的方法，其中该方法包括向人或动物补充合适剂量的协同草药组合物，该组合物包括选自可可的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第一成分和选自来檬的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第二成分的组合；并且任选地包含至少一种选自药学上可接受的赋形剂，稀释剂和载体的附加成分。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中以合适的剂量补充人或动物的形式为片剂，胶囊剂，控释片剂或通过纳米技术，微囊化，胶体载体系统和其他药物递送系统的技术来使用受控释放聚合物基涂层，以获得期望的治疗益处。
16.协同草药组合物的用途，所述组合物包含选自可可的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第一成分和选自衍生自来檬的提取物，馏分，植物化学物质及其混合物的第二成分的组合；任选地包含至少一种选自药学上可接受的赋形剂，稀释剂和载体的附加成分，以获得至少一种选自预防，控制或治疗肥胖和/或超重的健康益处；改善瘦体重，改善白色脂肪组织(WAT)的褐变，改善褐色脂肪组织(BAT)的形成，增加基础代谢率(BMR)/静息能量消耗，增加产热，改善甲状腺功能，保持健康的体重，增加饱腹感，减轻体重，改善脂肪损失并保持苗条身材。
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