KR101344189B1 - 발효 또는 미발효된 금은화 및 진피 혼합생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만증의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 발효 또는 미발효된 금은화 및 진피의 혼합생약 추출물을 유효성분을 함유하는 비만증 예방 및 치료를 위한 조성물에 대한 것이다. 본 발명의 생약 추출물은 마우스 유래 지방세포인 3T3-L1 세포의 지방분화를 억제 시켜주는 효과와 고지방 식이를 이용해 비만을 유도한 흰쥐에서 체중감소 및 체지방 감소, 혈중지질농도 감소효과가 있으므로 비만증의 예방 및 치료용 약제 또는 건강기능식품에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

발효 또는 미발효된 금은화 및 진피 혼합생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만증의 예방 및 치료용 조성물 {A Composition comprising an extract of fermented or non-fermented Lonicerae Flos and Citri Reticulatae Pericarpium for treating or preventing obesity}

본 발명은 발효 또는 미발효된 금은화 및 진피 혼합생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만증의 예방 및 치료용 건강기능식품에 관한 것이다.

[문헌 1] Van der Ploeg LH. Related Obesity: an epidemic in need of therapeutics. Curr Opin Chem Biol. 4(4), pp.452-460, 2004

[문헌 2] Kim DM, et al., Prevalence of obesity in Korea. Obes Rev. 6, pp.117-121, 2005

[문헌 3] Daily JW, Cha YS. Macronutrient intake and obesity. J Food Sci Nutr. 5(1), pp.58-64, 2000

[문헌 4] 張介賓. 張氏類經. 서울, 성보사. p.586, 1982

[문헌 5] 김은선 외 2, 비만치료제, 심층정보분석 보고서, 한국과학기술정보연구원, pp.1-111, 2002

[문헌 6] 전국한의과대학 공동교재편찬위원회, 본초학, 영림사, pp.242-244, 2006

[문헌 7] 전국한의과대학 공동교재편찬위원회, 본초학, 영림사, pp.466-469, 2006

[문헌 8] 박정연, 산사은국차가 과체중여대생의 체중 혈청 지질 및 산화적 스트레스에 미치는 영향, 석사학위논문, 명지 대학교, 2009

[문헌 9] 최종환 외 7, 진피 복합제 복용과 운동이 비만 여성의 체격, 체지방 및 혈중지질에 미치는 영향, 생약학회지, 33(1), pp. 57-63, 2002

[문헌 10] 박치덕 , Aureobasidium pullulans를 이용한 진피 flavonoid의 생물전환 및 항비만 효능에 관한 연구, 박사학위논문, 계명대학교, 2011

[문헌 11] Murase T. et, al, Nootkatone, a characteristic constituent of grapefruit, stimulates energy metabolism and prevents diet-induced obesity by activating AMPK, Am J Physiol Endocrinol Metab, 299(2), pp.E266-75, 2010)

[문헌 12] Wolfe K. et al., Antioxidant activity of apple peels. J. Agric. Food. Chem. 51, pp.609-614, 2003

[문헌 13] Lin. J. et al., Green Tea Polyphenol Epigallocatechin Gallate Inhibits Adipogenesis and Induces Apoptosis in 3T3-L1 Adipocytes, Obesity Research, 13(6), pp.982-990, 2005

[문헌 14] Lee J. S. et al., Supplementation of whole persimmon leaf improves lipid profiles and suppresses body weight gain in rat fed high-fat diet, Food and Chemical Toxicology, 44(11), pp.1875-1883, 2006

[문헌 15] Huang B. et, al, Cinnamaldehyde prevents adipocyte differentiation and adipogenesis via regulation of peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPARγ) and AMP-activated protein kinase (AMPK) pathways, J Agric Food Chem, Apr 27;59(8), pp.3666-73, 2011

[문헌 16] Allain C. et al., Enzymatic determination of total serum cholesterol, Clin. Chem. 20(4), pp.470-475, 1974

[문헌 17] Van Handel E. et al, Micromethod for the direct determination of serum triglycerides, J. Lab. Clin. Med. 50(1), pp.152-157, 1957

[문헌 18] Warnick G. R. et al., Dextran sulfate-Mg^{2 +} precipitation procedure for quantitationof high density lipoprotein cholesterol, Clin. Chem. 20(6), pp.1397-1388, 1982

[문헌 19] Giusti G. et al., A comparative study of some spectrophotometric and colorimetric procedures for the determination of serum glutamic-oxaloacetic and glutamic-pyruvic transaminase in hepatic diseases. Enzymol. Biol. Clin(Basel), 10(1), pp.17-38, 1969

[문헌 20] DiGirolamo M. et al., Qualitative regional differences in adipose tissue growth and cellularity in male Wistar rats fed ad libitum. Am. J. Physiol. 274, pp.R1460-1467, 1998

비만은 에너지의 섭취와 소비의 불균형에 의해서 야기되는 현상으로 체내에 지방이 과잉 축적되어 있는 상태를 의미한다. 다양한 원인에 의해 야기되기 때문에 명확한 원인은 아직 밝혀지지 않았지만 일반적으로 지나친 열량 섭취, 내분비 장애, 운동부족, 유전적 요인 등에 기인하는 것으로 인식되고 있다. 그리고 생활 습관과 밀접한 관계가 있기 때문에 일반적으로 생활습관병이라고도 한다. 국내에선 2000년 이후 심장병, 당뇨병 등과 같은 만성질환에 걸리기 쉬운 대사증후군을 갖고 있는 사람이 최근 5년 사이 65% 급증하고 있다. 이로 인하여 환자 본인의 고통 및 삶의 질 저하는 물론이고 사회적으로도 과도한 의료비 지출과 생산성 저하 등 다양한 문제점 발생하고 있다.

세계보건기구(WHO)의 통계에 따르면, 2005년 현재 전 세계 인구 중에서 10억 명 정도가 비만인 것으로 추정하고 있으며, 전체 사망원인의 30% 이상이 비만을 비롯한 대사성질환과 관련된 것 또한, 향후 10년 이내에 대사성질환은 15억명 정도로 약 50% 증가될 것으로 추정하고 있다.

비만은 건강을 해칠 정도로 체내 지방이 과도하게 축적된 상태를 말하며, 각 개인의 표준체중보다 20% 이상의 증가가 있을 때 비만이라고 정의할 수 있다. 구체적으로 지방의 무게가 체중에서 차지하는 체지방 비율이 남자의 경우는 25% 이상, 여자의 경우, 30% 이상일 때를 말한다(Van der Ploeg LH. Related Obesity: an epidemic in need of therapeutics. Curr Opin Chem Biol. 4(4), pp.452-460, 2004). 전 세계적으로 과체중 혹은 비만에 해당하는 사람들이 증가하는 추세인데 최근 우리나라에서도 비만의 발생률이 크게 증가하고 있다(Kim DM, et al., Prevalence of obesity in Korea. Obes Rev. 6, pp.117-121, 2005). 비만은 에너지 섭취와 소비의 불균형으로 인해 여분의 에너지가 지방으로 전환되므로 당뇨병, 고혈압, 심혈관계질환, 관절질환, 폐질환 및 일부 암 등의 다양한 퇴행성 질환들의 유병율과 밀접한 관계가 있고, 비만으로 야기되는 재정적 부담과 인명적 손실은 막대하다(Daily JW, Cha YS. Macronutrient intake and obesity. J Food Sci Nutr. 5(1), pp.58-64, 2000). 특히 동양인의 경우, 서양인에 비해 체질량 지수가 적어도 복부 비만이 심하여 고혈압, 당뇨병, 고지혈증과 같은 동맥관련 질환으로 인한 합병증의 감수성이 높기 때문에 비만관리가 더욱 중요시 된다. 한의학에서는 비만의 원인을 膏粱珍味와 氣虛, 濕滯 등으로 보고 있으며, 치료법으로는 利水化濕, 化痰, 熱通腑, 活血祛瘀의 약물요법을 쓰고 있다(張介賓. 張氏類經. 서울, 성보사. p.586, 1982). 비만치료법으로는 식욕억제제, 지방흡수억제제, 에너지대사촉진제, 호르몬제제 등의 약물요법과 위절제술, 지방흡입술 등의 외과적 수술법이 사용되고 있으나, 치료효과의 지속적 유지 여부 및 약물 중단 시 체중이 증가하는 현상 등이 문제되고 있다(Van der Ploeg LH. Related Obesity: an epidemic in need of therapeutics. Curr Opin Chem Biol. 4(4), pp.452-460, 2004; 김은선 외 2, 비만치료제, 심층정보분석 보고서, 한국과학기술정보연구원, pp.1-111, 2002). 현재 의료계에서는 식욕억제제인 시부트라민과 지방흡수억제제인 올리스태트 등을 장기간 사용 가능한 비만약물로 인정하고 있지만 아직도 부작용에 대한 의문이 제기되고 있으므로 안전하게 체중을 감량하기 위해서 식이요법, 운동요법 및 행동요법을 포함하는 다각적 접근방법이 권장되고 있다.

금은화(Lonicerae Flos)는 인동과(Caprifoliaceae)에 속하는 다년생 반상록의 덩굴성식물이며, 여름철 꽃이 피기 전에 채취하여 그늘에 말려 사용한다. 성분으로는 tannin, inositol, sterol, chlorogenic acid, isochlogenic acid등이 보고되어 있으며, flavonoid 성분으로는 luteolin, apigenin, luteolin-7-O-rhamnoglucoside. lonicerin, inositol, 정유, quercetin등을 함유하고 있다. 맛이 달고 약성이 차가워서 청열(淸熱)하고 해독하는 효능이 있어 열독창옹(熱毒瘡擁)을 치료하는 중요한 약이다(전국한의과대학 공동교재편찬위원회, 본초학, 영림사, pp.242-244, 2006).

진피(Citri Reticullatae Pericarpium)는 운향과에 속하는 상록 소교목인 귤나무 및 같은 속 근연식물의 성숙한 과실의 열매껍질을 건저혼 것으로, 11월에 채취하여 햇볕에 말린다. 성분으로 flavonoid로서 hesperidin, naringin poncirin, nobilein, neoesprin, nobileting, neohesprindin, tanderetin 등을 함유한다. 맛은 맵고 쓰며, 약성이 따뜻하고, 방향성이 있으며, 주로 비(脾), 폐경(肺經)에 들어가서 효능을 발휘한다. 매운맛은 발산(發散)하고 행체(行體)하며, 맛이 쓰고 약성이 따뜻하여 조습거한(燥濕去寒)한다. 그런데, 체(滯)한 기(氣)를 행하게 하면 비위장(脾胃腸)이 스스로 건전하게 활동하게 되고, 비위(脾胃)의 한습(寒濕)이 제거되면 담연(淡延)이 저절로 없어지므로, 본품은 이기(理氣), 건비(建脾), 조습(操濕), 화담(化痰)하는 중요한 약이된다(전국한의과대학 공동교재편찬위원회, 본초학, 영림사, pp.466-469, 2006).

최근 한약학계에서는 발효한약에 대한 관심이 증폭되고 있다. 발효한약은 전통발효공법을 통해 전통 한약재를 미생물이 잘 이용할 수 있게 찌거나 삶은 다음, 공기 중의 미생물 또는 혹은 유산균과 같은 순수 분리 미생물을 이용하여 발효한 한약재를 말한다. 이는 한약재 약효성분의 체내흡수율과 생체 이용률을 무도 극대화시킨 일종의 가공방법으로 약리적 기능성뿐만 아니라 한약의 제형개량과 포제방법을 향상시킬 수 있고 이를 통해 한약의 새로운 수요를 창출하고 고부가치의 새로운 한약제품을 개발할 수 있다는데 그 의의를 두고 있다. 현재 다양한 제법과 형태의 발효 한약이 개발되고 있으며 특히 발효 홍삼제품과 발효 한방 화장품 등을 그 대표적 제품으로 꼽을 수 있다.

하지만, 상기 어느 문헌에서도 금은화 및 진피를 발효시킨 혼합 생약 추출물이 비만의 예방 및 치료용 조성물로서 사용 가능하다고 교시되거나 개시된 바 없다.

이에 본 발명자들은 비만에 효과적인 치료제를 개발하기 위한 연구를 통해 금은화 및 진피 발효 추출물이 지방세포인 3T3-L1의 분화를 억제하며, 고지방 식이를 이용한 비만 유도 동물에서 체중 및 체지방 감소, 혈중 지질농도의 감소뿐만 아니라 렙틴(leptin), 아디포넥틴(adiponectin)의 혈중 농도 감소를 가져왔으며, 부고환 지방세포의 직경을 감소시키는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 발효 또는 미발효된 금은화 및 진피 혼합생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만증의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 발효 또는 미발효된 금은화 및 진피 혼합생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만증의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본원에서 정의되는 혼합 생약 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매에 가용한 추출물, 바람직하게는 물에 가용한 추출물을 포함한다.

본원에서 정의되는 혼합 생약의 바람직한 중량 배합비로는 금은화 : 진피의 중량 혼합비(w/w)가 1-5 : 1, 보다 바람직하게는 1-3 : 1(w/w)로 배합된 배합물을 포함하는 것임을 특징으로 한다.

본원에서 정의되는 발효 추출물은 개개 생약을 수분 함수율이 20% 미만, 바람직하게는 10% 미만으로 건조시킨 시료를 80 내지 150℃에서 10분 내지 70분간, 바람직하게는 20 내지 30분간 멸균과정을 거치는 멸균단계; 멸균된 시료를 아스페르질러스 오리자에(Aspergillus oryzae), 아스파질러스 나이거(Aspergillus niger), 락토바실러스 아시도플러스(Lactobacillus acidophilus) 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 기타 식품가공용으로 가능한 발효균주, 바람직하게는 아스페르질러스 오리자에(Aspergillus oryzae)를 시료 중량의 1 내지 30%, 바람직하게는 1 내지 20% 양으로 첨가하여 수분 10 내지 50%, 바람직하게는 20 내지 40%의 조건에서 10 내지 50℃, 바람직하게는 20 내지 40℃ 온도에서 1일 내지 30일, 바람직하게는 5일 내지 20일, 보다 바람직하게는 8일 내지 12일간 발효를 수행하는 제 2단계; 상기 발효가 완료된 발효물을 30 내지 100℃, 바람직하게는 40 내지 60℃ 온도에서 12시간 내지 72시간, 바람직하게는 24시간 내지 52시간 동안 건조시키는 제 3단계; 상기 건조된 덩어리진 입자를 비벼 자체 분리되도록 풀어주고 미세입자를 분리 및 선별하는 제 4단계; 상기 선별된 발효물을 100 내지 300℃, 바람직하게는 150 내지 200℃에서 원적외선 초제로 5분 내지 60분간, 바람직하게는 10분 내지 30분간 덖음과정을 수행하는 제 5단계 공정을 포함하는 공정으로 수득가능하다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 혼합 생약 추출물은 하기와 같이 수득될 수 있다.

본 발명의 발효 또는 미발효 혼합 생약 추출물은 먼저, 금은화 또는 진피 개개 생약을 수분 함수율이 20% 미만, 바람직하게는 10% 미만으로 건조시킨 시료를 80 내지 150℃에서 10분 내지 70분간, 바람직하게는 20 내지 30분간 멸균과정을 거치는 멸균단계; 멸균된 시료를 아스페르질러스 오리자에(Aspergillus oryzae), 아스파질러스 나이거(Aspergillus niger), 락토바실러스 아시도플러스(Lactobacillus acidophilus) 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 기타 식품가공용으로 가능한 발효균주를 시료 중량의 1 내지 30%, 바람직하게는 1 내지 20% 양으로 첨가하여 수분 10 내지 50%, 바람직하게는 20 내지 40%의 조건에서 10 내지 50℃, 바람직하게는 20 내지 40℃ 온도에서 1일 내지 30일, 바람직하게는 5일 내지 20일, 보다 바람직하게는 8일 내지 12일간 발효를 수행하는 제 2단계; 상기 발효가 완료된 발효물을 30 내지 100℃, 바람직하게는 40 내지 60℃ 온도에서 12시간 내지 72시간, 바람직하게는 24시간 내지 52시간 동안 건조시키는 제 3단계; 상기 건조된 덩어리진 입자를 비벼 자체 분리되도록 풀어주고 미세입자를 분리 및 선별하는 제 4단계; 상기 선별된 발효물을 100 내지 300℃, 바람직하게는 150 내지 200℃에서 원적외선 초제로 5분 내지 60분간, 바람직하게는 10분 내지 30분간 덖음과정을 수행하는 제 5단계 공정을 수행하여 본 발명의 발효 시료를 수득가능하다.

상기 단계에서 얻은 발효 시료 또는 미발효된 건조생약재료인 금은화 및 진피을 세척하여, 금은화 : 진피의 중량 혼합비(w/w)가 1-5 : 1, 보다 바람직하게는 1-3 : 1 (w/w)로 배합하고 상기 시료의 1 내지 20배 (w/v) 중량, 바람직하게는 1 내지 10배 (w/v) 중량의 물, 메탄올, 에탄올 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물로 50 내지 120℃, 바람직하게는 약 80-100℃에서 1시간 내지 5시간, 바람직하게는 2시간 내지 4시간 동안 열수 추출법, 냉침 추출법 또는 초음파 추출법, 바람직하게는 열수 추출법을 수행한 후에 얻어진 추출액을 여과지로 여과한 후에 얻어진 여과물을 동결건조, 상온건조 또는 열풍건조, 바람직하게는 동결건조를 수행하여 본 발명의 금은화, 진피로 구성된 발효 또는 미발효 혼합 생약 추출물을 수득할 수 있다.

본 발명은 상기의 제조방법 및 상기 제조공정으로 얻어진 발효 또는 미발효된 금은화 및 진피 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만증 치료 및 예방을 위한 약학 조성물을 제공한다.

상기에서 수득된 금은화, 진피 생약 추출물은 지방세포의 지방 분화를 감소시켜 주며, 고지방 식이를 이용해 비만을 유도한 흰쥐에서 체중감소 및 체지방 감소, 혈중지질농도 감소효과를 나타낸다.

본 발명의 비만증 치료용 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.01 내지 80 중량%, 바람직하게는 10 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 추출물을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 추출물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 추출물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무,알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 봉해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물 및 분획물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물을 포함하는 약학조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물을 포함하는 약학조성물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 발효 또는 미발효된 금은화 및 진피 추출물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(Intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 비만에 대하여 탁월한 억제효과를 갖는 발효 또는 미발효된 금은화 및 진피 혼합 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만증의 예방 및 개선을 위한 건강기능식품을 제공한다.

본원에서 정의되는 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 비만증의 예방 및 개선을 위한 건강기능식품은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.01 내지 95%, 바람직하게는 1 내지 80% 중량백분율로 포함한다.

또한, 비만증의 예방 및 개선을 위한 목적으로 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 약학 투여형태 또는 티백제, 침출차, 건강 음료 등의 형태인 건강기능식품으로 제조 및 가공이 가능하다.

또한, 본 발명은 비만증 억제활성을 나타내는 발효 또는 비발효된 금은화 및 진피의 혼합 생약 추출물을 주성분으로 함유하는 건강보조식품을 제공한다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖ 당 일반적으로 약 1~20 g, 바람직하게는 약 5~12 g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

또한, 본 발명의 추출물은 비만증의 예방 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖을 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 발효 또는 미발효된 금은화, 진피의 혼합생약 추출물은 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryo fibroblast) 유래 지방세포인 3T3-L1에서 지방분화를 억제시켜주는 효과와 고지방 식이로 비만을 유도한 흰쥐에서 체중감소 및 체지방 감소, 혈중지질농도 감소뿐만 아니라 렙틴(leptin), 아디포넥틴(adiponectin)의 혈중 농도 감소효과를 발휘하므로 비만 예방 및 치료를 위한 약학조성물, 건강기능식품 및 건강보조식품에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 지방세포의 cell line인 3T3-L1의 MTT assay에 대한 F-CL의 효과를 나타낸 도이며,
도 2는 지방세포의 cell line인 3T3-L1의 Oil Red-O staining에 대한 F-CL의 효과를 나타낸 도이며,
도 3은 한약재 추출물이 AMPK와 ACC 활성에 미치는 영향에 대한CL과 F-CL의 효과를 나타낸 도이며,
도 4는 고지방식이 투여로 인한 비만쥐의 몸무게에 대한 F-CL의 효과를 나타낸 도이며,
도 5는 고지방식이 투여로 인한 비만쥐의 간무게에 대한 F-CL의 효과를 나타낸 도이며,
도 6(a-d)은 고지방식이 투여로 인한 비만쥐의 체지방 무게에 대한 F-CL의 효과를 나타낸 도이며,
도 7(a-f)은 고지방식이 투여로 인한 비만쥐의 혈중 지질농도에 대한 F-CL의 효과를 나타낸 도이며,
도 8은 고지방식이 투여로 인한 비만쥐의혈중 Adiponectin, Leptin 농도에 대한 F-CL의 효과를 나타낸 도이며,
도 9는 고지방식이 투여로 인한 비만쥐의 조직에서 AMPK와 ACC 활성도에 대한 F-CL의 효과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 참고예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 금은화, 및 진피 생약 발효 및 추출물 제조

1-1. 금은화 발효물의 제조

수분 함수율이 10% 미만으로 건조된 금은화(구입처 신진물산)를 15 kg을 준비 및 선별하고 120℃에서 20분간 멸균기(CT-DAC 80 및 코아테크)로 멸균과정을 거친 후에, 발효균주(Aspergillus oryzae, 충무발효)를 시료 중량의 10%를 첨가하여 수분 30%의 조건에서 온도 30℃에서 10일간 발효장치(온도제어 발효실, (주)이조바이오)에서 발효를 수행하여 금은화 발효물을 수득하였다. 발효가 완료된 발효물을 57℃에서 48시간 동안 건조시킨 후에 덩어리진 입자를 손으로 가볍게 비벼 자체 분리되도록 풀어주고 미세입자를 분리 및 선별하였다.

이후에 180℃에서 원적외선 초제로 20분간 덖음과정을 수행하여 금은화 고체 발효물 13 Kg을 수득하여 하기에 사용하였다.

1-2. 진피 발효물의 제조

수분 함수율이 10% 미만으로 건조된 진피(신진물산) 18 kg을 준비 및 분쇄하고 각 원료별 입자크기가 0.2-0.5 mm가 되도록 별하고 120℃에서 20분간 멸균기(CT-DAC 80, 코아테크)로 멸균과정을 거친 후에, 발효균주(Aspergillus oryzae, 충무발효)를 시료 중량의 10%를 첨가하여 수분 30%의 조건에서 온도 30℃에서 10일간 발효장치(온도제어발효실 (주)이조바이오)에서 발효를 수행하여 금은화 발효물을 수득하였다. 발효가 완료된 발효물을 57℃에서 48시간 동안 건조시킨 후에 덩어리진 입자를 손으로 가볍게 비벼 자체 분리되도록 풀어주고 미세입자를 분리 및 선별하였다.

이후에 180℃에서 원적외선 초제로 20분간 덖음과정을 수행하여 진피 고체 발효물 15 Kg을 수득하여 하기에 사용하였다.

1-3. 발효배합 추출물의 제조

위의 공정으로 발효된 금은화, 진피, 미발효된 금은화, 진피를 3:2 중량비로 5 kg 측정한 후 10배의 증류수를 가수한 후 95℃로 상승 후 12시간 추출하였다. 추출 후 침전물을 거름종이(Advantec, 71101903)를 이용하여 여과한 다음 이 여과액을 회전 진공증류기(EYELA, A-1000s)에서 감압 농축 하였다. 상기 농축액을 -70℃ 저온 냉동기(deep freezer)에서 12시간 방치하고, 72시간 동안 냉동 건조기(freeze dryer)로 건조하여 발효된 혼합추출물 분말 2.1 kg(수득율 42%)과 상기 발효과정을 수행하지 않은 재료로 제조한 미발효 혼합 추출물 분말 1.6 kg(수득율 32%)을 수득하였다(이하 발효된 혼합추출물을 'F-CL', 미발효 혼합 추출물 'CL'이라 명명함).

참고예 1. 실험재료의 준비

3T3-L1 마우스유래 배아섬유아세포는 미국세포주은행(American Type Culture Collection; ATCC, CL-173TM)에서 구입하였으며, Dulbeccos modified Eagles media (DMEM, SH30243.01), Bovine calf serum (BCS, SH30401.01), Fetal bovine serum (FBS, SH30396.03) 및 페니실린과 스트렙토마이신(penicillin/streptomycin; PS)은 하이클론(SV30010, Hyclone, USA)에서 구입하였다. 인슐린(Insulin, 090-03446)과 디메칠술폭사이드(dimethyl sulfoxide; DMSO, D2650), 오일레드오(Oil Red-O, O0625-25), 덱사메타손(dexamethasone (DEX, D4902-100MG)과 이소부칠메틸잔틴(isobutylmethylxanthine (IBMX, I5879-250MG)는 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich company, St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.

참고예 2. 실험동물의 준비

실험동물은 체중 28~32 g의 생후 5주령의 ICR mice(오리엔트 사)를 사용하였고, 대구한의대학교 동물 사육실에서 일정한 조건(온도: 21±2, 명암: 12시간 명암주기)하에, 사료와 음수의 자유로운 섭취가 가능하도록 하였으며, 실험시작 전까지 물과 먹이를 충분히 제공하였다.

참고예 3. 3 T3 - L1 세포배양

3T3-L1 마우스유래 배아섬유아세포(mouse embryo fibroblast)를 하기와 같은 실험방법으로 배양하였다(Lin. J. et al., Green Tea Polyphenol Epigallocatechin Gallate Inhibits Adipogenesis and Induces Apoptosis in 3T3-L1 Adipocytes, Obesity Research, 13(6), pp.982-990, 2005).

먼저, 10% 우태아 혈청(bovine calf serum)을 함유하는 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)로 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하였다(Day 0). 8일 동안 배양한 다음에 전지방세포(preadipocyte)를 10% fetal bovine serum(FBS)을 함유한 DMEM 배지(167 nM insulin, 0.5μΜ isobutylmethylxanthine, 1μΜ dexamethasone 첨가)로 옮겨 2일간 배양하였다(Day 2). 167 nM 인슐린이 있는 배지에서 2일간 더 배양한 다음에 10% FBS/DMEM 배지에서 4일 동안 배양하여 성숙한 지방세포(adipocytes)로 만들었다.

참고예 4. 발효 금은화, 발효 진피 혼합 생약 추출물의 투여 및 비만 유도

비만을 유발하기 위하여 문헌에 기재된 식이조성을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(Lee J. S. et al., Supplementation of whole persimmon leaf improves lipid profiles and suppresses body weight gain in rat fed high-fat diet, Food and Chemical Toxicology, 44(11), pp.1875-1883, 2006).

먼저, 정상군을 제외한 실험군에는 AIN-76 조성을 기초로 한 식이에 표 1과 같이 콜레스테롤 1%와 Lard 15%를 첨가한 펠렛 형태의 고형사료(#102038, AIN-76A Based High Fat/High Carb Purified Rodent Diet with Cholesterol & Cholic Acid, Dyet, USA) 6주간 먹였으며, 실험동물은 각 군당 15마리씩 배정하였다. 즉, 정상군(Normal), 고지방대조군(HF), 고지방사료 미발효 혼합추출물(CL-5%), 고지방사료 발효 혼합추출물(F-CL-5%)로 나누고, 시료군에는 상기 실시예 1에서 수득한 동결 건조한 혼합 생약 추출물 분말을 고지방식이에 5% 첨가하여 매일 오전에 물과 함께 공급하였으며, 매일 20 g의 사료를 할당하였다.

Ingredient	Nomal	HF	CL	F-CL	HCA
Casein	200	200	199	199	200
DL - Methionine	3	3	3	3	3
Com starch	150	150	150	150	150
Sucrose	500	397.5	383	379	391.5
Cellulose	50	50	50	50	50
Corn oil	50	50	49.7	49.3	50
Mineral-mix	35	35	35	35	35
Vitamin-mix	10	10	10	10	10
Choline bitartrate	2	2	2	2	2
Lard	-	100	99.8	99.2	100
Cholesterol	-	2	2	2	2
Cholic acid	-	0.5	0.5	0.5	0.5
CL : 5%(수율32%)	-	-	16	-	-
F- CL : 5%(수율42%)	-	-	-	21	-
Garcinia cambogia 1% (HCA 0.6%)	-	-	-	-	101)
total(%)	1000	1000	1000	1000	1000
Kcal/100g diet	3850	4340	4274	4249	4316
Calorie from fat(%)	117	311	311	311	311
Calorie from carbohydrate(%)	675	505	505	505	505
Calorie from protein(%)	208	184	184	184	184

참고예 5. 통계처리

실험성적의 통계적 유의성은 SPSS 프로그램(Version 14.01)의 투웨이(Two-way) ANOVA와 LSD 사후검정을 이용하여, P<0. 05 인 경우에 유의한 것으로 인정하였으며, 정상군과의 통계학적 유의성(#) 및 고지방식이투여군(HF)과의 통계학적 유의성(*)을 도면 및 표에 각각 표기하였다.

실험예 1. 세포독성( MTT assay )

발효, 미발효, 혼합 추출물이 3T3-L1 세포에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MTT검정법(methylthiazol tetrazolium bromide)을 이용하여 측정하였다(Lin J. et al., Green Tea Polyphenol Epigallocatechin Gallate Inhibits Adipogenesis and Induces Apoptosis in 3T3-L1 Adipocytes, Obesity Research 13(6), pp.982-990, 2005).

MTT 검정법은 살아있는 세포의 미토콘드리아에 있는 탈수소효소에 의해 생성된 blue formazan 결정을 DMSO(dimethyl sulfoxide)로 녹여서 발색시켜 그 흡광도를 측정하는 방법이다. 참고예 1에서 배양한 3T3-L1 cell line을 사용하였으며, 실험에는 지수적 성장기에 있는 세포를 사용하셨다. 즉, 5 X 10⁴ cells/ml을 일정기간 아무처치 없이 동량의 5% tryphan으로 잘 섞어 살아있는 세포수를 측정하였고, 생존능 실험은 모두 3개 well의 평균가를 이용하여 평가하였다. Well당 MTT 용액(2 mg/ml)을 50 ㎕씩 넣어 37℃, 5% CO₂ 항온기에서 2시간 반응시킨 후 배지는 제거하고 DMSO를 well당 100 ㎕씩 넣어 5분간 plate shaker에서 blue formazan 결정을 용해시킨 다음 ELISA reader(Techan, Germany) 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 발효 한약재(F-CL)와 미발효 한약재(CL)를 농도별(0.1, 0.3, 1 mg/㎖)로 24시간 처리하여 MTT assay를 실험한 결과, 대조군에 비해 시료 농도에 의존적으로 지방세포의 생존율이 감소하는 것으로 관찰되었으며, 특히 발효 한약재(F-CL) 0.1 mg/㎖ 농도에서 미발효 한약재 추출물보다 유의하게 세포생존율이 저해되었다.

실험예 2. 세포를 이용한 oil red -O 염색

3T3-L1 세포에서 지방세포 분화 및 지방 생성에 발효, 미발효, 혼합 추출물이 미치는 영향을 알아보기 위하여 Oil Red-O 염색 실험을 수행하였다(Lin J. et al., Green Tea Polyphenol Epigallocatechin Gallate Inhibits Adipogenesis and Induces Apoptosis in 3T3-L1 Adipocytes, Obesity Research 13(6), pp.982-990, 2005).

Oil Red-O 염색법은 분화된 3T3-L1 세포에 Oil Red-O 시약으로 염색하여 세포내 생성된 지방을 측정하는 방법이다. 분화된 세포의 배지를 제거하고 D-PBS(DPBS, SH30028.03)로 세포를 세척하고 pH 7.2 Cacodylate buffer로 2시간 고정하고 Oil-red O Solution으로 염색하였다. 세포 염색이 끝난 후 40% Isopropyl alcohol(2-Propanol,67-63-0)로 3번 세척 후 건조하여 세포 내 지방의 크기를 광학현미경(AE 31, Motic, USA)으로 관찰하였다.

실험결과, 도 2에 나타나는 바와 같이, 3T3-L1 세포의 분화과정 중에 발효, 미발효 혼합 추출물을 각각 100 ㎍/㎖ (B), 150 ㎍/㎖ (C), 200 ㎍/㎖ (D)의 농도로 시료를 처리한 결과, 대조군(control)에 비해서 농도 의존적으로 세포분화 및 지방생성을 억제하였으며, 각각의 한약재 추출물을 현미경 및 육안으로 관찰한 결과, 발효 혼합 추출물 처리군이 미발효 혼합 추출물보다 지방축적 저해효과가 뛰어났다.

실험예 3. 3 T3 - L1 Cell Western

발효 혼합 추출물이 AMPK, ACC와 PPAR-γ 활성에 미치는 영향을 알보기 위하여 3T3-L1 Cell Western을 수행하였다(Huang B. et, al, Cinnamaldehyde prevents adipocyte differentiation and adipogenesis via regulation of peroxisome proliferator-activated receptor-γ(PPARγ) and AMP-activated protein kinase (AMPK) pathways, J Agric Food Chem, Apr 27;59(8), pp.3666-73, 2011).

농도별로 처리된 3T3-L1 cell을 D-PBS(DPBS, SH30028.03)로 washing 한 후 1mM EDTA가 포함된 50 mM tris-HCl(pH7.5) buffer 2 ml를 첨가하여 세포를 떼어낸 후 Branson model 185 sonifier를 이용하여 40 watt에서 5초간 sonication하였다. 13,000 rpm 4℃에서 5분간 원심분리한 후 20 ㎍의 동일한 양의 단백질을 denature시키고 8% 또는 10% SDS-PAGE를 분리한 후, PVDF membrane으로 transfer시킨다. mebrane을 TBS-T로 용해한 5% skin milk로 2시간 동안 blocking 한다음, rabbit polyclonal anti-PPARγ, AMPK, ACC antibody로 1시간 동안 처리하였다. TBS-T로 세척한 후에 horseradish peroxidase인 2차 항체로 1시간 동안 처리하여 다시 TBS-T로 washing 한 후 ECL detection 시약으로 immunorective bands를 관찰하였다.

실험결과, 도 3에 나타나는 바와 같이. 발효 혼합추출물에서 AMPK의 인산화 활성이 증가한 것으로 나타났다. 그에 비해 미발효 혼합 추출물에서는 AMPK의 인산화 활성에 아무런 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다. 또한 AMPK의 인산화 활성은 발효 혼합 추출물의 농도에 비례하여 증가하는 양상을 보였다. AMPK 인산화 활성에 따른 ACC 마찬가지로 발효 혼합 추출물에서 유의하게 활성화된 것으로 관찰되었다. 뿐만 아니라 PPAR-γ는 지방세포에 나타나는 특이적인 전사 인자로 분화 후기에 발현되며 여러 호르몬인 adipocytokine과 adipogenic protein 발현에 중요한 역할을 한다. 발효 혼합 추출물과 미발효 혼합 추출물에서 PPAR-γ 단백질 발현 억제활성을 확인한 결과 발효 추출물에 PPAR-γ가 매우 감소하는 양상을 보였고, 미발효 혼합 추출물에서는 농도에 따른 차이가 유의하게 나타나지 않았다.

실험예 4. 고지방 식이를 이용한 비만 유도 쥐의 식이효율 , 체중측정 및 조직의 채취

식이 섭취량은 매일 오전에 측정하여, 일일 먹이 섭취량을 계산하였으며, 체중은 일주일에 한 번씩 측정하였다. 식이효율(FER; Food efficiency ratio)은 실험기간 동안의 체중 증가량을 구하고 그 값을 식이섭취량으로 나눈 값이다(FER=body weight gain/food intake).

상기 실험 결과 표 2 및 도 4에 나타나는 바와 같이 6주 후 정상군(NOR)의 체중보다 고지방식이 투여군(HF)에서 유의성 있게 체중이 증가하였으며, HCA, CL, F-CL군에서는 체중의 증가를 유의적으로 억제하는 결과를 얻을 수 있었다. 식이섭취량을 보면 정상군(NOR)과 비교하였을 때, HCA군와 CL, F-CL군에서 유의성 있는 감소를 보였다. 체중의 변화율에 있어서는 고지방식이 투여군(HF)에 비해 정상군(NOR)과 HCA, F-CL군에서 유의적인 감소를 보였다. 식이효율(FER)에 있어서도 정상군(NOR)에 비해 HF군, HCA, CL, F-CL군에서 유의적으로 높은 결과를 보였다.

한편, 실험동물은 희생 전 15시간 절식 시킨 후 CO₂로 마취한 상태에서 Liver 및 부위별 내장지방조직(부고환;epididymal, 내장;visceral adipose tissue)과 갈색지방(brown adipose tissue; BAT)을 채취하였다. 조직 염색용 조직은 포르말린 용액에 고정 시켰으며, 분석용 체지방조직은 액체 질소로 급속 냉동시켜 사용하기 전까지 -80℃에 보관하였다.

상기 실험 결과 도 5 및 도 6(a-d)에 의하면 정상군에 비해 고지방 식이 투여군(HF)군에서 간 무게, 부고환 지방 무게, 신장주위 지방 무게, 내장 무게, 갈색지방(BAT)가 모두 유의하게 증가하였으며, HCA, CL, F-CL군에서 간장무게, 부고환지방 무게, 신장주위 지방조직 무게 및 갈색지방 무게가 감소되었으며, 그 중에서도 F-CL군에서 유의하게 억제되었다. 이 결과는 비만에 있어서 단순한 체중감소 보다는 심혈관계 질환과 같은 합병증을 야기시키는 것으로 알려진 체지방 감소에 대한 강력한 F-CL의 효과를 보여주는 것으로서 비만 치료제로서의 더 큰 의미가 있다고 할 수 있다.

	NOR	HF	HCA	CL	F - CL
food intake	550±0.14*	5.04±0.09	4.02±0.07#,*	4.28±0.04#,*	3.84±0.16#,*
Weight gain(g/day)	0.17±0.02#,*	0.27±0.02	0.09±0.02*	0.22±0.02	0.15±0.01*
FER*	0.03±0.00*	0.05±0.00#,*	0.07±0.00#	0.05±0.01#	0.05±0.00#

실험예 5. 비만을 유발시킨 쥐의 채혈 및 혈청 분석

각 군의 실험동물을 희생 전 15시간 절식시킨 후 CO₂로 가볍게 마취한 다음, 복부 대정맥에서 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 test tube에 넣고 상온에서 1시간 방치한 다음 4℃, 3,500 rpm에서 15분간 원심분리 하여 혈청을 분리하고, 혈청 중 총콜레스테롤(total cholesterol; TC)은 C. Allain 1의 효소법(Allain C. et al., Enzymatic determination of total serum cholesterol, Clin. Chem. 20(4), pp.470-475, 1974)에 따라 분석시약(L-type GHO M, Wako, 일본)을 사용하였고 중성지방(triglyceride) 함량은 Van Handel등의 효소법(Van Handel E. et al, Micromethod for the direct determination of serum triglycerides, J. Lab. Clin. Med. 50(1), pp.152-157, 1957)에 의하여 검사시약(L-type TG M, Wako, 일본)을 사용하였다. 고밀도지단백(HDL-cholesterol)과 저밀도지단백(LDL-cholesterol) 농도는 Warnick의 효소법(Warnick G. R. et al., Dextran sulfate-Mg²⁺ precipitation procedure for quantitationof high density lipoprotein cholesterol, Clin. Chem. 20(6), pp.1397-1388, 1982)에 의하여 검사시약(Choesterol N HDL, Choesterol N LDL, SEKISUI, 일본)으로 측정하였다. 간 기능과 관련된 트랜스아미나아제(transaminase)인 혈청 중 에이엘티(ALT; Alanine aminotransferase)와 혈청 에이에스티(AST; Aspartate aminotransferase) 함량은 분광광도법(Giusti G. et al., A comparative study of some spectrophotometric and colorimetric procedures for the determination of serum glutamic-oxaloacetic and glutamic-pyruvic transaminase in hepatic diseases. Enzymol. Biol. Clin(Basel), 10(1), pp.17-38, 1969)을 이용한 검사시약(L-type ALT J2, L-type AST J2, Wako, 일본)을 사용하여 자동화된 생화학 분석기(Hitachi 7080, Japan)로 분석하였다. 혈청 중 렙틴(leptin)의 농도는 Leptin ELISA kit(900-015, Assay Designs, U.S.A.), 혈청 중 아디포넥틴(adiponectin)의 농도는 Adiponectin ELISA kit(44-ADPR-0434, ALPCO Diagnostics, U.S.A.)를 사용하여 ELISA reader(Tecan, Germany)로 분석하였다.

실험결과, 도 7(a-f)에 나타나는 바와 같이, 정상군에 비해 고지방 식이 투여군(HF)군에서 혈청 중 ALT, AST와 중성지방 농도 및 저밀도지단백(LDL) 함량이 증가하였으나, F-CL의 투여로 혈청 중 ALT, AST와 중성지방 농도 및 저밀도지단백(LDL) 함량이 감소되었으며, 혈청 중 고밀도지단백(HDL) 함량은 정상군에 비해 고지방 식이 투여군(HF)군에서 감소하였으나, F-CL 투여로 고밀도지단백(HDL) 함량이 증가하는 경향을 보였다.

인슐린감수성 호르몬으로 작용하면서 지방세포에서 분비되는 아디포넥틴(adiponectin)의 혈청 중 함량은 도 8-a에 나타나는 바와 같이, 정상군(NOR)에서 고지방 식이 투여군(HF)보다 증가하였으며, F-CL 투여로 혈청 중 아디포넥틴 (adiponectin) 함량은 고지방 식이 투여군(HF)보다 증가하는 경향을 보였다.

지방세포에서 분비되는 펩타이드로서, 식욕조절과 관련이 있다고 알려진 렙틴(leptin)의 혈청 중 함량은 도 8-b에 나타나는 바와 같이, 정상군(NOR)에 비해 고지방 식이 투여군(HF)에서 유의하게 증가하였으며, F-CL 투여로 혈청 중 렙틴(leptin) 함량은 고지방 식이 투여군(HF)보다 유의하게 감소하는 경향을 보였다.

실험예 6. 근육에서 AMPK , ACC 및 PPAR -γ의 활성

발효 혼합 추출물이 AMPK, ACC와 PPAR-γ 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 3T3-L1 Cell Western을 수행하였다(Murase T. et, al, Nootkatone, a characteristic constituent of grapefruit, stimulates energy metabolism and prevents diet-induced obesity by activating AMPK, Am J Physiol Endocrinol Metab, 299(2), pp.E266-75, 2010).

조직을 RIPA buffer(150 mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 25 mM NaF, 20 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM Na₃VO₄, protease inhibitor cocktail)를 사용하여 균질화 시킨 다음 4℃에서 14,000 g에서 10분간 원심분리하여 상등액을 취한 다음 단백질 함량을 BCA reagent로 정량을 한 뒤, 20 ㎍을 8% SDS-PAGE에서 전기영동 시켰다. 전개시킨 gel을 PVDF membrane(Millipore)에 transfer한 후 5% bovine serum albumin(BSA)-TBST(TBS, 0.1% Tween-20)로 blocking 시켰다. 5% bovine serum albumin(BSA)-TBST에 anti-ACC(1:1000 dilution, Cell Signaling), P-ACC(1:1000 dilution, Cell Signaling), anti-AMPK(1:1000 dilution, Cell Signaling), P-AMPK(1:1000 dilution, Cell Signaling), PPAR-γ(1:1000 dilution, Santa cruz Biotechnology, USA) primary antibody를 overnight으로 반응시키고, TBST용액으로 5분간 6회 washing 한후 secondary antibody(goat anti-rabbit-HRP, 1:5000 dilution, Assay designs)를 5% bovine serum albumin(BSA)-TBST에 넣어 1시간 동안 반응시킨 다음 TBST용액으로 5분간 6회 washing하였다. 이후 ECL reagent(Amersham Pharmacia Biotech., Arlington Heights, IL, USA)를 사용하여 1분간 반응한 뒤 Image Quant software(Buckinghamshire, UK)를 사용하여 Membrane에 부착된 단백질을 확인하였다.

실험결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 근육에서의 비만 관련을 AMPK, ACC 인산화에 미치는 발효 한약재 추출물과 미발효 한약재 추출의 효과를 Western blot으로 확인하였을때, 밴드의 발현정도가, P-AMPK에서 고지방 식이 대조군(HF)과 비교 하였을때, 발효 한약재추출물(F-CL)에서 활성이 증가한 것으로 나타났다. P-AMPK와 마찬가지로 P-ACC도 고지방식이군(HF)과 비교 하였을때 F-CL군에서 활성화 되었고 약물대조군(HCA) 보다 유의하게 활성화된 것으로 관찰되었다.

하기에 본 발명의 추출물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

금은화, 진피 혼합 생약 추출물(F-CL) 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

금은화, 진피 혼합 생약 추출물(F-CL) 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

금은화, 진피 혼합 생약 추출물(CL) 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

금은화, 진피 혼합 생약 추출물(CL) 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO₄,12H2O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

금은화, 진피 혼합 생약 추출물(F-CL) 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖으로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

금은화, 진피 혼합 생약 추출물(F-CL) 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

금은화, 진피 혼합 생약 추출물(CL) 1000㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (8)

1. 수분 함수율이 20% 미만으로 건조시킨 금은화 및 진피 생약시료를 80 내지 150℃에서 10분 내지 70분간 멸균과정을 거치는 멸균단계; 멸균된 시료에 아스페르질러스 오리자에(Aspergillus oryzae), 또는 아스파질러스 나이거(Aspergillus niger)로부터 선택된 발효균주를 시료 중량의 1 내지 30% 양으로 첨가하여 수분 10 내지 50%의 조건에서 10 내지 50℃ 온도에서 1일 내지 30일간 발효를 수행하는 제 2단계; 상기 발효가 완료된 발효물을 30 내지 100℃ 온도에서 12시간 내지 72시간 동안 건조시키는 제 3단계; 상기 건조된 덩어리진 입자를 비벼 자체 분리되도록 풀어주고 미세입자를 분리 및 선별하는 제 4단계; 상기 선별된 발효물을 100 내지 300℃에서 원적외선 초제로 5분 내지 60분간 덖음과정을 수행하는 제 5단계 공정을 포함하는 공정으로 수득된 발효된 금은화 및 진피 혼합생약의 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만증의 예방 및 치료용 약학조성물.
   
2. 제 1항에 있어서,
   상기 금은화 : 진피의 중량 혼합비(w/w)가 1-5 : 1(w/w)로 배합된 배합물임을 특징으로 하는 약학조성물.
   
3. 제 1항에 있어서,
   상기 혼합 생약 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매에 가용한 추출물임을 특징으로 하는 약학조성물.
   
4. 삭제
5. 수분 함수율이 20% 미만으로 건조시킨 금은화 및 진피 생약시료를 80 내지 150℃에서 10분 내지 70분간 멸균과정을 거치는 멸균단계; 멸균된 시료에 아스페르질러스 오리자에(Aspergillus oryzae), 또는 아스파질러스 나이거(Aspergillus niger)로부터 선택된 발효균주를 시료 중량의 1 내지 30% 양으로 첨가하여 수분 10 내지 50%의 조건에서 10 내지 50℃ 온도에서 1일 내지 30일간 발효를 수행하는 제 2단계; 상기 발효가 완료된 발효물을 30 내지 100℃ 온도에서 12시간 내지 72시간 동안 건조시키는 제 3단계; 상기 건조된 덩어리진 입자를 비벼 자체 분리되도록 풀어주고 미세입자를 분리 및 선별하는 제 4단계; 상기 선별된 발효물을 100 내지 300℃에서 원적외선 초제로 5분 내지 60분간 덖음과정을 수행하는 제 5단계 공정을 포함하는 공정으로 수득된 발효된 금은화 및 진피 혼합생약의 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만증의 예방 및 개선용 건강기능식품.
   
6. 삭제
7. 삭제
8. 금은화 및 진피 개개 생약을 수분 함수율이 20% 미만으로 건조시킨 시료를 80 내지 150℃에서 10분 내지 70분간 멸균과정을 거치는 멸균단계; 멸균된 시료에 발효균주를 시료 중량의 1 내지 30% 양으로 첨가하여 수분 10 내지 50%의 조건에서 10 내지 50℃ 온도에서 1일 내지 30일간 발효를 수행하는 제 2단계; 상기 발효가 완료된 발효물을 30 내지 100℃ 온도에서 12시간 내지 72시간 동안 건조시키는 제 3단계; 상기 건조된 덩어리진 입자를 비벼 자체 분리되도록 풀어주고 미세입자를 분리 및 선별하는 제 4단계; 상기 선별된 발효물을 100 내지 300℃에서 원적외선 초제로 5분 내지 60분간 덖음과정을 수행하는 제 5단계 공정을 수행하여 발효 시료를 얻는 단계; 상기 단계에서 얻은 발효 시료 또는 미발효된 건조생약재료인 금은화 및 진피을 세척하여, 금은화 : 진피의 중량 혼합비(w/w)가 1-5 : 1(w/w)로 배합하고 상기 시료의 1 내지 20배 (w/v) 중량의 물, 메탄올, 에탄올 또는 이들의 혼합용매로 50 내지 120에서 1시간 내지 5시간 동안 열수 추출법, 냉침 추출법 또는 초음파 추출법을 수행한 후에 얻어진 추출액을 여과지로 여과한 후에 얻어진 여과물을 동결건조, 상온건조 또는 열풍건조를 수행하여 제 1항의 발효된 금은화 및 진피의혼합 생약 추출물을 제조하는 제조방법.
   

Images