JP6026639B2 - フジバカマ属の抽出物を含有する骨代謝疾患の予防及び治療用組成物及びその製造方法 - Google Patents

フジバカマ属の抽出物を含有する骨代謝疾患の予防及び治療用組成物及びその製造方法 Download PDF

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Description

本発明は、フジバカマ属の抽出物を有効成分とする肥満及び骨代謝疾患の予防及び治療用組成物に関する。本発明の組成物は、肥満及び骨代謝疾患の予防及び治療のための健康機能食品、及び医薬品の製造に活用されうる。
骨多孔症は、骨の量と質との減少によって、骨が弱くなって骨折が起こりやすい状態を言う。骨多孔症は、閉経期以後の女性で特に頻繁に発生し、これは、エストロゲンの分泌減少によって、骨の量が顕著に減少する疾患である。骨量の減少は、個人差、または他のさまざまな原因によって、その程度の差があるが、病的に過多に骨の量が減少して一定値以下に低下すれば、小さな衝撃にも骨折しやすくなる。骨多孔症は、その症状自体よりは、骨の弱化による各種骨折、特に、大腿骨骨折または脊椎骨折などによって、長期間活動を制限されて健康な生活を営むことができず、結果的に、老人層の死亡原因の１５％になると知られている。
過度な破骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）の活性によって誘発された骨疾患の治療や予防の目的として内因性調節因子の以外にも、多様な物質が研究されている。このような目的として現在使われている薬物は、一定の薬理作用を表わしているが、さまざまな副作用と服用上の難点とを有していることが知られていて、新たな作用及び薬物構造を有しながら、毒性と副作用とが少なく、骨多孔症の予防または治療に効果的な新物質の開発が要求されている。また、このような新物質は、民間療法で昔から使われた毒性のない天産物から発見される可能性が高いために、天産物から新薬を創出しようとする試みが活発に進められている。
今まで、骨多孔症に関する研究は、骨を吸収する破骨細胞と骨を形成する造骨細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）との間の不均衡に焦点を合わせて進められた。しかし、骨多孔症は、骨に関与する細胞以外に、骨髄（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ）由来の脂肪細胞にも大きく影響されるということと関連して、続けて研究が進められている。
骨量のほとんどは、１２歳〜１８歳に生成され、この際、骨の形成と共に、ホルモン、環境的な影響を受ける。この期間にホルモン配列の変化や骨吸収の促進は、骨量を減少させて、骨折の危険性が高くなる。重要な点は、幼い時代の骨折は骨格の不十分による骨構造の変化と肥満とを導ける身体の構成成分の変化と関わるということである。老化による骨喪失は、脂肪と骨との関係に重要な影響力がある。老化の平凡な特徴は、脂肪による骨髄の流入である。造骨細胞と脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）は、同じ前駆体を有し、間葉幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）から由来する。骨髄で脂肪細胞の数字は、間葉幹細胞から造骨細胞の分化は減り、脂肪細胞への分化を高め、老化と共に増加する。造骨細胞が形成されるときに伴われる脂肪細胞の阻害は、脂肪細胞の形成を抑制するか、存在する脂肪細胞を造骨細胞に切り替えることによって、骨多孔症の予防と治療との目標になりうる。結論的に、脂肪（ｆａｔ）と骨（ｂｏｎｅ）との関係は、老化と関連した骨の喪失を病理生理学的に理解可能にし、骨多孔症の治療と診断とに新たな接近を提供する。
したがって、造骨細胞と脂肪細胞との関係は、老化と関連した骨多孔症を治療し、予防するための標的として利用されうると認識され、造骨細胞の分化を高め、脂肪細胞の分化は低める物質を探し、それを機能性食品として開発しようとする努力が多く進められている。特に、このような物質は、抗肥満効果を表わし、骨細胞分化の増加のための骨折などの骨疾患にも直接に作用することができるので、さらに重要な食薬品／医薬品の素材である。
一方、大韓民国内に分布するフジバカマ属（Ｅｕｐａｔｏｒｉｕｍ ｓｐｐ．）は、フジバカマ（Ｅ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、サワヒヨドリ（Ｅ．ｌｉｎｄｌｅｙａｎｕｍ）、ヒヨドリバナ（Ｅ．ｍａｋｉｎｏｉ ｖａｒ．ｏｐｐｉｓｉｔｉｆｏｌｉｕｍ）、西洋フジバカマ（Ｅ．ｒｕｇｏｓｕｍ）が主に知られており、水辺の湿った草地でよく育つ宿根性多年草であって、食用、観賞用または薬用として使われ、発表、散寒、透疹の効能があり、脱抗、発疹しない麻疹、リウマチ性の腰痛、風邪による咳嗽の治療に使われたが、いまだに肥満及び骨多孔症を含む骨代謝疾患に対する効果については知られていない。
本発明の目的は、毒性のない天産物で由来した肥満及び骨代謝疾患の予防及び治療用組成物を提供し、これより健康機能食品及び医薬品を製造することである。
本発明の肥満及び骨代謝疾患の予防及び治療用組成物は、フジバカマ属の抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。
本発明の肥満及び骨代謝疾患の予防及び改善用健康機能食品は、フジバカマ属の抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。
本発明のフジバカマ属は、フジバカマ、サワヒヨドリ、ヒヨドリバナ、西洋フジバカマ、及びこれらの同属近縁植物から選択された何れか１つ以上の植物であり、望ましくは、フジバカマである。前記フジバカマの全草、葉、茎または花を抽出物の製造に使い、望ましくは、韓国の気候を基準に７月〜９月に採取されたものが活性に優れている。
本願で定義される抽出物は、精製水を含んだ水、炭素数１〜４の低級アルコール、非極性溶媒、またはこれらの混合溶媒に可溶したフジバカマ属の抽出物を意味する。
以下、本発明を詳しく説明する。
本発明のフジバカマ属の抽出物は、下記のように製造可能である。
本発明のフジバカマ属の抽出物は、フジバカマ属の植物の全草、茎または花を陰干しして磨砕した後、乾燥された試料の重量の約１〜５０倍、望ましくは、約１０〜４０倍分量の水、炭素数１〜４の低級アルコール、非極性溶媒、またはこれらの混合溶媒から選択された溶媒であって、２０〜１１０℃、望ましくは、８０〜１００℃で約１〜６時間、望ましくは、２〜４時間撹拌抽出、熱湯抽出、冷浸抽出、還流冷却抽出、超音波抽出、または超臨界抽出などの抽出方法を使って、望ましくは、熱湯抽出した後、収得した抽出液を濾過、減圧濃縮または乾燥して、本発明の生薬抽出物が得られる。
前記非極性溶媒としては、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、酢酸エチル、ヘキサン、または超臨界流体のうち何れか１つ以上が使われる。
また、前記混合溶媒としてアルコール水溶液が使われる場合、水と前記低級アルコールとの混合比が５（ｖ／ｖ）％〜９９．９％（ｖ／ｖ）であるアルコール水溶液が使われる。望ましくは、７０〜９９．９（ｖ／ｖ）％のメタノールまたはエタノール水溶液を溶媒として使う。また、前記メタノールまたはエタノール水溶液で溶媒抽出して抽出物を得た後、ヘキサンで溶媒分画したヘキサン分画物、さらに、そのヘキサン分画物をジクロロメタンで再び溶媒分画した分画物で、造骨細胞分化増大活性及び脂肪細胞分化抑制活性がさらに優れている。
本発明の肥満及び骨代謝疾患の予防及び治療用組成物は、造骨細胞分化増大活性及び脂肪細胞分化抑制活性を表わし、組成物総重量に対して、前記フジバカマ属の抽出物を０．１〜５０％重量で含む。
しかし、前記のような組成は、必ずしもこれに限定されるものではなく、患者の状態及び疾患の種類、及び進行程度によって変わる。
本発明のフジバカマ属の抽出物を含む肥満及び骨代謝疾患の予防及び治療用組成物は、通常、薬学組成物の製造に使う適切な担体、賦形剤及び希釈剤をさらに含みうる。
本発明による抽出物を含む組成物は、それぞれ通常の方法によって、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの経口用剤形、外用剤、座剤、及び滅菌注射溶液の形態で剤形化して使われ、抽出物を含む組成物に含まれる担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油が挙げられる。製剤化する場合には、普通使う充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使って調剤される。経口投与のための固型製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固型製剤は、前記抽出物に少なくとも１つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、酢酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウムタルクのような潤滑剤も使われる。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、よく使われる単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外にさまざまな賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれうる。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、座剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使われる。座剤の基剤としては、ハードファット（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、トウイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使われる。
本発明の抽出物の望ましい投与量は、患者の状態及び体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路及び期間によって異なるが、当業者によって適切に選択されうる。しかし、望ましい効果のために、本発明の抽出物は、１日０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｇ／ｋｇで、望ましくは、１ｍｇ／ｋｇ〜１ｇ／ｋｇで投与することが望ましい。投与は、１日に１回投与することもでき、数回分けて投与することができる。したがって、前記投与量は、如何なる面でも、本発明の範囲を限定するものではない。
本発明の組成物は、ラット、マウス、家畜、人間などの哺乳動物に多様な経路で投与される。投与のあらゆる方式は、予想されうるが、例えば、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜または脳血管内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）注射によって投与される。
本発明は、造骨細胞分化増大活性及び脂肪細胞分化抑制活性を表わすフジバカマ属の抽出物及び食品学的に許容可能な食品補助添加剤を含む肥満及び骨代謝疾患の予防及び改善用健康機能食品を提供する。
本発明の健康機能食品は、各種食品類、ガム、お茶、ビタミン複合剤、健康補助食品類などがあり、粉末、顆粒、錠剤、カプセルまたは飲料である形態で使うことができる。
本発明のフジバカマ属の抽出物自体は、毒性及び副作用はほとんどないので、予防目的として長期間服用時にも、安心して使うことができる。
本発明の前記抽出物が、肥満及び骨代謝疾患の予防及び改善を目的として食品または飲料に添加されるとき、食品または飲料中の前記抽出物の量は、一般的に本発明の健康食品組成物は、全体食品重量の０．０１〜１５重量％で加え、健康飲料組成物は、１００ｍｌを基準に０．０２〜１０ｇ、望ましくは、０．３〜１ｇの比率で加えることができる。
本発明の健康飲料組成物は、指示された比率で必須成分として前記抽出物を含有することの以外に、液体成分には特別な制限点はなく、通常の飲料のようにさまざまな香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含有することができる。前述した天然炭水化物の例は、モノサッカライド、例えば、葡萄糖、果糖などのジサッカライト、例えば、マルトース、スクロースなどのポリサッカライド、例えば、デキストリン、シクロデキストリンのような通常の糖及びキシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールである。前述したものの以外の香味剤として、天然香味剤（タウマチン、ステビア抽出物（例えば、レバウディオサイドＡ、グリチルリチンなど）及び合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を有利に使うことができる。前記天然炭水化物の比率は、本発明の組成物１００ｍｌ当たり一般的に約１〜２０ｇ、望ましくは、約５〜１２ｇである。
前記成分以外に、本発明の健康機能食品は、さまざまな営養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤及び天然風味剤などの風味剤、着色剤及び重鎮剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使われる炭酸化剤などを含有することができる。その他に、本発明の健康機能食品は、天然フルーツジュース及びフルーツジュース飲料及び野菜飲料の製造のための果肉を含有することができる。このような成分は、独立して、または組み合わせて使うことができる。このような添加剤の比率は、そんなに重要ではないが、本発明の組成物１００重量部当たり０〜約２０重量部の範囲で選択されることが一般的である。
本発明のフジバカマ属の抽出物は、脂肪細胞の分化に関連した遺伝子であるＰＰＡＲγ、ＡＰ２、ＣＤ３６、ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ Ｃ／ＥＢＰα、ＬＰＬ活性を阻害し、造骨細胞の分化に関連した遺伝子であるＡＬＰ、ｏｓｔｅｒｉｘ、ＲＵＮＸ２活性を高め、卵巣切除による骨多孔症動物モデルでは、骨密度（ＢＭＤ）の増加と骨髄内の脂肪細胞とを減少させて、肥満と老化とによる骨喪失による骨多孔症の予防、改善及び治療効果を有する健康機能食品及び医薬品として使われる。
大韓民国京畿道楊州市の紺岳山で収穫する前のフジバカマの写真である。 Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株でフジバカマの全草と各部位別抽出物とを骨細胞分化培地で９日間処理した後、ＡＬＰ活性に及ぼす影響を示す写真である。 Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株でフジバカマの全草と各部位別抽出物とを脂肪細胞 分化培地で９日間処理した後、脂肪細胞分化阻害効果を示す写真である。 Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株でフジバカマの葉抽出物を骨細胞分化培地で９日間処理した後、造骨細胞の分化に関連した遺伝子の相対的なｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。 Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株でフジバカマの茎抽出物を骨細胞分化培地で９日間処理した後、造骨細胞の分化に関連した遺伝子の相対的なｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。 Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株でフジバカマの花抽出物を骨細胞分化培地で９日間処理した後、造骨細胞の分化に関連した遺伝子の相対的なｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。 Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株でフジバカマの全草を骨細胞分化培地で１０日間処 理した後、造骨細胞の分化に関連した遺伝子の相対的なｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。 Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株でフジバカマの葉抽出物を脂肪細胞分化培地で１０日間処理した後、脂肪細胞の分化に関連した遺伝子の相対的なｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。 Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株でフジバカマの茎抽出物を脂肪細胞分化培地で１０日間処理した後、脂肪細胞の分化に関連した遺伝子の相対的なｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。 Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株でフジバカマの花抽出物を脂肪細胞分化培地で１０日間処理した後、脂肪細胞の分化に関連した遺伝子の相対的なｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。 Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株でフジバカマの全草抽出物を脂肪細胞分化培地で１０日間処理した後、脂肪細胞の分化に関連した遺伝子の相対的なｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。 Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株で月別に採取したフジバカマの茎抽出物を骨細胞分化培地で９日間処理した後、ＡＬＰ ｓｔａｉｎｉｎｇした写真である。 Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株でフジバカマの茎抽出物を骨細胞分化培地で９日間処理した後、ＡＬＰ ｓｔａｉｎｉｎｇした写真である。 Ｐｒｉｍａｒｙ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓでフジバカマの茎抽出物を骨細胞分化培地で９日間処理した後、ＡＬＰ ｓｔａｉｎｉｎｇした写真である。 Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株で９月に採取したフジバカマの茎抽出物を６種の溶媒に分画して造骨細胞分化培地で９日間処理した後、ＡＬＰ ｓｔａｉｎｉｎｇした写真である。 Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株でフジバカマの茎抽出物のＤＣＭ ｆｒａｃｔｉｏｎ層を造骨細胞分化培地で９日間処理した後、ＡＬＰ ｓｔａｉｎｉｎｇした写真である。 Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株でフジバカマの茎抽出物を骨細胞分化培地で９日間処理した後、造骨細胞の分化に関連した遺伝子の相対的なｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。 Ｐｒｉｍａｒｙ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓでフジバカマの茎抽出物を骨細胞分化培地で９日間処理した後、造骨細胞の分化に関連した遺伝子の相対的なｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。 Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株でフジバカマの茎抽出物のＤＣＭ ｆｒａｃｔｉｏｎ層を造骨細胞分化培地で９日間処理した後、造骨細胞の分化に関連した遺伝子の相対的なｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。 Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株で月別に採取したフジバカマの茎抽出物を脂肪細胞分化培地で９日間処理した後、オイルレッドＯ染色（Ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ ｓｔａｉｎｉｎｇ）した写真である。 Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株でフジバカマの茎抽出物を脂肪細胞分化培地で９日間処理した後、オイルレッドＯ染色した写真である。 Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株で９月に採取したフジバカマの茎抽出物を６種の溶媒に分画して脂肪細胞分化培地で９日間処理した後、オイルレッドＯ染色した写真である。 Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株でフジバカマの茎抽出物のＤＣＭ ｆｒａｃｔｉｏｎ層を脂肪細胞分化培地で９日間処理した後、オイルレッドＯ染色した写真である。 Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株でフジバカマの茎抽出物を脂肪細胞分化培地で９日間処理した後、脂肪細胞の分化に関連した遺伝子の相対的なｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。 Ｐｒｉｍａｒｙ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓでフジバカマの茎抽出物を脂肪細胞分化培地で９日間処理した後、脂肪細胞の分化に関連した遺伝子の相対的なｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。 Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株でフジバカマの茎抽出物のＤＣＭ ｆｒａｃｔｉｏｎ層を脂肪細胞分化培地で９日間処理した後、脂肪細胞の分化に関連した遺伝子の相対的なｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。 卵巣切除を利用した白ラットモデルで９月に採取したフジバカマの茎抽出物が有する体重変化量に関するグラフである。 卵巣切除を利用した白ラットモデルで９月に採取したフジバカマの茎抽出物が有する骨密度（ＢＭＤ）変化に関するグラフである。 卵巣切除を利用した白ラットモデルで９月に採取したフジバカマの茎抽出物が有する組織学的分析のためのＨ＆Ｅ ｓｔａｉｎｉｎｇした結果である。
本発明の肥満及び骨代謝疾患の予防及び治療用組成物は、フジバカマ属の抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。
本発明の肥満及び骨代謝疾患の予防及び改善用健康機能食品は、フジバカマ属の抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。
以下、本発明を実施例及び実験例によって詳しく説明する。
但し、下記の実施例及び実験例は、本発明を例示するものであり、本発明の内容が、これに限定されるものではない。
製造例１：フジバカマ部位別抽出物の製造
本発明に使われたフジバカマ属の植物は、大韓民国京畿道楊州市の紺岳山で直接収穫したものであって、フジバカマであった（図１）。
９月に収穫したフジバカマを全草と部位別（花、葉、茎）とに分けて、常温で２日間完全に乾燥させた後、きれいに粉砕してフジバカマ粉末試料を得た後、各部位別粉末試料１０ｇ当たり９９．９（ｖ／ｖ）％のメタノール２００ｍｌを入れた後、振盪培養器（ｓｈａｋｉｎｇ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で１２０ｒｐｍ、４０℃で２４時間抽出し、上澄み液をワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）Ｎｏ．１フィルターペーパー（ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ）で濾過し、残ったフジバカマ試料に再び９９．９％のメタノールを試料１０ｇ当たり２００ｍｌを入れた後、再び２４時間抽出して、前記のような方法で濾過した。濾液を回転式真空蒸発器（ｒｏｔａｒｙ ｖａｃｕｕｍ ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ）で４５℃で減圧濃縮して、溶媒を完全に飛ばしたフジバカマの全草及び各部位別メタノール抽出物を得た。
実験例１：フジバカマ部位別抽出物のＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞で造骨細胞分化上昇効果の測定
（１）ＡＬＰ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）染色
マウスの胚芽線維母細胞で起源したＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株は、一般的に骨母細胞と脂肪細胞とを含んだ多様な細胞血統に分化することができる多能性幹細胞株である。Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株は、１０％ ＦＢＳ、１％ペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）とストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎｅ）とが添加されたＤＭＥＭ培地で３７℃、５％ ＣＯ２環境で培養された。Ｃｅｌｌは、６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに２．５×１０４／ｍｌの濃度で骨細胞分化のための１０ｍＭ グリセロリン酸（ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）と５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）とを含有した培地と共に培養し、３日ごとに培地を交換し、２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌのフジバカマの全草と部位別抽出物と共に総９日間分化させた後、５−Ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ／ｎｉｔｒｏ ｂｌｕｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）を用いてＡＬＰ ｓｔａｉｎｉｎｇを行った。ＡＬＰ染色結果を図２に示した。
その結果、全草、葉、茎と花抽出物で濃度依存的にＡＬＰ活性が高くなることが分かり、そのうち、葉が最も高いＡＬＰ活性を示した。
（２）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅａｌｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ）を通じる造骨細胞分化因子発現量の分析
Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を３日ごとに培地を交換し、フジバカマの全草と各部位別抽出物５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌとを総９日間処理した後、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを通じて造骨細胞の形成の重要な要因であるＡＬＰ．ｏｓｔｅｒｉｘ、ＣＯｌＩのｍＲＮＡ発現量を確認して、図４ないし図７に示した。
その結果、全草の場合、造骨細胞の分化に関連した遺伝子のうちから５μｇ／ｍｌの濃度でＯｓｔｅｒｉｘのｍＲＮＡの発現が対照群（ｃｔｒｌ）に比べて高く、２０μｇ／ｍｌの濃度では、ＡＬＰ、ＣＯｌＩで対照群（ｃｔｒｌ）に比べてｍＲＮＡの発現がさらに高く（図７）、葉の場合、５μｇ／ｍｌの濃度では、対照群と差が大きくなかったが、２０μｇ／ｍｌの濃度では、ＡＬＰのｍＲＮＡの発現が著しく高かった（図４）。
茎の場合、５μｇ／ｍｌの濃度でＡＬＰ ｍＲＮＡの発現がさらに高く、２０μｇ／ｍｌの濃度では、ＡＬＰ、ＣＯｌＩのｍＲＮＡ発現量が対照群に比べて高く（図５）、花の場合には、ＡＬＰのｍＲＮＡ発現量が対照群に比べて高かった（図６）。
実験例２：フジバカマ部位別抽出物のＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞で脂肪細胞分化抑制効果の測定
（１）オイルレッドＯ染色法（Ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ ｓｔａｉｎｉｎｇ）による脂肪細胞分化阻害の測定
Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞は、２．５×１０４／ｍｌの濃度で脂肪細胞分化のための１ｕＭデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、５μｇ／ｍｌインシュリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）と２０ｎＭ ＰＰＡＲγとを含有した培地と５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌのフジバカマ部位別抽出物を入れて、９日間培養した。培地を収去し、４％ホルムアルデヒド（ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で細胞を固定させて、０．５％ Ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏで染色して、その結果を図３に示した。
図３の結果を見れば、全草、葉、茎と花いずれも濃度依存的に脂肪細胞の分化を抑制させたことが分かった。そのうち、花の脂肪細胞抑制効果が最も高かった。
（２）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを通じる脂肪細胞分化因子発現量の分析
Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に脂肪細胞分化物質を含有した培地とフジバカマの全草、部位別（葉、茎、花）抽出物を総１０日間処理した後、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを通じて脂肪細胞の形成の重要な要因によって、ＰＰＡＲγ、ＡＰ２、ＣＤ３６、ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ Ｃ／ＥＢＰα、ＬＰＬの相対的なｍＲＮＡ発現量を確認して、図８ないし図１１に示した。
図８ないし図１１の結果を見れば、全草、葉、茎と花抽出物いずれもＰＰＡＲγ、ＡＰ２、ＣＤ３６、ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ Ｃ／ＥＢＰα、ＬＰＬ活性を濃度依存的に阻害したことが分かった。
製造例２：採取時期によるフジバカマ抽出物の製造
大韓民国京畿道楊州市の紺岳山で５月から９月まで毎月同じ時期に収穫したフジバカマの茎を常温で２日間完全に乾燥させた後、きれいに粉砕してフジバカマ粉末試料を得た後、粉末試料１０ｇ当たり９９．９（ｖ／ｖ）％のメタノール２００ｍｌを入れた後、振盪培養器で１２０ｒｐｍ、４０℃で２４時間抽出し、上澄み液をワットマンＮｏ．１フィルターペーパーで濾過し、残ったフジバカマ試料に再び９９．９％のメタノールを試料１０ｇ当たり２００ｍｌを入れた後、再び２４時間抽出して、前記のような方法で濾過した。濾液を回転式真空蒸発器で４５℃で減圧濃縮して、溶媒を完全に飛ばした採取時期によるフジバカマの茎のメタノール抽出物を得た。
製造例３：フジバカマ抽出物の溶媒分画物の製造
製造例２のフジバカマの茎のメタノール抽出物のうち、９月に採取した試料を極性が異なる溶媒を用いて段階的に分画した。メタノール抽出物とヘキサン、水を１：２０：２０の比率で混合して抽出分画した後、濃縮してヘキサン分画物を得た。
水層分画は、分画濾斗で再びジクロロメタン、酢酸エチル、ブタノールに分画して、これよりそれぞれジクロロメタン、酢酸エチル、ブタノール及び水層分画物を得た後、濃縮し、それを凍結乾燥して使った。
実験例３：フジバカマの採取時期と溶媒分画とによるＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞とＰｒｉｍａｒｙ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ細胞とで造骨細胞分化上昇効果の測定
（１）ＡＬＰ染色
実験例１の（１）の方法を利用するが、試料として製造例２の５月から９月に採取したフジバカマの茎のメタノール抽出物、製造例３の溶媒分画物を試料として使い、ＡＬＰ染色結果を図１２、図１３、図１４、図１５及び図１６に示した。
その結果、月別に採取した茎抽出物で９月に採取した茎抽出物のＡＬＰ活性が最も高いことが分かり（図１２）、６種の溶媒分画物では、ジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ、ＤＣＭ）層で最も高いＡＬＰ活性を示した（図１５）。
また、ＤＣＭ層を５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌの濃度別に処理時、濃度依存的にＡＬＰ活性が高くなった（図１６）。
（２）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを通じる造骨細胞分化因子発現量の分析
Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞とＰｒｉｍａｒｙ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌとを３日ごとに培地を交換し、５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌのフジバカマの茎抽出物と６種の溶媒ｆｒａｃｔｉｏｎ層と共に総９日間処理した後、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを通じて造骨細胞の形成の重要な要因であるＡＬＰ．ｏｓｔｅｒｉｘ、ＲＵＮＸ２のｍＲＮＡ発現量を確認して、図１７、図１８及び図１９に示した。
その結果、９月に採取した茎抽出物は、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞で造骨細胞の分化に関連した遺伝子のうちから２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌの濃度でＡＬＰ、ＯｓｔｅｒｉｘのｍＲＮＡの発現が対照群（ｃｔｒｌ）に比べて高く、５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌの濃度では、ＲＵＮＸ２のｍＲＮＡの発現が対照群（ｃｔｒｌ）に比べてさらに高かった（図１７）。
９月に採取した茎抽出物のＰｒｉｍａｒｙ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ細胞では、造骨細胞の分化に関連した遺伝子のうちから２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌの濃度でＡＬＰ、ＯｓｔｅｒｉｘのｍＲＮＡの発現が対照群（ｃｔｒｌ）に比べて高く、５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌの濃度でＡＬＰ、Ｃｏｌ１、ＲＵＮＸ２のｍＲＮＡの発現が対照群（ｃｔｒｌ）に比べてさらに高かった（図１８）。
９月に採取した茎抽出物のＤＣＭ ｆｒａｃｔｉｏｎ層は、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞で造骨細胞の分化に関連した遺伝子のうちから５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌの濃度でＡＬＰのｍＲＮＡの発現が対照群（ｃｔｒｌ）に比べて高く、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌの濃度では、Ｏｓｔｅｒｉｘ、ＲＵＮＸ２のｍＲＮＡの発現が対照群（ｃｔｒｌ）に比べてさらに高かった（図１９）。
実験例４：フジバカマの採取時期と溶媒分画とによるＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞とＰｒｉｍａｒｙ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ細胞とで脂肪細胞分化抑制効果の測定
（１）オイルレッドＯ染色法による脂肪細胞分化阻害の測定
Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞は、２．５×１０４／ｍｌの濃度で脂肪細胞分化のための１ｕＭデキサメタゾン、５μｇ／ｍｌインシュリンと２０ｎＭ ＰＰＡＲγとを含有した培地と５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌのフジバカマの茎抽出物と６種の溶媒ｆｒａｃｔｉｏｎ層と共に総９日間分化させた。培地を収去し、４％ホルムアルデヒドで細胞を固定させて、０．５％ Ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏで染色して、その結果を図２０、図２１、図２２及び図２３に示した。
その結果、月別に採取した茎抽出物で、９月に採取した茎抽出物の脂肪細胞分化抑制が、最も高いことが分かり（図２０）、６種の溶媒ｆｒａｃｔｉｏｎ層では、ジクロロメタン（ＤＣＭ）層で最も高い脂肪細胞抑制を示した（図２２）。また、ＤＣＭ層を５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌの濃度別に処理時、濃度依存的に脂肪細胞分化が抑制された（図２３）。
（２）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを通じる脂肪細胞分化因子発現量の分析
Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞とＰｒｉｍａｒｙ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌとを３日ごとに培地を交換し、５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌのフジバカマの茎抽出物とＤＣＭ ｆｒａｃｔｉｏｎ層と共に総９日間処理した後、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを通じて脂肪細胞の形成の重要な要因であるＡＬＰ．ｏｓｔｅｒｉｘ、ＲＵＮＸ２のｍＲＮＡ発現量を確認して、図２４、図２５及び図２６に示した。
その結果、９月に採取した茎抽出物は、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞で脂肪細胞の分化に関連した遺伝子のうちから５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌの濃度でＰＰＡＲγ、ＡＰ２、ＣＤ３６のｍＲＮＡの発現が対照群（ｃｔｒｌ）に比べて低く、２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌの濃度では、ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ Ｃ／ＥＢＰα、ＬＰＬのｍＲＮＡの発現が対照群（ｃｔｒｌ）に比べてさらに低かった（図２４）。
９月に採取した茎抽出物のＰｒｉｍａｒｙ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ細胞では、脂肪細胞の分化に関連した遺伝子のうちから５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌの濃度でＰＰＡＲγ、ＡＰ２、ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎのｍＲＮＡの発現が対照群（ｃｔｒｌ）に比べて低かった（図２５）。
９月に採取した茎抽出物のＤＣＭ ｆｒａｃｔｉｏｎ層は、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞で脂肪細胞の分化に関連した遺伝子のうちから５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌの濃度でＰＰＡＲγ、ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎのｍＲＮＡの発現が対照群（ｃｔｒｌ）に比べて低く、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌの濃度では、ａｐ２のｍＲＮＡの発現が対照群（ｃｔｒｌ）に比べてさらに低かった（図２６）。
実験例５：卵巣切除（ｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｙ）を利用した骨多孔症動物モデルでの骨密度（ＢＭＤ）と組織学的分析
（１）実験動物の飼育と卵巣切除術
１１週齢の雌ＳＤ ｒａｔｓを大韓バイオリンクで購入して、１週間の順化期間を有した。１２週齢になった時、卵巣切除術を施行し、１週間の回復期を有した。実験期間中の実験動物は、一匹ずつ一ケージで飼育し、環境条件は、室内温度２４±２℃、相対湿度５５±１０％、照明時間１２時間に調節した。飼料と水は、自在に摂取可能にした。
実験動物は、３グループに、卵巣切除をしていない群（ｓｈａｍ）１０匹、卵巣切除をした群（ｏｖｘ−ｃｏｎｔｒｏｌ）１０匹、卵巣切除後、９月に採取したフジバカマの茎抽出物を５０ｍｇ／ｋｇ飲ませた群（ｏｖｘ＋ＳＥＥ ５０ｍｇ／ｋｇ）１０匹に分けて実験を進行した。卵巣切除術は、ゾレチルとロムプンとを用いて痲酔をさせた後、皮膚を除毛、切開して卵巣を除去後、縫合する方法で行った。実験の試料は、製造例２の９月に収穫したフジバカマの茎のメタノール抽出物を利用し、それを総６週間経口投与し、体重は毎日測定した。
その結果、卵巣切除によるエストロゲン分泌減少によって、卵巣切除をしたグループ（ｏｖｘ）が卵巣切除をしていないグループ（ｓｈａｍ）に比べて体重が増加する傾向を示し、フジバカマの茎抽出物を投与したグループ（ｏｖｘ＋ＳＥＥ ５０ｍｇ／ｋｇ）は、卵巣切除をしたグループ（ｏｖｘ−ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて体重が減少する傾向を示した（図２７）。
（２）骨密度（ＢＭＤ）の測定
実験動物が１９週齢になった時、大腿部（Ｆｅｍｕｒ）と硬骨（ｔｉｂｉａ）とを分離し、大腿部は、骨密度の測定に使われた。骨密度は、ｐＤＥＸＡ（Ｆｏｒｅａｒｍ：Ｘ−Ｒａｙ、ＮＯＲＬＡＮＤ、Ｂｏｎｅ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ、ＵＳＡ）を用いて測定した。
その結果、卵巣切除をしたグループ（ｏｖｘ−ｃｏｎｔｒｏｌ）の骨密度（ＢＭＤ）が卵巣切除をしていないグループ（ｓｈａｍ）に比べて有意差があるように減少することを示した。卵巣切除後、フジバカマの茎抽出物を投与したグループ（ｏｖｘ＋ＳＥＥ５０ｍｇ／ｋｇ）の骨密度（ＢＭＤ）は、卵巣切除グループ（ｏｖｘ−ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて有意差があるように増加することを示した（図２８）。
（３）組織学的分析（Ｈ＆Ｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）
各動物から分離した硬骨は、１０％ホルムアルデヒドで固定をさせた後、脱石灰化（ｄｅｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏ）を経てパラフィンブロック（ｐａｒａｆｆｉｎ ｂｌｏｃｋ）を製造した。５μｍの厚さでパラフィンブロックを切除して、ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ＆ｅｏｓｉｎ（Ｈ＆Ｅ）を行った。
その結果、骨髄内の脂肪細胞の量が、卵巣切除をしたグループ（ｏｖｘ＋ｃｏｎｔｒｏｌ）が卵巣切除をしていないグループ（ｓｈａｍ）に比べて増加することを観察し、フジバカマの茎抽出物を投与したグループ（ｏｖｘ＋ＳＥＥ ５０ｍｇ／ｋｇ）の骨髄内の脂肪細胞の量は、卵巣切除をしたグループ（ｏｖｘ＋ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて減少することを示した（図２９）。
以下、本発明の抽出物を含有する組成物の製剤例を説明するが、本発明は、これを限定するためのものではなく、単に具体的に説明するためのものである。
製剤例１．散剤の製造
製造例１の全草抽出物２０ｍｇ
乳糖１００ｍｇ
タルク１０ｍｇ
前記成分を混合し、気密布に充填して散剤を製造する。
製剤例２．錠剤の製造
製造例２の９月に収穫した茎抽出物１０ｍｇ
トウモロコシ澱粉１００ｍｇ
乳糖１００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム２ｍｇ
前記成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法によって打錠して錠剤を製造する。
製剤例３．カプセル剤の製造
製造例２の９月に収穫した茎抽出物１０ｍｇ
結晶性セルロース３ｍｇ
ラクトース１４．８ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム０．２ｍｇ
通常のカプセル剤の製造方法によって、前記成分を混合し、ゼラチンカプセルに充電してカプセル剤を製造する。
製剤例４．注射剤の製造
製造例３のジクロロメタン分画物１０ｍｇ
マンニトル１８０ｍｇ
注射用滅菌蒸溜水２９７４ｍｇ
Ｎａ２ＨＰＯ４、１２Ｈ２Ｏ ２６ｍｇ
通常の注射剤の製造方法によって、１アンプル当たり（２ｍｌ）前記成分含量で製造する。
製剤例５．液剤の製造
製造例１の全草抽出物２０ｍｇ
異性化糖１０ｇ
マンニトル５ｇ
精製水適量
通常の液剤の製造方法によって、精製水にそれぞれの成分を加えて溶解させ、レモン香を適量加えた後、前記成分を混合した後、精製水を加えて全体を精製水を加えて全体１００ｍｌに調節した後、褐色瓶に充填して滅菌させて液剤を製造する。
製剤例６．健康食品の製造
製造例１の全草抽出物１，０００ｍｇ
ビタミン混合物適量
ビタミンＡアセテート７０μｇ
ビタミンＥ １．０ｍｇ
ビタミンＢ１ ０．１３ｍｇ
ビタミンＢ２ ０．１５ｍｇ
ビタミンＢ６ ０．５ｍｇ
ビタミンＢ１２ ０．２μｇ
ビタミンＣ １０ｍｇ
ビオチン１０μｇ
ニコチン酸アミド１．７ｍｇ
葉酸５０μｇ
パントテン酸カルシウム０．５ｍｇ
無機質混合物適量
硫酸第一鉄１．７５ｍｇ
酸化亜鉛０．８２ｍｇ
炭酸マグネシウム２５．３ｍｇ
第一リン酸カリウム１５ｍｇ
第二リン酸カリウム５５ｍｇ
クエン酸カリウム９０ｍｇ
炭酸カルシウム１００ｍｇ
塩化マグネシウム２４．８ｍｇ
前記ビタミン及びミネラル混合物の組成比は、比較的健康食品に適した成分を、望ましい実施例で混合組成したが、その配合比を任意に変形実施しても良く、通常の健康食品の製造方法によって、前記成分を混合した後、顆粒を製造し、通常の方法によって健康食品組成物の製造に使うことができる。
製剤例７．健康飲料の製造
製造例２の９月に収穫した茎抽出物１，０００ｍｇ
クエン酸１，０００ｍｇ
オリゴ糖１００ｇ
梅濃縮液２ｇ
タウリン１ｇ
精製水を加えて全体９００ｍｌ
通常の健康飲料の製造方法によって、前記成分を混合した後、約１時間８５℃で撹拌加熱した後、作られた溶液を濾過して、滅菌された２Ｌ容器に取得して密封滅菌した後、冷蔵保管した後、本発明の健康飲料組成物の製造に使う。
前記組成比は、比較的嗜好飲料に適した成分を、望ましい実施例で混合組成したが、需要階層、需要国家、使用用途など、地域的、民族的嗜好度によって、その配合比を任意に変形実施してもよい。

Claims (10)

  1. フジバカマの葉の抽出物を有効成分として含有する骨代謝疾患の予防及び治療用組成物。
  2. 造骨細胞分化増大活性及び脂肪細胞分化抑制活性を同時に有することを特徴とする請求項１に記載の骨代謝疾患の予防及び治療用組成物。
  3. 請求項１又は２に記載の骨代謝疾患の予防及び治療用組成物の製造方法であって、
    韓国の気候を基準に７月〜９月に採取されたフジバカマの葉を抽出し、前記抽出物を得る工程を含むことを特徴とする骨代謝疾患の予防及び治療用組成物の製造方法。
  4. 前記抽出物は、精製水を含んだ水、炭素数１〜４の低級アルコール、またはこれらの混合溶媒から選択された溶媒に可溶した抽出物であることを特徴とする請求項３に記載の骨代謝疾患の予防及び治療用組成物の製造方法。
  5. 前記溶媒は、炭素数１〜４の低級アルコールの混合比が５（ｖ／ｖ）％〜１００（ｖ／ｖ）％であるアルコール水溶液またはアルコールであることを特徴とする請求項４に記載の骨代謝疾患の予防及び治療用組成物の製造方法。
  6. 前記抽出物は、７０〜９９．９（ｖ／ｖ）％のメタノールまたはエタノール水溶液で溶媒抽出して得た抽出物であることを特徴とする請求項５に記載の骨代謝疾患の予防及び治療用組成物の製造方法。
  7. 前記抽出物は、７０〜９９．９（ｖ／ｖ）％のメタノールまたはエタノール水溶液で溶媒抽出した後、ヘキサンで溶媒分画して得たヘキサン分画物であることを特徴とする請求項６に記載の骨代謝疾患の予防及び治療用組成物の製造方法。
  8. 前記ヘキサン分画物をジクロロメタンで溶媒分画して得たジクロロメタン分画物であることを特徴とする請求項７に記載の骨代謝疾患の予防及び治療用組成物の製造方法。
  9. フジバカマの葉の抽出物を有効成分として含有する骨代謝疾患の予防及び改善用健康機能食品。
  10. 前記健康機能食品の形態は、粉末、顆粒、錠剤、カプセル、または飲料形態であることを特徴とする請求項９に記載の骨代謝疾患の予防及び改善用健康機能食品。
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