KR101407188B1

KR101407188B1 - 발효 또는 비발효된 혼합 생약 추출물을 이용한 대사성질환 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101407188B1
Application number: KR1020120078465A
Authority: KR
Inventors: 김미려; 이은실; 신인순
Original assignee: 영농조합법인 이도; 대구한의대학교산학협력단
Priority date: 2012-07-18
Filing date: 2012-07-18
Publication date: 2014-06-13
Also published as: KR20140011713A

Abstract

본 발명은 발효 또는 비발효된 혼합 생약 추출물을 이용한 대사성질환 예방 및 치료용 조성물 및 건강기능식품에 대한 것이다. 본 발명의 생약 추출물은 마우스 유래 지방세포인 3T3-L1 세포와 L6 근육세포에서 지방분화 억제 및 지방대사와 당대사를 개선시켜주는 효과가 있으므로 대사성질환 예방 및 치료용 약제 또는 건강기능식품에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

발효 또는 비발효된 혼합 생약 추출물을 이용한 대사성질환 예방 및 치료용 조성물 {A composition comprising an extract of fermented or non-fermented combined crude drugs for treating and preventing abnormal metabolic diseases}

본 발명은 발효 또는 비발효된 혼합 생약 추출물을 이용한 대사성질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로는, 죽엽, 금은화, 갈근, 및 산사의 혼합생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 지방 및 당 대사 개선 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

[문헌 1] Giliand SE. Health and nutritional benefits from lactic acid bateria. FEMS Microbiol. Rev. 87:175-188. 1990.

[문헌 2] Annual report on the cause of death statistics. National Statistical Office, Republic of Korea. 2005.

[문헌 3] Ministry of Health and Welfare/Korean Health Industry Development. 2009 Korean national health and nutrition examination survey. pp256. 2010.

[문헌 4] 손숙미 외 4. 임상영양학. 교문사. pp. 215, 216, 219. 2007.

[문헌 5] Min HG. 1999. Clinical Endocrinology. Korea Medical Pub, Seoul.

[문헌 6] 남상민, 한방으로 풀어보는 당뇨병. 매일건강신문사출판부. pp.24-27, 2002.

[문헌 7] 김대근 외 5, 본초생약학, 신일북스, pp.90-91, 2008.

[문헌 8] 전국한의과대학 공동교재편찬위원회, 본초학, 영림사, pp.242-244, 2006.

[문헌 9] 김대근 외 5, 본초생약학, 신일북스, pp.68-69, 230-231, 2008.

[문헌 10] Yacoub Wasef SZ. et al. Glucose, dexamethasone, and the unfolded protein response regulate TRB3 mRNA expression in 3T3-L1 adipocytes and L6 myotubes. Am J Physiol Endocrinol Metab. 291(6):E1274-80. 2006.

[문헌 11] Hansawasdi C. et al. Alpha-amylase inhibitors from roselle Hibiscus sabdariffa Linn. tea. Biosci Biotechnol Biochem.64(5):1041-3. 2000.

[문헌 12] Watanabe. J. et. al., Isolation and identification of alpha-glucosidase inhibitors from tochu-cha (Eucommia ulmoides). Biosci Biotechnol Biochem.61(1):177-8.1997.

[문헌 13] Murase T. et, al, Nootkatone, a characteristic constituent of grapefruit, stimulates energy metabolism and prevents diet-induced obesity by activating AMPK, Am J Physiol Endocrinol Metab, 299(2), pp.E266-75, 2010.

[문헌 14] Lin. J. et al., Green tea polyphenol epigallocatechin gallate inhibits adipogenesis and induces apoptosis in 3T3-L1 adipocytes, Obesity Research, 13(6), pp.982-990, 2005.

[문헌 15] Bergeron S. et. al., Inhibition of the protein tyrosine phosphatase SHP-1 increases glucose uptake in skeletal muscle cells by augmenting insulin receptor signaling and GLUT4 expression. Endocrinology. 152(12) : 4581-8. 2011.

[문헌 16] Huang B. et, al, Cinnamaldehyde prevents adipocyte differentiation and adipogenesis via regulation of peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPARγ) and AMP-activated protein kinase (AMPK) pathways, J Agric Food Chem, Apr 27;59(8), pp.3666-73, 2011.

대사성 질환은 고열량, 고지방 및 고당질 식사에 의한 체내 에너지 대사의 불균형은 비만을 초래하고 인슐린 저항성과 대사성 염증을 유도하여 지질대사 이상 및 제2형 당뇨병 등 퇴행성 질환을 일으킬 수 있으므로, 생활습관성 질환이라고도 부른다.. 최근 우리나라는 식생활의 서구화로 인해 가공식품과 동물성식품의 섭취 증가와 식물성식품 섭취 감소로 인한 식생활의 변화로 고혈압, 심장병, 동맥경화증 및 당뇨병 등의 만성퇴행성질환의 이환율이 높아지고 있다(Giliand SE et al. Health and nutritionalbenefits from lactic acid bateria. FEMS Microbiol. Rev. 87:175-188. 1990 ; Annual report on the cause ofdeath statistics. National Statistical Office, Republic of Korea. 2005).

미국내 당뇨병 유병율은 1988년 5.6백만 명에서 2008년 18.1백만명으로 3배나 증가했으며, 2010년 65세 이상 노령인구에서 10.9백만명으로 26.9%의 유병율 보이고 있으며, 또한 20세 이상 인구에서는 1.9백만명이 당뇨병으로 새롭게 진단 받고 있다(Ministry ofHealth and Welfare/Korean Health Industry Development. 2009 Korean national health and nutrition examination survey. pp256. 2010.).

당뇨병의 경우 크게 인슐린 의존형 당뇨병(insulin dependent Diabetes Mellitus ; IDDM)인 제1형 당뇨병과 인슐린 비의존형 당뇨병(non-insulin dependent Diabetes Mellitus : NIDDM)인 제 2형 당뇨병으로 나눌 수 있다. 제 1형 당뇨병은 초기에 어느 정도 베타 세포가 남아 있어서 인슐린 합성이 분비되나 시간경과에 따라 베타 세포의 파괴가 진행되어 인슐린 합성 및 분비가 되지 않게 된다. 제 2형 당뇨병은 인슐린이 어느 정도 분비되지만 인슐린에 대하여 세포가 반응하지 못하여 저항성 증가로 발생한다 (손숙미 외 4. 임상영양학. 교문사. pp. 215, 216, 219. 2007). 하지만 병의 진전에 따라 이상이 생겨 제 2형 당뇨병에서 제 1형과 혼합되는 수도 많다 (Min HG. 1999. Clinical Endocrinology. Korea Medical Pub, Seoul).

당뇨병의 병증은 한의학의 여러 문헌에서 찾아볼 수 있으며, 소갈(消渴) ·피부소양(皮膚瘙痒) ·조(燥) ·풍비(風痺) ·위(胃) ·이양병(二陽病) ·옹저(癰疽) ·안혼(眼昏) ·비통(痺痛) 등의 범주에 속하는데, 가장 유사한 병증은 소갈이다. 소갈의 원인과 분류에 대하여는 문헌에 따라 다양하게 나타나고 있는데, 소갈증이란 음식소화가 잘 되고 배고프기를 잘하고 목이 말라 물을 많이 찾게 되는 증이라 설명하고 있다. 소갈의 원인으로는 선천적으로 오장(五臟)이 약하여 소갈이 되기도 하고, 대장과 위의 진액과 혈액이 부족하여 내부가 건조하고 열이 많아져서 뭉치게 되면 소갈이 된다고 설명하고 있다. 혹은 원기가 허약하여 몸에 한기(寒氣)가 왕성하여 생기는 것과, 병적인 열이 지나치게 많아서 생기는 것으로 분류하기도 한다. 소갈의 치료는 열을 식혀 주고 음기(陰氣)를 보충하여 주는 것을 기본으로 하며, 여기에 상소에 대해서는 열을 식혀 주는 것을 주로 하는데 백호가인삼탕(白虎加人蔘湯)류를 쓰고, 중소는 위장의 열을 식혀 주고 건조한 것을 부드럽게 하는데 조위승청탕(調胃升淸湯)류를 쓰며, 하소는 음기를 보충하여 주고 신장기능을 증대시켜 주는 육미지황환(六味地黃丸)류를 쓴다(남상민, 한방으로 풀어보는 당뇨병. 매일건강신문사출판부. pp.24-27, 2002).

당뇨병 치료제의 세계시장 규모는 약 300억달러(2025년)로 추정이 되며, -약물 치료를 받고 있는 당뇨병 환자 중 58%가 경구용 혈당제를 복용하고 있으며, 환자의 총 경제적 비용은 1740억 달러로 치료에 필요한 직접비용이 비당뇨병자에 비해 2.3배가 높게 지출되고 있는 실정이다. 또한 부작용에 대한 의문도 제기되고 있으므로 안전하게 혈당을 강하하기 위해서 식이요법, 운동요법 및 행동요법을 포함하는 다각적 접근방법이 권장되고 있다.

죽엽(Phyllostachyos Folium, 대나무잎)은 솜대(Phyllostachys nigra var. henonis Stapf.)의 잎으로 성미는 辛(맵고), 苦(쓰고), 淡(담담하고), 甘(달다)하다. 귀경은 심(心), 폐(肺), 위(胃), 담(膽)으로 淸熱瀉火除煩; 두통, 후비(喉痺), 목적(目赤), 심번불매(心煩不寐)를 치료하고 열병으로 인한 번열구갈(煩熱口渴), 심화상염(心火上炎)을 치료한다. 또한 生津利尿; 소갈(逍,渴), 소변불리, 뇨삽(尿), 열림(熱)을 치료한다. 18종의 유리 아미노산이 검출되는데 그 중 세린(serine)이 가장 많으며, 수산과 헤모젠티식 에시드(homogentisic acid)가 아린 맛의 원인이 되고 있다 (김대근 외 5, 본초생약학, 신일북스, pp.90-91, 2008).

금은화(Lonicerae Flos, 인동화)는 인동과(Caprifoliaceae)에 속하는 인동(Lonicera japonica Thunb)의 꽃봉오리를 여름철 꽃이 피기 전에 채취하여 그늘에 말려 사용한다. 성분으로는 tannin, inositol, sterol, chlorogenic acid, isochlogenic acid등이 보고되어 있으며, flavonoid 성분으로는 luteolin, apigenin, luteolin-7-O-rhamnoglucoside. lonicerin, inositol, 정유, quercetin등을 함유하고 있다. 맛이 달고 약성이 차가워서 청열(淸熱)하고 해독하는 효능이 있어 열독창옹(熱毒瘡擁)을 치료하는 중요한 약이다(전국한의과대학 공동교재편찬위원회, 본초학, 영림사, pp.242-244, 2006).

갈근(Puerariae Radix, 칡뿌리)은 Pueraia Thunbergiana Bentham의 뿌리로 성미는 감(甘), 신(辛)하며 비(脾), 폐(肺), 위(胃)로 귀경한다. 성분으로는 다이드자인(daidzein), 다이드진(daidzin), 게니스테인(genistein), 파라쿠마릭산, 푸에라린, 케르세틴, 칼슘, 철, 마그네슘, 인, 칼륨, 비타민 B2 isoflavonoids: daidzin, daidzein, 4,7-diglucoside, puerarin, puerarin-7-xyloside, 4,6-di-o-acetylpuerarin, genistein, formonetin, triterpenoids : soyasapogenol A, kudzusapogenol B, kudzusaponin B, allantoin, acetyl choline, Polysaccharide: starch 등을 함유하고 있다. 주치증으로는 해기발표(解飢發表)하여 풍열감모, 반진불투, 고혈압, 심교통을 치료하고 제번지갈(除煩止渴)하여 구갈, 소갈하고, 승양지사(升揚止瀉)로 비허설사, 이롱(耳聾)을 치료한다. 마지막으로 청열해독하여 정창, 토혈, 습열이질을 치료한다(김대근 외 5, 본초생약학, 신일북스, pp.68-69, 2008).

산사(Crataegi Fructus)는 산사나무 (Crataegus pinnatifdata Bunge var. typica Schneider)의 열매로 감(甘)하며 비(脾), 간(肝), 위(胃)로 귀경하여 소화식적(消食化積)의 효능으로 적체, 위완창통, 사리복통을 치료하고, 행기산어(行氣酸瘀)하여 혈어경폐, 산후복통, 징가(), 산기동통(疝氣疼痛), 퇴산(疝)을 치료한다. 성분으로는 플라보노이드, 유기산, 당류, 비타민 C 열매: Chlorogenic acid, Citric acid, Citric acid dimethyl ester, Citric acid 2-monomethyl ester, Citric acid trimethyl ester, (-)-Epicatechin, Hyperoside, Pinnatifidin, Quercetin, Quercetin-3-[O-alpha-L-rhamno pyranosyl-(1->6)-beta-D- galactopyranoside], Quercetin-3-O-[alpha-L- rhamnopyranosyl-(1->4)-beta-D- glucopyranoside], Sexangularetin, Vitexin, Vitexin-4-alpha-L- rhamnopyranoside등을 함유하고 있다(김대근 외 5, 본초생약학, 신일북스, pp.230-231, 2008).

최근 한약학계에서는 발효한약에 대한 관심이 증폭되고 있다. 발효한약은 전통발효공법을 통해 전통 한약재를 미생물이 잘 이용할 수 있게 찌거나 삶은 다음, 공기 중의 미생물 또는 혹은 유산균과 같은 순수 분리 미생물을 이용하여 발효한 한약재를 말한다. 이는 한약재 약효성분의 체내흡수율과 생체 이용률을 무도 극대화시킨 일종의 가공방법으로 약리적 기능성뿐만 아니라 한약의 제형개량과 포제방법을 향상시킬 수 있고 이를 통해 한약의 새로운 수요를 창출하고 고부가가치의 새로운 한약제품을 개발할 수 있다는데 그 의의를 두고 있다. 현재 다양한 제법과 형태의 발효 한약이 개발되고 있으며 특히 발효 홍삼제품과 발효 한방 화장품 등을 그 대표적 제품으로 꼽을 수 있다.

그러나, 상기 문헌의 어디에도 발효 또는 비발효된 죽엽, 금은화, 갈근, 및 산사로 구성된 혼합생약추출물이 대사성 질환의 치료효과에 대하여 개시되거나 교시된 바가 없다.

이에 본 발명자들은 대사질환인 당뇨에 효과적인 치료제를 개발하기 위한 연구를 통해 죽엽, 금은화, 갈근, 산사 발효 추출물의 당 분해를 억제할 수 있는 기능성을 찾기 위한 항당뇨 효과의 지표로 α-amylase 활성 저해 효과를 측정하여 혈당강하효과가 있음을 확인하였으며, 지방세포인 3T3-L1의 분화를 억제하여 근육세포인 L6에서 지방대사 관련 인자와 당대사 관련 인자를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 해결하기 위해 본 발명은 발효 또는 비발효된 죽엽, 금은화, 갈근 및 산사의 혼합생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 지방 및 당 대사질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 발효 또는 비발효된 죽엽, 금은화, 갈근 및 산사의 혼합생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 지방 및 당 대사질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본원에서 정의되는 혼합 생약의 바람직한 중량 배합비로는 죽엽, 금은화, 갈근 및 산사의 중량 혼합비(w/w)가 1-20 : 1-20 : 1-20 : 1-20 (w/w), 보다 바람직하게는 1-10 : 1-10 : 1-10: 1-10(w/w), 보다 더 바람직하게는 1-5 : 1-5 : 1-5 : 1-5(w/w)의 배합비로 배합된 배합물을 포함하는 것임을 특징으로 한다.

본원에서 정의되는 추출물은 물, C₁ 내지 C₄의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로, 바람직하게는 물 또는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 물에 가용한 추출물을 포함한다.

본원에서 정의되는 대사성 질환은 당질 및 지방대사 장애로 인한 고혈당, 내당능장애, 체지방증가, 당뇨, 비만증, 고지혈증, 지방간 등을 말하며, 바람직하게는, 고혈당 또는 비만증을 포함한다.

본원에서 정의되는 발효된 추출물은 (1) 개개 생약을 수분 함수율이 20% 미만, 바람직하게는 10% 미만으로 건조시킨 시료를 준비하는 제 1단계; (2) 상기 건조 시료를 50 내지 180℃, 바람직하게는 80 내지 150℃에서 10분 내지 70분간, 바람직하게는 20 내지 30분간 멸균과정을 거치는 멸균단계; (3) 상기 멸균된 시료를 아스페르질러스 오리자에(Aspergillus oryzae), 아스파질러스 나이거(Aspergillus niger), 락토바실러스 아시도플러스(Lactobacillus acidophilus) 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 또는 기타 식품가공용으로 가능한 발효균주, 바람직하게는 아스페르질러스 오리자에(Aspergillus oryzae)를 시료 중량의 1 내지 30%, 바람직하게는 1 내지 20% 양으로 첨가하여 수분 10 내지 50%, 바람직하게는 20 내지 40%의 조건에서 10 내지 50℃, 바람직하게는 20 내지 40℃ 온도에서 1일 내지 30일, 바람직하게는 5일 내지 20일, 보다 바람직하게는 8일 내지 12일간 발효를 수행하는 제 3단계; (4) 상기 발효가 완료된 발효물을 30 내지 100℃, 바람직하게는 40 내지 60℃ 온도에서 12시간 내지 72시간, 바람직하게는 24시간 내지 52시간 동안 건조시키는 제 4단계; (5) 상기 건조된 덩어리진 입자를 비벼 자체 분리되도록 풀어주고 미세입자를 분리 및 선별하는 제 5단계; (6) 상기 선별된 발효물을 100 내지 300℃, 바람직하게는 150 내지 200℃에서 원적외선 초제로 5분 내지 60분간, 바람직하게는 10분 내지 30분간 덖음 과정을 수행하는 제 6단계 공정을 포함하는 공정으로 수득된 발효물을 포함한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 발효 또는 비발효 혼합 생약 추출물은 하기와 같이 수득될 수 있다.

본 발명의 발효 혼합 생약 추출물은 먼저, 죽엽, 금은화, 갈근, 산사 개개 생약을 (1) 개개 생약을 수분 함수율이 20% 미만, 바람직하게는 10% 미만으로 건조시킨 시료를 준비하는 제 1단계; (2) 상기 건조 시료를 50 내지 180℃, 바람직하게는 80 내지 150℃에서 10분 내지 70분간, 바람직하게는 20 내지 30분간 멸균과정을 거치는 멸균단계; (3) 상기 멸균된 시료를 아스페르질러스 오리자에(Aspergillus oryzae), 아스파질러스 나이거(Aspergillus niger), 락토바실러스 아시도플러스(Lactobacillus acidophilus) 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 또는 기타 식품가공용으로 가능한 발효균주, 바람직하게는 아스페르질러스 오리자에(Aspergillus oryzae)를 시료 중량의 1 내지 30%, 바람직하게는 1 내지 20% 양(w/w)으로 첨가하여 수분 10 내지 50%, 바람직하게는 20 내지 40%의 조건에서 10 내지 50℃, 바람직하게는 20 내지 40℃ 온도에서 1일 내지 30일, 바람직하게는 5일 내지 20일, 보다 바람직하게는 8일 내지 12일간 발효를 수행하는 제 3단계; (4) 상기 발효가 완료된 발효물을 30 내지 100℃, 바람직하게는 40 내지 60℃ 온도에서 12시간 내지 72시간, 바람직하게는 24시간 내지 52시간 동안 건조시키는 제 4단계; (5) 상기 건조된 덩어리진 입자를 비벼 자체 분리되도록 풀어주고 미세입자를 분리 및 선별하는 제 5단계; (6) 상기 선별된 발효물을 100 내지 300℃, 바람직하게는 150 내지 200℃에서 원적외선 초제로 5분 내지 60분간, 바람직하게는 10분 내지 30분간 덖음 과정을 수행하는 제 6단계 공정을 통하여 발효된 개개생약 배합물을 제조가능하다.

상기에서 제조된 발효물 또는 상기 발효처리를 하지 않은 비발효 배합물을 하기와 같은 통상의 추출과정을 통하여 발효 또는 비발효 혼합 생약 추출물을 수득가능하다.

상기 단계에서 얻은 발효 시료 또는 비발효된 건조생약재료인 죽엽, 금은화, 갈근, 산사를 세척하여, 죽엽, 금은화, 갈근, 산사의 중량 혼합비(w/w)가 1-20 : 1-20 : 1-20 : 1-20 (w/w), 보다 바람직하게는 1-10 : 1-10 : 1-10: 1-10(w/w), 보다 더 바람직하게는 1-5 : 1-5 : 1-5 : 1-5(w/w)의 배합비로 배합하고 상기 시료의 1 내지 20배 (w/v) 중량, 바람직하게는 1 내지 10배 (w/v) 중량의 물, 메탄올, 에탄올 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물로 50 내지 120℃, 바람직하게는 약 80-100℃에서 1시간 내지 5시간, 바람직하게는 2시간 내지 4시간 동안 열수 추출법, 냉침 추출법 또는 초음파 추출법, 바람직하게는 열수 추출법을 수행한 후에 얻어진 추출액을 여과지로 여과한 후에 얻어진 여과물을 동결건조, 상온건조 또는 열풍건조, 바람직하게는 동결건조를 수행하여 본 발명의 죽엽, 금은화, 갈근, 산사로 구성된 발효 또는 비발효 혼합 생약 추출물을 수득할 수 있다.

따라서, 본 발명은 상기의 제조방법 및 상기 제조공정으로 얻어진 발효 또는 비발효된 죽엽, 금은화, 갈근 및 산사의 혼합생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 지방 및 당 대사질환의 예방 및 치료를 위한 약학 조성물을 제공한다.

상기에서 수득된 죽엽, 금은화, 갈근, 산사 생약 추출물은 in vitro 실험에서 근육세포주인 L6세포에서 혈당강하효과를 관찰 하였으며, 지방세포주인 3T3-L1세포에서 지방 분화를 억제시켜 주었으며, 지방축적 억제 효과를 나타냄을 확인하였다.

본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 생약 추출물을 0.01 내지 99% 중량으로 포함한다.

그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 추출물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 추출물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 이에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 적어도 면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 추출물은 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 그러므로 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 및 직장, 또는 정맥 등의 방법을 통하여 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 비만에 대하여 탁월한 억제효과를 갖는 발효 또는 비발효된 죽엽, 금은화, 갈근 및 산사의 혼합생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 지방 및 당 대사질환 예방 및 개선을 위한 건강기능식품을 제공한다.

본원에서 정의되는 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 대사성 질환의 예방 및 개선을 위한 건강기능식품은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.01 내지 95%, 바람직하게는 1 내지 80% 중량백분율로 포함한다.

또한, 비만증의 예방 및 개선을 위한 목적으로 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 약학 투여형태 또는 티백제, 침출차, 건강 음료 등의 형태인 건강기능식품으로 제조 및 가공이 가능하다.

또한, 본 발명은 지방 및 당 대사질환에 효과를 나타내는 발효 또는 비발효된 죽엽, 금은화, 갈근, 산사의 혼합 생약 추출물을 주성분으로 함유하는 건강보조식품을 제공한다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖ 당 일반적으로 약 1~20 g, 바람직하게는 약 5~12 g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

또한, 본 발명의 추출물은 대사성 질환 예방 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖을 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명은 발효 및 비발효된 죽엽, 금은화, 갈근, 산사의 혼합생약 추출물이 대사성 질환인 당뇨 및 비만에 효과적인 치료제를 개발하기 위한 연구의 일환으로 실시하였다. 즉, 죽엽, 금은화, 갈근, 산사 발효 추출물의 당 분해 억제능을 찾기 위한 항당뇨 효과의 지표로 α-amylase 활성 저해 효과를 측정하여 혈당강하효과가 있음을 확인하였으며, 지방세포인 3T3-L1의 분화 억제능 및 근육세포인 L6에서 지방 대사와 당대사 관련 인자를 확인함으로써 대사성질환 및 치료를 위한 약학조성물, 건강기능식품 및 건강보조식품에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 죽엽(대나무잎) 발효물 제조과정을 나타낸 도이며;
도 2은 금은화(인동꽃) 발효물의 제조과정을 나타낸 도이며;
도 3은 갈근(칡뿌리) 발효물의 제조과정을 나타낸 도이며;
도 4은 산사 발효물의 제조과정을 나타낸 도이며;
도 5은 α-amylase 활성에 대한 PLCL 및 F-PLCL의 효과를 나타낸 도이며,
도 6는 지방세포의 cell line인 3T3-L1 및 L6의 MTT assay에 대한 PLCL 및 F-PLCL의 효과를 나타낸 도이며,
도 7는 지방세포의 cell line인 3T3-L1의 Oil Red-O staining에 대한 PLCL 및 F-PLCL의 효과를 나타낸 도이며,
도 8은 한약재 추출물이 3T3-L1 및 L6 cell에서 AMPK, ACC, PPARγ, C/EBPα, Glut-4 단백질 활성에 미치는 영향에 대한 PLCL 및 F-PLCL의 효과를 나타낸 도이며,
도 9는 한약재 추출물이 3T3-L1 및 L6 cell에서 PPARγ, C/EBPα, Glut-4 mRNA 활성에 미치는 영향에 대한 PLCL 및 F-PLCL의 효과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 하기 참고예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 참고예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 참고예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 비발효 혼합생약 추출물 ( PLCL ) 제조

남경약업사(대구)로 부터 영천산을 구입하여 대구한의대 본초학교실에서 감별, 엄선한 죽엽, 금은화, 갈근, 산사 각 1 kg을 각각 증류수로 깨끗하게 세척한 후 이물질을 제거한 다음 10배 부피(v)의 증류수를 가한 후 96℃로 상승 후 8시간 열수추출하였다. 추출 후 침전물을 거름종이(Advantec, 71101903)를 이용하여 여과한 다음 이 여과액을 회전 진공증류기(EYELA, A-1000s)에서 감압 농축 하였다. 상기 농축액을 -70℃ 저온 냉동기(deep freezer)에서 12시간 방치하고, 72시간 동안 냉동 건조기(freeze dryer)로 건조하여 비발효된 혼합 추출물 분말 236 g(수득율 23.6 %)을 수득하였다(이하 비발효 혼합 추출물 'PLCL'이라 명명함).

실시예 2. 발효 혼합 추출물(F- PLCL )의 제조

2-1. 죽엽 발효물의 제조 (도 1 참조)

도 1과 같이, 수분 함수율이 10%미만인 죽엽의 원료를 준비 및 선별하고, 120℃에서 30분간 멸균기로 멸균한 후에, Aspergillus oryzae (충무발효) 10%(w/w), 수분 20% 발효온도 30℃의 조건으로 10일간 발효를 수행하고, 발효완료된 재료를 57℃에서 48시간 건조하였다. 덩어리진 입자를 손으로 가볍게 비벼 자제 분리되도록 풀어주고, 미세입자를 분리 및 선별한 후에, 섭씨 180도에서 원적외선초제기기(IJ20094, (주)이조바이오)를 이용하여 초제과정을 20분간 수행하고, 마지막 이물질을 선별작업 후에 포장하여 하기 실험에 수행하였다.

2-2. 금은화 발효물의 제조 (도 2 참조)

도 2과 같이, 수분 함수율이 10%미만인 금은화 원료를 준비 및 선별하고, 120℃에서 30분간 멸균기(CT-DAC 80, 코아테크)로 멸균한 후에, Aspergillus oryzae (충무발효) 10%(w/w), 수분 20% 발효온도 30℃의 조건으로 10일간 발효를 수행하고, 발효완료된 재료를 57℃에서 48시간 건조하였다. 덩어리진 입자를 손으로 가볍게 비벼 자제 분리되도록 풀어주고, 미세입자를 분리 및 선별한 후에, 섭씨 180도에서 원적외선초제기기(IJ20094, (주)이조바이오)를 이용하여 초제과정을 20분간 수행하고, 마지막 이물질을 선별작업 후에 포장하여 하기 실험에 수행하였다.

2-3. 갈근 발효물의 제조 (도 3 참조)

도 3과 같이, 수분 함수율이 10%미만인 갈근 원료를 준비 및 선별하고, 120℃에서 30분간 멸균기(CT-DAC 80, 코아테크)로 멸균한 후에, Aspergillus oryzae (충무발효) 10%(w/w), 수분 20% 발효온도 30℃의 조건으로 10일간 발효를 수행하고, 발효완료된 재료를 57℃에서 48시간 건조하였다. 덩어리진 입자를 손으로 가볍게 비벼 자제 분리되도록 풀어주고, 미세입자를 분리 및 선별한 후에, 섭씨 180도에서 원적외선초제기기(IJ20094, (주)이조바이오 )를 이용하여 초제과정을 20분간 수행하고, 마지막 이물질을 선별작업 후에 포장하여 하기 실험에 수행하였다.

2-4. 산사 발효물의 제조 (도 4 참조)

도 4과 같이, 수분 함수율이 10%미만인 산사 원료를 준비 및 선별하고, 120℃에서 30분간 멸균기(CT-DAC 80, 코아테크)로 멸균한 후에, Aspergillus oryzae (충무발효) 10%(w/w), 수분 20% 발효온도 30℃의 조건으로 10일간 발효를 수행하고, 발효완료된 재료를 57℃에서 48시간 건조하였다. 덩어리진 입자를 손으로 가볍게 비벼 자제 분리되도록 풀어주고, 분쇄 후 각 원료별 입자크기가 0.2-0.5mm가되도록 선별 및 분리한 후에, 섭씨 180도에서 원적외선초제기기(IJ20094, (주)이조바이오 )를 이용하여 초제과정을 20분간 수행하고, 마지막 이물질을 선별작업 후에 포장하여 하기 실험에 수행하였다.

2-5. 발효배합 추출물 (F- PLCL )의 제조

위의 공정으로 발효된 죽엽, 금은화, 갈근, 산사를 4: 3 : 2 : 1 중량 배합비(w/w)로 배합한 후, 10배의 증류수를 가수한 후 96℃로 상승 후 8시간 추출하였다. 추출 후 침전물을 거름종이(Advantec, 71101903)를 이용하여 여과한 다음 이 여과액을 회전 진공증류기(EYELA, A-1000s)에서 감압 농축 하였다. 상기 농축액을 -70℃ 저온 냉동기(deep freezer)에서 12시간 방치하고, 72시간 동안 냉동 건조기(freeze dryer)로 건조하여 발효된 혼합추출물 분말149 g(수득율 14.9 %)을 수득하였다(이하 발효된 혼합추출물을 'F-PLCL’라 명명함).

참고예 1. 실험재료의 준비

3T3-L1 마우스유래 배아섬유아세포와 L6 근육세포는 미국 세포주은행(American Type Culture Collection; ATCC, CL-173TM)에서 구입하였으며, Dulbeccos modified Eagles media (DMEM, SH30243.01), Bovine calf serum (BCS, SH30401.01), Fetal bovine serum (FBS, SH30396.03) 및 페니실린과 스트렙토마이신(penicillin/streptomycin; PS)은 하이클론(SV30010, Hyclone, USA)에서 구입하였다. 인슐린(Insulin, 090-03446)과 디메칠술폭사이드(dimethyl sulfoxide; DMSO, D2650), 오일레드오(Oil Red-O, O0625-25), 덱사메타손(dexamethasone, DEX, D4902-100MG)과 이소부칠메틸잔틴(isobutylmethylxanthine (IBMX, I5879-250MG)는 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich company, St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.

참고예 2. 3 T3 - L1 세포배양

3T3-L1 마우스유래 배아섬유아세포(mouse embryo fibroblast)를 하기와 같은 실험방법으로 배양하였다(Lin. J. et al., Green Tea Polyphenol Epigallocatechin Gallate Inhibits Adipogenesis and Induces Apoptosis in 3T3-L1 Adipocytes, Obesity Research, 13(6), pp.982-990, 2005).

먼저, 10% 우태아 혈청(bovine calf serum)을 함유하는 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)로 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하였다(Day 0). 8일 동안 배양한 다음에 전지방세포(preadipocyte)를 10% fetal bovine serum(FBS)을 함유한 DMEM 배지(167 nM insulin, 0.5μΜ isobutylmethylxanthine, 1μΜ dexamethasone 첨가)로 옮겨 2일간 배양하였다(Day 2). 167 nM 인슐린이 있는 배지에서 2일간 더 배양한 다음에 10% FBS/DMEM 배지에서 4일 동안 배양하여 성숙한 지방세포(adipocytes)로 만들었다.

참고예 3. L6 세포배양

L6 근육세포 (myocytes)를 하기와 같은 실험방법으로 배양하였다(Bergeron S. et. al., Inhibition of the protein tyrosine phosphatase SHP-1 increases glucose uptake in skeletal muscle cells by augmenting insulin receptor signaling and GLUT4 expression. Endocrinology. 152(12) : 4581-8. 2011).

먼저, 10% fetal bovine serum(FBS)을 함유하는 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)로 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하였다(Day 0). 4일 동안 배양한 다음에 10% fetal bovine serum(FBS)을 함유한 DMEM 배지(167 nM insulin, 0.5μΜ isobutylmethylxanthine, 1μΜ dexamethasone 첨가)로 옮겨 2일간 배양하였다(Day 2). 167 nM 인슐린이 있는 배지에서 2일간 더 배양한 다음에 Sampling하여 분석에 사용하였다.

참고예 4. 통계처리

실험성적의 통계적 유의성은 SPSS 프로그램(Version 14.01)의 투웨이(Two-way) ANOVA와 LSD 사후검정을 이용하여, P<0. 05 인 경우에 유의한 것으로 인정하였으며, 정상군과의 통계학적 유의성(#) 및 고지방식이투여군(HF)과의 통계학적 유의성(*)을 도면 및 표에 각각 표기하였다.

실험예 1. 항당뇨 효능 평가 (a-glucosidase inhibitory activity)

상기 실시예 시료의 a-glucosidase 활성저해( Watanabe. J. et. al., Isolation and identification of alpha-glucosidase inhibitors from tochu-cha (Eucommia ulmoides). Biosci Biotechnol Biochem.61(1):177-8.1997)는 a-Glucosidase가 -nitrophenyl(NP) glycoside의 glycoside 부분을 기질로 인식하여, NP와 glycoside를 효소반응으로 끊어주고, 여기에서 끊어져 나온 NP의 양을 405nm에서 흡광도를 측정하여 나타냈다. 적당히 희석한 추출물 50를 0.15U/ a-glucosidase 효소액 50, 200mM potassium phosphate buffer 50와 혼합하여 37에서 15분간 pre-incubation 한 후 3mM -nitrophenyl a-D-glucopyranosid 100을 가하여 37에서 10분간 반응시켰다 반응액은 0.1M Na₂CO₃ 750로 반응을 정지시키고 405nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 1-10mg/ml의 농도에서 비발효 한약재(PLCL) 추출물과 발효 한약재(F-PLCL) 추출물의 a-glucosidase 활성 저해를 비교한 결과 1-2.5mg/ml 농도에서 혈당강하제로 시판되고 있는 acarbose와 비슷한 활성 저해를 나타내었다.

실험예 2. 세포독성( MTT assay )

상기 실시예의 복합 추출물이 3T3-L1 세포에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MTT검정법(methylthiazol tetrazolium bromide)을 이용하여 측정하였다(Lin J. et al., Green Tea Polyphenol Epigallocatechin Gallate Inhibits Adipogenesis and Induces Apoptosis in 3T3-L1 Adipocytes, Obesity Research 13(6), pp.982-990, 2005).

MTT 검정법은 살아있는 세포의 미토콘드리아에 있는 탈수소효소에 의해 생성된 blue formazan 결정을 DMSO (dimethyl sulfoxide)로 녹여서 발색시켜 그 흡광도를 측정하는 방법이다. 참고예 1에서 배양한 3T3-L1 cell line을 사용하였으며, 실험에는 지수적 성장기에 있는 세포를 사용하셨다. 즉, 5 X 10⁴cells/ml을 일정기간 아무처치 없이 동량의 5% tryphan으로 잘 섞어 살아있는 세포수를 측정하였고, 생존능 실험은 모두 3개 well의 평균가를 이용하여 평가하였다. Well당 MTT 용액(2 mg/ml)을 50 ㎕씩 넣어 37℃, 5% CO₂ 항온기에서 2시간 반응시킨 후 배지는 제거하고 DMSO를 well당 100 ㎕씩 넣어 5분간 plate shaker에서 blue formazan 결정을 용해시킨 다음에 ELISA reader (Techan, Germany) 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 대조군(Control), 발효 한약재(F-PLCL)와 비발효 한약재(PLCL)를 농도별(0.05 ~ 0.8 ㎎/㎖)로 24시간 처리하여 MTT assay를 실험한 결과 대조군에 비해 시료 농도에 의존적으로 지방세포의 생존율이 감소하는 것으로 관찰되었으나, 처리농도 범위에서 세포에 큰 영향을 주지 않는 것으로 보였다.

실험예 3. 세포를 이용한 oil red -O 염색

상기 실시예 시료의 3T3-L1 세포에서 지방세포 분화 및 지방 생성에 복합 추출물이 미치는 영향을 알아보기 위하여 Oil Red-O 염색 실험을 수행하였다(Lin J. et al., Green Tea Polyphenol Epigallocatechin Gallate Inhibits Adipogenesis and Induces Apoptosis in 3T3-L1 Adipocytes, Obesity Research 13(6), pp.982-990, 2005).

Oil Red-O 염색법은 분화된 3T3-L1 세포에 Oil Red-O 시약으로 염색하여 세포내 생성된 지방을 측정하는 방법이다. 분화된 세포의 배지를 제거하고 D-PBS(DPBS, SH30028.03)로 세포를 세척하고 pH 7.2 Cacodylate buffer로 2시간 고정하고 Oil-red O Solution으로 염색하였다. 세포 염색이 끝난 후 40% Isopropyl alcohol(2-Propanol,67-63-0)로 3번 세척 후 건조하여 세포 내 지방의 크기를 광학현미경(AE 31, Motic, USA)으로 관찰하였다.

실험결과, 도 7에 나타나는 바와 같이, 각각의 한약재 추출물을 현미경 및 육안으로 관찰한 결과 발효 한약재 추출물(F-PLCL) 처리군이 대조군 및 비발효 한약재(PLCL) 추출물 보다 지방축적 저해효과가 뛰어났으며, 발효 한약재 추출물은 농도의존적으로 지방세포의 분화 및 지방축적을 억제하였고, 고농도의 발효한약재 처리군에서는 양성대조군인 고지혈증 치료제인 fenofibrate 군보다 우세하게 지방세포의 분화 및 지방축적을 저해하였다.

실험예 4. 3 T3 - L1 및 L6 Cell Western

상기 실시예의 복합 추출물이 AMPK와 ACC 인산화 및 지방합성 전사인자인 C/EBPα, PPARγ, 당대사에 관련이 있는 Glut4의 단백질 발현에 미치는 영향을 알보기 위하여 3T3-L1 과 L6 Cell 에서 Western을 수행하였다 (Huang B. et, al, Cinnamaldehyde prevents adipocyte differentiation and adipogenesis via regulation of peroxisome proliferator-activated receptor-γ(PPARγ) and AMP-activated protein kinase (AMPK) pathways, J Agric Food Chem, Apr 27;59(8), pp.3666-73, 2011).

농도별로 처리된 3T3-L1 및 L6 cell을 D-PBS(DPBS, SH30028.03)로 세척(washing) 한 후, 1mM EDTA가 포함된 50 mM tris-HCl(pH7.5) buffer 첨가하여 스크레이퍼(scrapfer)를 이용하여 세포를 떼어낸 후 용해(lysis)하였다. 13,000 rpm 4℃에서 5분간 원심분리한 후에 20 ㎍의 동일한 양의 단백질을 변성(denature)시키고 8% 또는 10% SDS-PAGE를 분리한 후, PVDF membrane으로 transfer시킨다. membrane을 TBS-T로 용해한 5% skim milk로 2시간 동안 blocking 한 다음에, rabbit polyclonal anti-PPARγ(sc-7196, Santa-Cruz Biotechnology, USA), C/EBPα(sc-365318, Santa-Cruz Biotechnology, USA), Glut-4(sc-7938, Santa-Cruz Biotechnology, USA), AMPK(#2532, Cell Signaling, USA), ACC(#3662, Cell Signaling, USA) antibody로 하룻밤(overnight) 처리하였다. TBS-T로 세척한 후에 horseradish peroxidase인 2차 항체(sc-47778, Santa-Cruz Biotechnology, USA)로 2시간 동안 처리하여 다시 TBS-T로 washing 한 후 ECL detection 시약(#34079, Amersham Biosciences, USA)으로 immunorective bands를 관찰하였다.

실험결과, 도 8에 나타나는 바와 같이, 발효추출물이 3T3-L1, L6 cell에서 AMPK와 ACC의 인산화 활성을 증가시켰다. 비교적 3T3-L1에서는 비발효 한약재(PLCL)추출물에이 큰 영향을 미치는 않는 것으로 나타났다. 발효 한약재(F-PLCL) 추출물과 비발효 한약재(PLCL) 추출물처리군에서 C/EBPα, PPARγ 단백질 발현 억제활성을 확인한 결과 3T3-L1 cell에서 발효 한약재(F-PLCL)가 C/EBPα, PPARγ를 매우 감소시키는 양상을 보였으나 L6 cell에서는 큰 차이를 보이지 않았다. 세포에서 막 단백질을 분리하여 Glut4의 이동성을 확인한 결과 3T3-L1 cell과 L6 cell에서 발효 한약재(F-PLCL) 추출물이 비발효 한약재(PLCL) 추출물 보다 증가한 것으로 나타났다. Glut4는 지방세포와 근육세포에서 주로 발현되는 포도당 수용체로 세포질에 분포하고 있다가 인슐린이 존재할 때 세포막으로 이동하여 glucose uptake를 원활하게 일어나도록 하는 역할을 하여 지방세포의 분화와 지방축적에 이어 포도당 유입은 중요한 반응으로 당 흡수를 증가시킴으로써 혈당을 강하시키는데 영향을 주는 것으로 보인다.

실험예 5. 3 T3 - L1 및 L6 Cell RT - PCR

상기 실시예의 복합 추출물이 PPARγ, C/EBPα 지방합성 전사인자와 당대사에 관련이 있는 Glut4의 mRNA 발현에 미치는 영향을 알보기 위하여 3T3-L1 과 L6 Cell 에서 RT-PCR을 수행하였다(Yacoub Wasef SZ. et al. Glucose, dexamethasone, and the unfolded protein response regulate TRB3 mRNA expression in 3T3-L1 adipocytes and L6 myotubes. Am J Physiol Endocrinol Metab. 291(6):E1274-80. 2006).

PBS로 세척해서 원심분리하여 수거한 세포에 Trizol reagent (15596-026, Invitrogen, USA)용액을 5배 부피 이상 첨가하여 23 게이지 니들(gage needle)을 사용해 균질화 시켰다. 그 후 여기에 2M sodium acetate(pH 4.5), water saturated phenol, 그리고 chloroform/isoamylalchol를 첨가해 얼음에 15분간 둔 후, 이 용액을 20분간 원심분리(4℃,10,000rpm)하여 상층액을 취한 다음 phenol/chloroform 추출 1회와 chloroform/isoamyalcohol 추출을 2회 시행하였다. 그 후 상층액을 취해 0.1 배 부피의 3M sodium acetate (pH 5.2)와 2.5배 부피의 무수ethanol을 첨가해 -70℃에서 30분간 둔 후 20분간 원심 분리 (4℃ 10,000rpm)해 70% ethanol로 세척해서 공기 중에서 건조시켰다 이것을 0.1% DEPC water(750023, Invitrogen, USA)에 녹여 UV spectrophotometer(Lambda 35, Perkin Elmer, USA)로 260nm에서 흡광도를 초사하여 총 RNA를 정량하였다. 5X RT buffer를 PCR tube에 넣어 42℃에서 60분간 열처리하여 역전사 반응 완료 한 다음, PCR은 10X PCR buffer를 혼합하여 여기에 증류수로 최종 부피를 채워 PCR mixture를 만들었다. PCR mixture를 PCR tube에 넣고 여기에 역전사 산물을 첨가하여 혼합한 뒤 PCR 장치에 넣어 PCR 실시 하였다. PCR 반응은 94℃에서 3분간 1 cycle 반응 후 94℃ 45초, 72℃ 45초간 38cycle 반응시켰으며, 72℃에서 10분간 extension을 시행한 후 반응을 완료하여 증폭된 산물은 1.2% agarose gel에 전기영동하여 Gel Doc(Vilber Lourmet, Marne-la-Vallaee Cedex, France)을 이용하여 DNA band를 확인하였다.

실험결과, 도 9에 나타나는 바와 같이, 3T3-L1 cell에서 발효 한약재(F-PLCL) 추출물이 비발효 한약재(PLCL) 추출물 처리군보다 발현을 증가시킨 것으로 나타났으며, L6 또한 발효 한약재(F-PLCL)n 처리군이 mRNA의 발현을 증가시켰다. PPARγ와 C/EBPα도 마찬가지로 발효 한약재(F-PLCL) 추출물이 억제시킴으로써 3T3-L1 및 L6 cell에서 지방합성을 억제시킬 것으로 추측된다. 따라서 발효 한약재(F-PLCL) 추출물은 탄수화물 소화 관련 효소의 활성을 저하시켜 탄수화물의 체내 흡수를 억제 시킬 뿐만 아니라 Glut4의 mRNA발현을 증가시킴으로써 혈당 강하 효과가 뛰어나며, 지방대사 관련 인자의 mRNA를 조절함으로써 지방합성 억제 작용도 나타낼 것으로 생각된다.

하기에 본 발명의 추출물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

혼합 생약 추출물 (F-PLCL) ------------------------------- 20 mg

유당 --------------------------------------------------- 100 mg

탈크 ---------------------------------------------------- 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

혼합 생약 추출물 (PLCL) -------------------------------- 10 mg

옥수수전분 -------------------------------------------- 100 mg

유당 -------------------------------------------------- 100 mg

스테아린산 마그네슘 ------------------------------------- 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

혼합 생약 추출물 (F-PLCL) ------------------------------ 10 mg

결정성 셀룰로오스 --------------------------------------- 3 mg

락토오스 --------------------------------------------- 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 --------------------------------- 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

혼합 생약 추출물 (PLCL) -------------------------------- 10 mg

만니톨 ------------------------------------------------ 180 mg

주사용 멸균 증류수 ----------------------------------- 2974 mg

Na₂HPO₄,12H2O ------------------------------------------- 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

혼합 생약 추출물 (F-PLCL) ------------------------------- 20 mg

이성화당 ------------------------------------------------- 10 g

만니톨 ---------------------------------------------------- 5 g

정제수 --------------------------------------------------- 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖으로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

혼합 생약 추출물 (PLCL) ------------------------------- 1000 ㎎

비타민 혼합물 -------------------------------------------- 적량

비타민 A 아세테이트 ------------------------------------- 70 ㎍

비타민 E ----------------------------------------------- 1.0 ㎎

비타민 B1 --------------------------------------------- 0.13 ㎎

비타민 B2 --------------------------------------------- 0.15 ㎎

비타민 B6 ---------------------------------------------- 0.5 ㎎

비타민 B12 --------------------------------------------- 0.2 ㎍

비타민 C ------------------------------------------------ 10 ㎎

비오틴 -------------------------------------------------- 10 ㎍

니코틴산아미드 ----------------------------------------- 1.7 ㎎

엽산 ---------------------------------------------------- 50 ㎍

판토텐산 칼슘 ------------------------------------------ 0.5 ㎎

무기질 혼합물 -------------------------------------------- 적량

황산제1철 --------------------------------------------- 1.75 ㎎

산화아연 ---------------------------------------------- 0.82 ㎎

탄산마그네슘 ------------------------------------------ 25.3 ㎎

제1인산칼륨 --------------------------------------------- 15 ㎎

제2인산칼슘 --------------------------------------------- 55 ㎎

구연산칼륨 ---------------------------------------------- 90 ㎎

탄산칼슘 ----------------------------------------------- 100 ㎎

염화마그네슘 ------------------------------------------ 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

혼합 생약 추출물 (F-PLCL) ------------------------------- 1000㎎

구연산 ------------------------------------------------- 1000 ㎎

올리고당 ------------------------------------------------- 100 g

매실농축액 ------------------------------------------------- 2 g

타우린 ----------------------------------------------------- 1 g

정제수를 가하여 ------------------------------------ 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims

(1) 죽엽, 금은화, 갈근 및 산사 개개 생약을 수분 함수율이 20% 미만으로 건조시킨 시료를 준비하는 제 1단계; (2) 상기 건조 시료를 50 내지 180℃에서 10분 내지 70분간 멸균과정을 거치는 멸균단계; (3) 상기 멸균된 시료를 아스페르질러스 오리자에(Aspergillus oryzae), 아스파질러스 나이거(Aspergillus niger), 락토바실러스 아시도플러스(Lactobacillus acidophilus) 또는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) 균주를 시료 중량의 1 내지 30% 양(w/w)으로 첨가하여 수분 10 내지 50%의 조건에서 10 내지 50℃ 온도에서 1일 내지 30일간 발효를 수행하는 제 3단계; (4) 상기 발효가 완료된 발효물을 30 내지 100℃ 온도에서 12시간 내지 72시간 동안 건조시키는 제 4단계; (5) 상기 건조된 덩어리진 입자를 비벼 자체 분리되도록 풀어주고 미세입자를 분리 및 선별하는 제 5단계; (6) 상기 선별된 발효물을 100 내지 300℃에서 원적외선 초제로 5분 내지 60분간 덖음 과정을 수행하는 제 6단계 공정을 포함하는 공정으로 수득된, 발효된 죽엽, 금은화, 갈근 및 산사의 중량 혼합비(w/w)가 1-10 : 1-10 : 1-10 : 1-10 (w/w)의 배합비로 배합된 혼합생약 물 추출물을 유효성분으로 함유하는 고혈당 또는 비만증의 예방 및 치료용 약학 조성물.
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(1) 죽엽, 금은화, 갈근 및 산사 개개 생약을 수분 함수율이 20% 미만으로 건조시킨 시료를 준비하는 제 1단계; (2) 상기 건조 시료를 50 내지 180℃에서 10분 내지 70분간 멸균과정을 거치는 멸균단계; (3) 상기 멸균된 시료를 아스페르질러스 오리자에(Aspergillus oryzae), 아스파질러스 나이거(Aspergillus niger), 락토바실러스 아시도플러스(Lactobacillus acidophilus) 또는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) 균주를 시료 중량의 1 내지 30% 양(w/w)으로 첨가하여 수분 10 내지 50%의 조건에서 10 내지 50℃ 온도에서 1일 내지 30일간 발효를 수행하는 제 3단계; (4) 상기 발효가 완료된 발효물을 30 내지 100℃ 온도에서 12시간 내지 72시간 동안 건조시키는 제 4단계; (5) 상기 건조된 덩어리진 입자를 비벼 자체 분리되도록 풀어주고 미세입자를 분리 및 선별하는 제 5단계; (6) 상기 선별된 발효물을 100 내지 300℃에서 원적외선 초제로 5분 내지 60분간 덖음 과정을 수행하는 제 6단계 공정을 포함하는 공정으로 수득된, 발효된 죽엽, 금은화, 갈근 및 산사의 중량 혼합비(w/w)가 1-10 : 1-10 : 1-10 : 1-10 (w/w)의 배합비로 배합된 혼합생약 물 추출물을 유효성분으로 함유하는 고혈당 또는 비만증의 예방 및 개선용 건강기능식품.
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