BR112020017891A2 - Composições sinérgicas fitoterápicas para tratamento de obesidade e sobrepeso - Google Patents

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Venkata Kanaka Ranga Raju Gokaraju
Rama Raju Gokaraju
Trimurtulu Golakoti
Kiran Bhupathiraju
Venkateswarlu Somepalli
Venkata Krishna Raju Alluri
Krishanu SENGUPTHA
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Abstract

composições sinérgicas fitoterápicas para tratamento de obesidade e sobrepeso. a invenção divulga uma composição sinérgica fitoterápica, compreendendo a combinação de um primeiro ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da theobroma cacao e um segundo ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da citrus aurantifolia para obtenção de, pelo menos, um benefício à saúde selecionado entre prevenção, controle ou tratamento de obesidade e/ou sobrepeso, melhoria da massa corporal magra, melhoria do escurecimento do tecido adiposo branco/melhoria da formação do tecido adiposo marrom, aumento da taxa metabólica basal/gasto de energia em repouso, aumento da termogênese, melhoria da função da tireoide, manutenção do peso corporal saudável, aumento da saciedade, apoio à perda de peso, melhoria da perda de gordura e manutenção de um corpo magro. a invenção divulga, ainda, composições sinérgicas fitoterápicas, compreendendo theobroma cacao e citrus aurantifolia, e opcionalmente compreendendo, pelo menos, um ingrediente selecionado a partir de um excipiente / diluente / transportador farmaceuticamente aceitável e métodos de tratamento e uso para prevenção e tratamento da obesidade/ sobrepeso ou melhoria da massa corporal magra ou gasto de energia em repouso em um ser humano ou animal.

Description

1 / 54 “COMPOSIÇÕES SINÉRGICAS FITOTERÁPICAS PARA TRATAMENTO DE OBESIDADE E SOBREPESO” CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO
[001] A invenção se refere a uma composição sinérgica fitoterápica, compreendendo a combinação de um primeiro ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Theobroma cacao e um segundo ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Citrus aurantifolia e opcionalmente contendo, pelo menos, um ingrediente selecionado a partir de um excipiente, diluente e transportador farmaceuticamente aceitável ou misturas respectivas para obtenção de, pelo menos, um benefício à saúde selecionado entre prevenção, controle ou tratamento da obesidade e/ou sobrepeso, melhoria da massa corporal magra, melhoria do escurecimento do tecido adiposo branco (WAT | white adipose tissue)/melhoria da formação do tecido adiposo marrom (BAT | brown adipose tissue), aumento da taxa metabólica basal (BMR | basal metabolic rate)/gasto de energia em repouso, aumento da termogênese, melhoria da função da tireoide, manutenção do peso corporal saudável, aumento da saciedade, apoio à perda de peso, melhoria da perda de gordura e manutenção de um corpo magro. A invenção também se refere a um método para obtenção de, pelo menos, um benefício à saúde selecionado entre prevenção, controle ou tratamento da obesidade e/ou sobrepeso, melhoria da massa corporal magra, melhoria do escurecimento do tecido adiposo branco (WAT)/melhoria da formação do tecido adiposo marrom (BAT), aumento da taxa metabólica basal (BMR)/gasto de energia em repouso, aumento da termogênese, melhoria da função da tireoide, manutenção do peso corporal saudável, aumento da saciedade, apoio à perda de peso, melhoria da perda de gordura e manutenção de um corpo magro em um ser humano com o uso de uma dose adequada de uma composição sinérgica fitoterápica, compreendendo a combinação de um primeiro ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Theobroma cacao e um segundo ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Citrus aurantifolia e opcionalmente contendo, pelo
2 / 54 menos, um ingrediente selecionado a partir de um excipiente, diluente e transportador farmaceuticamente aceitável ou misturas respectivas. HISTÓRICO DA INVENÇÃO
[002] A obesidade e o sobrepeso são condições de crescimento rápido em um número crescente de países em todo o mundo. De acordo com um relatório recente da OMS, a obesidade mundial triplicou desde 1975. Uma pessoa com índice de massa corporal (BMI | body mass index) ≥30 kg/m2 é geralmente considerada obesa e o sobrepeso é uma condição identificada com BMI de ≥25 kg/m2; ambas condições são causadas por um desequilíbrio entre a ingestão e o gasto de energia. A obesidade está associada a um aumento substancial na morbidade, mortalidade prematura, qualidade de vida prejudicada e grandes custos com a saúde. O excesso de peso corporal aumenta as chances de desenvolver diabetes, síndrome metabólica, hipertensão, dislipidemia, infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral, certos tipos de câncer, apneia do sono e osteoartrite. As estratégias primárias para desenvolver agentes terapêuticos que possam reduzir o peso corporal incluem diminuir o consumo ou absorção de alimentos e/ou aumentar o gasto de energia. Muitos fármacos foram comercializados como resposta ao problema da obesidade, mas a maioria deles foi retirada do mercado devido a efeitos colaterais inaceitáveis. Nas últimas décadas, pesquisadores da área de distúrbios metabólicos têm voltado suas atenções para ingredientes derivados de alimentos, principalmente do mundo vegetal e marinho, em busca de tratamentos para obesidade/sobrepeso e doenças associadas. Foi demonstrado que alguns extratos fitoterápicos e componentes alimentares afetam a regulação do apetite, a oxidação de gorduras, a captação de energia ou a termogênese. Apesar disso, os ingredientes fitoterápicos são conhecidos por terem a vantagem de menos efeitos colaterais adversos e, portanto, podem representar abordagens complementares interessantes para o controle da obesidade.
[003] A publicação da patente US2016045560 A1 divulga um produto para perda de peso, compreendendo uma mistura de Alchemilla vulgaris, Olea europaea, Cuminum cyminum e Mentha longiflora (na proporção em peso de 12:10:5:4) e ingredientes adicionais selecionados a partir da Theobroma cacao, cafeína anidra, Coffea Arabica,
3 / 54 Coffea canephora, Camellia sinensis, Ilex paraguariensis, guaraná e noz‐de‐cola.
[004] O pedido de patente WO2016046375 A1 divulga o extrato de Theobroma cacao para tratamento de distúrbios relacionados ao receptor da tirosina quinase.
[005] O pedido de patente W02008110853 A1 divulga uma composição contendo extratos fluidos aquosos de folhas de Cucumis sativus, Citrus aurantifolia, Pimenta racemosa e Graptophyllum pictum para psoríase e outras doenças dermatológicas, como acne e doenças micóticas.
[006] A publicação de patente AU2006312947B2 divulgou um suplemento dietético que promove a perda de peso, compreendendo, pelo menos, 3% de ácido corosólico, uma fonte de catequinas e extrato de Theobroma cacao.
[007] A publicação de patente US20100112099A1 divulga um método para ativar a AMPK de miócitos em um animal ao utilizar uma composição, compreendendo uma dose farmaceuticamente eficaz de um ou mais elemento(s) do grupo consistindo em fitoquímicos ou extratos isolados de Zingiber officinale, Cotinus coggygria, Citrus aurantium, Lupulona, isolado de proteína do soro do leite, polinicotinato de cromo, Ácidos hexahidroisoalfa, Xanthohumol, ácidos Rho‐isoalfa, Sambucu, Gymnema sylvestre, Camellia sinensis, Acacia nilotica, Malus pumila, Ribes nigrum L., Hypericum perforatum, Theobroma cacao, Vaccinium, Camellia sinensis, Rosa canina, Ácidos isoalfa, Vaccinium erythrocarpum, Leucina, Hydrastis Canadensis, Vitis vinifera, Rhamnus pershiana, Epimedium (erva de cabra córnea), Curcuma longa, Opuntia ficus indica, Syzygium cumini e ácidos tetrahidroisoalfa.
[008] Outra publicação de patente, US7329419B2, divulga um comprimido para perda de peso, compreendendo quantidades eficazes de chá verde, gengibre, cafeína, cacau, cálcio, erva‐mate, baga de hawthorne, folha de salsa, raiz de marshmallow, semente de erva‐doce, raiz de astrágalo, raiz de alcaçuz, suma, canela, semente de aipo e folha de alfafa.
[009] Portanto, há uma necessidade contínua na técnica de fornecer tratamentos alternativos, compreendendo composições fitoterápicas altamente eficazes para o controle da obesidade e sobrepeso. Além disso, extratos de ervas e composições que sejam bem toleradas e mais eficazes são urgentemente necessários para tratamento
4 / 54 da obesidade e sobrepeso. OBJETO DA INVENÇÃO
[010] O objeto da presente invenção é fornecer composições sinérgicas fitoterápicas, compreendendo a combinação de um primeiro ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Theobroma cacao e um segundo ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Citrus aurantifolia para obtenção de, pelo menos, um benefício à saúde selecionado entre prevenção, controle ou tratamento da obesidade e/ou sobrepeso, melhoria da massa corporal magra, melhoria do escurecimento do tecido adiposo branco (WAT) / melhoria da formação do tecido adiposo marrom (BAT), aumento da taxa metabólica basal (BMR)/gasto de energia em repouso, aumento da termogênese, melhoria da função da tireoide, manutenção do peso corporal saudável, aumento da saciedade, apoio à perda de peso, melhoria da perda de gordura e manutenção de um corpo magro.
[011] Outro objeto da presente invenção é fornecer métodos de prevenção, controle ou tratamento da obesidade e/ou sobrepeso, melhoria da massa corporal magra, melhoria do escurecimento do tecido adiposo branco (WAT)/melhoria da formação do tecido adiposo marrom (BAT), aumento da taxa metabólica basal (BMR)/gasto de energia em repouso, aumento da termogênese, melhoria da função da tireoide, manutenção do peso corporal saudável, aumento da saciedade, apoio à perda de peso, melhoria da perda de gordura e manutenção de um corpo magro em seres humanos ou animais, caracterizado pelo método compreender suplementar os seres humanos com uma dose eficaz de uma composição sinérgica fitoterápica, compreendendo a combinação de um primeiro ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Theobroma cacao e um segundo ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Citrus aurantifolia.
[012] Ainda outro objeto da invenção é fornecer o uso de uma composição sinérgica fitoterápica, compreendendo a combinação de um primeiro ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da
5 / 54 Theobroma cacao e um segundo ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Citrus aurantifolia para obtenção de, pelo menos, um benefício à saúde selecionado entre prevenção, controle ou tratamento da obesidade e/ou sobrepeso, melhoria da massa corporal magra, melhoria do escurecimento do tecido adiposo branco (WAT) / melhoria da formação do tecido adiposo marrom (BAT), aumento da taxa metabólica basal (BMR)/gasto de energia em repouso, aumento da termogênese, melhoria da função da tireoide, manutenção do peso corporal saudável, aumento da saciedade, apoio à perda de peso, melhoria da perda de gordura e manutenção de um corpo magro. SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[013] A presente invenção fornece uma composição sinérgica fitoterápica, compreendendo a combinação de um primeiro ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Theobroma cacao e um segundo ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Citrus aurantifolia para obtenção de, pelo menos, um benefício à saúde selecionado entre prevenção, controle ou tratamento da obesidade e/ou sobrepeso, melhoria da massa corporal magra, melhoria do escurecimento do tecido adiposo branco (WAT)/melhoria da formação do tecido adiposo marrom (BAT), aumento da taxa metabólica basal (BMR)/gasto de energia em repouso, aumento da termogênese, melhoria da função da tireoide, manutenção do peso corporal saudável, aumento da saciedade, apoio à perda de peso, melhoria da perda de gordura e manutenção de um corpo magro.
[014] Outro aspecto da invenção fornece um método para obtenção de um benefício à saúde selecionado entre prevenção, controle ou tratamento da obesidade e/ou sobrepeso, melhoria da massa corporal magra, melhoria do escurecimento do tecido adiposo branco (WAT)/melhoria da formação do tecido adiposo marrom (BAT), aumento da taxa metabólica basal (BMR)/gasto de energia em repouso, aumento da termogênese, melhoria da função da tireoide, manutenção do peso corporal saudável, aumento da saciedade, apoio à perda de peso, melhoria da perda de gordura e manutenção de um corpo magro em seres humanos, caracterizado pelo método
6 / 54 compreender suplementar os seres humanos com uma dose eficaz de uma composição sinérgica fitoterápica, compreendendo a combinação de um primeiro ingrediente selecionado a partir de extratos, frações e misturas respectivas derivados da Theobroma cacao e um segundo ingrediente selecionado de extratos, frações e misturas respectivas derivados da Citrus aurantifolia e opcionalmente compreender, pelo menos, um ingrediente selecionado a partir de um excipiente, diluente e transportador farmaceuticamente aceitável respectivo.
[015] Outro aspecto da invenção fornece o uso de uma composição sinérgica fitoterápica, compreendendo a combinação de um primeiro ingrediente selecionado a partir de extratos, frações e misturas respectivas derivados da Theobroma cacao e um segundo ingrediente selecionado a partir de extratos, frações e misturas respectivas derivados da Citrus aurantifolia e opcionalmente compreendendo, pelo menos, um ingrediente selecionado a partir de um excipiente, diluente e transportador farmaceuticamente aceitável e misturas respectivas para obtenção de, pelo menos, um benefício à saúde selecionado entre prevenção, controle ou tratamento da obesidade e/ou sobrepeso, melhoria da massa corporal magra, melhoria do escurecimento do tecido adiposo branco (WAT)/melhoria da formação do tecido adiposo marrom (BAT), aumento da taxa metabólica basal (BMR)/gasto de energia em repouso, aumento da termogênese, melhoria da função da tireoide, manutenção do peso corporal saudável, aumento da saciedade, apoio à perda de peso, melhoria da perda de gordura e manutenção de um corpo magro.
[016] Outro aspecto da invenção fornece uma composição sinérgica fitoterápica, compreendendo a combinação de um primeiro ingrediente selecionado a partir de extratos, frações e misturas respectivas derivados da Theobroma cacao e um segundo ingrediente selecionado a partir de extratos, frações e misturas respectivas derivados da Citrus aurantifolia e opcionalmente compreendendo, pelo menos, um ingrediente selecionado a partir de um excipiente, diluente e transportador farmaceuticamente aceitável respectivo para melhoria dos processos metabólicos, tais como promoção de lipólise e inibição de adipogênese, aumento do fator de crescimento de fibroblastos 21 (FGF‐21), aumento da proteína desacopladora (UCP‐1) e aumento de β3‐
7 / 54 adrenoceptores (β3‐ARs). DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[017] Figura I: Diagrama de barras que mostra os pesos corporais dos animais nos grupos de controle e tratamento nos dias 1, 8, 15, 22 e 28 (A). Cada barra apresenta o peso corporal médio ± SM. Significativo em p <0,05; # G1 vs. G2; * G2 vs. os grupos de tratamento. O diagrama de barras mostra a variação percentual no peso corporal dos grupos de controle e tratamento de animais no dia 28 (B). G1 e G2 representam os grupos de ratos suplementados com ração normal e dieta rica em gordura, respectivamente. G3, G4 e G5 representam uma dieta rica em gordura mais 100 e 300 mg/kg em peso corporal de uma composição de 67 e 10 mg/kg em peso corporal de ratos suplementados com Sibutramina, respectivamente.
[018] Figura II: O diagrama de barras representa a redução da ingestão diária de calorias dietéticas pelos ratos obesos induzidos por dieta suplementados com a composição 67. Cada barra apresenta a média ± SD. G1 e G2 representam os grupos de ratos suplementados com ração normal e dieta rica em gordura, respectivamente. G3, G4 e G5 representam uma dieta rica em gordura mais 100 e 300 mg/kg em peso corporal da composição de 67 e 10 mg/kg em peso corporal de ratos suplementados com Sibutramina, respectivamente. n = 7; Significativo em p <0,05; # G1 vs. G2; * G2 vs. os grupos de tratamento.
[019] Figura III: O diagrama de barras representa a redução do peso da gordura visceral em ratos obesos induzidos por dieta suplementados com a composição 67. Cada barra apresenta a média ± SD. G1 e G2 representam os grupos de ratos suplementados com ração normal e dieta rica em gordura, respectivamente. G3, G4 e G5 representam uma dieta rica em gordura mais 100 e 300 mg/kg em peso corporal da composição de 67 e 10 mg/kg em peso corporal de ratos suplementados com Sibutramina, respectivamente. n = 7; Significativo em p <0,05; # G1 vs. G2; * G2 vs. os grupos de tratamento.
[020] Figura IV: O diagrama de barras representa a modulação dos tamanhos das células adiposas do epidídimo em ratos obesos induzidos por dieta suplementados com a composição 67. Cada barra apresenta uma média ± SE da área das células
8 / 54 adiposas em pm2. G1 e G2 representam os grupos de ratos suplementados com ração normal e dieta rica em gordura, respectivamente. G3, G4 e G5 representam uma dieta rica em gordura mais 100 e 300 mg/kg em peso corporal da composição de 67 e 10 mg/kg em peso corporal de ratos suplementados com Sibutramina, respectivamente. n = 7; Significativo em p <0,05; # G1 vs. G2; * G2 vs. os grupos de tratamento.
[021] Figura V: O diagrama de barras mostra a normalização do nível de leptina sérica em ratos obesos induzidos por dieta suplementados com a composição 67. G1 e G2 representam os grupos de ratos suplementados com ração normal e dieta rica em gordura, respectivamente. G3, G4 e G5 representam uma dieta rica em gordura mais 100 e 300 mg/kg em peso corporal da composição de 67 e 10 mg/kg em peso corporal de ratos suplementados com Sibutramina, respectivamente. n = 7; Significativo em p <0,05; # G1 vs. G2; * G2 vs. os grupos de tratamento.
[022] Figura VI: O diagrama de barras mostra melhorias no equilíbrio do hormônio da tireoide em ratos obesos induzidos por dieta suplementados com a composição 67. Cada barra apresenta a média ± SD da razão entre triiodotironina (T3) e tiroxina (T4). G1 e G2 representam os grupos de ratos suplementados com ração normal e dieta rica em gordura, respectivamente. G3, G4 e G5 representam uma dieta rica em gordura mais 100 e 300 mg/kg em peso corporal da composição de 67 e 10 mg/kg em peso corporal de ratos suplementados com Sibutramina, respectivamente. n = 7; os números acima de cada barra representam o percentual da proporção T3/T4 relativa, considerando 100% no G1.
[023] Figura VII: Fotomicrografias mostram coloração imuno‐histoquímica de UCP‐1 em tecido adiposo epididimal. G1 e G2 representam os grupos de ratos suplementados com ração normal e dieta rica em gordura, respectivamente. G3, G4 e G5 representam uma dieta rica em gordura mais 100 e 300 mg/kg em peso corporal da composição de 67 e 10 mg/kg em peso corporal de ratos suplementados com Sibutramina, respectivamente. Barra: 50 horas. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[024] A seguir, a invenção será descrita em detalhes em conexão com certas aplicações preferenciais e opcionais, de modo que vários aspectos respectivos possam
9 / 54 ser mais bem compreendidos e apreciados.
[025] Os termos ‘adipólise’ e ‘lipólise’ são termos reconhecidos na técnica e usados indistintamente em todo o relatório descritivo, e um especialista irá compreender e apreciar os mesmos como tal. Da mesma forma, escurecimento, escurecimento da gordura, gordura bege e escurecimento do tecido adiposo branco (WAT) também são usados indistintamente. Os termos ‘fitoterápico’ e ‘plantas’ também são usados indistintamente ao longo do relatório descritivo.
[026] Adipogênese é o processo de diferenciação e proliferação de pré‐adipócitos em adipócitos maduros ou células de gordura. Nesse processo, a proliferação de pré‐ adipócitos ou células precursoras de gordura é seguida pela diferenciação dessas células para o fenótipo de um adipócito maduro. O receptor nuclear PPAR γ é conhecido por desempenhar um papel crítico na diferenciação de adipócitos e na deposição de gordura. Os adipócitos desempenham um papel vital na homeostase energética e são responsáveis pela manutenção da maior reserva de energia na forma de triglicerídeos no corpo dos animais. Os adipócitos permanecem em um estado dinâmico, eles começam a se expandir quando o gasto de energia ultrapassa a ingestão. Esse processo é altamente regulado por hormônios contrarreguladores aos quais essas células são muito sensíveis. Assim, a inibição da adipogênese é um dos principais alvos para o desenvolvimento de tratamentos contra a obesidade/sobrepeso e para promover o emagrecimento.
[027] Adipólise (lipólise) é o processo catabólico que leva à quebra de triglicerídeos armazenados em células de gordura e liberação de ácidos graxos e glicerol na corrente sanguínea. Este é um processo altamente regulado, que permite a entrega adequada de ácidos graxos livres para atender às necessidades de energia. Assim, o aumento da adipólise é um dos principais alvos no tratamento da obesidade/sobrepeso e na promoção do emagrecimento. Os agonistas dos β3‐adrenoceptores podem estimular a lipólise no tecido adiposo branco e a termogênese no tecido adiposo marrom. Agentes fitoquímicos, extratos e frações vegetais com atividade de lipólise podem ser úteis no tratamento da obesidade, sobrepeso e outros distúrbios metabólicos.
[028] Portanto, os inventores do presente pedido selecionaram aleatoriamente um
10 / 54 grande número de extratos de plantas e frações por suas atividades antiadipogênicas e pró‐adipólise e descobriram que os extratos e frações derivados da Theobroma cacao e Citrus aurantifolia mostraram um potente antiadipogênese e atividades pró‐lipólise, conforme resumido nas tabelas 3 a 7.
[029] Um breve resumo sobre cada um dos materiais vegetais é fornecido aqui abaixo. Theobroma cacao: Theobroma cacao L. é uma árvore pequena, mas economicamente importante. É uma árvore perenifólia da família Sterculiaceae com 4 a 8 m de altura, nativa da região tropical das Américas. Sementes da cacao são fonte significativa de polifenóis e teobromina. As sementes são usadas para fazer massa de cacau, cacau em pó, confeitaria, guache e chocolate. O extrato de cacau ou seus fitoquímicos mostraram diversos efeitos benéficos contra a agregação plaquetária, hipertensão, aterosclerose, hiperglicemia e hipercolesterolemia, inflamação, hepatocarcinogênese, dano ao DNA e efeito clastogênico. A teobromina (I) é o alcaloide principal na Theobroma cacao (Donald L. Pavia, Journal of Chemical Education, 1973, 50, 791‐792) e os extratos usados na presente invenção são padronizados para terobromina pelo método de análise por HPLC.
Estrutura química da teobromina (I)
[030] Citrus aurantifolia: C. aurantifolia é uma árvore perene de folha persistente que pode crescer até uma altura de 3 a 5 m. É irregularmente delgada, ramificada e possui pontas ou espinhos afiados curtos e rígidos. Suas flores são curtas, algumas são brancas e perfumadas; ela é amarela quando madura. Classificação da C. aurantifolia: reino (Plantae); sub‐reino (Tracheobionta); superdivisão (Spermatophyta); divisão (Magnoliophyta); classe (Magnoliopsida); subclasse (Rosidae); ordem (Sapindales); família (Rutaceae); gênero (Citrus); espécie (C. aurantifolia). É nativa das regiões tropicais e subtropicais da Ásia e sudeste da Ásia, incluindo Índia e China, e foi introduzida no Norte da África, Europa e em todo o mundo. O nome vernacular da C.
11 / 54 aurantifolia é lime (em inglês) e lima (em português). Não é usada apenas como um agente aromatizante em bebidas, alimentos industrializados e formas farmacêuticas, mas também como ingredientes em perfumes. As cascas da Citrus aurantifolia têm sido tradicionalmente usadas como atividades antidiabéticas, antilipêmicas, anti‐ inseticida e anticâncer. Foi apresentada atividade inibitória da xantina oxidase in vitro, atividades antivirais citotóxicas e antioxidantes. É conhecida por ser usada em produtos cosméticos, como bronzeadores sem sol, sabonetes em barra, etc. A limonina (II) é identificada como um metabólito principal na Citrus aurantifolia e os extratos da presente invenção são padronizados para limonina (II) pelo método de análise por HPLC.
Estrutura química da limonina (II)
[031] Fonte dos fitoterápicos usados na invenção, conforme segue: 1) A semente de Theobroma cacao foi coletada de uma fonte de cultivo na aldeia Aswaraopeta, Aswaraopeta panchayati, Aswaraopeta mandal, distrito de Bhadradri Kothagudem, estado de Telangana. 2) A Citrus aurantifolia foi coletada de uma fonte de cultivo na aldeia de Rayapudi, Rayapudi panchayati, Thullur mandal, distrito de Guntur, estado de Andhra Pradesh.
[032] Sementes de Theobroma cacao foram pulverizadas e o pó foi extraído com vários solventes, como água, etanol aquoso, etanol, metanol aquoso e n‐butanol para obtenção de extrato de água (T.C‐1), extrato aquoso de etanol (T.C‐2), extrato de etanol (T.C‐3), extrato aquoso de metanol (T.C‐4) e extrato de n‐butanol (T.C‐5), respectivamente. Os referidos extratos de semente de Theobroma cacao foram padronizados para teobromina (I) pelo método analítico por HPLC e os resultados foram resumidos na Tabela 1. Da mesma forma, a casca do fruto de Citrus aurantifolia
12 / 54 foi pulverizada e o pó foi extraído com vários solventes, como etanol aquoso, etanol, água, metanol aquoso e n‐butanol para obtenção de extrato aquoso de etanol (C.A‐1), extrato de etanol (C.A‐2), extrato de água (C.A‐3), extrato aquoso de metanol (C.A‐4) e extrato de n‐butanol (C.A‐5), respectivamente. Os extratos de Citrus aurantifolia foram padronizados para limonina (II) pelo método analítico por HPLC e os resultados foram resumidos na Tabela 2.
[033] Os referidos extratos de sementes de Theobroma cacao e extratos da casca de frutos da Citrus aurantifolia foram avaliados quanto às suas atividades antiadipogênicas e de pró‐adipólise usando modelos celulares in vitro em células pré‐ adipócitos 3T3‐L1 de um camundongo. Os resultados indicaram que os extratos foram potentes em inibir a adipogênese e aumentar a adipólise. O extrato de água da semente de Theobroma cacao (T.C‐1), por exemplo, nas concentrações de tratamento de 5 µg/mL e 10 µg/mL apresentou 38,36% e 41,10% de inibição na adipogênese, respectivamente. O extrato aquoso de etanol da casca do fruto de Citrus aurantifolia (C.A‐1) nas concentrações de tratamento de 5 µg/mL e 10 µg/mL apresentou 25,81% e 35,74% de inibição na adipogênese, respectivamente. Os outros extratos de solvente da semente de Theobroma cacao e da casca do fruto de Citrus aurantifolia também foram considerados eficazes.
[034] Esses extratos individuais ou suas frações foram, então, avaliados para explorar a viabilidade de uma eficácia sinérgica entre esses ingredientes. Os extratos ou frações derivados da Theobroma cacao e extratos ou frações derivados da Citrus aurantifolia foram combinados em diferentes proporções para obtenção das composições de 1 a 65 (C‐1 a C‐65). As referidas composições (composições 1‐65) foram testadas quanto à atividade de inibição da adipogênese em comparação com os ingredientes individuais correspondentes. Os dados do ensaio de inibição da adipogênese in vitro para essas composições mostraram inesperadamente melhor eficácia na inibição da adipogênese quando comparados aos seus ingredientes individuais correspondentes, sugerindo que o(s) extrato(s), fração(ões), fitoquímicos ou misturas respectivas derivados da Theobroma cacao têm tendência a exibir sinergismo quando combinado(s) com extrato(s), fração(ões), fitoquímicos ou misturas respectivas derivados da Citrus
13 / 54 aurantifolia.
[035] Por exemplo, o extrato de água da semente de Theobroma cacao (T.C‐1) em concentração de 1,67 µg/mL e o extrato aquoso de etanol a 50% da casca do fruto da Citrus aurantifolia (C.A‐1) em concentração de 3,33 µg/mL mostraram 15,23% e 19,47% de inibições da adipogênese, respectivamente. A composição 2 contendo extrato de água da semente de Theobroma cacao (T.C‐1) e extrato aquoso de etanol em 50% da casca de Citrus aurantifolia (C.A‐1) na proporção de 1:2 a 5 µg/mL apresentou 44,78% de inibição da adipogênese, o que é significativamente melhor do que o efeito aditivo de 34,7% (15,23% + 19,47%) calculado a partir das inibições mostradas pelos ingredientes individuais correspondentes. A composição 1 (C‐1) e as composições de 3 a 5 (C‐1 e C‐3 a C‐5) contendo esses dois extratos (T.C‐1 e C.A‐1) nas proporções de 1:3, 1:1, 2:1 e 3:1, respectivamente, também exibiram sinergismo quando comparadas às inibições mostradas por cada uma de suas concentrações de ingredientes individuais correspondentes, conforme resumido na Tabela 3. As outras composições (C6 a C19) contendo extrato de água da semente de Theobroma cacao (T.C‐1) em combinação com outros extratos solventes da casca de Citrus aurantifolia (C.A‐2 a C.A‐5) também mostraram inibição da adipogênese sinérgica (Tabela 3).
[036] Em um exemplo adicional, o extrato aquoso de etanol a 50% da semente de Theobroma cacao (T.C‐2) em concentração de 0,83 µg/mL e o extrato aquoso de etanol a 50% da casca de Citrus aurantifolia (C.A‐1) em concentração de 1,67 µg/mL mostraram 2,07% e 26,46% de inibições da adipogênese, respectivamente. A composição 21 contendo extrato aquoso de etanol a 50% da semente de Theobroma cacao (T.C‐2) e o extrato aquoso de etanol a 50% da casca de Citrus aurantifolia (C.A‐1) na proporção de 1:2 a 2,5 µg/mL apresentou 40,19% de inibição da adipogênese, o que é significativamente melhor do que o efeito aditivo de 28,53% (2,07% + 26,46%) calculado a partir das inibições mostradas pelos ingredientes individuais correspondentes. As composições de 20 e 22 a 24 (C‐20, C‐22 a C‐24) contendo esses dois extratos (T.C‐2 e C.A‐1) em outras proporções de ingredientes, e também as composições contendo extrato aquoso de etanol a 50% da semente de Theobroma cacao (T.C‐2) em combinação com outros extratos solventes da casca do fruto da
14 / 54 Citrus aurantifolia também exibiram sinergismo quando comparadas às inibições mostradas por cada uma de suas concentrações de ingredientes individuais correspondentes, conforme resumido na tabela 4.
[037] Da mesma forma, as composições (C‐39 a C‐65) compreendendo outros extratos de solvente da Theobroma cacao e Citrus aurantifolia mostraram sinergismo quando comparadas às inibições mostradas por cada uma de suas concentrações de ingredientes individuais correspondentes, conforme resumido na tabela 5.
[038] As composições (composições de 1 a 65) foram, ainda, testadas quanto à sua eficácia para aumento da adipólise usando modelos celulares in vitro em células pré‐ adipócitos 3T3‐L1 de camundongo em comparação com os ingredientes individuais correspondentes. Os dados do ensaio de adipólise in vitro para essas composições mostraram inesperadamente melhor eficácia no aumento da adipólise quando comparados aos seus ingredientes individuais correspondentes, sugerindo que o(s) extrato(s), fração(ões), fitoquímicos ou misturas respectivas derivados da Theobroma cacao têm tendência a exibir sinergismo quando combinados com extrato(s), fração(ões), fitoquímicos ou misturas respectivas derivados da Citrus aurantifolia.
[039] Por exemplo, o extrato de água da semente de Theobroma cacao (T.C‐1) em concentração de 6,67 µg/mL e o extrato aquoso de etanol a 50% da casca do fruto da Citrus aurantifolia (C.A‐1) em concentração de 13,33 µg/mL mostraram 29,52% e 7,12% de aumento de adipólise, respectivamente. A composição 2 contendo extrato de água da semente de Theobroma cacao (T.C‐1) e extrato aquoso de etanol a 50% da casca de Citrus aurantifolia (C.A‐1) na proporção de 1:2 a 20 µg/mL apresentou 47,88% de aumento de adipólise, o que é significativamente melhor do que o efeito aditivo de 36,64% (29,52% + 7,12%) calculado a partir do aumento mostrado pelo ingrediente individual correspondente. A composição 1 e as composições de 3 a 5 contendo esses dois extratos (T.C‐1 e C.A‐1) em outras proporções de ingredientes também exibiram sinergismo quando comparadas ao aumento mostrado por cada uma de suas concentrações de ingredientes individuais correspondentes, conforme resumido na Tabela 6. As outras composições (C6 a C19) contendo extrato aquoso de Theobroma cacao (TC‐1) e outros extratos solventes de Citrus aurantifolia (C.A‐2 ‐ C.A‐5) também
15 / 54 apresentaram atividade pró‐adipólise sinérgica (Tabela 6). Da mesma forma, as composições (C‐20 a C‐65) compreendendo outros extratos solventes de Theobroma cacao e Citrus aurantifolia mostraram sinergismo quando comparadas ao aumento mostrado por cada uma de suas concentrações de ingredientes individuais correspondentes, conforme resumido na Tabela 7.
[040] Curiosamente, os extratos e frações derivados da semente de Theobroma cacao e da casca do fruto da Citrus aurantifolia e suas composições exibiram, ainda, eficácia inesperada em outros mecanismos para tratamento da obesidade e do sobrepeso, tais como escurecimento da gordura, termogênese, gasto de energia em repouso, melhoria da função da tireoide, aumento da saciedade, modulação de fatores moleculares responsáveis pelo escurecimento das células de gordura branca, como FGF21, UCP‐1 e β3‐AR, conforme discutido abaixo.
[041] Tecido adiposo marrom (BAT), escurecimento do tecido adiposo branco (WAT) e gasto de energia em repouso: O tecido adiposo (gordura corporal) é um tecido conjuntivo fracamente ligado composto de adipócitos, que são derivados de pré‐ adipócitos. Em humanos, o tecido adiposo está localizado principalmente sob a pele (gordura subcutânea) e ao redor de órgãos internos (gordura visceral). O tecido adiposo branco (WAT), também chamado de gordura branca, é um dos dois tipos de tecidos adiposos encontrados em mamíferos. O outro tipo de tecido adiposo é o tecido adiposo marrom (BAT). O tecido adiposo branco armazena energia na forma de lipídios e sofre expansão patológica durante a obesidade. O tecido adiposo marrom (BAT) é uma forma especializada de tecido adiposo em humanos e outros mamíferos. O BAT evoluiu nos mamíferos para dissipar grandes quantidades de energia química na forma de calor por meio de um processo chamado termogênese. O BAT não é apenas uma importante defesa do corpo contra a hipotermia, mas também desempenha um papel na termogênese induzida por dieta. As células de gordura marrom possuem um grande número de mitocôndrias, que são equipadas com uma proteína especializada conhecida como proteína desacopladora 1 (UCP‐1). A UCP‐1 causa um curto‐circuito na cadeia de transporte de elétrons, que normalmente é usada para conduzir a síntese de ATP celular, permitindo, assim, que o potencial da membrana mitocondrial seja
16 / 54 transduzido em calor (termogênese), tornando o BAT um tecido capaz de alterar o gasto de energia e metabolismo do combustível sem aumento da atividade física.
[042] Nos últimos anos, o tópico de tecido adiposo marrom foi revigorado com muitos novos estudos relativos à conversão de tecido adiposo branco (WAT) em gordura bege, também conhecido como escurecimento WAT. O WAT a partir de certos depósitos, em resposta a estímulos apropriados, pode passar por um processo conhecido como “escurecimento” para produzir gordura bege, onde assume características de BAT, aumentando a expressão de proteínas específicas como a UCP‐ 1, a presença de gotículas lipídicas multiloculares e múltiplas mitocôndrias. Os adipócitos bege induzidos pelo estímulo de “escurecimento” são fenotipicamente semelhantes aos adipócitos marrons clássicos em BAT com quantidades comparáveis de mitocôndrias e UCP‐1, indicando que eles podem ter capacidades termogênicas semelhantes às BAT. O fator de crescimento de fibroblastos 21 (FGF21 | Fibroblast Growth Factor 21) desempenha um papel fisiológico no recrutamento termogênico de WATs e também é um importante regulador do escurecimento. O coativador 1‐alfa do receptor gama ativado por proliferador de peroxissoma (PGC 1α) é também um dos reguladores importantes da transcrição central para o escurecimento WAT. Além disso, o escurecimento do tecido adiposo branco é impulsionado pela estimulação simpática por meio do envolvimento da norepinefrina (NE) com os receptores adrenérgicos β3 (β3AR | β3‐adrenergic receptors) dos adipócitos brancos. A ativação dos β3AR inicia uma cascata de transdução de sinal que resulta na superexpressão de UCP‐1 e outras proteínas termogênicas nas células de gordura branca. Essa série de eventos faz parte do escurecimento das células de gordura branca até o estágio intermediário, células bege ou brite. Além disso, o hormônio tireoidiano, em especial o T3, regula positivamente a síntese de UCP‐1. O T3 pode estimular independentemente a síntese de UCP‐1 ou pode trabalhar em cooperação com a estimulação simpática de maneira sinérgica. A atividade do T3 é inibida por T4. Portanto, um equilíbrio saudável entre T3 e T4 é crucial para o escurecimento das células de gordura branca.
[043] FGF‐21: O fator de crescimento 21 de fibroblastos (FGF‐21) é um novo elemento da família FGF e é predominantemente expresso no fígado. O FGF‐21 está
17 / 54 envolvido no controle do metabolismo por meio da modulação da homeostase da glicose, da sensibilidade à insulina, da cetogênese e da promoção do “escurecimento” do tecido adiposo. Durante a última década, o FGF‐21 demonstrou ser um potencial alvo terapêutico para o tratamento da obesidade e diabetes. O tecido adiposo é um dos principais alvos da ação do FGF‐21 e um dos importantes benefícios metabólicos do FGF‐21 é o “escurecimento”. Cada vez mais evidências sugerem que o FGF‐21 desempenha um papel fisiológico na termogênese e no recrutamento termogênico do tecido adiposo branco por meio da regulação positiva da expressão de UCP‐1 e outros genes termogênicos por um eixo autócrino‐parácrino. O FGF21 também aumenta os níveis de PGC lα em tecidos adiposos.
[044] Algumas composições selecionadas entre a composição 1 e a composição 65 foram testadas em comparação aos ingredientes individuais correspondentes quanto à sua capacidade de aumento do Fator de crescimento dos fibroblastos 21 (FGF‐21) em ensaio celular em células de pré‐adipócitos 3T3‐L1 de um camundongo. Os dados do ensaio de FGF‐21 in vitro para essas composições mostraram inesperadamente melhor eficácia no aumento de FGF‐21, quando comparados aos seus ingredientes individuais correspondentes, sugerindo que o(s) extrato(s), fração(s), fitoquímicos ou misturas respectivas derivados da Theobroma cacao tem tendência a exibir sinergismo quando combinados com o(s) extrato(s), fração(ões), fitoquímicos ou misturas respectivas derivados da Citrus aurantifolia.
[045] Por exemplo, o extrato de água da semente de Theobroma cacao (T.C‐1) em concentração de 1,67 µg/mL e o extrato aquoso de etanol a 50% da casca do fruto da Citrus aurantifolia (C.A‐1) em concentração de 3,33 µg/mL mostraram 10,08% e 18,60% de aumento de FGF‐21, respectivamente. A composição 2, contendo extrato de água da Theobroma cacao (T.C‐1) e extrato aquoso de etanol a 50% da Citrus aurantifolia (C.A‐1) na proporção de 1:2 a 5 µg/mL, apresentou aumento de 44,21% de FGF‐21, o que é significativamente melhor do que o efeito aditivo de 28,68% (10,08% + 18,60%) calculado a partir do aumento mostrado pelos ingredientes individuais correspondentes. A composição 1 e as composições de 3 a 5 contendo estes dois extratos (T.C‐1 e C.A‐1) em outras proporções de ingredientes também exibiram
18 / 54 sinergismo quando comparadas às inibições mostradas por cada uma de suas concentrações de ingredientes individuais correspondentes, conforme resumido na Tabela 8. As demais composições (C‐10 e C‐15) contendo extrato aquoso de Theobroma cacao (T.C‐1) e outros extratos solventes de Citrus aurantifolia (C.A‐2 a C.A‐5), e as composições de 20 a 23 e de 36 a 38 (C‐20 a C‐23 e C36 a 38), contendo outros extratos de solventes da semente de Theobroma cacao e da casca da Citrus aurantifolia, também mostraram aumento sinérgico na atividade do FGF21 quando comparado ao aumento mostrado por cada uma de suas concentrações de ingredientes individuais correspondentes, conforme resumido na Tabela 8.
[046] UCP‐1: A epidemia mundial de obesidade e outros distúrbios metabólicos levou a comunidade científica a concentrar a atenção recentemente no tecido adiposo branco (WAT) e sua biologia. O WAT pode ser convertido em tecido parecido com gordura marrom sob certas situações fisiológicas e fisiopatológicas. O fenômeno de “escurecimento” da gordura branca, em que certos depósitos de tecido adiposo branco aumentam significativamente a expressão do gene para a proteína desacopladora (UCP‐1) e, portanto, supostamente adquirem propriedades termogênicas e de queima de gordura, atraiu considerável atenção, pois muda sua função de armazenamento de energia para dissipação de energia. A UCP‐1 é uma proteína de membrana integral encontrada na membrana mitocondrial interna do tecido adiposo marrom e facilita o processo de termogênese sem tremores em mamíferos. Assim, o foco principal dos pesquisadores é a identificação dos agentes que induziriam uma resposta de “escurecimento”, aumento da expressão e da atividade da UCP‐1 nos tecidos adiposos, o que em última instância ajudaria a neutralizar o desenvolvimento da obesidade e do sobrepeso; além de outros distúrbios metabólicos e a promoção do gasto de energia.
[047] Portanto, algumas composições selecionadas entre as composições de 1 a 65 foram testadas quanto a atividade de expressão da proteína desacopladora (UCP‐1) em modelos celulares usando células de pré‐adipócitos 3T3‐L1 de um camundongo. Os dados do ensaio UCP‐1 in vitro para essas composições mostraram inesperadamente um aumento significativo na expressão de UCP‐1, em relação ao controle. Por
19 / 54 exemplo, as composições de 1 a 5 contendo extrato de água da semente de Theobroma cacao (T.C‐1) e extrato aquoso de etanol a 50% da casca do fruto da Citrus aurantifolia (C.A‐1) em proporções de 1:3, 1:2, 1:1, 2:1 e 3:1 mostraram eficácia significativa com 38,48%, 34,23%, 33,81%, 30,71% e 28,69% de aumento na expressão da UCP‐1, respectivamente, sobre o controle. Da mesma forma, as composições de 58 e 59 contendo extrato de metanol a 50% da semente de Theobroma cacao (T.C‐4) e extrato aquoso de etanol a 50% da casca do fruto da Citrus aurantifolia (C.A‐1) em proporção de 1:1 e 2:1 também exibiram melhora significativa com 24,63% e 11,96% de aumento na expressão da UCP‐1 sobre o controle. Os dados resumidos na Tabela 9 sugerem, portanto, que as composições contendo extratos ou fração derivados da Theobroma cacao e extratos ou frações derivados da Citrus aurantifolia podem ter o potencial de regular positivamente a expressão da UCP‐1, que por sua vez se correlaciona ao aumento do escurecimento da gordura, termogênese e gasto de energia em repouso.
[048] β3AR: O β3‐AR é um receptor beta‐adrenérgico localizado principalmente no tecido adiposo. Suas principais ações incluem a regulação da lipólise e termogênese. Os depósitos clássicos de BAT são altamente inervados e ativados por centros no cérebro em resposta a certos estímulos, como exposição ao frio e exposição a certos produtos químicos da dieta, levando à liberação de norepinefrina (NE) dos nervos simpáticos. Após a ligação de NE aos β3‐adrenoceptores BAT (β3‐ARs), os níveis aumentados de AMP cíclico intracelular (cAMP) promovem a lipólise, e essa quebra de triglicerídeos leva à liberação de ácidos graxos livres que aumentam e ativam a proteína desacopladora‐1 (UCP‐1). A UCP‐1 ativada desacopla a respiração mitocondrial, levando à geração de calor, portanto, a sinalização do β3‐AR aumenta a respiração e a termogênese sem tremores, com os adipócitos BAT sendo notavelmente ricos em mitocôndrias. Além dos adipócitos castanhos clássicos (BAT), os adipócitos bege ou brite também podem apresentar efeitos semelhantes. Essas células residem em depósitos de WAT, mas podem ser “escurecidas” por vários estímulos, principalmente exposição ao frio ou ativadores da sinalização do β‐AR e pelos agonistas do receptor ativado por proliferador de peroxissoma (PPAR γ), como a
20 / 54 rosiglitazona. A ativação de adipócitos brite/bege leva a um aumento no desacoplamento mitocondrial semelhante ao que ocorre no BAT. Portanto, a ativação do receptor β3‐adrenérgico (AR) pode levar ao aumento do escurecimento, termogênese e gasto de energia em repouso (REE | resting energy expenditure).
[049] Assim, algumas composições representativas selecionadas das composições de 1 a 65 foram testadas quanto ao aumento da expressão dos β3‐adrenoceptores (β3AR) em células de adipócitos. No ensaio de β3AR, as células 3T3‐L1 tratadas in vitro com as composições mostraram um aumento inesperadamente significativo na expressão do β3‐AR sobre as células tratadas com controle, conforme resumido na Tabela 10. Por exemplo, as composições 1, 2 e 3 (C‐1, C‐2 e C‐3) contendo extrato aquoso de Theobroma cacao (TC‐1) e extrato aquoso de etanol a 50% da casca de Citrus aurantifolia (C.A‐1) em proporções de 1:3, 1:2 e 1:1 mostraram 36,17%, 37,47% e 51,02% de aumento na expressão de β3AR, respectivamente, em relação ao controle. Da mesma forma, as composições 21 e 22 (C‐21 e C‐22) contendo extrato de etanol a 50% de Theobroma cacao (T.C‐2) e extrato aquoso de etanol a 50% de Citrus aurantifolia (C.A‐1) em proporção de 1:2 e 1:1 também mostrou 18,75% e 12,66% de aumento na expressão de β3AR, respectivamente, sobre o controle, conforme resumido na Tabela 10. Esses resultados sugerem que as composições contendo um extrato derivado de Theobroma cacao em combinação com um extrato derivado de Citrus aurantifolia podem aumentar a expressão de β3AR e, como tal, podem ter a capacidade de aumentar o escurecimento da gordura, termogênese e lipólise.
[050] Formulações: A presente invenção também fornece composições sinérgicas fitoterápicas compreendendo, pelo menos, um ingrediente selecionado a partir de extratos, frações e fitoquímicos ou misturas respectivas derivados da Theobroma cacao e um segundo ingrediente selecionado a partir de extratos, frações e fitoquímicos ou misturas respectivas derivados da Citrus aurantifolia e opcionalmente contendo, pelo menos, um componente selecionado a partir de excipientes, transportadores e diluentes farmacêutica, nutracêutica ou dieteticamente aceitáveis.
[051] As composições compreendem, pelo menos, um ingrediente selecionado a partir de extratos, frações e fitoquímicos ou misturas respectivas derivados da
21 / 54 Theobroma cacao e um segundo ingrediente selecionado a partir de extratos, frações e fitoquímicos ou misturas respectivas derivados da Citrus aurantifolia e opcionalmente contendo, pelo menos, um componente selecionado a partir de excipientes, transportadores e diluentes farmacêutica, nutracêutica ou dieteticamente aceitáveis para prevenir, controlar ou tratar a obesidade, o sobrepeso e melhorar a massa corporal magra, manter o peso corporal e manter um corpo magro, caracterizado pelos excipientes, transportadores e diluentes farmacêutica, nutracêutica ou dieteticamente aceitáveis serem selecionados a partir de monossacarídeos, como glicose, dextrose, frutose, galactose, etc.; dissacarídeos, tais como, entre outros, sacarose, maltose, lactose, lactulose, trealose, celobiose, quitobiose, etc.; policarboidratos, tais como amido e amido modificado, tais como glicolato de amido sódico, amido pré‐gelatinizado, amido solúvel e outros amidos modificados; dextrinas que são produzidas por hidrólise de amido ou glicogênio, como dextrina amarela, dextrina branca, maltodextrina, etc.; álcoois poli‐hídricos ou álcoois de açúcar, tais como, entre outros, sorbitol, manitol, inositol, xilitol, isomalte, etc.; derivados à base de celulose, tais como, entre outros, celulose microcristalina, hidroxipropilmetilcelulose, hidroxietilcelulose, etc.; silicatos, tais como, entre outros, neusilina, veegum, talco, dióxido de silício coloidal, etc.; estearatos metálicos, tais como, entre outros, estearato de cálcio, estearato de magnésio, estearato de zinco, etc.; ácidos orgânicos, como ácido cítrico, ácido tartárico, ácido málico, ácido succínico, ácido láctico, ácido l‐ascórbico, etc.; ésteres de ácidos graxos e ésteres de poli sorbato, gomas naturais, tais como, entre outros, acácia, carragenina, goma guar, goma xantana etc.; um grupo vitamina b, nicotinamida, pantotenato de cálcio, aminoácidos, proteínas, tais como, entre outras, caseína, gelatina, pectina, ágar; sais de metais orgânicos, tais como, entre outros, cloreto de sódio, cloreto de cálcio, fosfato dicálcico, sulfato de zinco, cloreto de zinco etc.; pigmentos naturais, sabores, conservantes de classe I e classe II e soluções aquosas, alcoólicas, hidroalcóolicas e orgânicas dos ingredientes listados acima, sozinhos ou em combinações.
[052] Por exemplo, a composição 66 foi preparada combinando 60 g de extrato de água da semente de Theobroma cacao (T.C‐1), 30 g de extrato aquoso de etanol a 50%
22 / 54 da casca do fruto da Citrus aurantifolia (C.A‐1), 9 g de maltodextrina e 1 g de siloide. Da mesma forma, a composição 67 foi preparada combinando 53,33 g de extrato de água da semente de Theobroma cacao (T.C‐1), 26,67 g de extrato aquoso de etanol a 50% da casca do fruto da Citrus aurantifolia (C.A‐1), 18 g de maltodextrina e 2 g de siloide na presença de etanol/água, seguido de secagem. Além disso, a composição 68 foi preparada combinando 53,2 g de extrato de água da semente de Theobroma cacao (T.C‐1), 26,6 g de extrato aquoso de etanol a 50% da casca do fruto da Citrus aurantifolia (C.A‐1), 18,2 g de Glucidex‐12D e 2 g de siloide na presença de etanol/água, seguido de secagem para fornecer a composição.
[053] Avaliação in vivo da composição 97 em animais obesos induzidos por dieta rica em gordura (HFD | high fat diet): As potentes propriedades antiobesidade e os efeitos sinérgicos mostrados pelas composições compreendendo Theobroma cacao e Citrus aurantifolia em modelos in vitro foram avaliados posteriormente em um modelo in vivo de obesidade. A obesidade foi induzida em ratos Sprague Daley machos por suplementação dos ratos com dieta rica em gordura por quatro semanas. O grupo de controle (G1) foi alimentado com ração normal. Após quatro semanas do período de indução, os ratos obesos foram alocados aleatoriamente em vários grupos de G2 a G4 com sete animais em cada grupo, os animais pertencentes aos grupos de tratamento foram suplementados por via oral diariamente com 100 mg/kg (G3), ou 300 mg/kg (G4) em peso corporal da composição 67 ou 10 mg de sibutramina (G5), cada em 10 mL de CMC a 0,5% em água por mais quatro semanas. O grupo de controle (G2) dos animais recebeu apenas o veículo (10 ml de CMC a 0,5% em água). O peso corporal de cada animal foi registrado semanalmente e o peso corporal médio dos animais em cada grupo foi determinado. O ganho/alteração do peso corporal foi calculado no final da 1ª semana, 2ª semana, 3ª semana e 4ª semana após o início do tratamento em comparação ao respectivo peso corporal inicial. A composição 67 inibiu significativamente e de forma dependente da dose o ganho de peso corporal em ratos obesos induzidos por dieta rica em gordura quando comparado ao grupo de controle com HFD (G2). Foi exibida redução de 99,5% e 109,1% no ganho de peso corporal no grupo de tratamento suplementado com 100 mg/kg e 300 mg/Kg de peso corporal da
23 / 54 composição 67, respectivamente, no final do período de tratamento. No entanto, o efeito começou a mostrar significância por 2 semanas de tratamento no grupo de dose de 300mg/Kg. Os resultados do peso corporal e da alteração percentual final do peso corporal para os grupos de tratamento e grupo de controle estão resumidos nas Figuras 1A e 1B. Estes resultados sugerem claramente que a composição 67 tem um potente efeito antiobesidade.
[054] Além disso, a ingestão alimentar média diária para os ratos do grupo G3 e G4 suplementados com a composição 67 foi significativamente reduzida. Os dados de consumo alimentar são apresentados como ingestão diária de calorias dietéticas (KJ/dia) na Figura II. Juntas, essas observações demonstram que a suplementação oral de composição 67 reduz significativamente o ganho de peso corporal e ajuda a manter o peso corporal saudável dos ratos HFD; além de também restringir o consumo de calorias da dieta pelos ratos.
[055] Após a eutanásia no final do estudo, os tecidos adiposos viscerais (retroperitoneal, epididimal, perirrenal e mesentérico) foram coletados dos ratos e pesados. O peso total da gordura dos grupos suplementados com a composição 67 foi significativamente reduzido e o grupo suplementado com 300 mg da composição 67 (G4) exibiu significância estatística, quando comparado com os ratos alimentados com HFD (Figura III). Além disso, o exame microscópico dos tecidos adiposos embebidos em parafina e fixados em formalina revelou que o grupo G4 suplementado com 300 mg da composição 67 por 28 dias reduziu substancialmente o tamanho das células adiposas, quando comparado com ratos do grupo controle HFD (G2) (Figura IV). Coletivamente, essas observações demonstram que a suplementação com a composição 67 reduz significativamente a adiposidade corporal ou gordura corporal em ratos obesos.
[056] Após 28 dias de suplementação, as amostras de soro foram analisadas para os níveis de leptina circulante. Os níveis de leptina sérica foram significativamente reduzidos nos grupos de tratamento suplementados com a composição 67 em comparação com os de ratos HFD, conforme resumido na Figura V. Curiosamente, os níveis de leptina nos grupos de tratamento foram reduzidos aos valores dos animais de controle alimentados com ração. Esses dados indicam que a composição 67 tem um
24 / 54 papel potencial na regulação do consumo de alimentos por meio da modulação da saciedade. Esta observação pode explicar a base da quantidade reduzida de consumo de ração pelos ratos suplementados com composição 67 no estudo.
[057] Além disso, uma observação interessante é que os ratos suplementados com a composição 67 apresentaram equilíbrio de T3/T4 melhorado, quando comparado aos ratos HFD (Figura VI). T3 é o hormônio tireoidiano ativo que é formado através de uma conversão metabólica de seu precursor T4. O T3 é um importante regulador da homeostase energética do corpo; influencia positivamente a taxa metabólica basal do corpo ou o gasto energético de repouso. Além disso, o T3 também é um fator crucial para o processo de transformação das células de gordura branca em marrom. Em animais obesos, a proporção T3/T4 é menor do que em não obesos. Em nosso experimento, os ratos suplementados com a composição 67 apresentaram melhora na proporção T3/T4, quando comparados aos ratos HFD. Esta observação indica que a composição fitoterápica melhorou a função da tireoide em ratos obesos. Juntas, as observações fortemente propõem que a suplementação com a composição 67 induziu a geração de gordura marrom em conjunto com a função tireoidiana melhorada; coletivamente, esses eventos forneceram a base da redução da gordura corporal por meio do aumento do gasto energético em repouso em ratos obesos.
[058] O estudo de imuno‐histoquímica no tecido adiposo epididimal demonstra a presença de células de gordura marrom coradas com a UCP‐1 em ratos suplementados com a composição 67 (Figura VII). Os ratos alimentados com ração (G1) ou HFD (G2) não apresentaram a presença de células de gordura marrom em seus tecidos adiposos epididimários. Portanto, a presente observação indica claramente que a composição 67 potencialmente induz a geração de gordura marrom.
[059] O precedente demonstra que composições sinérgicas fitoterápicas, compreendendo a combinação de um primeiro ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Theobroma cacao e um segundo ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Citrus aurantifolia inibem a adipogênese, aceleram a lipólise, aumentam a produção do FGF21, aumentam a expressão de UCP‐1, Β3‐AR
25 / 54 aumentam o escurecimento da gordura e melhoram o equilíbrio T3/T4. Portanto, as referidas composições podem ser úteis para obtenção de, pelo menos, um benefício à saúde selecionado entre prevenção, controle ou tratamento da obesidade e/ou sobrepeso, melhoria da massa corporal magra, melhoria do escurecimento do tecido adiposo branco (WAT) / melhoria da formação do tecido adiposo marrom (BAT), aumento da taxa metabólica basal (BMR)/gasto de energia em repouso, aumento da termogênese, melhoria da função da tireoide, manutenção do peso corporal saudável, aumento da saciedade, apoio à perda de peso, melhoria da perda de gordura e manutenção de um corpo magro.
[060] Portanto, em uma importante aplicação, a presente invenção fornece uma composição sinérgica fitoterápica, compreendendo a combinação de um primeiro ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Theobroma cacao e um segundo ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Citrus aurantifolia para obtenção de, pelo menos, um benefício à saúde selecionado entre prevenção, controle ou tratamento da obesidade e/ou sobrepeso, melhoria da massa corporal magra, melhoria do escurecimento do tecido adiposo branco (WAT)/melhoria da formação do tecido adiposo marrom (BAT), aumento da taxa metabólica basal (BMR)/gasto de energia em repouso, aumento da termogênese, melhoria da função da tireoide, manutenção do peso corporal saudável, aumento da saciedade, apoio à perda de peso, melhoria da perda de gordura e manutenção de um corpo magro.
[061] Em outra aplicação, a presente invenção fornece uma composição sinérgica fitoterápica, compreendendo a combinação de um primeiro ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Theobroma cacao e um segundo ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Citrus aurantifolia, caracterizado pela concentração do primeiro ingrediente na composição variar na faixa de 10% a 90% em peso e a concentração do segundo ingrediente variar na faixa de 90% a 10% em peso.
[062] Em outra aplicação exemplar, a presente invenção fornece uma composição sinérgica fitoterápica, compreendendo a combinação de um primeiro ingrediente
26 / 54 selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Theobroma cacao e um segundo ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Citrus aurantifolia e opcionalmente compreendendo, pelo menos, um componente selecionado a partir de excipientes, transportadores e diluentes farmacêutica, nutracêutica ou dieteticamente aceitáveis.
[063] Em outra aplicação, a presente invenção fornece uma composição sinérgica fitoterápica, compreendendo a combinação de um primeiro ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Theobroma cacao e um segundo ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Citrus aurantifolia e opcionalmente compreendendo, pelo menos, um componente selecionado a partir de excipientes, transportadores e diluentes farmacêutica, nutracêutica ou dieteticamente aceitáveis; para obtenção de, pelo menos, um benefício à saúde selecionado entre prevenção, controle ou tratamento da obesidade e/ou sobrepeso, melhoria da massa corporal magra, melhoria do escurecimento do tecido adiposo branco (WAT)/melhoria da formação do tecido adiposo marrom (BAT), aumento da taxa metabólica basal (BMR)/gasto de energia em repouso, aumento da termogênese, melhoria da função da tireoide, manutenção do peso corporal saudável, aumento da saciedade, apoio à perda de peso, melhoria da perda de gordura e manutenção de um corpo magro; caracterizado pelos excipientes, transportadores e diluentes farmacêutica, nutracêutica ou dieteticamente aceitáveis serem selecionados a partir de monossacarídeos, como glicose, dextrose, frutose, galactose, etc.; dissacarídeos, tais como, entre outros, sacarose, maltose, lactose, lactulose, trealose, celobiose, quitobiose, etc.; policarboidratos, tais como amido e amido modificado, tais como glicolato de amido sódico, amido pré‐gelatinizado, amido solúvel e outros amidos modificados; dextrinas que são produzidas por hidrólise de amido ou glicogênio, como a dextrina amarela, dextrina branca, maltodextrina, etc.; álcoois poli‐hídricos ou álcoois de açúcar, tais como, entre outros, sorbitol, manitol, inositol, xilitol, isomalte, etc.; derivados à base de celulose, tais como, entre outros, celulose microcristalina,
27 / 54 hidroxipropilmetilcelulose, hidroxietilcelulose, etc.; silicatos, tais como, entre outros, neusilina, veegum, talco, dióxido de silício coloidal, etc.; estearatos metálicos, tais como, entre outros, estearato de cálcio, estearato de magnésio, estearato de zinco, etc.; ácidos orgânicos, como ácido cítrico, ácido tartárico, ácido málico, ácido succínico, ácido láctico, ácido l‐ascórbico, etc.; ésteres de ácidos graxos e ésteres de poli sorbato, gomas naturais, tais como, entre outros, acácia, carragenina, goma guar, goma xantana etc.; um grupo vitamina b, nicotinamida, pantotenato de cálcio, aminoácidos, proteínas, tais como, entre outras, caseína, gelatina, pectina, ágar; sais de metais orgânicos, tais como, entre outros, cloreto de sódio, cloreto de cálcio, fosfato dicálcico, sulfato de zinco, cloreto de zinco etc.; pigmentos naturais, sabores, conservantes de classe I e classe II e soluções aquosas, alcoólicas, hidroalcóolicas e orgânicas dos ingredientes listados acima, sozinhos ou em combinações.
[064] Em outra aplicação, a invenção fornece uma composição sinérgica fitoterápica, compreendendo a combinação de um primeiro ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Theobroma cacao e um segundo ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Citrus aurantifolia, caracterizado pelo extrato ou fração ser obtido a partir de, pelo menos, uma parte da planta selecionada a partir do grupo compreendendo folhas, caules, caules tenros, galhos tenros, partes aéreas, frutos inteiros, casca de frutas, sementes, capítulo da flor, raiz, casca, madeira dura ou a planta inteira ou misturas respectivas.
[065] Em outra aplicação, a invenção fornece uma composição sinérgica fitoterápica, compreendendo a combinação de um primeiro ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Theobroma cacao e um segundo ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Citrus aurantifolia, caracterizado pelo extrato ou fração ser produzido utilizando, pelo menos, um solvente selecionado do grupo compreendendo álcoois C1‐C5, como etanol, metanol, n‐propanol, álcool isopropílico; cetonas, como acetona, metilisobutilcetona; solventes clorados, como dicloreto de metileno e clorofórmio, água e misturas respectivas; Hidrocarbonetos C1‐C7, como
28 / 54 hexano; ésteres, como acetato de etila e semelhantes e misturas respectivas.
[066] Em outra aplicação, a presente invenção fornece uma composição sinérgica fitoterápica, compreendendo a combinação de um primeiro ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Theobroma cacao e um segundo ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Citrus aurantifolia, caracterizado pelos extratos ou frações serem padronizados a, pelo menos, um composto marcador de referência fitoquímica ou marcador biológico ativo no extrato ou fração, em que o composto marcador fitoquímico ou grupo de compostos fitoquímicos está na faixa de concentração de 0,1% a 99% em peso do extrato.
[067] Em outra aplicação, a presente invenção fornece uma composição sinérgica fitoterápica, compreendendo a combinação de um primeiro ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Theobroma cacao e um segundo ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Citrus aurantifolia, caracterizado pelos extratos, frações ou fitoquímicos da Theobroma cacao serem padronizados para teobromina; em que a teobromina está na faixa de concentração de 0,1% a 20% em peso da composição.
[068] Em outra aplicação, a presente invenção fornece uma composição sinérgica fitoterápica, compreendendo a combinação de um primeiro ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Theobroma cacao e um segundo ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Citrus aurantifolia, caracterizado pelos extratos ou frações de Citrus aurantifolia serem padronizados para limonina; em que a limonina está na faixa de concentração de 0,1% a 10% em peso da composição.
[069] Em outra aplicação, a presente invenção fornece uma composição sinérgica fitoterápica, compreendendo a combinação de um primeiro ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Theobroma cacao e um segundo ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Citrus aurantifolia, caracterizado
29 / 54 pela(s) composição(ões) ser(em) formulada(s) em uma forma de dosagem selecionada entre uma forma de pó seco, forma líquida, bebida, produto alimentar, suplemento dietético ou qualquer forma adequada, tal como um comprimido, uma cápsula, um mastigável macio ou goma de mascar.
[070] Em outra aplicação da invenção, a(s) composição(ões), conforme divulgada(s) acima, pode(m) ser formulada(s) em suplementos nutricionais/dietéticos que podem ser contemplados/feitos na forma de dosagem de alimentos saudáveis ou alimentos para usos de saúde específicos, tais como alimentos sólidos, como chocolate ou barras nutricionais, alimentos semissólidos, como cremes, geleias, géis ou bebidas, como uma bebida refrescante, bebida com bactérias de ácido láctico, gotas, doces, gomas de mascar, balas de goma, iogurtes, sorvetes, pudins, jujuba de feijão azuki, geleias, biscoitos, chás, refrigerantes, sucos, leite, café, cereal, petiscos e afins.
[071] Em uma aplicação adicional, a presente invenção fornece métodos de prevenção, controle ou tratamento da obesidade e/ou sobrepeso, melhoria da massa corporal magra, melhoria do escurecimento do tecido adiposo branco (WAT)/melhoria da formação do tecido adiposo marrom (BAT), aumento da taxa metabólica basal (BMR)/gasto de energia em repouso, aumento da termogênese, melhoria da função da tireoide, manutenção do peso corporal saudável, aumento da saciedade, apoio à perda de peso, melhoria da perda de gordura e manutenção de um corpo magro, caracterizado pelo método compreender suplementar o indivíduo com uma dose adequada de uma composição sinérgica fitoterápica, compreendendo a combinação de um primeiro ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Theobroma cacao e um segundo ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Citrus aurantifolia e opcionalmente compreendendo, pelo menos, um ingrediente adicional selecionado a partir de um excipiente, diluente e transportador farmaceuticamente aceitável.
[072] Em outra aplicação, a presente invenção fornece métodos de prevenção, controle ou tratamento da obesidade e/ou sobrepeso, melhoria da massa corporal magra, melhoria do escurecimento do tecido adiposo branco (WAT)/melhoria da
30 / 54 formação do tecido adiposo marrom (BAT), aumento da taxa metabólica basal (BMR)/gasto de energia em repouso, aumento da termogênese, melhoria da função da tireoide, manutenção do peso corporal saudável, aumento da saciedade, apoio à perda de peso, melhoria da perda de gordura e manutenção de um corpo magro, caracterizado pelo método compreender suplementar o indivíduo com uma dose adequada de uma composição sinérgica fitoterápica, compreendendo a combinação de um primeiro ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Theobroma cacao e um segundo ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Citrus aurantifolia e opcionalmente compreendendo, pelo menos, um ingrediente adicional selecionado a partir de um excipiente, diluente e transportador farmaceuticamente aceitável; em que o referido tratamento da obesidade compreende, pelo menos, um entre; promoção da lipólise, inibição da adipogênese, acúmulo de lipídios, aumento do fator de crescimento de fibroblastos 21 (FGF‐21), aumento da proteína desacopladora (UCP‐1) e aumento de β3‐adrenoceptores (β3‐ ARs).
[073] Em outra aplicação, a presente invenção fornece o uso de uma composição sinérgica fitoterápica, compreendendo a combinação de um primeiro ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Theobroma cacao e um segundo ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Citrus aurantifolia e opcionalmente compreendendo, pelo menos, um ingrediente adicional selecionado a partir de um excipiente, diluente e transportador farmaceuticamente aceitável para obtenção de, pelo menos, um benefício à saúde selecionado entre prevenção, controle ou tratamento da obesidade e/ou sobrepeso, melhoria da massa corporal magra, melhoria do escurecimento do tecido adiposo branco (WAT)/melhoria da formação do tecido adiposo marrom (BAT), aumento da taxa metabólica basal (BMR)/gasto de energia em repouso, aumento da termogênese, melhoria da função da tireoide, manutenção do peso corporal saudável, aumento da saciedade, apoio à perda de peso, melhoria da perda de gordura e manutenção de um corpo magro.
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[074] Em outra aplicação, a presente invenção fornece um método para prevenção, controle ou tratamento da obesidade e/ou sobrepeso, melhoria da massa corporal magra, melhoria do escurecimento do tecido adiposo branco (WAT)/melhoria da formação do tecido adiposo marrom (BAT), aumento da taxa metabólica basal (BMR)/gasto de energia em repouso, aumento da termogênese, melhoria da função da tireoide, manutenção do peso corporal saudável, aumento da saciedade, apoio à perda de peso, melhoria da perda de gordura e manutenção de um corpo magro, caracterizado pelo método compreender suplementar o indivíduo com uma dose adequada de uma composição sinérgica fitoterápica, compreendendo a combinação de um primeiro ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Theobroma cacao e um segundo ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Citrus aurantifolia e opcionalmente compreendendo, pelo menos, um ingrediente adicional selecionado a partir de um excipiente, diluente e transportador farmaceuticamente aceitável; em que a suplementação do indivíduo com uma dose adequada ocorre na forma de comprimidos de liberação controlada ou uso de revestimentos à base de polímero de liberação controlada por técnicas incluindo nanotecnologia, microencapsulação, sistemas transportadores coloidais e outros sistemas de distribuição de fármacos para obter o benefício terapêutico desejado.
[075] Aqueles de habilidade comum na técnica apreciarão que mudanças podem ser feitas nas aplicações descritas acima sem se afastar do amplo conceito inventivo respectivo. Entende‐se, portanto, que esta invenção não se limita às aplicações particulares ou a exemplos aqui divulgados, mas se destina a cobrir aplicações dentro dos objetivos e escopo da presente invenção, conforme definido no relatório descritivo. Os exemplos apresentados ilustram a invenção, mas eles não devem ser considerados como limitantes ao escopo da invenção de nenhuma forma. EXEMPLO 1: PREPARAÇÃO DO EXTRATO DE ÁGUA DA SEMENTE DE THEOBROMA CACAO.
[076] As sementes secas de Theobroma cacao (100 g) foram pulverizadas e a matéria‐ prima em pó foi extraída com água (700 mL) em um extrator de laboratório em
32 / 54 temperatura ambiente (rt | room temperature) por 1h. O extrato foi filtrado e a matéria‐prima usada foi extraída novamente duas vezes com água (2 x 500 mL) em condições semelhantes. O extrato combinado foi filtrado e concentrado sob vácuo para obtenção de um resíduo de extrato de água na forma de um pó (T.C‐1; 14 g). EXEMPLO 2: PREPARAÇÃO DE EXTRATOS DE ETANOL AQUOSO A 50% E ETANOL DE SEMENTES DE THEOBROMA CACAO
[077] As sementes secas de Theobroma cacao (100 g) foram pulverizadas e a matéria‐ prima em pó foi extraída com etanol aquoso a 50% (700 mL) em um extrator de laboratório em rt por 1h. O extrato foi filtrado e a matéria‐prima usada foi extraída novamente duas vezes com etanol aquoso a 50% (2 x 500 mL) em condições semelhantes. O extrato combinado foi filtrado e concentrado sob vácuo para obtenção de um resíduo de extrato de etanol (T.C‐2; 11 g).
[078] O extrato de etanol (T.C‐3; 4,4 g) de sementes de Theobroma cacao (100 g) foi obtido pela adoção de procedimento semelhante ao descrito acima usando etanol como solvente de extração. EXEMPLO 3: PREPARAÇÃO DO EXTRATO DE METANOL AQUOSO A 50% DA SEMENTE DE THEOBROMA CACAO
[079] As sementes secas de Theobroma cacao (100 g) foram pulverizadas e a matéria‐ prima em pó foi extraída com metanol aquoso a 50% (700 mL) em um extrator de laboratório em rt por 1h. O extrato foi filtrado e a matéria‐prima usada foi extraída novamente duas vezes com metanol a 50% (2 x 500 mL) em condições semelhantes. O extrato combinado foi filtrado e concentrado sob vácuo para obtenção de um resíduo de extrato aquoso de metanol a 50% (T.C‐4; 10 g). EXEMPLO 4: PREPARAÇÃO DO EXTRATO DE N‐BUTANOL DE SEMENTES DE THEOBROMA CACAO
[080] Sementes secas de Theobroma cacao (100 g) foram pulverizadas e a matéria‐ prima em pó foi extraída com n‐butanol (700 mL) em um extrator de laboratório em rt por 1h. O extrato foi filtrado e a matéria‐prima usada foi extraída novamente duas vezes com n‐butanol (2 x 500 mL) em condições semelhantes. O extrato combinado foi filtrado e concentrado sob vácuo para obtenção de um resíduo de extrato de n‐
33 / 54 butanol (T.C‐5; 24.5 g). EXEMPLO 5: PADRONIZAÇÃO DOS EXTRATOS DE SEMENTES DE THEOBROMA CACAO
[081] Os vários extratos de semente de Theobroma cacao foram padronizados para Teobromina pelo método analítico por HPLC e os resultados foram resumidos na Tabela 1. TABELA 1: Nº de Seq. Código do Extrato Solvente para Peso do produto Teobromina (HPLC) extração 1 T.C‐1 água 14 g 4,4 % 2 T.C‐2 etanol a 50% 11 g 6,9 % 3 T.C‐3 etanol 4,4 g 7,5 % 4 T.C‐4 metanol a 50% 10 g 6,9 % 5 T.C‐5 n‐butanol 24,5 g 0,26 % EXEMPLO 6: PREPARAÇÃO DE EXTRATOS AQUOSOS DE ETANOL A 50% E ETANOL DA CASCA DO FRUTO DA CITRUS AURANTIFOLIA
[082] A matéria‐prima da casca do fruto seco de Citrus aurantifolia (100 g) foi pulverizada em pó e extraída com 1:1 etanol/água (700 mL) em um extrator de laboratório em rt por 1h. O extrato foi filtrado e a matéria‐prima usada foi extraída novamente duas vezes com etanol/água 1:1 (2 x 500 mL) em condições semelhantes de extração. O extrato combinado foi filtrado e concentrado sob vácuo para obtenção de um resíduo aquoso de etanol a 50% na forma de um pó de cor marrom (C.A‐1; 21 g); Flavonoides totais por UV: 9,92%.
[083] O extrato de etanol (C. A‐2; 9,5 g) foi obtido ao adotar um procedimento semelhante, o uso de etanol como solvente de extração.
[084] Da mesma forma, a matéria‐prima de frutos secos inteiros da Citrus aurantifalia (100 g) foi submetida a procedimento de extração semelhante ao descrito acima para obtenção de extrato aquoso de álcool a 50% na forma de um pó de cor marrom (15 g). EXEMPLO 7: PREPARAÇÃO DE EXTRATO DE ÁGUA DA CASCA DO FRUTO DE CITRUS AURANTIFALIA
[085] A casca dos frutos secos de Citrus aurantifalia (100 g) foi pulverizada e a
34 / 54 matéria‐prima em pó foi extraída com água (700 mL) em um extrator de laboratório em rt por 1h. O extrato foi filtrado e a matéria‐prima usada foi extraída novamente duas vezes com água (2 x 500 mL) em condições de extrato semelhantes. O extrato combinado foi filtrado e concentrado sob vácuo para obtenção de um resíduo de extrato de água na forma de um pó de cor marrom (C.A‐3; 21 g). EXEMPLO 8: PREPARAÇÃO DE EXTRATO AQUOSO DE METANOL A 50% DA CASCA DO FRUTO DA CITRUS AURANTIFALIA
[086] A casca do fruto seco da Citrus aurantifalia (100 g) foi pulverizada e a matéria‐ prima em pó foi extraída com metanol aquoso a 50% (700 mL) em um extrator de laboratório em rt por 1h. O extrato foi filtrado e a matéria‐prima usada foi extraída novamente duas vezes com metanol aquoso a 50% (2 x 500 mL) sob condições semelhantes. O extrato combinado foi filtrado e concentrado sob vácuo para obtenção de um resíduo de extrato aquoso de metanol a 50% na forma de um pó de cor marrom (C.A‐4; 30 g). EXEMPLO 9: PREPARAÇÃO DE EXTRATO DE BUTANOL DA CASCA DO FRUTO DE CITRUS AURANTIFOLIA
[087] A casca do fruto seco de Citrus aurantifolia (100 g) foi pulverizada e a matéria‐ prima em pó foi extraída com n‐butanol (700 mL) em um extrator de laboratório em rt por 1h. O extrato foi filtrado e a matéria‐prima usada foi extraída novamente duas vezes com n‐butanol (2 x 500 mL) em condições semelhantes. O extrato combinado foi filtrado e concentrado sob vácuo para obtenção de um resíduo de extrato de butanol na forma de um pó de cor marrom (C.A‐5; 7 g). EXEMPLO 10: PADRONIZAÇÃO DE EXTRATOS DA CITRUS AURANTIFOLIA
[088] Os vários extratos de Citrus aurantifolia foram padronizados para limonina pelo método analítico por HPLC e os resultados foram resumidos na Tabela 2. TABELA 2: Limonina Nº de Seq. Código do extrato Solvente para extração Peso do produto (HPLC) 1 C.A‐1 etanol a 50% 21 g 0,57% 2 C.A‐2 etanol 9,5 g 1,18%
35 / 54 3 C.A‐3 água 21g 0,28% 4 C.A‐4 metanol a 50% 30 g 0,69% 5 C.A‐5 n‐butanol 7g 1,70% EXEMPLO 11: PREPARAÇÃO DE COMPOSIÇÕES DE EXTRATO DE ÁGUA DA THEOBROMA CACAO (T.C‐1) E EXTRATOS DA CITRUS AURANTIFOLIA (C.A‐1 A C.A‐5)
[089] Composição‐1 (C‐1): A composição‐1 foi preparada combinando extrato de água de Theobroma cacao (T.C‐1) e extrato aquoso de etanol a 50% de Citrus aurantifolia (C.A‐1) na proporção de 1:3.
[090] Composição‐2 (C‐2): A composição‐2 foi preparada combinando extrato de água de Theobroma cacao (T.C‐1) e extrato aquoso de etanol a 50% de Citrus aurantifolia (C.A‐1) na proporção de 1:2.
[091] Composição‐3 (C‐3): A composição‐3 foi preparada combinando extrato de água de Theobroma cacao (T.C‐1) e extrato aquoso de etanol a 50% de Citrus aurantifolia (C. A‐1) na proporção de 1:1.
[092] Composição‐4 (C‐4): A composição‐4 foi preparada combinando extrato de água de Theobroma cacao (T.C‐1) e extrato aquoso de etanol a 50% de Citrus aurantifolia (C.A‐1) na proporção de 2:1.
[093] Composição‐5 (C‐5): A composição‐5 foi preparada combinando extrato de água de Theobroma cacao (T.C‐1) e extrato aquoso de etanol a 50% de Citrus aurantifolia (C. A‐1) na proporção de 3:1.
[094] Composição‐6 (C‐6): A composição‐6 foi preparada combinando extrato de água de Theobroma cacao (T.C‐1) e extrato de etanol de Citrus aurantifolia (C.A‐2) na proporção de 1:2.
[095] Composição‐7 (C‐7): A composição‐7 foi preparada combinando extrato de água de Theobroma cacao (T.C‐1) e extrato de etanol de Citrus aurantifolia (C.A‐2) na proporção de 1:1.
[096] Composição‐8 (C‐8): A composição‐8 foi preparada combinando extrato de água de Theobroma cacao (T.C‐1) e extrato de etanol de Citrus aurantifolia (C.A‐2) na proporção de 2:1.
36 / 54
[097] Composição‐9 (C‐9): A composição‐9 foi preparada combinando extrato de água de Theobroma cacao (T.C‐1) e extrato de água de Citrus aurantifolia (C.A‐3) na proporção de 1:3.
[098] Composição‐10 (C‐10): A composição‐10 foi preparada combinando extrato de água de Theobroma cacao (T.C‐1) e extrato de água de Citrus aurantifolia (C.A‐ 3) na proporção de 1:2.
[099] Composição‐11 (C‐1l): A composição‐11 foi preparada combinando extrato de água de Theobroma cacao (T.C‐1) e extrato de água de Citrus aurantifolia (C.A‐ 3) na proporção de 1:1.
[100] Composição‐12 (C‐12): A composição‐12 foi preparada combinando extrato de água de Theobroma cacao (T.C‐1) e extrato de água de Citrus aurantifolia (C.A‐ 3) na proporção de 2:1.
[101] Composição‐13 (C‐13): A composição‐13 foi preparada combinando extrato de água de Theobroma cacao (T.C‐1) e extrato de água de Citrus aurantifolia (C.A‐3) na proporção de 3:1.
[102] Composição‐14 (C‐14): A composição‐14 foi preparada combinando extrato de água de Theobroma cacao (T.C‐1) e extrato aquoso de metanol a 50% de Citrus aurantifolia (C. A‐4) na proporção de 1:2.
[103] Composição‐15 (C‐15): A composição‐15 foi preparada combinando extrato de água de Theobroma cacao (T.C‐1) e extrato aquoso de metanol a 50% de Citrus aurantifolia (C. A‐4) na proporção de 1:1.
[104] Composição‐16 (C‐16): A composição‐16 foi preparada combinando extrato de água de Theobroma cacao (T.C‐1) e extrato aquoso de metanol a 50% de Citrus aurantifolia (C. A‐4) na proporção de 2:1.
[105] Composição‐17 (C‐17): A composição‐17 foi preparada combinando extrato de água de Theobroma cacao (T.C‐1) e extrato de butanol de Citrus aurantifolia (C.A‐5) na proporção de 1:2.
[106] Composição‐18 (C‐18): A composição‐18 foi preparada combinando extrato de água de Theobroma cacao (T.C‐1) e extrato de butanol de Citrus aurantifolia (C.A‐5) na proporção de 1:1.
37 / 54
[107] Composição‐19 (C‐19): A composição‐19 foi preparada combinando extrato de água de Theobroma cacao (T.C‐1) e extrato de butanol de Citrus aurantifolia (C.A‐5) na proporção de 2:1. EXEMPLO 12: PREPARAÇÃO DE COMPOSIÇÕES DE EXTRATO AQUOSO DE ETANOL A 50% DE THEOBROMA CACAO (T.C‐2) E EXTRATOS DE CITRUS AURANTIFOLIA (C.A‐1 A C.A‐5)
[108] Composição‐20 (C‐20): A composição‐20 foi preparada combinando extrato aquoso de etanol a 50% de Theobroma cacao (T.C‐2) e extrato aquoso de etanol a 50% de Citrus aurantifolia (C.A‐1) na proporção de 1:3.
[109] Composição‐21 (C‐21): A composição‐21 foi preparada combinando extrato aquoso de etanol a 50% de Theobroma cacao (T.C‐2) e extrato aquoso de etanol a 50% de Citrus aurantifolia (C.A‐1) na proporção de 1:2.
[110] Composição‐22 (C‐22): A composição‐22 foi preparada combinando extrato aquoso de etanol a 50% de Theobroma cacao (T.C‐2) e extrato aquoso de etanol a 50% de Citrus aurantifolia (C.A‐l) na proporção de 1:1.
[111] Composição‐23 (C‐23): A composição‐23 foi preparada combinando extrato aquoso de etanol a 50% de Theobroma cacao (T.C‐2) e extrato aquoso de etanol a 50% de Citrus aurantifolia (C.A‐l) na proporção de 2:1.
[112] Composição‐24 (C‐24): A composição‐24 foi preparada combinando extrato aquoso de etanol a 50% de Theobroma cacao (T.C‐2) e extrato aquoso de etanol a 50% de Citrus aurantifolia (C.A‐1) na proporção de 3:1.
[113] Composição‐25 (C‐25): A composição‐25 foi preparada combinando extrato aquoso de etanol a 50% de Theobroma cacao (T.C‐2) e extrato de etanol de Citrus aurantifolia (C.A‐2) na proporção de 1:2.
[114] Composição‐26 (C‐26): A composição‐26 foi preparada combinando extrato aquoso de etanol a 50% de Theobroma cacao (T.C‐2) e extrato de etanol de Citrus aurantifolia (C.A‐2) na proporção de 1:1.
[115] Composição‐27 (C‐27): A composição‐27 foi preparada combinando extrato aquoso de etanol a 50% de Theobroma cacao (T.C‐2) e extrato de etanol de Citrus aurantifolia (C.A‐2) na proporção de 2:1.
38 / 54
[116] Composição‐28 (C‐28): A composição‐28 foi preparada combinando extrato aquoso de etanol a 50% de Theobroma cacao (T.C‐2) e extrato de água de Citrus aurantifolia (C.A‐3) na proporção de 1:3.
[117] Composição‐29 (C‐29): A composição‐29 foi preparada combinando extrato aquoso de etanol a 50% de Theobroma cacao (T.C‐2) e extrato de água de Citrus aurantifolia (C.A‐3) na proporção de 1:2.
[118] Composição‐30 (C‐30): A composição‐30 foi preparada combinando extrato aquoso de etanol a 50% de Theobroma cacao (T.C‐2) e extrato de água de Citrus aurantifolia (C.A‐3) na proporção de 1:1.
[119] Composição‐31 (C‐31): A composição‐31 foi preparada combinando extrato aquoso de etanol a 50% de Theobroma cacao (T.C‐2) e extrato de água de Citrus aurantifolia (C.A‐3) na proporção de 2:1.
[120] Composição‐32 (C‐32): A composição‐32 foi preparada combinando extrato aquoso de etanol a 50% de Theobroma cacao (T.C‐2) e extrato de água de Citrus aurantifolia (C.A‐3) na proporção de 3:1.
[121] Composição‐33 (C‐33): A composição‐33 foi preparada combinando extrato aquoso de etanol a 50% de Theobroma cacao (T.C‐2) e extrato aquoso de metanol a 50% de Citrus aurantifolia (C. A‐4) na proporção de 1:2.
[122] Composição‐34 (C‐34): A composição‐34 foi preparada combinando extrato aquoso de etanol a 50% de Theobroma cacao (T.C‐2) e extrato aquoso de metanol a 50% de Citrus aurantifolia (C. A‐4) na proporção de 1:1.
[123] Composição‐35 (C‐35): A composição‐33 foi preparada combinando extrato aquoso de etanol a 50% de Theobroma cacao (T.C‐2) e extrato aquoso de metanol a 50% de Citrus aurantifolia (C. A‐4) na proporção de 2:1.
[124] Composição‐36 (C‐36): A composição‐36 foi preparada combinando extrato aquoso de etanol a 50% de Theobroma cacao (T.C‐2) e extrato de butanol de Citrus aurantifolia (C.A‐5) na proporção de 1:2.
[125] Composição‐3 7 (C‐37): A composição‐37 foi preparada combinando extrato aquoso de etanol a 50% de Theobroma cacao (T.C‐2) e extrato de butanol de Citrus aurantifolia (C.A‐5) na proporção de 1:1.
39 / 54
[126] Composição‐3 8 (C‐38): A composição‐38 foi preparada combinando extrato aquoso de etanol a 50% de Theobroma cacao (T.C‐2) e extrato de butanol de Citrus aurantifolia (C.A‐5) na proporção de 2:1. EXEMPLO 13: PREPARAÇÃO DE COMPOSIÇÕES DE EXTRATOS DE THEOBROMA CACAO (T.C‐3, T.C‐4 & T.C‐5) E EXTRATOS DE CITRUS AURANTIFOLIA (C.A‐1 A C.A‐5)
[127] Composição‐39 (C‐39): A composição‐39 foi preparada combinando extrato de etanol de Theobroma cacao (T.C‐3) e extrato aquoso de etanol a 50% de Citrus aurantifolia (C.A‐1) na proporção de 1:2.
[128] Composição‐40 (C‐40): A composição‐40 foi preparada combinando extrato de etanol de Theobroma cacao (T.C‐3) e extrato aquoso de etanol a 50% de Citrus aurantifolia (C.A‐1) na proporção de 1:1.
[129] Composição‐41 (C‐41): A composição‐41 foi preparada combinando extrato de etanol de Theobroma cacao (T.C‐3) e extrato aquoso de etanol a 50% de Citrus aurantifolia (C.A‐1) na proporção de 2:1.
[130] Composição‐42 (C‐42): A composição‐42 foi preparada combinando extrato de etanol de Theobroma cacao (T.C‐3) e extrato de etanol de Citrus aurantifolia (C.A‐2) na proporção de 1:2.
[131] Composição‐43 (C‐43): A composição‐43 foi preparada combinando extrato de etanol de Theobroma cacao (T.C‐3) e extrato de etanol de Citrus aurantifolia (C.A‐2) na proporção de 1:1.
[132] Composição‐44 (C‐44): A composição‐44 foi preparada combinando extrato de etanol de Theobroma cacao (T.C‐3) e extrato de etanol de Citrus aurantifolia (C.A‐2) na proporção de 2:1.
[133] Composição‐45 (C‐45): A composição‐45 foi preparada combinando extrato de etanol de Theobroma cacao (T.C‐3) e extrato de água de Citrus aurantifolia (C.A‐3) na proporção de 1:2.
[134] Composição‐46 (C‐46): A composição‐46 foi preparada combinando extrato de etanol de Theobroma cacao (T.C‐3) e extrato de água de Citrus aurantifolia (C.A‐3) na proporção de 1:1.
40 / 54
[135] Composição‐47 (C‐47): A composição‐47 foi preparada combinando extrato de etanol de Theobroma cacao (T.C‐3) e extrato de água de Citrus aurantifolia (C.A‐3) na proporção de 2:1.
[136] Composição‐48 (C‐48): A composição‐48 foi preparada combinando extrato de etanol de Theobroma cacao (T.C‐3) e extrato aquoso de metanol a 50% de Citrus aurantifolia (C. A‐4) na proporção de 1:2.
[137] Composição‐49 (C‐49): A composição‐49 foi preparada combinando extrato de etanol de Theobroma cacao (T.C‐3) e extrato aquoso de metanol a 50% de Citrus aurantifolia (C. A‐4) na proporção de 1:1.
[138] Composição‐50 (C‐50): A composição‐50 foi preparada combinando extrato de etanol de Theobroma cacao (T.C‐3) e extrato aquoso de metanol a 50% de Citrus aurantifolia (C. A‐4) na proporção de 2:1.
[139] Composição‐51 (C‐51): A composição‐51 foi preparada combinando extrato de etanol de Theobroma cacao (T.C‐3) e extrato de butanol de Citrus aurantifolia (C.A‐5) na proporção de 1:2.
[140] Composição‐52 (C‐52): A composição‐52 foi preparada combinando extrato de etanol de Theobroma cacao (T.C‐3) e extrato de butanol de Citrus aurantifolia (C.A‐5) na proporção de 1:1.
[141] Composição‐53 (C‐53): A composição‐53 foi preparada combinando extrato de etanol de Theobroma cacao (T.C‐3) e extrato de butanol de Citrus aurantifolia (C.A‐5) na proporção de 2:1.
[142] Composição‐54 (C‐54): A composição‐54 foi preparada combinando extrato de metanol a 50% de Theobroma cacao (T.C‐4) e extrato de água de Citrus aurantifolia (C.A‐3) na proporção de 1:2.
[143] Composição‐55 (C‐55): A composição‐55 foi preparada combinando extrato de metanol a 50% de Theobroma cacao (T.C‐4) e extrato de água de Citrus aurantifolia (C. A‐3) na proporção de 1:1.
[144] Composição‐56 (C‐56): A composição‐56 foi preparada combinando extrato de metanol a 50% de Theobroma cacao (T.C‐4) e extrato de água de Citrus aurantifolia (C. A‐3) na proporção de 2:1.
41 / 54
[145] Composição‐57 (C‐57): A composição‐57 foi preparada combinando extrato de metanol a 50% de Theobroma cacao (T.C‐4) e extrato de etanol a 50% de Citrus aurantifolia (C.A‐1) na proporção de 1:2.
[146] Composição‐58 (C‐58): A composição‐58 foi preparada combinando extrato de metanol a 50% de Theobroma cacao (T.C‐4) e extrato de etanol a 50% de Citrus aurantifolia (C.A‐1) na proporção de 1:1.
[147] Composição‐59 (C‐59): A composição‐59 foi preparada combinando extrato de metanol a 50% de Theobroma cacao (T.C‐4) e extrato de etanol a 50% de Citrus aurantifolia (C.A‐1) na proporção de 2:1.
[148] Composição‐60 (C‐60): A composição‐60 foi preparada combinando extrato de butanol de Theobroma cacao (T.C‐5) e extrato de água de Citrus aurantifolia (C.A‐3) na proporção de 1:2.
[149] Composição‐61 (C‐61): A composição‐61 foi preparada combinando extrato de butanol de Theobroma cacao (T.C‐5) e extrato de água de Citrus aurantifolia (C.A‐3) na proporção de 1:1.
[150] Composição‐62 (C‐62): A composição‐62 foi preparada combinando extrato de butanol de Theobroma cacao (T.C‐5) e extrato de água de Citrus aurantifolia (C.A‐3) na proporção de 2:1.
[151] Composição‐63 (C‐63): A composição‐63 foi preparada combinando extrato de butanol de Theobroma cacao (T.C‐5) e extrato de etanol a 50% de Citrus aurantifolia (C.A‐l) na proporção de 1:2.
[152] Composição‐64 (C‐64): A composição‐64 foi preparada combinando extrato de butanol de Theobroma cacao (T.C‐5) e extrato de etanol a 50% de Citrus aurantifolia (C.A‐l) na proporção de 1:1.
[153] Composição‐65 (C‐65): A composição‐65 foi preparada combinando extrato de butanol de Theobroma cacao (T.C‐5) e extrato de etanol a 50% de Citrus aurantifolia (C.A‐l) na proporção de 2:1. EXEMPLO 14: FORMULAÇÃO DAS COMPOSIÇÕES
[154] Composição 66 (C‐66): A composição 66 foi preparada combinando 60 g de extrato aquoso de Theobroma cacao (T.C‐1), 30 g de extrato aquoso de etanol a 50%
42 / 54 de Citrus aurantifolia (C.A‐1), 9 g de maltodextrina e 1 g de siloide.
[155] Composição 67 (C‐67): A composição 67 foi preparada combinando 53,33 g de extrato aquoso de Theobroma cacao (T.C‐1), 26,67 g de extrato aquoso de etanol a 50% de Citrus aurantifolia (C.A‐1), 18 g de maltodextrina e 2 g de siloide na presença de etanol/água e secada para dar a composição.
[156] Composição 68 (C‐68): A composição 68 foi preparada combinando 53,2 g de extrato aquoso de Theobroma cacao (T.C‐1), 26,6 g de extrato aquoso de etanol a 50% de Citrus aurantifolia (C.A‐1), 18,2 g de Glucidex‐12D e 2 g de siloide na presença de etanol/água e secada para dar a composição. EXEMPLO 15: PROCEDIMENTO GERAL PARA ENSAIO DE INIBIÇÃO DE ADIPOGÊNESE
[157] Pré‐adipócitos 3T3‐L1 de um camundongo (50000 células/poço em 500 µL) foram semeados em uma placa de cultura celular de 48 poços e mantidos em meio DMEM contendo 10% de FBS a 37°C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2. Após as células estarem confluentes (~2 dias), as células foram tratadas com diferentes concentrações das amostras de teste em meio de diferenciação (DM | differentiation medium) contendo 0,5 mM de 3‐isobutil‐l‐metilxantina (IBMX | 3‐isobutyl‐l‐ methylxanthine), 1 µM de dexametasona e 500 nM de insulina em DMEM com 10% de FBS por 48 horas. O meio de cultura celular foi alterado para um pós‐DM, contendo 100nM de insulina em DMEM com 10% de FBS com as respectivas concentrações de amostras de teste, e pós‐DM, juntamente com as respectivas concentrações de amostras de teste, sendo renovadamente substituído a cada 48 horas até o 6º dia. As células foram submetidas à coloração por Oil Red O, 8 dias após o início da diferenciação.
[158] Coloração por Oil Red O: O meio foi aspirado e 0,5mL de formaldeído a 10% foi adicionado a cada poço e incubado por 2 horas em temperatura ambiente. O formaldeído foi removido dos poços, 0,25 mL de isopropanol a 60% foram adicionados e a placa foi deixada secar completamente. Cem microlitros de Oil Red O foram adicionados e incubados por 20 minutos no escuro em temperatura ambiente. O Oil Red O foi aspirado e a placa foi lavada 4 vezes com água destilada. A placa foi
43 / 54 completamente secada e 150 µL de isopropanol a 100% foram adicionados, bem misturados, e 75 µL foram transferidos para uma placa de ensaio de 96 poços e a absorbância foi medida a 550 nm no leitor de placas Spectramax5e. A inibição percentual da adipogênese foi calculada usando a fórmula abaixo: OP Médio de Controle do Veículo ‐ OP Médio de % de inibição da x Tratamentos adipogênese = 100 OP Médio de Controle do Veículo
[159] Com o procedimento acima, todas as composições foram rastreadas quanto à sua inibição de adipogênese e os resultados foram apresentados nas tabelas 3, 4 e 5.
[160] Tabela 3: Atividade de adipogênese das composições contendo extrato de Theobroma cacao (T.C‐1) e extratos de Citrus aurantifolia (C.A‐1 a C.A‐5).
Dose da % de inibição da Comp. T.C‐1 C.A‐1 Proporçã Comp. adipogênese # o µg/m Aditivo Observado µg/mL % de inibição µg/mL %de inibição L (Calculado) C‐1 1,25 11,40 3,75 21,93 1:3 5 33,33 40,26 C‐2 1,67 15,23 3,33 19,47 1:2 5 34,7 44,78 C‐3 2,5 22,80 2,5 14,62 1:1 5 37,42 49,32 C‐4 3,33 30,37 1,67 9,76 2:1 5 40,13 53,42 C‐5 3,75 34,20 1,25 7,31 3:1 5 41,51 51,13 T.C‐1 C.A‐2 C‐6 1,67 11,40 3,33 6,86 1:2 5 18,26 34,25 C‐7 2,5 17,06 2,5 5,15 1:1 5 22,21 31,94 C‐8 3,33 22,72 1,67 3,44 2:1 5 26,16 48,61 T.C‐1 C.A‐3 C‐10 1,67 16,53 3,33 29,62 1:2 5 46,15 59,24 C‐12 3,33 32,97 1,67 14,86 2:1 5 47,83 62,56 T.C‐1 C.A‐4 C‐14 1,67 12,81 3,33 1,66 1:2 5 14,47 24,62 C‐15 2,5 19,18 2,5 1,24 1:1 5 20,42 38,88 T.C‐1 C.A‐5 C‐17 0,83 7,52 1,67 8,20 1:2 2,5 15,72 28,97 C‐18 1,25 11,33 1,25 6,14 1:1 2,5 17,47 22,54
44 / 54 Tabela 4: Atividade de adipogênese das composições contendo extrato de Theobroma cacao (T.C‐2) e extratos de Citrus aurantifolia (C.A‐1 a C.A‐4).
Dose da % de inibição da Comp. T.C‐2 C.A‐1 Proporçã Comp. adipogênese # o µg/m Aditivo Observado µg/mL % de inibição µg/mL % de inibição L (Calculado) C‐20 0,63 1,57 1,87 29,63 1:3 2,5 31,2 45,58 C‐21 0,83 2,07 1,67 26,46 1:2 2,5 28,53 40,19 C‐22 1,25 3,12 1,25 19,81 1:1 2,5 22,93 38,46 C‐23 1,67 4,17 0,83 13,15 2:1 2,5 17,32 28,74 C‐24 1,87 4,67 0,63 9,98 3:1 2,5 14,65 21,71 T.C‐2 C.A‐2 C‐25 0,83 3,09 1,67 5,34 1:2 2,5 8,43 15,34 C‐26 1,25 4,65 1,25 3,99 1:1 2,5 8,65 27,00 C‐27 1,67 6,22 0,83 2,65 2:1 2,5 8,87 11,02 T.C‐2 C.A‐3 C‐29 1,67 2,80 3,33 20,66 1:2 5 23,46 35,05 C‐31 3,33 5,76 1,67 10,30 2:1 5 16,06 24,80 T.C‐2 C.A‐4 C‐33 3,33 5,96 6,67 5,05 1:2 10 11,01 21,50 C‐34 1,25 2,41 1,25 0,5 1:1 2,5 2,91 23,80 C‐35 3,33 8,93 1,67 4,48 2:1 5 13,41 19,37 Tabela 5: Atividade de adipogênese das composições contendo extratos de Theobroma cacao (T.C‐3, T.C‐4, T.C‐5) e extratos de Citrus aurantifolia (C.A‐1 a C.A‐5). % de inibição de Dose da adipogênese T.C‐3 C.A‐1 Comp. Proporçã Comp. # o µg/m Aditivo % de Observado µg/mL µg/mL % de inibição L (Calculado) inibição C‐39 0,83 4,43 1,67 15,02 1:2 2,5 19,45 27,20 C‐40 1,25 6,67 1,25 11,24 1:1 2,5 17,91 22,31 C‐41 1,67 8,91 0,83 7,46 2:1 2,5 16,37 20,66
45 / 54 T.C‐3 C.A‐2 C‐43 5,0 6,78 5,0 8,76 1:1 10 15,54 37,33 T.C‐3 C.A‐3 C‐45 0,83 7,23 1,67 18,21 1:2 2,5 25,44 31,24 C‐47 1,67 14,54 0,83 9,05 2:1 2,5 23,59 26,00 T.C‐3 C.A‐4 C‐49 2,5 3,48 2,5 6,22 1:1 5 9,7 15,17 T.C‐3 C.A‐5 C‐51 0,83 0,86 1,67 5,97 1:2 2,5 6,83 17,86 C‐52 1,25 1,29 1,25 4,47 1:1 2,5 5,76 16,95 T.C‐4 C.A‐1 C‐59 1,67 7,10 0,83 8,54 2:1 2,5 15,64 19,22 T.C‐5 C.A‐3 C‐60 0,83 10,42 1,67 23,28 1:2 2,5 33,7 44,05 T.C‐5 C.A‐1 C‐64 1,25 2,58 1,25 15,38 1:1 2,5 17,96 22,95 EXEMPLO 16: PROCEDIMENTO GERAL PARA AUMENTO DO ENSAIO DE ADIPÓLISE
[161] Pré‐adipócitos 3T3‐L1 de um camundongo (50000 células/poço em 500 μL) foram semeados em uma placa de cultura celular de 48 poços e mantidos em DMEM contendo 10% de FBS a 37°C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2. Após as células estarem confluentes (~2 dias), a diferenciação foi iniciada usando um meio de diferenciação (DM) contendo 0,5 mM de IBMX, 1 µM de dexametasona e 500 nM de insulina em DMEM com 10% de FBS por 48 horas. O meio de cultura celular foi alterado para um pós‐DM, contendo 100nM de insulina em DMEM com 10% de FBS, e o pós‐DM foi renovadamente substituído a cada 48 horas até o 6º dia. No 7º dia, o meio foi aspirado dos poços e eles foram lavados com 600 µL de DMEM sem vermelho de fenol. As células foram tratadas com diferentes concentrações de amostras de teste (50 µL) em meio DMEM sem vermelho de fenol contendo 2% de BSA (50 µL) e incubadas por 4 horas a 37°C em uma incubadora de CO2. Após a incubação, 25 µL de sobrenadantes livres de células foram coletados dos poços em uma placa de ensaio de 96 poços e processados para ensaio de glicerol.
46 / 54
[162] Ensaio de glicerol: Vinte e cinco microlitros de padrões ou amostras foram adicionados a 100 µL de reagente de glicerol [ATP: 20,65 mg, MgCl2: 46,20 mg, sal de sódio de N‐etil‐N‐(3‐sulfopropil)‐m‐ansidina:31,10 mg, aminoantipirol: 1,90 mg, glicerol quinase: 10,2 µL, glicerol oxidase: 125 µL, HRP: 62,5 µL foram dissolvidos em 50 mL de 1XPBS] em uma placa de ensaio de 96 poços e incubados por 15 minutos em temperatura ambiente. A absorbância foi medida a 550 nm no leitor de placas Spectramax5e. Uma curva padrão de glicerol de 7 pontos foi gerada no intervalo de 0,781‐50 µg/mL. O aumento percentual na lipólise foi estimado usando a fórmula abaixo: % de aumento no teor Conc. de glicerol na amostra ‐ Conc. de glicerol no de glicerol nas = controle do veículo x 100 amostras de teste Conc. de glicerol no controle do veículo
[163] Com o procedimento acima, todas as composições foram rastreadas quanto ao seu aumento de adipólise e os resultados foram apresentados nas tabelas 6 e 7.
[164] Tabela 6: Atividade de adipólise das composições contendo extrato de Theobroma cacao (T.C‐1) e extratos de Citrus aurantifolia (C.A‐1 a C.A‐4).
Dose da % de aumento da adipólise T.C‐1 C.A‐1 Comp. Proporçã Comp. Aditivo # % de % de o µg/m Observado µg/mL µg/mL (Calculado) aumento aumento L C‐1 5,0 22,13 15,0 8,02 1:3 20 30,15 34,28 C‐2 6,67 29,52 13,33 7,12 1:2 20 36,64 47,88 C‐3 10,0 44,25 10,0 5,34 1:1 20 49,59 56,69 C‐4 3,33 14,43 1,67 2,76 2:1 5 17,19 25,18 C‐5 3,75 15,13 1,25 2,07 3:1 5 17,2 26,11 T.C‐1 C.A‐2 C‐7 5,0 17,69 5,0 5,77 1:1 10 23,46 32,05 T.C‐1 C.A‐3 C‐9 2,5 5,01 7,5 4,21 1:3 10 9,22 32,35 C‐10 6,67 14,80 13,33 13,19 1:2 20 27,99 31,93 C‐11 5,0 10,02 5,0 2,80 1:1 10 12,82 24,06 C‐12 6,67 13,37 3,33 1,86 2:1 10 15,23 24,78
47 / 54 C‐13 7,5 15,03 2,5 1,40 3:1 10 16,43 28,34 T.C‐1 C.A‐4 C‐15 5,0 8,48 5,0 5,58 1:1 10 14,06 27,68 Tabela 7: Atividade de adipólise das composições contendo extrato de Theobroma cacao (T.C‐2 e T.C‐3) e extratos de Citrus aurantifolia (C.A‐1 e C.A‐5). Dose da T.C‐2 C.A‐1 % de aumento da adipólise Comp. Proporçã Comp. # % de % de o Aditivo µg/mL µg/mL µg/m Observado aumento aumento (Calculado)
L C‐20 1,25 3,02 3,75 0,52 1:3 5 3,54 12,26 C‐21 1,67 4,04 3,33 0,46 1:2 5 4,50 16,58 C‐22 2,5 6,04 2,5 0,34 1:1 5 6,38 31,26 C‐23 3,33 8,05 1,67 0,23 2:1 5 8,28 16,27 C‐24 3,75 9,07 1,25 0,17 3:1 5 9,24 16,23 T.C‐3 C.A‐5 C‐52 10,0 6,31 10,0 8,05 1:1 20 14,36 23,95 EXEMPLO 17: PROCEDIMENTO GERAL PARA O ENSAIO DE FGF21
[165] Pré‐adipócitos 3T3‐L1 de um camundongo (150000 células/poço em 3 mL) foram semeados em uma placa de cultura celular de 6 poços e mantidos em meio DMEM contendo 10% de FBS e 4,5g/L de glicose a 37°C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2. Após as células estarem confluentes (~2 dias), a diferenciação foi iniciada usando um meio de diferenciação (DM) contendo 0,5 mM de IBMX, 1 µM de dexametasona e 500 nM de insulina em DMEM com 10% de FBS por 48 horas. O meio de cultura celular foi alterado para um pós‐DM, contendo 100nM de insulina em DMEM com 10% de FBS, e o pós‐DM foi renovadamente substituído a cada 48 horas até o 6º dia. No 7º dia, o meio foi aspirado dos poços e eles foram lavados duas vezes com meio DMEM contendo 1% de FBS. As células foram tratadas com diferentes concentrações de amostras de teste (50 µL) em meio DMEM contendo 1% de FBS (1 mL de volume total) e incubadas por mais 48 horas a 37°C em uma incubadora de CO2. Após a incubação, 50 µL de sobrenadantes livres de células foram coletados dos poços e processados para análise de FGF21 por ELISA. A análise de FGF21 por ELISA (R&D Systems Cat nº DY2539) foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante.
[166] O aumento percentual no FGF21 foi calculado usando a fórmula abaixo:
48 / 54 % de Conc. de FGF21 em tratamento ‐ Conc. de FGF21 no controle x aumento do veículo 100 do= FGF21 Conc. de FGF21 no controle do veículo
[167] Com o procedimento acima, as composições selecionadas foram rastreadas quanto ao seu aumento do FGF‐21 sobre o controle e os resultados foram resumidos na tabela 8.
[168] Tabela 8: Atividade do FGF 21 das composições contendo extratos de Theobroma cacao e extratos de Citrus aurantifolia.
Dose da % de aumento do FGF 21 T.C‐1 C.A‐1 Comp. Proporçã Comp. Aditivo # % de % de o µg/m Observado µg/mL µg/mL (Calculado) aumento aumento L C‐1 1,25 7,54 3,75 20,95 1:3 5 28,49 56,36 C‐2 1,67 10,08 3,33 18,60 1:2 5 28,68 44,21 C‐3 12,5 12,10 12,5 17,96 1:1 25 30,05 42,94 C‐4 3,33 20,09 1,67 9,33 2:1 5 29,42 41,47 C‐5 3,75 22,63 1,25 6,98 3:1 5 29,61 40,40 T.C‐1 C.A‐3 C‐10 8,33 26,01 16,67 55,83 1:2 25 81,84 90,58 T.C‐1 C.A‐4 C‐15 12,5 31,18 12,5 16,06 1:1 25 47,24 56,41 T.C‐2 C.A‐1 C‐20 1,67 1,80 3,33 17,00 1:2 5 18,8 25,78 C‐21 2,5 2,7 2,5 12,77 1:1 5 15,47 23,60 C‐22 3,33 3,60 1,67 8,53 2:1 5 12,13 22,30 T.C‐2 C.A‐5 C‐36 1,67 2,67 3,33 11,79 1:2 5 14,46 61,60 C‐37 2,5 3,99 2,5 8,86 1:1 5 12,85 59,10 C‐38 3,33 5,31 1,67 5,92 2:1 5 11,23 42,39 EXEMPLO 18: PROCEDIMENTO GERAL PARA ENSAIO DE UCP‐1
[169] Pré‐adipócitos 3T3‐L1 de um camundongo (150000 células/poço em 3 mL) foram semeados em uma placa de cultura celular de 6 poços e mantidos em meio DMEM contendo 10% de FBS e 4,5g/L de glicose a 37°C em um atmosfera umidificada
49 / 54 de 5% de CO2. Após as células estarem confluentes (~2 dias), a diferenciação foi iniciada usando um meio de diferenciação (DM) contendo 0,5 mM de IBMX, 1 µM de dexametasona e 500 nM de insulina em DMEM com 10% de FBS por 48 horas. O meio de cultura celular foi alterado para um pós‐DM, contendo 100nM de insulina em DMEM com 10% de FBS, e o pós‐DM foi renovadamente substituído a cada 48 horas até o 6º dia. No 7º dia, o meio foi aspirado dos poços e eles foram lavados duas vezes com meio DMEM contendo 1% de FBS. As células foram tratadas com diferentes concentrações de amostras de teste (50 µL) em meio DMEM contendo 1% de FBS (1 mL de volume total) e incubadas por mais 48 horas a 37°C em uma incubadora de CO2. WESTERN BLOT
[170] Após a incubação, as placas de cultura celular foram colocadas em uma bandeja de gelo e lavadas duas vezes com 1XPBS. Oitenta microlitros de tampão de lise (10 mM de Tris‐HCl com pH 7,4, 150 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 1 mM de PMSF, 10 µg/mL de aprotinina, 10 µg/mL de leupeptina, Triton X‐100 a 1%, 1 mM de NaF, 1 mM de Na3VO4, desoxicolato de sódio a 0,5% e 1 µM de pepstatina) foram adicionados a cada poço e os lisados celulares foram recolhidos nos respectivos tubos de microcentrífuga. Os tubos de microcentrífuga foram sonicados por 1 min. e a proteína celular foi recolhida após centrifugação a 21952xg. A proteína foi quantificada usando o conjunto de ensaio de proteína Pierce BCA (Thermo Scientific Cat nº 23225). SDS‐PAGE foi realizado para as amostras de proteínas e as proteínas resolvidas foram transferidas para a membrana de nitrocelulose usando o método de imunotransferência enzimática. Resumidamente, 10 µg de proteína foram carregados em gel de acrilamida (resolução de 10%) e funcionou a 100V por aproximadamente 1h 40 min. No final da execução, as proteínas foram transferidas para a membrana de nitrocelulose, colocando o sistema de transferência na câmara de 4°C (100V por 2 horas). Após a transferência, a UCP‐1 foi sondada usando anticorpo anti‐UCP‐1 (Thermo Scientific Cat nº PA1‐24894; diluição 1:10000), sendo incubada a 4°C por 18 horas. A β‐Actina foi sondada usando anticorpo anti‐β‐actina (Sigma Cat nº A4700‐100 µL; diluição 1:10000),sendo incubada em temperatura ambiente por 2 horas. Um anticorpo secundário anticabra de camundongo de afinipura com peroxidase (Jackson Immuno
50 / 54 Research Cat nº 205‐035‐108; diluição 1: 10000) foi adicionado e incubado por 30 minutos em temperatura ambiente. Finalmente, as manchas foram desenvolvidas usando um substrato quimioluminescente (Thermo Scientific Cat nº 34080) e as imagens foram capturadas usando o gerador de imagens Bio‐Rad Molecular (Modelo: ChemiDOC XRS+). As intensidades das bandas da proteína UCP‐1 foram calculadas usando o software Carestream MI e normalizadas usando β‐actina para obtenção de índices relativos. A expressão percentual de UCP‐1 sobre o controle foi calculada usando a seguinte fórmula: % da expressão de Expressão de UCP1 relativa em amostras de teste ‐ x UCP‐l sobre = Expressão relativa de UCP‐1 no controle 100 controle Expressão relativa de UCP‐1 em amostras de teste
[171] Com o procedimento acima, as composições selecionadas foram rastreadas quanto à sua expressão de % de UCP‐1 sobre o controle e os resultados são apresentados na tabela 9. Tabela 9: Expressão de UCP‐1 das composições de extratos de Theobroma cacao e de Citrus aurantifolia. Dose Índice relativo de expressão de % da expressão de Comp. # Proporção Controle µg/mL UCP‐1 (unidades arbitrárias) UCP‐1 sobre o controle C‐1 1:3 25 0,673 38,48 C‐2 1:2 25 0,631 34,23 C‐3 1:1 25 0,415 0,627 33,81 C‐4 2:1 25 0,599 30,71 C‐5 3:1 25 0,582 28,69 C‐58 1:1 25 0,820 24,63 0,618 C‐59 2:1 25 0,702 11,96 EXEMPLO 19: PROCEDIMENTO GERAL PARA ENSAIO DE β3AR
[172] Pré‐adipócitos 3T3‐L1 de UM camundongo (150000 células/poço em 3 mL) foram semeados em uma placa de cultura CELULAR de 6 poços e mantidos em meio DMEM contendo 10% de FBS e 4,5g/L de glicose a 37°C em um atmosfera umidificada de 5% de CO2. Após as células estarem confluentes (~2 dias), a diferenciação foi iniciada usando um meio de diferenciação (DM) contendo 0,5 mM de IBMX, 1 µM de dexametasona e 500 nM de insulina em DMEM com 10% de FBS por 48 horas. O meio
51 / 54 de cultura celular foi alterado para um pós‐DM, contendo 100nM de insulina em DMEM com 10% de FBS, e o pós‐DM foi renovadamente substituído a cada 48 horas até o 6º dia. No 7º dia, o meio foi aspirado dos poços e eles foram lavados duas vezes com meio DMEM contendo 1% de FBS. As células foram tratadas com diferentes concentrações de amostras de teste (50 µL) em meio DMEM contendo 1% de FBS (1 mL de volume total) e incubadas por mais 48 horas a 37°C em uma incubadora de CO2. WESTERN BLOT
[173] Após a incubação, as placas de cultura celular foram colocadas em uma bandeja de gelo e lavadas duas vezes com 1XPBS. Oitenta microlitros de tampão de lise (10 mM de Tris‐HCl com pH 7,4, 150 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 1 mM de PMSF, 10 µg/mL de aprotinina, 10 µg/mL de leupeptina, Triton X‐100 a 1%, 1 mM de NaF, 1 mM de Na3VO4, desoxicolato de sódio a 0,5% e 1 µM de pepstatina) foram adicionados a cada poço e os lisados celulares foram recolhidos nos respectivos tubos de microcentrífuga. Os tubos de microcentrífuga foram sonicados por 1 min. e a proteína celular foi recolhida após centrifugação a 21952xg. A proteína foi quantificada usando o conjunto de ensaio de proteína Pierce BCA (Thermo Scientific Cat nº 23225). SDS‐PAGE foi realizado para as amostras de proteínas e as proteínas resolvidas foram transferidas para a membrana de nitrocelulose usando o método de imunotransferência enzimática. Resumidamente, 10 µg de proteína foram carregados em gel de acrilamida (resolução de 10%) e funcionou a 100 V por aproximadamente 1h 40 min. No final da execução, as proteínas foram transferidas para a membrana de nitrocelulose, colocando o sistema de transferência na câmara de 4°C (100 V por 2 horas). Após a transferência, a Β3 AR foi sondada usando anticorpo anti‐Β3 AR (Biorbyt Cat nº orb221343; diluição 1:500), sendo incubada a 4°C por 18 horas. A β‐actina foi sondada usando anticorpo anti‐ β‐actina (Sigma Cat nº A4700‐100uL; diluição 1:10000), incubando à temperatura ambiente durante 2 horas. Um anticorpo secundário anticabra de camundongo de afinipura com peroxidase (Jackson Immuno Research Cat nº 205‐035‐108; diluição 1:10000) foi adicionado e incubado por 30 minutos em temperatura ambiente. Finalmente, as manchas foram desenvolvidas usando um substrato quimioluminescente (Thermo Scientific Cat nº 34080) e as imagens foram
52 / 54 capturadas usando o gerador de imagens Bio‐Rad Molecular (Modelo: ChemiDOC XRS+). As intensidades das bandas da proteína do β3AR foram calculadas usando o software Carestream MI e normalizadas usando β‐actina para obtenção de índices relativos. A expressão percentual de β3AR sobre o controle foi calculada usando a seguinte fórmula: % de expressão Expressão relativa de β3AR em amostras de teste ‐ x de β3AR sobre = Expressão relativa de β3AR no controle 100 o controle Expressão relativa de β3AR em amostras de teste
[174] Com o procedimento acima, todas as composições são rastreadas quanto à sua expressão da β3AR sobre o controle e os resultados foram apresentados na tabela 10. Tabela 10: Expressão de β3AR das composições de Theobroma cacao e Citrus aurantifolia. Dose Índice relativo da expressão da % de expressão de Comp. # Proporção Controle µg/mL Β3AR (unidades arbitrárias) Β3AR obre o controle C‐1 1:3 2,5 0,821 36,17 C‐2 1:2 2,5 0,838 37,47 C‐3 1:1 2,5 0,524 1,070 51,02 C‐21 1:2 2,5 0,645 18,75 C‐22 1:1 2,5 0,600 12,66 EXEMPLO 20
[175] Atividade antiobesidade in vivo da composição 6 ou 7, contendo extrato aquoso de Theobroma cacao (T.C‐1) e extrato aquoso de etanol a 50% de Citrus aurantifolia (C.A‐1), maltodextrina e siloide em modelo de obesidade induzida por dieta rica em gordura de ratos Sprague‐Dawley.
[176] Indução: Ratos Sprague‐Dawley saudáveis selecionados foram aleatoriamente designados para controle normal (N = 7) ou grupos de dieta rica em gordura (n = 34). Todos os animais alocados no grupo de obesidade induzida por dieta rica em gordura foram experimentalmente tornados obesos por meio de intervenção dietética durante as primeiras quatro semanas do período de indução por meio de dieta rica em gordura. No final do período de indução, os animais obesos foram randomizados com base nos pesos corporais em quatro grupos (n=7) viz. G2 ‐ Controle obeso, G3 ‐
53 / 54 Composição 67 (100mg/Kg; p.o.), G4 ‐ Composição 67 (300mg/Kg; p.o.) e G5 ‐ sibutramina (l0mg/Kg; p.o.).
[177] Tratamento: Após 4 semanas da fase de indução, os animais foram tratados por via oral (usando gavagem de alimentação oral) com substâncias de teste alocadas ou veículo diariamente durante 4 semanas. Os animais dos grupos de tratamento foram suplementados com 100 mg (G3) ou 300 mg/kg (G4) de peso corporal da composição 67 (C‐67) ou 10 mg/kg de peso corporal de sibutramina em 10 mL de CMC a 0,5% em água por 4 semanas. O grupo de animais controle recebeu apenas o veículo (10 mL de CMC 0,5% em água) durante este período. Durante a fase de tratamento, todos os animais receberam a dieta padrão para roedores até o final do estudo.
[178] Parâmetros avaliados: O peso corporal de animais individuais foi registrado semanalmente durante toda a duração do estudo e os pesos corporais médios foram determinados. O ganho de peso corporal foi calculado semanalmente durante a fase de tratamento em comparação com os respectivos pesos corporais iniciais no final do tratamento. Os resultados foram apresentados nas Figuras 1A e 1B.
[179] Consumo de calorias na dieta: Durante a fase de tratamento do estudo, foi registrada a quantidade total de consumo de ração pelos ratos experimentais. A quantidade total de ração consumida em 28 dias foi calculada para estimar o consumo diário de ração (em gramas). O consumo médio de ração (em gramas) foi multiplicado pela quantidade de energia (kJ/grama) fornecida pela ração regular (3,43 kJ/grama) e pela dieta rica em gordura (5,15 kJ/grama). Os consumos calóricos dietéticos médios diários (kJ/dia) pelos grupos experimentais são apresentados na Figura II.
[180] Após a eutanásia, os tecidos adiposos viscerais (retroperitoneal, epididimal, perirrenal e mesentérico) foram coletados dos ratos e pesados em uma balança eletrônica com sensibilidade de 0,01 g (Mettler Toledo, Columbus, OH). As observações sobre a modulação do peso da gordura visceral estão resumidas na Figura H1.
[181] Morfometria do tecido adiposo: Os tecidos adiposos do epidídimo coletados de animais individuais foram fixados em formalina a 10%. Os tecidos incluídos em parafina foram cortados em seções de 5 µm e as seções foram processadas seguindo
54 / 54 um protocolo padrão. As seções de tecido coradas com hematoxilina‐eosina foram observadas em microscópio a 20X (Axio Scope A1, Carl Zeiss GmbH, Jena, Alemanha). Os tamanhos dos pixels das células de gordura foram estimados e uma escala de conversão de 0,1694 pm por pixel foi usada para estimar a área de cada célula. Os dados do tamanho das células de gordura são representados na Figura IV.
[182] Avaliação de biomarcadores séricos: Amostras de sangue foram coletadas de todos os animais no final do estudo. O soro foi separado da amostra de sangue e analisado quanto a leptina, triiodotironina (T3) e tiroxina (T4) usando conjuntos ELISA comerciais (conjunto Leptina ELISA, EMD Millipore, Billerica, MA; conjuntos T3 e T4 ELISA, Calbiotech, EL Cajon, CA). Os ensaios foram realizados seguindo as instruções fornecidas pelos vendedores. Os dados de leptina sérica para os grupos de tratamento em comparação com o grupo de controle estão resumidos na Figura V. O equilíbrio do hormônio tireoidiano (T3/T4) foi calculado para todos os animais e os resultados estão resumidos.
[183] Imuno‐histoquímica de células adiposas: A imuno‐histoquímica da UCP‐1 foi realizada em tecido adiposo epididimal embebido em parafina usando o método de coloração DAB de acordo com as instruções do conjunto (HMD Millipore, Billerica, MA). As seções de tecido reagiram com anticorpo da UCP‐1 (Invitrogen, Carlsbad, CA), seguido de HRP conjugado com estreptavidina. Finalmente, a reação cromogênica específica do anticorpo foi desenvolvida com o diaminobenzedeno (DAB). As imagens das seções de tecido coradas com UCP‐1 foram capturadas usando um microscópio Axio Observer, Z1 (Carl‐Zeiss, Oberkochen, Alemanha). As fotomicrografias representativas das seções de tecido adiposo epididimal coradas com UCP‐1 são apresentadas na Figura VII.

Claims (6)

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REIVINDICAÇÕES 1) “COMPOSIÇÃO SINÉRGICA FITOTERÁPICA”, caracterizado por compreender a combinação de um primeiro ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Theobroma cacao e um segundo ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Citrus aurantifolia para obtenção de, pelo menos, um benefício à saúde selecionado entre prevenção, controle ou tratamento da obesidade e/ou sobrepeso, melhoria da massa corporal magra, melhoria do escurecimento do tecido adiposo branco (WAT)/melhoria da formação do tecido adiposo marrom (BAT), aumento da taxa metabólica basal (BMR)/gasto de energia em repouso, aumento da termogênese, melhoria da função da tireoide, manutenção do peso corporal saudável, aumento da saciedade, apoio à perda de peso, melhoria da perda de gordura e manutenção de um corpo magro.
2) “COMPOSIÇÃO SINÉRGICA” de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por extratos ou frações serem padronizados a, pelo menos, um composto marcador de referência fitoquímica ou um marcador biológico ativo no extrato ou fração, em que o composto marcador fitoquímico ou grupo de compostos fitoquímicos está na faixa de concentração de 0,1% a 99% em peso do extrato.
3) “COMPOSIÇÃO SINÉRGICA” de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por peso do ingrediente derivado da semente de Theobroma cacao variar na faixa de 10% a 90% e o peso do ingrediente derivado da casca do fruto de Citrus aurantifolia variar na faixa de 90% a 10%.
4) “COMPOSIÇÃO SINÉRGICA” de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por referido extrato ou fração de semente da Theobroma cacao ser padronizado para teobromina; em que a teobromina está na faixa de concentração de 0,1% a 20% em peso da composição.
5) “COMPOSIÇÃO SINÉRGICA” de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo referido extrato ou fração da casca do fruto de Citrus aurantifolia ser padronizado para limonina, em que a limonina está na faixa de concentração de 0,1% a 10% em peso da composição.
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6) “COMPOSIÇÃO SINÉRGICA” de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender, opcionalmente, pelo menos, um componente selecionado entre excipientes, transportadores e diluentes farmacêutica, nutracêutica ou dieteticamente aceitáveis. 7) “COMPOSIÇÃO SINÉRGICA” de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por excipientes, transportadores e diluentes farmacêutica, nutracêutica ou dieteticamente aceitáveis serem selecionados a partir de monossacarídeos, tais como glicose, dextrose, frutose, galactose etc.; dissacarídeos, tais como, entre outros, sacarose, maltose, lactose, lactulose, trealose, celobiose, quitobiose, etc.; policarboidratos, tais como amido e amido modificado, tais como glicolato de amido sódico, amido pré‐ gelatinizado, amido solúvel e outros amidos modificados; dextrinas que são produzidas por hidrólise de amido ou glicogênio, como a dextrina amarela, dextrina branca, maltodextrina, alginatos, etc.; álcoois poli‐hídricos ou álcoois de açúcar, tais como, entre outros, sorbitol, manitol, inositol, xilitol, isomalte, etc.; derivados à base de celulose, tais como, entre outros, celulose microcristalina, hidroxipropilmetilcelulose, hidroxietilcelulose, etc.; silicatos, tais como, entre outros, neusilina, veegum, talco, dióxido de silício coloidal, etc.; estearatos metálicos, tais como, entre outros, estearato de cálcio, estearato de magnésio, estearato de zinco, etc.; ácidos orgânicos, tais como ácido cítrico, ácido tartárico, ácido málico, ácido succínico, ácido láctico, ácido l‐ ascórbico, etc.; ésteres de ácidos graxos e ésteres de poli sorbato, gomas naturais, tais como, entre outros, acácia, carragenina, goma guar, goma xantana etc.; um grupo de vitamina b, nicotinamida, pantotenato de cálcio, aminoácidos, proteínas, tais como, entre outras, caseína, gelatina, pectina, ágar; sais de metais inorgânicos, tais como, entre outros, cloreto de sódio, cloreto de cálcio, hidróxido de sódio, cloreto de potássio, hidróxido de potássio, fosfato dicálcico, sulfato de zinco, cloreto de zinco, etc.; pigmentos naturais, sabores, conservantes de classe I e classe II e soluções aquosas, alcoólicas, hidroalcóolicas e orgânicas dos ingredientes listados acima, sozinhos ou em combinações. 8) “COMPOSIÇÃO SINÉRGICA” de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por extrato, fração ou fitoquímico ser obtido a partir de, pelo menos, uma parte da planta
3 / 5 selecionada a partir do grupo compreendendo folhas, caules, caules tenros, galhos tenros, partes aéreas, casca de fruta inteira, crosta da casca de fruta, semente, capítulo da flor, raiz, casca, madeira dura ou a planta inteira ou misturas respectivas. 9) “COMPOSIÇÃO SINÉRGICA” de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por extrato, fração ou fitoquímico ser produzido utilizando, pelo menos, um solvente selecionado do grupo compreendendo álcoois C1‐C5, como etanol, metanol, n‐ propanol, álcool isopropílico; cetonas, como acetona, metilisobutilcetona; solventes clorados, como dicloreto de metileno e clorofórmio, água, hidrocarbonetos C1‐C7, como hexano; ésteres, como acetato de etila e semelhantes e misturas respectivas. 10) “COMPOSIÇÃO SINÉRGICA” de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizado por composição(ões) ser(em) formulada(s) em uma forma de dosagem selecionada entre uma forma de pó seco, forma líquida, bebida, formulação dispersível em água, produto alimentar, suplemento dietético ou qualquer forma adequada, tal como um comprimido, uma cápsula, um mastigável macio ou goma de gelatina. 11) “COMPOSIÇÃO SINÉRGICA” de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizado por composições serem formuladas em suplementos nutricionais/dietéticos que podem ser contemplados/feitos na forma de dosagem de alimentos saudáveis ou alimentos para usos de saúde específicos, tais como alimentos sólidos, como chocolate ou barras nutricionais, uma bebida dispersível em água, alimentos semissólidos, como cremes, geleias, géis ou uma bebida do tipo bebida refrescante, bebida com bactérias de ácido láctico, gotas, doces, gomas de mascar, balas de goma, iogurtes, sorvetes, pudins, jujuba de feijão azuki, geleias, biscoitos, chás, refrigerantes, sucos, leite, café, cereal, petiscos e afins. 12) “COMPOSIÇÃO SINÉRGICA” de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por referido benefício à saúde selecionado entre prevenção, controle ou tratamento da obesidade e/ou excesso de peso; melhoria da massa corporal magra, melhoria do escurecimento do tecido adiposo branco (WAT)/melhoria da formação do tecido adiposo marrom (BAT), aumento da taxa metabólica basal (BMR)/gasto de energia em repouso, aumento da termogênese, melhoria da função da tireoide, manutenção do
4 / 5 peso corporal saudável, aumento da saciedade, apoio à perda de peso, melhoria da perda de gordura e manutenção de um corpo magro ser obtido através de, pelo menos, um entre: promoção da lipólise, inibição da adipogênese, acúmulo de lipídios, aumento do fator de crescimento de fibroblastos 21 (FGF‐21), aumento da proteína desacopladora (UCP‐1) e aumento de β3‐adrenoceptores (β3‐ARs). 13) “MÉTODO DE PREVENÇÃO, CONTROLE OU TRATAMENTO DA OBESIDADE E/OU EXCESSO DE PESO”, compreendendo melhoria da massa corporal magra, melhoria do escurecimento do tecido adiposo branco (WAT)/melhoria da formação do tecido adiposo marrom (BAT), aumento da taxa metabólica basal (BMR)/gasto de energia em repouso, aumento da termogênese, melhoria da função da tireoide, manutenção do peso corporal saudável, aumento da saciedade, apoio à perda de peso, melhoria da perda de gordura e manutenção de um corpo magro em um ser humano ou animal, caracterizado por método compreender suplementar o indivíduo com uma dose adequada de uma composição sinérgica fitoterápica, compreendendo a combinação de um primeiro ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Theobroma cacao e um segundo ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados de Citrus aurantifolia e opcionalmente contendo, pelo menos, um ingrediente adicional selecionado de um excipiente, diluente e transportador farmaceuticamente aceitável. 14) “MÉTODO DE PROMOÇÃO DA LIPÓLISE, INIBIÇÃO DA ADIPOGÊNESE, INIBIÇÃO DO ACÚMULO DE LIPÍDIOS, AUMENTO DO FATOR DE CRESCIMENTO DE FIBROBLASTOS 21 (FGF‐21), AUMENTO DA EXPRESSÃO DA PROTEÍNA DESACOPLADORA (UCP‐1) E AUMENTO DE Β3‐ADRENOCEPTORES (Β3‐ARS) EM UM SER HUMANO OU ANIMAL”, caracterizado por método compreender suplementar o ser humano ou animal com uma dose adequada de uma composição sinérgica fitoterápica, compreendendo a combinação de um primeiro ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Theobroma cacao e um segundo ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Citrus aurantifolia e opcionalmente
5 / 5 contendo, pelo menos, um ingrediente adicional selecionado a partir de um excipiente, diluente e transportador farmaceuticamente aceitável. 15) “MÉTODO” de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado por suplementação do ser humano ou animal com uma dose adequada ocorrer na forma de comprimidos, cápsulas, comprimidos de liberação controlada ou uso de revestimentos à base de um polímero de liberação controlada por técnicas incluindo nanotecnologia, microencapsulação, sistemas transportadores coloidais e outros sistemas de distribuição de fármacos para obter o benefício terapêutico desejado. 16) “USO DE UMA COMPOSIÇÃO SINÉRGICA FITOTERÁPICA”, caracterizado por compreender a combinação de um primeiro ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Theobroma cacao e um segundo ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, fitoquímicos e misturas respectivas derivados da Citrus aurantifolia e opcionalmente contendo, pelo menos, um ingrediente adicional selecionado de um excipiente, diluente e transportador farmaceuticamente aceitáveis para prevenir, controlar ou tratar a obesidade e/ou excesso de peso; melhorar a massa corporal magra, melhorar o escurecimento do tecido adiposo branco (WAT)/melhorar a formação do tecido adiposo marrom (BAT), aumentar a taxa metabólica basal (BMR)/gasto de energia em repouso, aumentar a termogênese, melhorar a função da tireoide, manter o peso corporal saudável, aumentar a saciedade, apoiar a perda de peso, melhorar a perda de gordura e manter um corpo magro.
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