KR20110130857A - 항산화능, 항알레르기 및 아토피성 피부염 개선 및 예방 효과를 갖는 기능성 조성물, 이의 제조방법, 이를 함유한 식품 및 건강 기능성 식품 - Google Patents

항산화능, 항알레르기 및 아토피성 피부염 개선 및 예방 효과를 갖는 기능성 조성물, 이의 제조방법, 이를 함유한 식품 및 건강 기능성 식품 Download PDF

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KR20110130857A KR1020100050391A KR20100050391A KR20110130857A KR 20110130857 A KR20110130857 A KR 20110130857A KR 1020100050391 A KR1020100050391 A KR 1020100050391A KR 20100050391 A KR20100050391 A KR 20100050391A KR 20110130857 A KR20110130857 A KR 20110130857A
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Abstract

본 발명은 항산화능, 항알레르기 및 아토피성 피부염 개선 및 예방 효과를 지니는 감잎 추출물 및 감잎 추출물의 부분 정제물을 유효성분으로 함유하는 기능성 조성물, 이의 제조방법, 이를 함유한 식품 및 건강 기능성 식품에 관한 것으로, 본 발명의 우수한 항산화능, 항알레르기 및 아토피성 피부염 개선 및 예방 효과를 나타내면서도 세포독성을 나타내지 않는 기능성 조성물, 이의 제조방법, 이를 함유한 식품 및 건강 기능성 식품에 관한 것이다.

Description

항산화능, 항알레르기 및 아토피성 피부염 개선 및 예방 효과를 갖는 기능성 조성물, 이의 제조방법, 이를 함유한 식품 및 건강 기능성 식품{Functional composition having anti-oxidative function, anti-allergic, improvement and prevention effect of atopic dermatitis, and method for manufacturing the same, and A healthful food having the same}
본 발명은 항산화능, 항알레르기 및 아토피성 피부염 개선 및 예방 효과를 지니는 감잎 추출물 및 감잎 추출물의 부분 정제물을 유효성분으로 하는 기능성 조성물, 이의 제조방법, 이를 함유한 식품 및 건강 기능성 식품에 관한 것이다.
알레르기는 면역학적 기전에 의해 야기되는 과민반응(hypersensitivity)을 말하며, 항체 또는 세포에 의해서 매개된다. 알레르기성 비염과 아토피와 같은 제Ⅰ형 알레르기 반응(type Ⅰ allergic reaction)은 생체 내 결합조직, 피부, 호흡기 등에 분포하는 비만세포가 면역글로불린 E(IgE)에 의해 탈과립이 유도되면서 나타난다(Kimura et al., 1984; Table 1). 비만세포 내에 있는 5-리폭시게나제(5-lipoxygenase, 5-LO)와 사이클로옥시게나제(cyclooxygenase, COX)는 arachidonic acid를 변형하여 염증을 유발하는 류코트리엔류(leukotrienes)와 프로스타글란딘류(prostaglandins)를 생성한다(Fujiki et al., 1996; Fig. 3). 리폭시게나제는 현재까지 type 5-, 8-, 9-, 11-, 12- 그리고 type 15-LO 등 다양한 종류가 알려져 있으며 특히 포유동물에서 5-LO에 의해 생성된 류코트리엔류는 제Ⅰ형 알레르기 증상 발현에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되어 있다(Kemal et al., 1987; Nakatsuka et al., 1983; Neichi et al., 1983; Sekiya et al., 1982). 사이클로옥시게나제(cyclooxygenase, COX)는 COX-1과 COX-2의 두 종류가 존재하며, COX-1은 위, 신장을 비롯한 여러 조직에서 발현되며 체내에서 혈소판의 형성, 위벽보호, 신장 기능의유지 등 정상적 생체기능에 작용하고, COX-2는 염증성 자극에 의해 단시간에 유도되는 발현 현상을 나타낸다(Otto et al., 1994; Morita et al., 1995; Yokoyama et al., 1988). 따라서, 이러한 물질들이 기도 내로 유입되면 염증세포를 활성화시키고 기도 점막에서 점액분비를 촉진시켜 알레르기 반응이 일어나게 된다(Jew et al., 2003). 또한, 호산구를 비롯한 염증세포의 조직 내 침윤은 제Ⅰ형 알레르기 반응이 잠복기를 거친 후기 반응에 발생되는 현상으로 만성적인 코막힘이나 비 특이적 점막 과민성을 일으킨다. 따라서 프로스타글란딘류와 류코트리엔류의 합성, 히스타민 방출 그리고 호산구의 비강내 침윤에 대하여 억제 활성을 갖는 물질들은 제Ⅰ형 알레르기 예방 및 치료제로 사용될 수 있을 것으로 생각된다. 기존의 시중에서 판매되고 있는 비스테로이성 항염증제(nonsteroidal anti-inflammatory drugs; 이하 NSAIDs)는 COX-1과 COX-2를 동시에 억제하거나 주로 COX-1을 억제하기 때문에 염증이 있는 조직뿐만 아니라, 장기간 복용 시 간, 위장관 또는 신장 등의 기능유지에 필수적인 프로스타글란딘류의 생성을 동시에 억제하여 많은 부작용을 야기하는 것으로 알려져 있다(Isselbcher et al., Harrison's Principles of Internal Medicine (13th ed), 2, pp1543-1711, 1994). 최근 개발되고 있는 선택적 COX-2 억제제(selective COX-2 inhibitor)들은 기존의 소염진통제 효과를 그대로 유지하면서 부작용을 크게 감소시킬 수 있어 현재 그 사용이 증가되고 있는 추세이다. 따라서 LO 저해 활성과 선택적인 COX-2 저해 활성을 갖는 물질들은 부작용이 적은 알레르기성 비염, 만성천식 및 아토피성 피부염 치료제로 사용될 수 있다.
Nitric oxide(NO)는 내피 세포, 신경세포, 혈관 평활근 및 간 세포에 이르기까지 다양한 종류의 세포들에 의하여 합성되는 것으로 알려져 있다. NO는 세포내 nitric oxide synthase(NOS)에 의하여 아미노산인 L-arginine으로부터 합성되고, 더욱 산화되어 안정적이고 불활성 산화물인 nitrite(NO2 -)와 nitrate(NO3 -)를 생산한다. NOS에는 3가지의 동종효소가 있다는 것이 현재까지 밝혀졌다. 그 중 정상 세포에서는 발현되지 않으나 면역학적 자극이나 염증성 자극 또는 많은 유해인자에 의한 조직손상이 발생할 경우에 세포에서 발현되는 inducible nitric oxide synthase(iNOS)는, 정상세포에서 항상 발현되는 neuronal nitric oxide synthase(nNOS)나 endothelial nitric oxide synthase(eNOS)에 비하여 대량의 NO를 생성한다. 염증상태에서 iNOS에 의해 생성된 NO는 병리적인 혈관확장에 의한 혈관투과성 증가, 부종, 세포독성, 조직 손상 등의 염증반응을 촉진시킬 뿐 아니라 cyclooxygenase를 활성화하여 prostaglandins과 같은 염증매개체의 생합성을 촉진하여 염증을 심화시키는 것으로 알려져 있다. 따라서 iNOS에 의한 NO의 생성을 저해하는 새로운 염증치료제를 개발하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다
감나무(Diospyros kaki Thunb)는 오랜 역사를 가진 과실수로 온대 아시아 지방, 우리나라, 중국, 일본이 원산지이며, 우리나라의 중, 북부 및 일부 산간 지방을 제외하고 전국에서 재배가 가능하다. 감나무는 오랜 역사를 가진 과실수이지만 다른 과실에 비해 가공이용면에서는 뒤떨어진 과실수로서 근래에 들어서야 다각적인 측면에서 이용 가치가 연구되고 있는 실정이다. 과실인 감은 성숙 후에도 수렴작용과 혈관 수축작용이 뛰어난 것으로 알려진 tannin을 약 1～2%가량 함유하고 있고(Mutsuo et al., 1991), 외국에서 수입되는 오렌지 등과 같은 과실보다 비타민 A와 C가 풍부하며 여러 생리활성 효능을 갖고 있어 전통적으로 애용되어 온 과실이다(Yu, 1979). 기능성 페놀화합물이 다량 함유되어 있으며, 이들 물질은 항산화기능, 노화방지, 심혈관계 질환 예방 및 항암효과가 보고되어 있다(Moon et al., 1991; Ma et al., 2007; Kim et al., 1999). 더구나 감잎은 녹차 이상의 다양한 생리활성 물질을 함유하고 있는 것으로 알려져 있으며, 예로부터 천식이나 고혈압 같은 여러 질병을 치료하는데 효과가 있는 것으로 알려져 민간요법으로 많이 이용되어 왔다. 이의 임상학적 약리 작용과 효능은 여러 고문헌에 잘 나타나 있지만, 감잎의 성분과 그 효과에 관한 연구는 최근에서야 이루어지고 있는 실정이다. 감잎의 성분으로는 tannin, polyphenol류, 수지, coumarin류 화합물, betulic acid, oleanolic acid, ursolic acid와 같은 유기산 및 엽록소, astragalin, myricitrin과 같은 flavonoid 배당체, 비타민 A, C를 과량 함유하고 있으며 비타민 B1, 판토텐산, 엽산의 함유량이 많은 것으로 보고되고 있다(Moon et al., 1995).
상기와 같이, 오랜 옛날부터 한방과 민간에서 특별한 독성이나 부작용 없이 사용되어온 감잎에 대해서는 그 동안 과학적으로도 여러 효능 및 독성에 대해 여러 연구가 이루어져 왔다.
그러나, 감잎의 항알레르기 및 아토피성 피부염 개선 및 예방 효과에 대해서는 연구 문헌이나 기타 자료가 거의 없을 뿐만 아니라 연구 자체도 미미한 실정이다.
이에 본 발명자는 천연물 유래의 항알레르기, 아토피성 피부염 개선 및 예방 식품연구에 주력한 결과 감잎 추출물 및 감잎 추출물의 부분 정제물이 우수한 항산화능, 항알레르기 및 아토피성 피부염 개선 및 예방 효과를 가지고 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은, 감잎 추출물 및 감잎 추출물의 부분 정제물을 유효성분으로 함유하는 항산화능, 항알레르기 효과 및 아토피성 피부염 개선 및 예방 효과를 갖는 기능성 조성물, 이의 제조방법, 이를 함유한 식품 및 건강 기능성 식품을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 기능성 조성물은, 감잎에 물 및 저급알콜 중 선택된 1종 이상을 포함하는 추출용매를 첨가하여 교반 추출한 감잎 추출물; 및 상기 감잎 추출물을 비 특이적 흡착수지로 부분 정제한 감잎 추출물의 부분 정제물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 식품 및 건강 기능성 식품은, 상기 기능성 조성물을 주성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 기능성 조성물의 제조방법은, a) 감잎을 준비하는 단계; 및 b) 상기 감잎에 물 및 저급알콜 중 선택된 1종 이상을 포함하는 추출용매를 첨가하여 교반 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
이와 같이 본 발명에 따르면, 감잎 추출물 및 감잎 추출물의 부분 정제물은 뛰어난 항산화능, 항알레르기 및 아토피성 피부염 개선 및 예방 효과를 제공한다.
도 1은 감잎 추출물과 감잎 추출물의 부분정제물의 다양한 농도에서 마우스 대식 세포(RAW 264.7 cell)에 대한 독성실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 감잎 추출물과 감잎 추출물의 부분정제물의 Nitric oxide 소거능 측정결과 효능 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 감잎 추출물과 감잎 추출물의 부분 정제물의 수동 피부 과민증(passive cutaneous anaphylaxis, PCA)억제 효능 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 4(a) 내지 도 4(e)는 아토피성 피부염이 유발된 마우스에 감잎추출물과 감잎추출물의 부분 정제물을 경구 투여하여 표피의 외관을 관찰한 도면이다.
여기서, 도 4(a)는 DNCB vehicle group; control (acetone : olive oil = 4 : 1), 도 4(b)는 DNCB-treated group; (-) control, 도 4(c)는 Oral administration group of promethazine hydrochloride (1 mg/kg); (+) control, 도 4(d)는 Oral administration group of persimmon leaves extract (50 mg/kg), 도(e)는 Oral administration group of partially purified persimmon leaves extract (50 mg/kg)이다.
도 5(A) 내지 도 5(E)는 아토피성 피부염이 유발된 마우스에 감잎추출물과 감잎추출물의 부분 정제물을 경구투여 하여 표피조직의 변화를 관찰한 도면이다.
여기서, 도 5(A)는, DNCB vehicle group; control (acetone : olive oil = 4 : 1), 도 5(B)는 DNCB-treated group; (-) control, 도 5(C)는 Oral administration group of promethazine hydrochloride (1 mg/kg); (+) control, 도 5(D)는 Oral administration group of persimmon leaves extract (50 mg/kg), 도 (E)는 Oral administration group of partially purified persimmon leaves extract (50 mg/kg) 이다.
도 6(f) 내지 도 6(i)는 아토피성 피부염이 유발된 마우스에 감잎추출물과 감잎추출물의 부분 정제물을 유발 부위에 직접 도포하여 투여 표피 외관 관찰한 도면이다.
여기서, 도 6(f)는 DNCB treated group; (-) control, 도 6(g) Topically application group of promethazine hydrochloride (1%); (+) control, 도 (h) 는 Topically application group of persimmon leaves extract (1%), 도 (i) 는 Topically application group of partially purified persimmon leaves extract (1%) 이다.
도 7(F) 내지 도 7(I)는 아토피성 피부염이 유발된 마우스에 감잎추출물과 감잎추출물의 부분 정제물을 유발 부위에 도포하여 표피조직의 변화를 관찰한 도면이다.
여기서, 도 7(F)는 DNCB treated group; (-) control, 도 7(G)는 Topically application group of promethazine hydrochloride (1%); (+) control, 도 7(H)는 Topically application group of persimmon leaves extract (1%), 도 7(I)는 Topically application group of partially purified persimmon leaves extract (1%)이다.
도 8j 내지 도 8m은 아토피성 피부염이 유발된 마우스에 감잎추출물과 감잎추출물의 부분 정제물을 유발 부위에 직접 도포와 경구투여를 병행하여 표피 외관을 관찰한 도면이다.
여기서, 도 8(j)은 DNCB-treated group; (-) control, 도 8(k)는 Oral administration (50 mg/kg) with topically application (1%) group of promethazine hydrochloride; (+) control, 도 (l)은 Oral administration (50 mg/kg) with topically application (1%) group of persimmon leaves extract, 도 8(m)은 Oral administration (50 mg/kg) with topically application (1%) group of partially purified persimmon leaves extract이다.
도 9J 내지 도 9M은 아토피성 피부염이 유발된 마우스에 감잎추출물과 감잎추출물의 부분 정제물을 유발 부위에 도포와 경구투여를 병행하여 표피조직의 변화를 관찰한 도면이다.
여기서, 도 9(J)는 DNCB-treated group; (-) control, 도 9(K)는 Oral administration (50 mg/kg) with topically application (1%) group of promethazine hydrochloride; (+) control, 도 9(L)은 Oral administration (50 mg/kg) with topically application (1%) group of persimmon leaves extract, 도 9(M)은 Oral administration (50 mg/kg) with topically application (1%) group of partially purified persimmon leaves extract이다.
본 발명에 따른 항산화능, 항알레르기 및 아토피성 피부염 개선 및 예방 효과를 갖는 기능성 조성물은, 감잎에 물 및 저급알콜 중 선택된 1종 이상을 포함하는 추출용매를 첨가하여 교반 추출한 감잎 추출물; 및 상기 감잎 추출물을 비 특이적 흡착수지로 부분 정제한 감잎 추출물의 부분 정제물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 감잎 추출물은, 감잎 1 Kg당 2~20 배의 50~80% 상기 추출용매로 20~60℃에서 1~6시간 동안 활성 물질을 추출하여 제조될 수 있다.
상기 추출용매의 사용에 있어, 2배보다 적으면 추출이 용이하지 않고, 20배보다 많아지면 추출된 것을 농축할 때 농축하려는 양이 많아져서 공정이 용이하지 않을 수 있다.
또한 추출용매 함량의 경우, 50%보다 적은 알콜 함량이면 추출물의 폴리페놀 함량이 줄어들고 80%보다 많으면 폴리페놀이 더 이상 추출되지 않고 추출용매의 단가만 증가될 수 있다.
또한 온도가 20℃ 미만인 경우 추출과정에 냉각이 포함되어 공정상의 장애와, 폴리페놀의 추출양이 줄어들고, 60℃를 초과하는 경우 폴리페놀의 추출양이 줄어들고 고온에 의한 물질의 파괴가 우려될 수 있다.
여기서, 감잎 1 Kg당 60% 상기 추출용매로 30℃에서 2시간 동안 활성 물질을 추출하게 되면, 폴리페놀 함량이 향상되기 때문에 가장 바람직할 수 있다.
상기 추출용매의 예로서 상기 저급알콜은, 메탄올, 메탄올 수용액, 에탄올, 에탄올 수용액, 노말프로판올, 이소-프로판올, 및 노말 부탄올 중에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
예컨대, 이중 에탄올의 경우 식품에 허용된 추출용매이기 때문에 에탄올 추출 시 식품에 적용시키기 훨씬 수월할 수 있다.
상기 감잎 추출물의 부분 정제물은, 상기 감잎 추출물의 액상상태에 물 및 저급알콜 중 선택된 1종 이상을 포함하는 제1용매로 1~20배 희석하여 상기 비 특이적 흡착수지와 교반시키고 50~100% 물 및 저급알콜 중 선택된 1종 이상을 포함하는 제2용매로 활성 물질을 용출시켜 제조될 수 있다.
여기서 비 특이적 흡착수지란 흡착제와 흡착되는 물질 사이에 반데르발스 힘(Van der Waals force)에 의하여 수지에 단순 흡착되는 것을 말하며 특정한 물질만을 흡착하는 것이 아니기 때문에 비특이적 흡착 수지라고 한다. 수지의 예로 Mitsubishi Chemical Corporation의 DIAION HP-2MG 수지를 들 수 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
한편, 본 발명에 따른 식품 및 건강 기능성 식품은, 항산화능, 항알레르기, 및 아토피성 피부염 개선 및 예방 효과를 갖는 기능성 조성물을 주성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.
여기서, 상기 식품은, 식이섬유, 및 석류추출물 중에서 선택된 1종 이상의 추가성분을 더 포함할 수 있으나, 추가성분이 이로 한정되는 것은 아니며, 당업계에 알려진 추가성분을 적용할 수 있음은 물론이다.
상기 식품은, 분말 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태로 이루어질 수 있다.
그리고, 상기 건강 기능성 식품은, 식품 보조 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 상기 식품 보조 첨가제는 식품학적으로 허용 가능한 것이라면 모두 적용가능하다.
상기 건강 기능성 식품은, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 액상 또는 음료 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 항산화능, 항알레르기 및 아토피성 피부염 개선 및 예방 효과를 갖는 기능성 조성물의 제조방법은, a) 감잎을 준비하는 단계; 및 b) 상기 감잎에 물 및 저급알콜 중 선택된 1종 이상을 포함하는 추출용매를 첨가하여 교반 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 a) 단계에서는 건조된 감잎을 준비할 수 있다.
상기 b) 단계에서는 감잎 1 Kg당 2~20 배의 50~80% 상기 추출용매로 20~60℃에서 1~6시간 동안 활성 물질을 추출할 수 있다.
예컨대, 상기 b) 단계에서는 감잎 1 Kg당 60% 상기 추출용매로 30℃에서 2시간 동안 활성 물질을 추출하는 것이 가장 바람직하다.
상기 추출용매의 예로서 상기 저급알콜은, 메탄올, 메탄올 수용액, 에탄올, 에탄올 수용액, 노말프로판올, 이소-프로판올, 및 노말 부탄올 중에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다. 예컨대, 이중 에탄올을 사용하는 것이 바람직하다.
그리고, 상기 b) 단계에서 추출한 후, 감압 농축하여 건조분말로 제조하는 단계를 더 포함할 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 항산화능, 항알레르기 및 아토피성 피부염 개선 및 예방 효과를 갖는 건강기능식품의 제조방법은, c) 상기 b) 단계에서 추출된 액상 상태의 감잎 추출물을 비 특이적 흡착수지로 부분 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다.
그리고, 상기 c) 단계는, c1) 상기 감잎 추출물의 액상상태에 물 및 저급알콜 중 선택된 1종 이상을 포함하는 제1용매로 희석하는 단계; c2) 상기 c1) 단계에서 희석한 후, 상기 비 특이적 흡착수지를 가하여 교반시키는 단계; c3) 상기 c2) 단계에서 교반 후, 상기 비 특이적 흡착수지를 물 및 저급알콜 중 선택된 1종 이상을 포함하는 제2용매를 사용하여 상기 비 특이적 흡착수지를 용출시키는 단계; 및 c4) 상기 c3) 단계에서 용출시킨 후, 감압 농축하여 건조 분말을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
여기서, 상기 c1) 단계에서는 상기 제1용매로 1~20배 희석하며, 상기 c3) 단계에서는 50~100% 상기 제2용매로 용출시킬수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 사용된 감잎 추출물을 제조하기 위해서 구체적으로는, 감잎을 세척 후, 그늘에서 충분히 건조시키고 세절하거나 분쇄한 다음, 무게(㎏)의 약 1배 내지 30배의 물, 에탄올과 같은 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 약2배 내지 20배의 물, 에탄올과 같은 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매로 20 내지 80 ℃, 바람직하게는 20내지 60 ℃ 추출온도에서 약 1시간 내지 2일, 바람직하게는 약 2시간 내지 12시간 동안, 1회 내지 10회, 바람직하게는 2회 내지 5회 반복적으로 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출 등의 추출방법, 더욱 바람직하게는 20 내지 60 ℃에서 1 내지 6시간 추출 방법을 수행하여 본 발명의 추출물을 수득하였다. 감잎 추출물의 부분 정제물을 제조하기 위해서 구체적으로는, 감잎 추출물을 1배 내지 20배 희석하여 이를 비 특이적 흡착 수지를 이용하여 약 1시간 내지 2일, 바람직하게는 약 2시간 내지 1일 동안, 1회 내지 6회 반복적으로 교반시키고 이 흡착 수지를 약 10 내지 100%, 바람직하게는 50 내지 100% 의 물, 에탄올과 같은 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매로 용출시킨 뒤 이를 여과하여 감잎 추출물의 부분 정제물을 수득하였고, 감잎 추출물 및 감잎 추출물의 부분 정제물은 감압농축, 진공 농축 또는 부가적으로 동결 건조시켜 분말형태로 수득 가능하다.
본 발명은 상기한 바와 감잎 추출물 및 감잎 추출물의 부분 정제물을 제조하는 제조방법을 제공한다.
상기와 같은 방법으로 얻어진 조성물을 항산화 효과를 알아보기 위하여 DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl)라디칼 포착 효능, superoxide 음이온 라디칼 포착 효능을 측정한 결과 우수한 항산화능을 확인할 수 있었다. 또한 염증을 유발하는 리폭시게나제(lipoxygenase) 및 사이클로옥시게나제(cyclooxygenase) 효소의 억제효능, 급성면역반응인 아낙필락시스 억제효과, 아토피성 피부염을 유발시킨 마우스에 감잎 추출물 및 감잎 추출물의 부분 정제물을 처리 동물실험을 실시한 결과, 항알레르기 및 아토피성 피부염 개선 및 예방에 대한 효과가 탁월함을 확인하였다. 또한 세포독성을 측정한 결과 독성을 거의 보이지 않는 것을 확인 할 수 있었다.
본 발명의 항산화, 항알레르기 및 아토피성 피부염 개선 및 예방에 효과적인 약학조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 복합생약 추출물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다. 본 발명의 조성물을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간 등 여러 인자에 따라 결정되어야 하는 것이지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 감잎 추출물 또는 감잎 추출물의 부분 정제물군으로부터 선택된 하나 이상의 추출물을 유효성분으로 포함하는 알레르기 및 아토피성 피부염 예방 및 개선용 기능성 조성물 및 이를 주성분으로 하는 식품 또는 건강 기능성 식품을 제공한다.
본 발명의 식품 또는 건강 기능성 식품은 상기 추출물을 분쇄물, 추출물 또는 분말엑스의 형태로 포함한다.
본 발명의 조성물은 알레르기 및 아토피성 피부염의 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있으며, 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량 %로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 조성물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 감잎 추출물 제조
자연초(서울특별시 동대문구 제기동 1077-1 부림빌딩 4층)에서 구입한 건조된 감잎 1 kg에 60% 에탄올 7 L 넣고 30 ℃에서 2시간 교반 추출하여 감잎 추출물을 얻고 이를 진공농축기(Buchi R-114, Buchi사, Switzerland)로 감압 농축하여 건조분말을 제조하였다.
실시예 2. 감잎 추출물의 부분 정제물 제조
감잎추출물의 부분 정제물을 얻기 위하여 액상의 추출물을 증류수를 사용하여 10배 희석하고 희석액 1 L에 비특이적 흡착수지를 200 mL를 가하여 2시간동안 교반하였다. 교반이 끝난 뒤 흡착수지를 80% 에탄올을 사용하여 수지에 흡착된 물질을 용출시키고 이를 진공농축기(Buchi R-114, Buchi사, Switzerland)로 감압 농축하여 건조 분말을 제조하였다.
실험예 1. 감잎 추출물과 감잎 추출물의 부분 정제물의 총페놀성 화합물 및 플라보노이드 함량 측정
본 발명의 실시예 1에서 제조한 감잎 추출물 및 실시예 2의 부분 정제물의 총페놀성 화합물 및 플라보노이드 함량을 확인하기 위하여 총 페놀성 화합물의 함량은 Gutfinger(Gutfinger, 1981)의 방법을 변형하여 측정하였다.
즉, 시료 1 mL에 2%(w/v) Na2CO3 용액 1 mL를 가하여 3분간 상온에서 반응시킨 후, 50% Folin-Ciocalteu 시약 0.2 mL를 첨가하여 30분간 상온에서 반응시켰다. 이 반응물 1 mL를 취하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 표준농도 곡선은 EGCG(epigallocatechin gallate)를 이용하여 작성하였다.
총 플라보노이드 함량은 다음과 같은 방법으로 측정하였다(Kim et al., 1999). 시료 0.5 mL에 95% 에탄올 1.5 mL, 10%(w/v) 염화 알루미늄용액 0.1 mL, 1 M 초산칼륨용액 0.1 mL, 증류수 2.8 mL를 가하여 충분히 교반을 하고 실온에서 30분간 방치한다. 그 후 증류수를 대조액으로 하여 반응액을 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 때 표준농도 곡선은 quercetin을 이용하여 작성하였다.
상기 실험 결과, 총페놀성 화합물 및 플라보노이드 함량의 변화는 표 1과 같이 나타났다(표 1참조).
Total phenolics Total flavonoid
감잎 추출물 230.0 ± 19.6 34.8 ± 6.5
감잎 추출물의 부분 정제물 475.5 ± 38.7 78.8 ± 3.6
(mg/g)
실험예 2. 감잎 추출물 및 감잎 추출물의 부분 정제물의 DPPH 라디칼 포착 효능 측정
본 발명의 실시예 1에서 제조한 감잎 추출물 및 실시예 2의 부분정제물의 DPPH 라디칼 포착 효능측정을 Yasushi 등(Yasushi et al., 1999)의 문헌을 변형하여 실험하였다. 2.0×10-4 M 농도가 되도록 에탄올에 용해한 DPPH를 1.5 mL, 시료 0.15 mL, 증류수 1.35 mL를 첨가하여 30분 동안 25℃에서 반응시킨 후, 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 포착능(%)은 100－[(시료를 첨가한 반응군의 흡광도/시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도)×100] 식으로부터 구하였다. 그 결과는 DPPH 라디칼을 50% 포착할 때의 농도인 50% scavenging activity concentration(SC50) 값으로 나타내었고, 양성대조군으로 녹차의 대표적인 유효성분인 EGCG((-)-epigallocatechine-3-gallate)(E4143, Sigma사, USA)와 vitamin C를 함께 비교하였다.
상기 실험 결과, DPPH 라디칼 포착 효능은 감잎 추출물과 그 부분 정제물의 SC50값은 각각 23.8±3.2 ppm, 10.0±1.3 ppm으로 나타났다. 양성대조군으로 사용된 EGCG와 비교시, 감잎 추출물은 12.4배, 감잎 추출물의 부분 정제물의 경우 5.0배 떨어지는 효능을 나타내었지만 단일 물질이 아님을 생각할 때 이는 감잎 추출물 및 그 부분 정제물의 높은 효능을 나타낸다(표 2참조).
DPPH　radical-scavenging activities (SC50, ppm)
감잎 추출분말 23.8±3.2
감잎 추출물의 부분 정제물 10.0±1.3
EGCG 4.4±0.4
Vitamin C 2.0±0.3
실험예 3. 감잎 추출물 및 감잎 추출물의 부분 정제물의 superoxide 음이온 라디칼 포착 효능 측정
본 발명의 실시예 1의 감잎 추출물 및 실시예 2의 감잎 추출물의 부분 정제물의 superoxide 음이온 라디칼 포착효능 측정은 SOD 활성 검출 kit를 사용하였다. 시료 0.05 mL, 발색액(0.4 mM xanthine, 0.24 mM nitro blue tetrazolium in 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 8.0) 0.5 mL, 효소액(0.048 unit/mL xanthine oxidase in 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 8.0) 0.5 mL를 첨가하고 잘 혼합하여 37℃에서 20분 동안 반응시킨 후, 반응정지액(70 mM sodium dodecyl sulfate) 1 mL를 첨가하여 효소 반응을 정지시킨 다음 560 nm에서 흡광도를 측정하였다.
Superoxide 음이온 라디칼 포착능(%)은 100－[(시료를 첨가한 반응군의 흡광도/시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도)×100] 식으로부터 구하였다. 그 결과는 SC50값으로 나타내었고, 양성대조군으로 EGCG와 vitamin C를 사용하였다.
상기 실험 결과, 감잎 추출물과 부분 정제물의 SC50값은 각각 47.6±3.4 ppm, 22.4±3.3 ppm이며, EGCG와 vitamin C의 SC50값은 각각 5.8±0.2 ppm, 0.7±0.1 ppm으로 나타났다. 감잎 추출물이 양성대조군으로 사용한 EGCG에 비하여 감잎 추출물은 8.2배, 감잎 추출물의 부분 정제물의 경우 4배 떨어지는 효능을 나타내었지만 순수 정제물이 아님을 생각할 때 이는 감잎 추출물과 그 부분 정제물의 높은 효능을 보여주는 것으로 생각된다(표 3참조).
Superoxide anion radical-scavenging activities (SC50, ppm)
감잎 추출물 47.6±3.4
감잎 추출물의 부분 정제물 22.4±3.3
EGCG 5.8±0.2
Vitamin C 0.7±0.1
실험예 4. 감잎 추출물 및 감잎 추출물의 부분 정제물의 LO 효소 저해 효과 측정
본 발명의 실시예 1의 감잎 추출물과 실시예 2의 부분 정제물의 5-LO 억제 효능 측정은 lipoxygenase inhibitor screening assay kit를 이용하여 실험하였다. 시료 10 μL에 5-LO(220 units/mL) 90 μL와 1 mM linoleic acid 10 μL를 첨가하여 5분간 상온에서 반응시킨 후, 색원체(chromogen) 100 μL를 가하여 상온에서 5분 동안 반응시키고 ELISA reader 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 5-LO를 50% 억제할 때의 농도인 50% inhibitory concentration(IC50) 값으로 나타내었고 양성대조군으로 녹차카테킨인 EGCG를 사용하였다. 5-LO 억제율(%)은 [(대조군의 흡광도－실험군의 흡광도)/대조군의 흡광도]×100 식을 이용하여 IC50값으로 나타내었다. 양성대조군으로 녹차 카테킨인 EGCG와 함께 비교하였다.
상기 실험 결과, LO에 대한 실시예 1의 감잎 추출물과 실시예 2의 부분 정제물의 저해활성을 측정한 결과 IC50값이 각각 77.1± 11.7 ppm, 38.6± 7.0 ppm으로 나타났고, 양성대조군으로 사용한 EGCG의 경우 18.9± 5.5 ppm으로 나타났다. PLE와 PPLE의 5-LO억제 효능이 단일물질인 EGCG의 효능에 비교하면 약 4배와 2배 정도 떨어지지만 단일물질이 아님을 생각할 때 감잎 추출물과 그 부분 정제물이 5-LO를 상당히 효과적으로 저해한다고 할 수 있다(표 4참조).
Lipoxygenase IC50 (ppm)
감잎 추출물 77.1±11.7
감잎 추출물의 부분 정제물 38.6±7.0
EGCG 18.9±5.5
실험예 5. COX(COX-1, COX-2) 효소 저해 효과 측정
본 발명의 실시예 1의 감잎 추출물과 실시예 2의 부분 정제물의 염증 및 알레르기 유발 효소인 COX-1, COX-2 효소에 대한 저해 효능을 확인하기 위하여 문헌에 기재된 Reddy 등(Reddy et al., 2000)의 방법을 변형하여 수행하였다. 96 well plate에 한 well당 60 units/mL의 COX-1이나 30 units/mL의 COX-2를 40 μL씩 넣고, 100 mM Tris-HCl buffer(pH 8.0) 90 μL, 30 μM EDTA 20 μL, 150 μM hematin 20 μL 그리고 시료 20 μL를 혼합하여 25℃에서 5분간 반응시키고 5 mM TMPD 5 μL와 20 mM arachidonic acid 5 μL를 첨가하여 25℃에서 5분간 반응시킨 후 ELISA reader를 사용하여 590 nm에서 흡광도를 측정하였다. COX 억제율(%)은 다음과 같은 식을 이용하여 IC50 값으로 나타내었으며 양성대조군으로 녹차카테킨인 EGCG를 사용하였다. COX 억제율(%)＝[(대조군의 흡광도－실험군의 흡광도)/대조군의 흡광도]×100
상기 실험 결과, 실시예 1의 감잎 추출물과 실시예 2의 부분 정제물의 염증관여 효소 저해효능을 측정한 결과, 감잎 추출물의 COX-1과 COX-2의 IC50값은 47.4± 4.4 ppm, 129.5± 5.9이며, 감잎 추출물의 부분 정제물의 IC50값은 각각 25.3± 6.4 ppm, 84.5± 2.3ppm으로 나타났고 양성대조군인 EGCG의 경우 COX-1과 COX-2의 IC50값은 각각9.3± 0.4 ppm, 13.3± 2.0 ppm으로 나타났다. 감잎 추출물과 그 부분 정제물에 대한 COX-1의 IC50값은 양성대조군인 EGCG보다 각각 약 5배, 2.7배씩 떨어지는 양상을 보였다. 따라서 감잎 추출물과 그 부분 정제물은 COX-1의 높은 억제로 인한 부작용을 감소시킬 수 있을 것으로 사료된다.
실제로 COX-2에 대한 선택적 저해능을 COX-1의 IC50값과 COX-2의 IC50값의 비로 나타내었을 때 감잎 추출물, 감잎 추출물의 부분 정제물 그리고 EGCG가 각각 2.7, 3.3, 1.4로 나타났다. 이는 이전의 연구결과(Kim et al., 2003)에서 항알레르기 효능이 우수한 식물소재로 알려져 있는 첨차 추출분말보다는 PLE와 PPLE의 COX-2 IC50/COX-1 IC50의 비가 각각 약 2.3배(6.3/2.7), 1.9배(6.3/3.3) 떨어지는 것으로 나타나 첨차 추출분말보다 더 선택적으로 COX-2를 억제하는 것으로 나타났다. (표 5참조).
IC50 (ppm) Ratio of
IC50 of COX-2 /IC50 of COX-1
COX-1 COX-2
감잎 추출물 47.4±7.7 129.5±5.5 2.7
감잎 추출물의 부분 정제물 25.3±6.3 84.5±2.3 3.3
EGCG 9.3±0.4 13.3±2.0 1.4
실험예 6. MTT assay를 이용한 세포 생존율 측정 결과
본 발명의 실시예 1의 감잎 추출물과 실시예 2의 부분 정제물의 세포에 대한 독성 측정은 MTT[(3-(4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)(Sigma, MO, 미국)] 측정으로 분석하였다. 이 방법은 MTT가 formazan으로 전환되는 것을 측정하는 것으로, DMEM 배지를 이용하여 96 well plate에 1×104 cells/well의 RAW 264.7 세포를 분주 후 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 전 배양하였다. 24시간 후 전 배양에 사용된 배지를 제거하고 감잎 추출물과 그 부분 정제물을 DMSO에 녹인 뒤 DMSO의 최종농도가 1%가 되도록 배지로 희석하여 추출물의 농도별(0, 50, 100, 250, 500, 1000 μg/mL)로 각각 37℃, 5% CO2에서 5시간과 24시간 동안 각각 처리하였다. 처리 후 well 당 0.2% MTT용액을 20 μL씩 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응 후 상등액을 모두 제거하고 DMSO 150 μL씩을 첨가하고 10분간 상온에서 생성된 formazan을 모두 녹이고 ELISA reader를 이용하여 570 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다. DMSO에 대한 영향을 알아보기 위해 일반 대조군과 1% DMSO에 대한 대조군으로 나누어 실험 하였으며, 세포 생존율(%)은 다음과 같은 식을 사용하여 나타내었다. 세포 생존율(%)=(샘플처리군의 흡광도/대조군의 흡광도)×100
상기 실험 결과, 실시예 1의 감잎 추출물과 실시예 2의 부분 정제물의 정상세포 보호 및 세포독성을 측정한 결과 농도별(0, 50, 100, 250 그리고 1000 μg/mL)로 5시간 및 24시간 동안 각각 처리한 결과, 5시간 처리군에서는 감잎 추출물, 감잎 추출물의 부분 정제물 그리고 추출물의 용매로 사용된 1% DMSO의 대조군 모두에서 세포독성을 보이지 않았고, 감잎 추출물과 그 부분 정제물은 오히려 생존율이 증가함에 따라서 세포의 보호 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 24시간 처리군에서는 추출물의 용매로 사용된 1% DMSO의 대조군의 생존율이 약 81.3%로 나타났으며, 감잎 추출물이 1000 μg/mL의 농도에서 약 30.0%의 생존율을 보였고 그 이하의 농도에서는 독성이 나타나지 않았다. 감잎 추출물의 부분 정제물은 실험에 사용된 모든 농도에서 독성을 보이지 않았다. 따라서 감잎 추출물은 5시간 처리군의 실험에 사용된 모든 농도와 24시간 처리군의 500 μg/mL농도 이하 농도에서는 생존율에 영향을 주지 않았으며, 감잎 추출물의 부분 정제물의 경우 5시간과 24시간 처리군의 실험에 사용된 모든 농도의 범위에서 세포의 생존율에 영향을 주지 않는다는 사실을 알 수 있었다(도 1참고).
실험예 7. NO소거능 실험
본 발명의 실시예 1의 감잎 추출물과 실시예 2의 부분 정제물의 염증 부위에서 활성화된 대식세포에서 대량 생성되어 염증 매개에 큰 역할을 하는 nitric oxide(NO)의 소거 효과를 마우스의 대식세포에서 생성된 NO의 소거 효능을 측정함으로써 확인 하였다. NO의 농도는 배양액 내의 nitrite 농도를 Griess 반응을 이용하여 측정하는 것으로 대체하였다. DMEM 배지를 이용하여 96 well culture plate에 1×10４ cells/well의 RAW 264.7 세포를 분주 후 5% CO2 항온기에서 24시간 전 배양하였다. 24시간 후, 전 배양에 사용된 배지를 제거하고 PLE와 PPLE를 DMSO에 녹인 뒤 DMSO의 최종농도가 1%가 되도록 배지로 희석하여 추출물의 농도별(0, 50, 100, 250, 500, 1000 μg/mL)로 1시간 동안 처리하였다. 1시간 후 100 ng/mL의 LPS를 처리하여 24시간 배양하였다. 배양 동안 생성된 NO는 Griess시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 전체 NO2 -의 농도로 측정하였는데, 세포배양 상층액 50 μL와 Griess시약[1%(w/v) sulfanilamide, 0.1%(w/v) N-(1-Naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride in 2.5%(v/v) phosphoric acid] 50 μL를 혼합하여 96 well plates에서 10분 동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로 녹차카테킨인 EGCG를 사용하였으며, 표준농도 곡선은 sodium nitrite(NaNO2)를 이용하여 얻었다. Nitric oxide 소거능(%)은 다음과 같은 식으로 IC50 값을 구하여 비교하였다. Nitric oxide 소거능(%)=100－[(시료를 첨가한 반응군의 흡광도/시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도) ×100]
상기 실험 결과, 실시예 1의 감잎 추출물과 실시예 2의 부분 정제물의 NO소거능은 감잎 추출물의 경우 SC50값이 186.5±8.6 ppm으로 나타났고, 감잎 추출물의 부분정제물의 SC50값은 185.5±12.0 ppm으로 양성대조군으로 사용된 EGCG의 SC50값(191.35±43.9 ppm)보다 낮게 나타나 NO의 소거에 상당한 효과가 있는 것으로 나타났다(도 2참조).
실험예 8. 수동 피부 과민증(passive cutaneous anaphylaxis, PCA) 실험
실시예 1의 감잎 추출물과 실시예 2의 부분 정제물에 대하여 실제 동물(마우스)내의 알레르기 반응을 유발시키고 이에 대하여 개선 효능을 지니는지 알아보기 위해 하기와 같은 방법으로 실험하였다. (주)오리엔트 바이오(경기도 가평, Korea)에서 공급받은 7 주령 ICR계 수컷 마우스 양 이각에 항체-디니트로페닐(anti-DNP(anti-Dinitrophenyl), 1.2μg/mL, D8406, Sigma)를 10 ㎕씩 주사하고, 항체-디니트로페닐 주사 47시간 경과 후, 시료를 경구 투여한다. 한시간 뒤(즉 항체-디니트로페닐 주사 48시간 경과 후), 디니트로페닐-알부민(DNP-albumin, A6661, Sigma) 0.25 mg 및 에반스 블루(evans blue, E2129, Sigma) 1.25 mg을 용해한 생리식염수 0.25 mL을 꼬리정맥에 주사하여 반응을 일으켰다. 30분 후 경추 탈골하여 치사시킨 다음 양쪽 귀를 제거 한 후 제거한 양쪽 귀에 1 N KOH 1 mL씩을 넣고 37℃ shaking incubator에서 12시간 교반 하였다. 교반이 끝난 뒤 0.6 N H3PO4와 acetone을 5:13으로 혼합하여 4 mL 첨가 하였다. 이것을 3000 rpm에서 15분간 원심분리 후 상등액속의 양쪽 귀 혈관으로부터 누출된 Evans blue 색소량을 620 nm에서 흡광도를 측정 하였다. 수동 피부 과민증의 억제율(%)은 [1-(샘플처리군의 흡광도/대조군의 흡광도)]×100의 식으로 나타냈으며 양성대조군으로 녹차카테킨인 EGCG와 프로메타진 하이드로클로라이드(promethazine hydrochloride, Phenergan: H1 histamine receptor antagonist)를 사용하였다.
상기 실험 결과, 실시예 1의 감잎 추출물과 실시예 2의 부분 정제물의 알레르기 반응 개선 효능은 vehicle만을 투여한 대조군에 비해 양성 대조군으로 사용된 EGCG(10 mg/kg)와 프로메타진 하이드로클로라이드의(1 mg/kg)의 경우 각각 49.8%, 51.9%의 억제효과를 보였다. 감잎 추출물의 경우는 10, 50 mg/kg의 농도에서 각각 22.5%, 22.7%의 억제율을 보여 농도 의존적이지 않는 결과를 보였으며, 감잎 추출물의 부분 정제물은 10, 50 mg/kg의 농도에서 각각 40.4%, 50.2%의 억제율을 보여 감잎 추출물보다 약 2배가량 우수한 효과를 보였으며 더구나 동일농도(10 mg/kg)에서 EGCG와 거의 차이가 없는 결과를 보였다. 이는 감잎 추출물과 그 부분 정제물이 in- vivo 에서 혈관에서 조직으로 색소 누출을 억제하는 것으로 미루어 IgE로 매개되는 피부 알레르기에 효과가 있음을 나타낸다(도 3참조).
실험예 9. 동물 실험을 통한 아토피성 피부염 억제 효과 측정
본 발명의 실시예 1의 감잎 추출물과 실시예 2의 부분 정제물에 대한 아토피성 피부염 억제 효과 여부를 알아보기 위하여 (주)오리엔트 바이오(경기도 가평, Korea)에서 공급받은 5 주령 Balb/c 수컷 마우스에 DNCB 처리로 아토피성 피부염이 유발시킨 후 아토피성 피부염 억제 효과를 관찰 하였다.
9-1. DNCB를 이용한 아토피성 피부염 유발
접촉성 피부염을 유발하기 전 Balb/c 마우스의 등 부위를 1.5×1.5 cm2 크기로 면도기를 사용하여 제모 후 24시간 동안 안정화 시켰다. 안정화 후 1% DNCB와 0.2% DNCB를 용매물질(acetone : olive oil = 4 : 1 혼합)에 녹여 제조하였다. 우선 1% DNCB 100 μL를 일주일에 2일 간격으로 3회 등부위에 도포하여 감작시켰다. 다음 1주일 동안에는 0.2% DNCB 100 μL를 2일 간격으로 3회 등 부위에 도포하였다. 이때 대조군 마우스에는 동량의 용매물질만을 같은 방법으로 도포하였다.
9-2. 시료 투여
피부의 짓무름, 염증, 탈모 등 의 접촉성 피부염이 유발된 것을 육안으로 확인한 후 Balb/c 마우스에 시료를 투여하였다. 시료의 투여 방법은 존대를 사용한 경구 투여군, 시료를 피부염이 유발된 부위에 직접 바르는 도포군, 경구투여와 도포를 병행 투여한 군으로 나누어 실시하였다. 경구투여군은 감잎 추출물과 감잎 추출물의 부분 정제물을 증류수를 사용하여 50 mg/kg의 농도로 제조하여 7일간 투여하였다. 양성대조군으로 프로메타진 하이드로클로라이드를 증류수를 사용하여 1 mg/kg의 농도로 제조하여 7일간 투여하였다. 도포군은 감잎 추출물, 감잎 추출물의 부분 정제물 그리고 양성대조군으로 사용된 프로메타진 하이드로클로라이드를 증류수를 사용하여 1% 농도로 제조하여 100 μL씩 등 부위에 7일간 도포하였다.
9-3. 조직 표본 제작
시료의 투여가 종료된 후 2일 뒤 증상확인 및 경추 탈골하여 치사시킨 다음 부검을 실시하였다. 등의 피부조직을 10% 포르말린 용액에 고정 시킨 뒤 파라핀을 이용하여 표본제작을 실시하였다. 고정된 피부조직을 적당한 크기로 잘라 70% 에탄올, 90% 에탄올, 100% 에탄올에 각각 3시간씩 침지하여 조직을 탈수하였다. 탈수된 조직을 xylene을 사용하여 투명과정을 거친 후 파라핀 포매 과정을 거쳐 등의 피부 조직 파라핀 블록을 제작 하였다. Microtome을 사용하여 파라핀 블록을 6 μm 두께의 박절편으로 만들고 광학현미경용 유리 슬라이드에 부착하였다. 부착된 표본을 xylene을 이용하여 탈 파라핀 과정과 에탄올과 물을 이용하여 함수과정을 거쳐 염색할 슬라이드 표본을 준비 하였다.
9-4. 조직 표본 염색
함수 과정이 끝난 표본을 Gill's hematoxylin과 eosin(H&E) 염색을 실시하였다. 슬라이드 표본을 hematoxylin에 30초간 염색 시킨 뒤 흐르는 물로 수세 하였다. 수세 후 0.0005% HCl을 사용하여 약 1분간 감별탈색 한 뒤 다시 흐르는 물로 수세 하였다. 0.5% 암모니아수를 이용하여 약 30초간 중화 현색을 실시하고 흐르는 물로 수세하였다. 세포질 염색을 위하여 eosin에 3분간 염색시킨 뒤 흐르는 물을 사용하여 수세하였다. 에탄올을 사용하여 탈수과정 및 xylene을 사용하여 투명과정을 진행하였다. 그 뒤 canada balsam과 xylene를 6:4의 비율로 섞은 봉입제를 바르고 커버글라스를 이용하여 봉입하였다. 봉입된 표본을 광학 현미경으로 관찰 후 조직의 두께 변화를 관찰하였다.
상기 실험 결과, 실시예 1의 감잎 추출물과 실시예 2의 부분 정제물의 처리는 경구투여군, 도포군 및 경구투여와 도포의 병행 처리군으로 나누어 실험하여 각 실험군의 외관 상태변화의 관찰(도 4, 6, 8참조) 및 조직의 표피 두께의 변화를 관찰하였다. 경구투여의 경우 감잎 추출물과 그 부분 정제물의 차이를 크게 구별 하기는 힘들었으나 둘 다 양성대조군으로 사용된 프로메타진 하이드로클로라이드와 비슷한 정도로 표피 피부의 두께가 줄어들고 표면이 매끄러워 진 것으로 관찰되어 육안적 소견과도 일치되는 양상을 보였다(도 5참조). 도포군의 경우에는 음성대조군보다 감잎 추출물과 그 부분 정제물 모두 피부의 두께가 줄어든 결과를 보였으나 감잎 추출물의 부분 정제물을 도포한 군이 좀 더 줄어든 결과를 보였다(도 7참조). 경구투여와 도포의 병행 처리군에서도 감잎 추출물과 그 부분 정제물의 처리시 피부의 두께가 감소하는 결과를 보여(도 9참조) 감잎 추출물과 그 부분 정제물의 처리가 아토피성 피부염의 증상을 완화 시키는 것을 확인 할 수 있었다.
본 발명의 추출물을 포함하는 식품 또는 건강 기능 식품의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 산제의 제조
실시예 1 의 기능성 조성물 300 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예 2. 정제의 제조
실시예 2 의 기능성 조성물 50 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 3. 캅셀제의 제조
실시예 2 의 기능성 조성물 50 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 4. 주사제의 제조
실시예 1의 기능성 조성물 50 mg
주사용 멸균 증류수 적량
pH 조절제 적량
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예 5. 액제의 제조
실시예 1 의 기능성 조성물 100 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 6. 건강 기능 식품의 제조
실시예 2 의 기능성 조성물 1000 ㎎
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 ㎎
비타민 B1 0.13 ㎎
비타민 B2 0.15 ㎎
비타민 B6 0.5 ㎎
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 ㎎
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 ㎎
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 ㎎
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 ㎎
산화아연 0.82 ㎎
탄산마그네슘 25.3 ㎎
제1인산칼륨 15 ㎎
제2인산칼슘 55 ㎎
구연산칼륨 90 ㎎
탄산칼슘 100 ㎎
염화마그네슘 24.8 ㎎
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제제예 7. 건강 음료의 제조
실시예 2 의 기능성 조성물 1000 ㎎
구연산 1000 ㎎
올리고당 100 g
매실농축액 2 g
타우린 1 g
정제수를 가하여 전체 900 ㎖
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (18)

  1. 감잎에 물 및 저급알콜 중 선택된 1종 이상을 포함하는 추출용매를 첨가하여 교반 추출한 감잎 추출물; 및 상기 감잎 추출물을 비 특이적 흡착수지로 부분 정제한 감잎 추출물의 부분 정제물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화능, 항알레르기 및 아토피성 피부염 개선 및 예방 효과를 갖는 기능성 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 감잎 추출물은, 감잎 1 Kg당 2~20 배의 50~80% 상기 추출용매로 20~60℃에서 1~6시간 동안 활성 물질을 추출하여 제조된 것을 특징으로 하는 항산화능, 항알레르기 및 아토피성 피부염 개선 및 예방 효과를 갖는 기능성 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 감잎 추출물의 부분 정제물은, 상기 감잎 추출물의 액상상태에 물 및 저급알콜 중 선택된 1종 이상을 포함하는 제1용매로 1~20배 희석하여 상기 비 특이적 흡착수지와 교반시키고 50~100% 물 및 저급알콜 중 선택된 1종 이상을 포함하는 제2용매로 활성 물질을 용출시켜 제조된 것을 특징으로 하는 항산화능, 항알레르기 및 아토피성 피부염 개선 및 예방 효과를 갖는 기능성 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 저급알콜은, 메탄올, 메탄올 수용액, 에탄올, 에탄올 수용액, 노말프로판올, 이소-프로판올, 및 노말 부탄올 중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화능, 항알레르기 및 아토피성 피부염 개선 및 예방 효과를 갖는 기능성 조성물.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 따른 상기 기능성 조성물을 주성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화능, 항알레르기 및 아토피성 피부염 개선 및 예방 효과를 갖는 식품.
  6. 청구항 5에 있어서,
    식이섬유, 및 석류추출물 중에서 선택된 1종 이상의 추가성분을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화능, 항알레르기 및아토피성 피부염 개선 및 예방 효과를 갖는 식품.
  7. 청구항 5에 있어서,
    상기 식품은, 분말 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태로 이루어진 것을 특징으로 하는 식품.
  8. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 따른 상기 기능성 조성물을 주성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화능, 항알레르기 및 아토피성 피부염 개선 및 예방 효과를 갖는 건강 기능성 식품.
  9. 청구항 8에 있어서,
    식품 보조 첨가제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화능, 항알레르기 및 아토피성 피부염 개선 및 예방 효과를 갖는 건강 기능성 식품.
  10. 청구항 8에 있어서,
    상기 건강 기능성 식품은, 분말 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태로 이루어진 것을 특징으로 하는 건강 기능성 식품.
  11. a) 감잎을 준비하는 단계; 및
    b) 상기 감잎에 물 및 저급알콜 중 선택된 1종 이상을 포함하는 추출용매를 첨가하여 교반 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화능, 항알레르기 및 아토피성 피부염 개선 및 예방 효과를 갖는 기능성 조성물의 제조방법.
  12. 청구항 11에 있어서,
    c) 상기 b) 단계에서 추출된 액상 상태의 감잎 추출물을 비 특이적 흡착수지로 부분 정제하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화능, 항알레르기 및 아토피성 피부염 개선 및 예방 효과를 갖는 기능성 조성물의 제조방법.
  13. 청구항 12에 있어서,
    상기 c) 단계는,
    c1) 상기 감잎 추출물의 액상상태에 물 및 저급알콜 중 선택된 1종 이상을 포함하는 제1용매로 희석하는 단계;
    c2) 상기 c1) 단계에서 희석한 후, 상기 비 특이적 흡착수지를 가하여 교반시키는 단계;
    c3) 상기 c2) 단계에서 교반 후, 상기 비 특이적 흡착수지를 물 및 저급알콜 중 선택된 1종 이상을 포함하는 제2용매를 사용하여 상기 비 특이적 흡착수지를 용출시키는 단계; 및
    c4) 상기 c3) 단계에서 용출시킨 후, 감압 농축하여 건조 분말을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화능, 항알레르기 및 아토피성 피부염 개선 및 예방 효과를 갖는 기능성 조성물의 제조방법.
  14. 청구항 13에 있어서,
    상기 c1) 단계에서는 상기 제1용매로 1~20배 희석하며,
    상기 c3) 단계에서는 50~100% 상기 제2용매로 용출시키는 것을 특징으로 하는 항산화능, 항알레르기 및 아토피성 피부염 개선 및 예방 효과를 갖는 기능성 조성물의 제조방법.
  15. 청구항 11에 있어서,
    상기 a) 단계에서는 건조된 감잎을 준비하는 것을 특징으로 하는 항산화능, 항알레르기 및 아토피성 피부염 개선 및 예방 효과를 갖는 기능성 조성물의 제조방법.
  16. 청구항 11에 있어서,
    상기 b) 단계에서는 감잎 1 Kg당 2~20 배의 50~80% 상기 추출용매로 20~60℃에서 1~6시간 동안 활성 물질을 추출하는 것을 특징으로 하는 항산화능, 항알레르기 및 아토피성 피부염 개선 및 예방 효과를 갖는 기능성 조성물의 제조방법.
  17. 청구항 11에 있어서,
    상기 b) 단계에서 추출한 후, 감압 농축하여 건조분말로 제조하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화능, 항알레르기 및 아토피성 피부염 개선 및 예방 효과를 갖는 기능성 조성물의 제조방법.
  18. 청구항 11에 있어서,
    상기 저급알콜은, 메탄올, 메탄올 수용액, 에탄올, 에탄올 수용액, 노말프로판올, 이소-프로판올, 및 노말 부탄올 중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화능, 항알레르기 및 아토피성 피부염 개선 및 예방 효과를 갖는 기능성 조성물의 제조방법.
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