KR101421347B1

KR101421347B1 - 항비만 활성을 나타내는 정유(ｅｓｓｅｎｔｉａｌｏｉｌ) 분획물을 제조하는 제조방법 및 이 분획물을 포함하는 지방간 및 비만 예방 및 치료효과를 갖는 조성물

Info

Publication number: KR101421347B1
Application number: KR1020120110030A
Authority: KR
Inventors: 김미려; 양재하; 김성옥; 신인순; 박지영
Original assignee: 대구한의대학교산학협력단
Priority date: 2012-10-04
Filing date: 2012-10-04
Publication date: 2014-07-18
Also published as: KR20140044078A

Abstract

본 발명은 당귀(Angelica gigas Nakai)로부터 지방간 억제 및 항비만 활성을 나타내는 정유(essential oil) 분획물을 제조하는 제조방법 및 이 분획물을 포함하는 지방간, 비만 예방 및 치료효과를 갖는 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 고지방 식이를 이용한 비만 유도 동물에서 체중 및 체지방 감소, 혈중 중성지방의 감소 및 식이섭취량의 감소를 가져왔으며, 조직에서 고지방식이 공급으로 유발되는 지방 간병증, 지방세포 비대, 췌장섬 증식, 인슐린(insulin), 글루카곤(glucagon) 생산세포의 증가를 억제함을 확인함으로써, 지방간 및 비만증 예방 및 치료용 약제 및 건강기능식품에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

항비만 활성을 나타내는 정유(ｅｓｓｅｎｔｉａｌｏｉｌ) 분획물을 제조하는 제조방법 및 이 분획물을 포함하는 지방간 및 비만 예방 및 치료효과를 갖는 조성물 {A method for preparing the essential oil fraction showing potent anti-obesity and inhibiting activity on fatty liver from Angelica gigas Nakai and the composition comprising the same the prevention or treatment of obesity and fatty liver}

본 발명은 항비만 활성을 나타내는 정유 분획물을 제조하는 제조방법 및 이 분획물을 포함하는 지방간과 비만 예방 및 치료효과를 갖는 조성물에 관한 것이다.

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비만이란 체지방의 과잉 축적으로 정의된다. 비만은 건강을 해칠 정도로 체내 지방이 과도하게 축적된 상태를 말하며, 각 개인의 표준체중보다 20% 이상의 증가가 있을 때 비만이라고 정의할 수 있다. 구체적으로 지방의 무게가 체중에서 차지하는 체지방 비율이 남자의 경우는 25% 이상, 여자의 경우, 30% 이상일 때를 말한다(Van der Ploeg LH. Related Obesity: an epidemic in need of therapeutics. Curr Opin Chem Biol. 4(4), pp.452-460, 2004). 이는 서구사회의 문제만이 아니라 우리나라를 포함한 여러 아시아 국가들에서도 급증하고 있는 심각한 보건문제의 하나이다. 전 세계적으로도 현재의 증가 추세가 지속되면 2025년에는 세계 인구 3분의 1이 비만환자(BMI, Body Mass Index, 30 kg/㎡이상)가 될 것이라고 세계비만연맹(International Obesity Task Force)은 예측하고 있다.

비만은 미용상의 스트레스뿐만 아니라 제2형 당뇨병, 고혈압과 관상동맥질환 등의 여러 질환을 유발한다고 알려져 있으며 유방암, 자궁내막암, 전립선암과 대장암의 발병도 증가시킨 것으로 알려져 있다(Aviva M, et, al,. The disease burden associated with overweight and obesity. JAMA, 282, pp.1523-9, 1999).

간은 지방산 합성과 산화의 균형을 통해 간의 지방 축적 및 인슐린 저항성을 조절해 신체의 대사 항상성 유지에 중요한 역할을 한다. 알코올 섭취와 관련이 없이 중성지방이 간에 과도하게 축적되는 비알콜성 지방간질환(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)은 단순 지방간(simple hepatic steatosis)으로부터 지방간염(steatohepatitis), 간섬유증(hepatic fibrosis) 및 간암(liver cancer)과 같은 만성 간질환으로 진행할 수 있다(Park SH, Jeon WK, Kim SH, Kim HJ, Park DI, Cho YK, Sung IK, Sohn CI, Keum DK, Kim BI. Prevalence and risk factors of non-alcoholic fatty liver disease among Korean adults. J Gastroenterol Hepatol 21: 138-143, 2006). 최근 비만, 인슐린 저항성, 제2형 당뇨, 심혈관계질환 등 대사증후군과 관련이 있는 것으로 알려지고 있다(Asselah T, Rubbia-Brandt L, Marcellin P, Negro F. Steatosis in chronic hepatitis C: why does it really matter Gut 55: 123-130, 2006).

뿐만 아니라 비만은 6개 비만관련 질병의 사회경제적 비용이 전체 국민의료비 대비 2.1-1.1% 정도라고 보고된 바 있어, 경제적 부담 또한 막대하다고 볼 수 있다(Jung. B. The annual socioeconomic costs of six obesity-related disease. Unpublished master's dissertation, Seoul National University, Seoul. 2001).

이렇듯 비만은 발생빈도, 관련 질병유발, 경제적 손실, 일상생활에 대한 문제점 등이 문제가 되는 것으로 현대사회에서는 보다 다차원적이고 과학적인 방법을 통해 속히 비만에 대한 중재가 이뤄져야 할 것이며, 적극적인 예방이 필요하다.

비만치료법으로는 식욕억제제, 지방흡수억제제, 에너지대사촉진제, 호르몬제제 등의 약물요법과 위절제술, 지방흡입술 등의 외과적 수술법이 사용되고 있으나, 치료효과의 지속적 유지 여부 및 약물 중단 시 체중이 증가하는 현상 등이 문제되고 있다(김은선 외 2, 비만치료제, 심층정보분석 보고서, 한국과학기술정보연구원, pp.1-111, 2002).

비만을 관리하는 방법으로는 식이요법, 운동요법, 약물요법, 수술요법 등이 있으나 식이요법으로는 내장지방의 감소효율이 적고 원래의 식습관으로 돌아가는 경우 내장지방이 더 많이 증가하는 부작용이 있고(이득주 외 1, 여성에서 허리둔부둘레비와 비만관련 질환 예측. 대한비만학회지, 5, pp.41-48, 1996) 운동요법으로는 효과뿐만 아니라 경제적인 면에서도 월등히 뛰어나지만 시간이 오래 걸려 현대인의 생활에는 부담을 줄 수 있다는 단점이 있으며, 약물요법이나 수술요법은 경제적 부담, 통증, 부작용 등의 위험요소가 있는 것으로 보고되고 있다(비만증의 치료. 한국영양학회지, 5(2), pp.179-190, 1990). 이렇듯 식욕조절이 어렵고 운동이 어려운 비만한 현대인들의 경우 쉽게 사용할 수 있는 대체요법을 찾는 실정이며, 실제로 우리나라 폐경 후 비만한 여성의 44%는 살을 빼기 위해서 마사지, 사우나 및 찜질방 등의 대체요법을 사용하며(이종화 외 1, 갱년기 여성들이 인지하는 폐경이후의 생활변화와 이에 대한 수용. 대한폐경학회지, 9(3), pp.254-260, 2003) 대체요법을 사용하는 사람들 중 25%는 비만관리를 위해 아로마 향기요법을 사용한다고 하였다(신진희. 피부관리사의 아로마테라피 이용 실태조사, 고신대학교, 석사학위논문. 2000).

향기요법이란 향과 향기를 의미하는 아로마(aroma)와 치료를 의미하는 테라피(therapy)의 합성어로서 종자, 껍질, 뿌리, 잎, 꽃, 나무, 발삼과 레진을 포함하여 모든 다양한 부분에서 추출된(한국아로마협회. 아로마 에센셜오일 백과사전. 현문사, 서울, 2002) 휘발성이면서 독특한 향을 발산하는 에센셜 오일 성분을 후각이나 피부를 통해 인체에 흡수시켜 신체와 정신의 부조화를 개선하여 건강을 유지하고 증진시키기 위한 자연요법이다(김명숙 외 1, 중년기 복부 비만 여성의 특성과 비만관리 실시효과, 대한비만학회지, 12(1), pp.65-66, 2003). 향기요법은 투여방법에 따라 마사지법, 향을 발향시키는 확산법, 코로 향을 흡입하는 흡입법, 목욕법, 통증 있는 부위를 찜질하는 습포법, 입안을 헹구는 가글링법, 복용법, 도포법이 있는데, 후각을 통한 흡수 경로는 코로 흡입되어 점막에 있는 후각신경을 통해 대뇌에 전달된 향기물질이 대뇌의 변연계에서 분석이 이루어진 후 신경화학(Neurochemical)물질을 조절하여 심신의 불균형상태를 안정시켜 준다. 이 신경화학물질들은 뇌하수체 등에도 영향을 주어 호르몬 분비를 조절함으로서 전체적인 신체조직에 영향을 미치게 된다.

향기가 풍부한 당귀(Angelica Gigantis Radix)는 미나리과에 속하는 다년생 초본으로 1~2년 생근을 말하며 한국에서는 이의 뿌리를 건조한 것이다. 늦가을에 채취하여 수염 뿌리를 제거하고, 수분이 약간 증발할 때를 기다렸다가 천천히 연기로 훈증한다. 당귀의 유효성분으로는 coumarin류의 decoursin, decousinol, phthalide류의 ligustilide, butylidene phthalide, butylphthalide 등이 있다. 뿌리에는 베르갑텐 C12H8O4, 이소핌피넬린, 정유 약 0.2%, β-시토스테롤이 있다.

비만을 해결하기 위한 여러 대책들 중 하나로 최근 아로마 테라피가 각광받고 있는 가운데 현재 사용되고 있는 정유의 종류는 70가지 이상이지만, 비만을 타켓으로 하는 방향성 정유들에 대한 과학적인 연구는 매우 드문 현황이다. 방향성이 있는 당귀는 많이 연구되어왔으나, 국내 및 해외에서도 비만증 치료에 관한 당귀 정유의 연구는 활발하지 않다.

이에 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하고, 비만증에 효과적인 치료제를 개발하기 위한 연구를 통해 당귀 정유분획물 흡입은 고지방 식이를 이용한 비만 유도 동물에서 체중 및 체지방 감소, 혈중 중성지질농도의 감소 및 식이섭취량의 감소를 가져왔다. 또한 조직에서 고지방식이 공급으로 유발되는 지방 간병증, 지방세포 비대, 췌장섬 증식, insulin, glucagon 생산세포의 증가 억제를 유의적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 당귀를 건조하여 마쇄한 후 시료 중량의 약 1 내지 100배, 바람직하게는 약 2 내지 20배에 달하는 부피의 n-헥산, 헵탄, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름 또는 에틸 아세테이트로부터 선택된 비극성용매, 바람직하게는 헥산 또는 에틸아세테이트 용매, 보다 바람직하게는, 헥산 용매를 가하여, 20 내지 120℃, 바람직하게는 실온 내지 80℃에서 약 24시간 내지 144시간, 바람직하게는 48 내지 96시간 동안에서 냉침추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법을 사용하여, 바람직하게는 냉침추출법으로 추출하여 얻어진 추출액을 20 내지 80℃, 바람직하게는 30 내지 60℃에서 감압여과 및 농축하여 당귀 비극성 용매 분획물을 수득하는 제 1단계; 상기 비극성 용매 분획물에 상기 분획물 중량의 약 0.05 내지 50배, 바람직하게는 0.5 내지 5배 부피 (v/w%)의 에탄올을 가하여 생성된 침전물을 제거하고 얻어진 정유 분획물을 농축하여 제 2단계를 공정을 포함하는 당귀로부터 항비만 활성을 갖는 당귀 정유 분획물을 수득하는 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 제조방법 및 상기 제조공정으로 얻어진 당귀 정유 분획물을 유효성분으로 함유하는 지방간 및 비만증 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물 및 건강기능식품을 제공한다.

상기에서 수득된 당귀 정유 분획물들은 고지방 식이를 이용한 비만 유도 동물에서 체중 및 체지방 감소, 혈중 중성지질농도의 감소 및 식이섭취량의 감소를 가져왔다. 또한 조직에서 고지방식이 공급으로 유발되는 지방 간병증, 지방세포 비대, 췌장섬 증식, 인슐린(insulin), 글루카곤(glucagon) 생산세포의 증가 억제를 유의적으로 확인하였다.

본 발명의 지방간 및 비만증 치료용 약학 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 분획물을 0.01 내지 80 중량%, 바람직하게는 10 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 분획물을 포함하는 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 분획물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 분획물을 포함하는 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무,알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 봉해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물 및 분획물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다.

본 발명의 당귀로부터 추출 분리되는 정유 분획물을 함유하는 제제는 비경구 투여, 예를 들어, 흡입형태의 스프레이(spray) 제제, 비강제 등으로 투여됨이 바람직하다.

따라서 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 당귀 정유 분획물을 유효성분으로 함유하는 지방간 및 비만증의 치료 및 예방을 위한 스프레이제제 또는 비강제를 제공한다.

상기한 제제에는 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 분획물을 포함하는 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 분획물을 포함하는 약학조성물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 당귀 정유 분획물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(Intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 비만에 대하여 탁월한 억제효과를 갖는 상기 제조방법으로 제조된 당귀 정유 분획물을 유효성분으로 함유하는 지방간 및 비만증의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품을 제공한다.

본원에서 정의되는 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 지방간 및 비만증의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 분획물을 0.01 내지 95%, 바람직하게는 1 내지 80% 중량백분율로 포함한다.

또한, 지방간 및 비만증의 예방 또는 개선을 위한 목적으로 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 약학 투여형태 또는 티백제, 침출차, 건강 음료 등의 형태인 건강기능식품으로 제조 및 가공이 가능하다.

또한, 본 발명은 지방간 및 비만증 억제활성을 나타내는 상기 제조방법으로 제조된 당귀 정유 분획물을 주성분으로 함유하는 건강보조식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 지방간 및 비만증 억제활성을 나타내는 상기 제조방법으로 제조된 당귀 정유 분획물을 주성분으로 함유하는 식품첨가제를 제공한다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 분획물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖ 당 일반적으로 약 1~20 g, 바람직하게는 약 5~12 g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

또한, 본 발명의 분획물은 지방간 및 비만증의 예방 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 분획물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖을 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 당귀로부터 추출 분리되는 정유 분획물은 고지방 식이로 비만을 유도한 흰쥐에서 체중감소 및 체지방 감소, 혈중지질농도를 감소시킬 뿐만 아니라 지방간 및 비만 예방 및 치료를 위한 약학조성물 또는 흡입용 기능성 제품, 건강기능식품 및 건강보조식품에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 고지방 식이 투여로 인한 비만 쥐의 몸무게에 대한 당귀 정유분획물의 효과를 나타낸 도이며,
도 2는 고지방 식이 투여로 인한 비만 쥐의 식이섭취량에 대한 당귀 정유분획물의 효과를 나타낸 도이며,
도 3는 고지방식이 투여로 인한 비만 쥐의 간무게에 대한 당귀 정유분획물의 효과를 나타낸 도이며,
도 4은(a-d) 고지방식이 투여로 인한 비만 쥐의 체지방 무게에 대한 당귀 정유분획물의 효과를 나타낸 도이며,
도 5(a-d)은 고지방식이 투여로 인한 비만 쥐의 혈중 간기능 효소 및 중성지질농도에 대한 당귀 정유분획물의 효과를 나타낸 도이며,
도 6(a-h)은 고지방식이 투여로 인한 비만 쥐의 간 소엽 전반에 걸친 간세포의 비대와 지방간 병증에 대한 당귀 정유분획물의 효과를 나타낸 도이며,
도 7(a-h)은 고지방식이 투여로 인한 비만 쥐의 부고환 조직에서 부고환 지방세포 비대에 대한 당귀 정유분획물의 효과를 나타낸 도이며,
도 8(a-h)은 고지방식이 투여로 인한 비만 쥐의 췌장 Zymogen과립의 감소와 함께 췌장섬의 분포에 대한 당귀 정유분획물의 효과를 나타낸 도이며,
도 9(a-h)은 고지방식이 투여로 인한 비만 쥐의 인슐린 생산 세포의 수적 증가에 대한 당귀 정유분획물의 효과를 나타낸 도이며,
도 10(a-h)은 고지방식이 투여로 인한 비만 쥐의 glucagon 생산 세포의 수적 증가에 대한 당귀 정유분획물의 효과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 참고예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 당귀 정유 분획물의 제조

당귀는 대구소재 대원약업사에서 8Kg을 구입하여 깨끗이 세척하여 분쇄 후 추출기에 넣고 n-헥산(hexane) 30L을 첨가한 다음, 72시간 동안 실온 방치하면서 교반하여 추출하고 이 추출액을 회전 진공증류기(R-220, Buchi, rotary vacuum evaporator, Switzerland)를 이용하여 40℃에서 감압 농축 하였다. 농축된 당귀 헥산 추출물에 에탄올(ethanol 10L)을 첨가하여 재 용해 후 침전된 Wax층 등을 여과(Filter Paper NO2 Advantec)하고 농축과정을 거쳐 실험에 사용된 정유 성분을 획득하였다. 그 결과, 수득한 정유의 수율은 약 1.81%이었다(이하, AGEO라 함).

참고예 1. 실험동물의 준비

실험동물은 체중 28~32 g의 생후 5주령의 ICR mice(오리엔트 사)를 사용하였고, 대구한의대학교 동물 사육실에서 일정한 조건(온도: 21±2, 명암: 12시간 명암주기)하에, 사료와 음수의 자유로운 섭취가 가능하도록 하였으며, 실험시작 전까지 물과 먹이를 충분히 제공하였다.

참고예 2. 당귀 정유 흡입 및 비만 유도

비만을 유발하기 위하여 문헌에 기재된 식이조성을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(Lee J. S. et al., Supplementation of whole persimmon leaf improves lipid profiles and suppresses body weight gain in rat fed high-fat diet, Food and Chemical Toxicology, 44(11), pp.1875-1883, 2006).

먼저, 정상군을 제외한 실험군에는 AIN-76 조성을 기초로 한 식이에 표 1과 같이 콜레스테롤 1%와 Lard 15%를 첨가한 펠렛 형태의 고형사료(#102038, AIN-76A Based High Fat/High Carb Purified Rodent Diet with Cholesterol & Cholic Acid, Dyet, USA) 6주간 먹였으며, 실험동물은 각 군당 15마리씩 배정하였다. 정상군(NOR), 고지방대조군(HFD), 고지방사료와 당귀 정유분획물을 흡입하는 당귀정유흡입군(AGEO)으로 나누었다. 당귀정유흡입군(AGEO)은 다시 2주 흡입군(2AGEO)과 3주 흡입군(3AGEO)으로 나누고 상기 실시예 1에서 수득한 당귀 정유분획물을 매일 12시간씩 각각 고지방 식이 공급 4주 후부터 2주간, 또는 고지방식이 공급 3주 후부터 3주간 고지방식이와 함께 흡입시켰으며, 매일 10 g의 사료를 할당하였다.

Ingredient	Normal	HFD
Casein	20	20
DL - Methionine	0.3	0.3
Com starch	15	15
Sucrose	50	39.75
Cellulose	5	5
Corn oil	5	5
Mineral-mix	3.5	3.5
Vitamin-mix	1	1
Choline bitartrate	0.2	0.2
Lard	-	10
Cholesterol	-	0.2
Cholic acid	-	0.05
total(%)	100	100
Kcal/100g diet	3850	4340
Calorie from fat(%)	117	311
Calorie from carbohydrate(%)	675	505
Calorie from protein(%)	208	184

참고예 3. 통계처리

실험성적의 통계적 유의성은 SPSS 프로그램(Version 14.01)의 투웨이(Two-way) ANOVA와 LSD 사후검정을 이용하여, P<0. 05 인 경우에 유의한 것으로 인정하였으며, NOR군과의 통계학적 유의성(#) 및 HFD군과의 통계학적 유의성(*)을 도면 및 표에 각각 표기하였다.

실험예 1. 고지방 식이를 이용한 비만 유도 쥐의 식이효율, 체중측정 및 조직의 채취

상기 실시예의 당귀 정유 분획물(AGEO)이 고지방 식이를 이용한 비만 유도 쥐의 식이효율, 체중측정 등에 미치는 영향을 확인하기 위하여 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(허명행 외 4, 향 흡입이 비만을 유도한 쥐의 체중, 식이 섭취량, 섭취 효율 및 혈청 렙틴에 미치는 효과, 한국인간·식물·환경학회지 pp.113-124, 9(2), 2006).

식이 섭취량은 매일 오후 5시에 측정하여, 일일 먹이 섭취량을 계산하였으며, 체중은 3일에 한 번씩 측정하였다. 식이효율(FER; Food efficiency ratio)은 실험기간 동안의 체중 증가량을 구하고 그 값을 식이섭취량으로 나눈 값이다(FER=body weight gain/food intake).

상기 실험 결과 표 2 및 도 1에 나타나는 바와 같이 3주 후 정상군(NOR)의 체중보다 고지방식이 투여군(HFD)에서 유의성 있게 체중이 증가하였으며, 당귀 정유 2주 흡입(2AGEO), 당귀 정유 3주 흡입군(3AGEO)에서는 체중의 증가를 유의적으로 억제하는 결과를 얻을 수 있었다. 또한, 표 2 및 도 2에 나타나는 바와 같이 식이섭취량을 보면 정상군(NOR)과 비교하였을 때, 2AGEO, 3AGEO 군에서 유의성 있는 감소를 보였다. 체중의 변화율에 있어서는 HFD군에 비해 NOR군과 2AGEO, 3AGEO 군에서 유의적인 감소를 보였다. 식이효율(FER)에 있어서도 NOR군에 비해 HFD군, 3AGEO 군에서 유의적으로 높은 결과를 보였다.

한편, 실험동물은 희생 전 12시간 절식 시킨 후 펜토바비탈로 마취한 상태에서 간 및 부위별 내장지방조직(부고환;epididymal, 내장;visceral adipose tissue)과 갈색지방(brown adipose tissue; BAT)을 채취하였다. 조직 염색용 조직은 포르말린 용액에 고정 시켰으며, 분석용 체지방조직은 액체 질소로 급속 냉동시켜 사용하기 전까지 -80℃에 보관하였다.

상기 실험 결과 도 3 및 도 4(a-d)에 의하면 정상군에 비해 고지방 식이 투여군(HFD)군에서 간 무게, 부고환 지방 무게, 내장 무게, 갈색지방(BAT) 무게가 유의하게 증가하였으며, 2AGEO, 3AGEO 군에서 부고환지방 무게, 신장주위 지방조직 무게, 내장 무게 및 갈색지방 무게가 감소되었으며, 그 중에서도 2AGEO 군에서 유의하게 억제되었다. 이 결과는 비만에 있어서 단순한 체중감소 보다는 심혈관계 질환과 같은 합병증을 야기 시키는 것으로 알려진 체지방 감소에 대한 강력한 당귀 정유의 효과를 보여주는 것으로서 비만 치료제로서의 더 큰 의미가 있다고 할 수 있다.

	NOR	HFD	2AGEO	3AGEO
Food intake	5.14±0.43	4.33±0.83	4.48±0.54	3.62±0.40
Weight gain (g/day)	0.17±0.07	0.22±0.04	0.01±0.05	0.06±0.07
FER	0.03±0.02	0.05±0.01	0.02±0.01	0.04±0.02

실험예 2. 비만을 유발시킨 쥐의 채혈 및 혈청 분석

각 군의 실험동물을 희생 전 12시간 절식시킨 후 pentobarbital sodium (10901,한림제약주식회사, 한국)로 마취한 다음, 복부 대정맥에서 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 test tube에 넣고 상온에서 1시간 방치한 다음 4℃, 3,500 rpm에서 15분간 원심분리하여 혈청을 분리하고, 혈청 중 총콜레스테롤(total cholesterol; TC)은 C. Allain 1의 효소법(Allain C. et al., Enzymatic determination of total serum cholesterol, Clin. Chem. 20(4), pp.470-475, 1974)에 따라 분석시약(L-type GHO M, Wako, 일본)을 사용하였고 중성지방(triglyceride) 함량은 Van Handel 등의 효소법(Van Handel E. et al, Micromethod for the direct determination of serum triglycerides, J. Lab. Clin. Med. 50(1), pp.152-157, 1957)에 의하여 검사시약(L-type TG M, Wako, 일본)을 사용하였다.

간 기능과 관련된 트랜스아미나아제(transaminase)인 혈청 중 에이엘티(ALT; Alanine aminotransferase)와 혈청 에이에스티(AST; Aspartate aminotransferase) 함량은 분광광도법(Giusti G. et al., A comparative study of some spectrophotometric and colorimetric procedures for the determination of serum glutamic-oxaloacetic and glutamic-pyruvic transaminase in hepatic diseases. Enzymol. Biol. Clin(Basel), 10(1), pp.17-38, 1969)을 이용한 검사시약(L-type ALT J2, L-type AST J2, Wako, 일본)을 사용하여 자동화된 생화학 분석기(Hitachi 7080, Japan)로 분석하였다.

실험결과, 도 5(a-d)에 나타나는 바와 같이, 정상군에 비해 고지방 식이 투여군(HFD)군에서 혈청 중 ALT(143.4± 7.8 U/L), AST(1238.8± 691.1 U/L)와 중성지방(50.5± 3.5 ㎎/㎗) 함량이 증가하였으나, 당귀 정유의 흡입으로 2AGEO, 3AGEO 군에서 각각 혈청 중에서 ALT(79.4± 6.8. 71.4± 6.9 U/L), AST(703.7± 265.0, 499.1± 137.8 U/L) 및 중성지방(27.3± 7.6, 41.2± 13.4 ㎎/㎗) 함량이 감소하였다.

실험예 3. 고지방 식이를 이용하여 비만을 유발시킨 쥐의 조직병리학적 분석

상기 실시예의 당귀 정유 분획물(AGEO)이 비만 유발 쥐에 대한 영향을 확인하기 위하여 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.(구세광 외 3, 고지방식이로 유발된 비만 마우스에서 산마늘 잎추출물의 항비만효과, 한국임상수의학회지, 28(3), pp.280-286, 2011)

재료 및 방법: 정상 대조군, HFD 대조군, 2AGEO, 3AGEO 군에서 각각 간, 부고환 주위 지방 및 췌장 실질조직의 일부를 취하여 10% 중성포르말린에 고정시킨 다음 일반적인 방법으로 탈수 및 파라핀 포매를 실시하고, 3~4μm의 절편을 제작하여 Hematoxylin-eosin(MHS16-SIGMA) 또는 Masson’s trichrome(B8563, SIGMA) 염색을 실시한 후 광학현미경하에서 관찰하였으며, 췌장섬내 insulin 및 glucagon 생산세포를 avidin-biotin-peroxidase (ABC) 방법을 이용하여 염색하였다. 또한 명확한 조직병리학적 변화의 관찰을 위해 지방간 병변 부위의 비율 (%/mm²of hepatic parenchyma), 간세포 직경 (μm/hepatocyte), 부고환 지방세포 크기 (μm/adipocyte), 췌장 zymogen 과립 (%/ mm²of exocrine pancreatic parenchyma) 및 췌장섬이 차지하는 부위 (%/mm²of pancreatic parenchyma), insulin 및 glucagon 생산세포의 수적 (cells/mm²of pancreatic parenchyma)변화와 이들의 비율 (insulin/glucagon cell ratio)를 각각의 현미경 시야에서 자동영상 분석장치 (DMI-300 Image Processing; DMI, Korea)를 이용하여, histomorphometry적으로 평가하였다.

실험결과, 도 6(a-h)에 나타난 바와 같이, 고지방사료 공급(HFD)에 의해 간 소엽 전반에 걸쳐 간세포의 비대와 공포화를 특징으로 하는 지방변화 (fatty changes) 소견이 인정되었다. 한편, 고지방식이투여와 정유 분획물을 병용 흡입한 2AGEO, 3AGEO군에서는 HFD 대조군에 비해 현저한 간세포 직경을 감소시킴으로써, HFD 공급으로 유발되는 지방간병증을 2AGEO, 3AGEO군 모두에서 현저하게 개선시켰으나 3AGEO에서 더 유의한 직경감소가 관찰되었다.

도 7에 나타난 바와 같이 고지방사료 공급에 의해 부고환 지방 세포의 직경이 극적으로 증가하였으나, 고지방식이투여와 정유 분획물을 병용 흡입한 2AGEO, 3AGEO군에서는 HFD 대조군에 비해 부고환 지방세포의 직경이 유의하게 감소하였다.

도 8에 나타난 바와 같이 고지방사료 공급에 의해 HFD군에서 췌장 zymogen 과립의 감소와 함께 췌장섬의 증가를 나타내었으나, 고지방식이투여와 정유를 병용흡입한 2AGEO, 3AGEO군에서는 HFD 대조군에 비해 zymogen 과립의 수가 두군 모두에서 정상화 되었으며, 고지방사료 공급에 의한 췌장 내분비 호르몬의 확산 또한 정상화 되었다.

도 9에 나타난 바와 같이 고지방사료 공급에 의해 HFD군에서 insulin 과 glucagon 생산세포의 수적 증가와 같은 내분비 장애가 나타났으나, 고지방식이투여와 정유 분획물을 병용 흡입한 2AGEO, 3AGEO군에서는 HFD 대조군에 비해 현저하게 정상화 되었다.

도 10에 나타난 바와 같이 고지방사료 공급에 의해 HFD군에서 glucagon 생산세포의 수적 증가와 같은 내분비 장애가 나타났으나, 고지방식이투여와 정유 분획물을 병용 흡입한 2AGEO, 3AGEO군에서는 HFD 대조군에 비해 현저하게 정상화 되었다.

즉, 정상 대조군에 비해 HFD 대조군에서는 유의성 있는 (p<0.01) 변성 간 부위 비율, 평균 간세포 직경, 부고환 주위 지방세포의 크기, 췌장섬이 차지하는 부위, 인슐린(insulin) 및 글루카곤(glucagon) 생산세포의 수적 증가가 각각 인정되었으며, 췌장 zymogen 과립이 차지하는 비율은 유의성 있는 (p<0.01) 감소를 나타내었다. 한편, 2AGEO, 3AGEO군 모두 고지방식이 투여로 유발되는 지방 간병증, 지방세포 비대, 췌장섬 증식, 인슐린(insulin) 및 글루카곤(glucagon) 생산세포의 증가를 현저히 억제하는 것으로 관찰되었으며, 특히 췌장의 zymogen 과립의 감소 억제가 인정되어, 이들의 분비 조절을 통한 지방 흡수 및 대사의 제어로 고지방 식이 공급에 의해 초래되는 다양한 변화들이 억제되는 것으로 판단되며, 전체적으로 3AGEO군이 2AGEO군 보다 비교적 우수한 지방 간병증, 지방세포 비대, 췌장섬 증식, 인슐린(insulin) 및 글루카곤(glucagon) 생산세포 증가 억제효과를 나타내었다.

하기에 본 발명의 분획물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

당귀 정유 분획물(AGEO) --------------------------------- 20 mg

유당 -------------------------------------------------- 100 mg

탈크 --------------------------------------------------- 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

당귀 정유 분획물(AGEO) --------------------------------- 10 mg

옥수수전분 -------------------------------------------- 100 mg

유당 -------------------------------------------------- 100 mg

스테아린산 마그네슘 ------------------------------------- 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

당귀 정유 분획물(AGEO) --------------------------------- 10 mg

결정성 셀룰로오스 --------------------------------------- 3 mg

락토오스 --------------------------------------------- 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 --------------------------------- 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

당귀 정유 분획물(AGEO) --------------------------------- 10 mg

만니톨 ------------------------------------------------ 180 mg

주사용 멸균 증류수 ----------------------------------- 2974 mg

Na₂HPO₄,12H2O ------------------------------------------- 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

당귀 정유 분획물(AGEO) --------------------------------- 20 mg

이성화당 ------------------------------------------------ 10 g

만니톨 --------------------------------------------------- 5 g

정제수 -------------------------------------------------- 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖으로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 스프레이제제의 제조

성분 및 함량 (100ml 중) (비중: 0.812g/ml)

당귀 정유 분획물(AGEO): 0.9g

글리세린: 6.30g

스테비오사이드 (100%): 0.020g

무수에탄올: 74.8g

통상의 스프레이 제제의 제조방법에 따라 상기 원료약품 중 글리세린 6.30g, 무수에탄올 70.0g 및 당귀 정유 분획물(AGEO) 0.9g을 먼저 혼합 용해시키고, 별도로 스테비오사이드 (순도100%) 0.02g을 정제수 0.1g에 녹인 액을 상기 용액에 첨가한 후 무수에탄올 4.8g을 첨가하여 전체를 100ml로 하여 스프레이 병에 넣고 마개를 한 다음 사용 시에는 별도로 첨부 포장한 분무 장치를 마개와 교체 조립한 다음 스프레이제제로 제조한다.

제제예 7. 건강 식품의 제조

당귀 정유 분획물(AGEO) --------------------------------- 1000 ㎎

비타민 혼합물 --------------------------------------------- 적량

비타민 A 아세테이트 -------------------------------------- 70 ㎍

비타민 E ------------------------------------------------ 1.0 ㎎

비타민 B1 ---------------------------------------------- 0.13 ㎎

비타민 B2 ---------------------------------------------- 0.15 ㎎

비타민 B6 ----------------------------------------------- 0.5 ㎎

비타민 B12 ---------------------------------------------- 0.2 ㎍

비타민 C ------------------------------------------------- 10 ㎎

비오틴 --------------------------------------------------- 10 ㎍

니코틴산아미드 ------------------------------------------ 1.7 ㎎

엽산 ----------------------------------------------------- 50 ㎍

판토텐산 칼슘 ------------------------------------------- 0.5 ㎎

무기질 혼합물 --------------------------------------------- 적량

황산제1철 ---------------------------------------------- 1.75 ㎎

산화아연 ----------------------------------------------- 0.82 ㎎

탄산마그네슘 ------------------------------------------- 25.3 ㎎

제1인산칼륨 ---------------------------------------------- 15 ㎎

제2인산칼슘 ---------------------------------------------- 55 ㎎

구연산칼륨 ----------------------------------------------- 90 ㎎

탄산칼슘 ------------------------------------------------ 100 ㎎

염화마그네슘 ------------------------------------------- 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 8. 건강 음료의 제조

당귀 정유 분획물(AGEO) --------------------------------- 1000㎎

구연산 ------------------------------------------------ 1000 ㎎

올리고당 ------------------------------------------------ 100 g

매실농축액 ------------------------------------------------ 2 g

타우린 ---------------------------------------------------- 1 g

정제수를 가하여 ----------------------------------- 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims

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당귀를 건조하여 마쇄한 후 시료 중량의 2 내지 20배에 달하는 부피의 헥산 용매를 가하여, 실온 내지 80℃에서 48 내지 96시간 동안에서 냉침추출법으로 추출하여 얻어진 추출액을 30 내지 60℃에서 감압여과 및 농축하여 당귀 헥산 용매 분획물을 수득하는 제 1단계; 상기 헥산 용매 분획물에 상기 분획물 중량의 0.5 내지 5배 부피 (v/w%)의 에탄올을 가하여 생성된 침전물을 제거하고 얻어진 당귀 정유 분획물을 유효성분으로 함유하는 비만증의 치료 또는 예방을 위한 스프레이제제 또는 비강제.
삭제
당귀를 건조하여 마쇄한 후 시료 중량의 2 내지 20배에 달하는 부피의 헥산 용매를 가하여, 실온 내지 80℃에서 48 내지 96시간 동안에서 냉침추출법으로 추출하여 얻어진 추출액을 30 내지 60℃에서 감압여과 및 농축하여 당귀 헥산 용매 분획물을 수득하는 제 1단계; 상기 헥산 용매 분획물에 상기 분획물 중량의 0.5 내지 5배 부피 (v/w%)의 에탄올을 가하여 생성된 침전물을 제거하고 얻어진 당귀 정유 분획물을 유효성분으로 함유하는 비만증의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품.
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