KR101213134B1 - 멀티플라본엑스를 포함하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 갈근, 승마, 석류, 오미자 및 당귀를 장내유산균(Streptococcus thermophilus)으로 발효시켜서 추출한 멀티플라본엑스를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 본 발명 멀티플라본엑스는 엘라스타제 저해 활성 및 에스트로젠 활성이 우수하며 상기 멀티플라본엑스가 함유된 본 발명 화장료 조성물은 인체 적용시 피부탄력 및 피부 윤택을 증가시키는 매우 뛰어난 효과가 있다.

Description

멀티플라본엑스를 포함하는 화장료 조성물{Cosmetics composition containing Multiflavone-X}

본 발명은 갈근, 승마, 석류, 오미자 및 당귀를 장내유산균(Streptococcus thermophilus)으로 발효시켜서 추출한 멀티플라본엑스를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 엘라스타제 저해활성 및 에스트로젠 활성이 있는 멀티플라본엑스 및 이를 함유함으로써 피부탄력 유지에 효과적이고 피부노화를 방지하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

피토에스트로젠(phytoestrogen)은 호르몬 불균형으로 인한 증상을 극복하는 안전하고 새로운 대안으로 여겨지고 있으며, 식물이란 의미의 피토(phyto)와, 에스트로겐과 기능이 유사하여 에스트로젠(estrogen)이 합해진 피토에스트로젠이라 불리는 식물성호르몬이다. 피토에스트로젠은 분자구조가 에스트로겐과 매우 유사하여 체내에서 에스트로겐과 같은 작용을 나타내면서도, 식용식물에서 추출했기 때문에 부작용이 없어 안전하다고 연구 보고되고 있다.

식물성 에스트로겐의 종류는 매우 복잡하고 종류가 많으며 이소플라본, 플라보노이드, 리그난 등이 그 효능이 입증된 성분들이다. 대표적인 것이 대두에 많은 것으로 알려진 이소플라본으로 주요 활성성분은 다이드제인(daidzein)과 제니스테인(genistein)이다. 이 외에도 콩, 당귀, 블랙베리, 블루베리, 승마, 감초, 갈근, 파파야, 올리브유, 석류 등에 많으며 매우 복잡하고 다양하다. 현재 이런 피토에스트로젠 성분들은 그 안전성의 정도에 따라 의약품과 건강기능식품으로 나뉘어 이용되고 있다. 또한, 피토에스트로젠은 일상에서 음식으로 지속하여 필요량을 섭취하기는 어려움이 있으므로, 외국에서는 상업적으로 피토에스트로젠을 고농도로 추출 정제하고, 여성건강에 도움을 주는 항산화제인 각종비타민, 셀레늄, 허브류 등을 복합함유한 제품들이 많이 공급되고 있다.

지금까지 피토에스트로젠에 관한 주목할 만한 연구는 다음과 같다. 즉, 일본 여성을 상대로 한 피토에스트로젠 관련연구를 보면, 일본여성이 서구인에 비해 갱년기 장애가 경미하다는 사실이 많이 알려져 있다. 이는 피토에스트로젠이 많이 함유된 대두 관련 식품을 많이 섭취하는 식생활에서 유래하는 것으로 간주되고 있다. 따라서 피에스트로젠을 이용하여 갱년기 장애를 개선하고자 하는 많은 연구가 이루어지고 있다. 예를들면, 갱년기 장애를 개선하고 특히 유방암, 심혈관 질환과 같은 질병을 예방하기 위해 콩과 식물에서 추출한 피토에스트로젠 물질인 제니스테인을 복용하거나 생리주기에 관여하는 항체 호르몬인 프로게스테론의 전구체(前驅體)로서 멕시코 산의 야생마(野生麻;Wild Yam)에서 추출한 디오스게닌을 크림제재로 만들어 피부에 도포하는 상품이 나와 있다. 특히 피토에스트로젠은 유방암 발생을 감소시킨다는 연구결과가 계속적으로 나오고 있다. 아시아 여성의 경우 이러한 피토에스트로젠이 많이 함유된 콩과 식물의 음식물을 오랫동안 섭취하기 때문에 유방암, 난소암, 자궁암 등에 더 적게 걸린다고 한다[Adlercreutz H, Honjo H, Am.J.Clin.Nutr.1991,54(6),1093～1100].

또, 피토에스트로젠은 항산화력을 가지고 있으며 골다공증을 예방하거나 개선시키는 작용이 있는 것으로 보고되어 있다[Tsutsmi N, Biol Pharm bull 1995,18(7),1012～1015]. 피토에스트로젠은 생체내의 에스트로젠 수용체와 결합하며 이에 따라 조직내에서 에스트로겐 친화적 작용이나 길항적 작용이 있다고 보여진다. 생체내에서 에스트로젠이 얼마나 생성되고 있는지는 수용체와 결합하는 정도에 따라 설명할 수 있다. 폐경기의 경우 에스트로젠의 양이 매우 적기 때문에 피토에스트로젠의 작용은 상대적으로 커지게 된다. 일반적으로 피토에스트로젠은 에스트라디올의 활성에 비해 약 1/400 내지 1/1000의 활성범위를 가진다. 그러나 그 활성은 매우 작기 때문에 에스트로젠의 부작용은 나타나지 않는다. 따라서 장기간 섭취시 오히려 에스트로젠이 가져 올 수 있는 부작용을 예방한다는 많은 연구결과가 나오고 있다. 하지만 많은 연구결과에도 불구하고 아직까지 피토에스트로젠과 관련하여 상기 여러 가지 질병에 대한 정확한 작용기전과 효능을 완전히 밝혀 내지 못하고 있다.

상기와 같은 피토에스트로젠을 응용할 수 있는 한가지 예로서 피토에스트로젠을 피부에 도포시 나타나는 생리적 활성 결과를 들 수 있다. 피부의 노화가 빨리 진행되는 갱년기 여성의 피부에 에스트로젠을 도포하였을 때 피부의 노화가 억제되는 현상이 나타남을 관찰한 연구가 있다. 즉, 약 6개월간 에스트로젠을 도포하였을 때 피부의 탄력성이 눈에 띄게 증가하였고 주름의 깊이 등의 수치가 60%이상 감소되었으며 이는 에스트로젠에 의해 피부 콜라겐 섬유의 숫자가 증가함에 기인한다고 보고되어 있다[Schmidt JB, Binder M, Int J Dermatol 1996, 35(9), 669～674].

한편, 피부에서 엘라스틴 조직은 콜라겐조직과 함께 망상으로 결합되어 있으며 피하조직을 구성하고 있다. 엘라스타제는 이러한 엘라스틴을 가수분해시키는 단백분해 효소로서 항염 메커니즘의 중요한 역할을 담당한다고 알려져 있다. 이 효소는 결합조직(connective tissue)의 골격과 형태를 유지시키는 역할을 하는 모든 단백질, 예를 들어 엘라스틴, 콜라겐, 프로티오글리칸과 케라틴 등을 비선택적으로, 무차별적으로 가수분해시킨다. 또 콜라게나제 효소는 한정된 수의 기질에만 작용하는 것으로 보고 되어 있다[Wiedow, O., Schroder, J.M. , E.J.Biol.Chem. 265(25), 14791(1990)]. UV-A에 노출된 피부는 가벼운 염증이 반복적으로 나타나게 되는데 이는 엘라스타제가 망상조직에 작용하는 것으로 최종적으로 엘라스틴과 콜라겐 섬유의 손상을 불러 일으키며 피부가 늘어지는 노화현상으로 진행되어 버린다[Motoyoshi,K., Takenouch,M., Proceedings of the 19th IFSCC congress Sydney 22～25, October 1996]. 특히 40대 이후 엘라스타제의 작용에 의해 피부의 탄력이 급격히 감소하게 되는데 이는 엘라스타제의 작용이 나이를 먹음에 따라 매우 활발해져 엘라스틴 섬유가 일부 소멸되거나 응집현상이 나타나고 콜라겐 섬유가 감소한다. 생화학적인 측면에서 보면 엘라스티나제의 활성이 나이를 먹음에 따라 촉진되는 것이라고 보여진다(Bissett,D.L., Photochem. Photobiol.,1987, 46, 367～378). 최근, 상기 엘라스타제의 작용을 저해시키는 물질을 찾는 많은 연구가 이루어지고 있다. 예를들면, UV자극에 의해 발생되는 건성 피부를 예방하거나 피부 노화를 억제하기 위하여 엘라스타제 저해물질을 함유하는 도포 화장료 제품이 나와 있다. 특히 항산화력이 있는 식물추출물인 경우 일반적으로 엘라스타제 억제 효과가 있기 때문에 이를 응용하여 피부노화나 주름을 예방하고자 하는 연구가 많이 이루어지고 있다[Bizot-Foulon V., Godeat G., W. Int. J. Cos. Sci. 17,255～264(1995)].

본 발명자들은 엘라스타제 저해활성 및 에스트로젠 활성이 더욱 뛰어난 효능을 가지는 물질을 찾고자 수십 종의 천연물을 검색하던 중, 갈근, 승마, 석류, 오미자 및 당귀의 혼합추출물이 뛰어난 상승효과를 나타내며 장내유산균으로 발효시켜서 수득한 여과액인 멀티플라본엑스는 피부탄력 및 피부 윤택 증강에 더욱 우수한 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 갈근, 승마, 석류, 오미자 및 당귀의 혼합추출물을 장내유산균(Streptococcus thermophilus)으로 발효시켜서 수득한 여과액인 멀티플라본엑스을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 화장품 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 조성물은 갈근, 승마, 석류, 오미자 및 당귀를 장내유산균(Streptococcus thermophilus)으로 발효시켜서 추출한 엘라스타제 저해활성 및 에스트로젠 활성이 우수한 멀티플라본엑스를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 갈근, 승마, 석류, 오미자 및 당귀를 장내유산균(Streptococcus thermophilus)으로 발효시켜서 추출한 멀티플라본엑스를 유효성분으로 함유함으로써 엘라스타제 저해 활성 및 에스트로젠 활성이 우수하여 인체 적용시 피부탄력 및 피부 윤택을 증가시키는 매우 뛰어난 효과가 있다.

도 1은 피부탄력도를 큐토메타(Cutometer, Model명 MPA 580, CK Electronic, 독일)를 이용하여 측정한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 보다 더 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에서 당업자에게 명백한 것이다.

본 발명에 따른 화장료 조성물에 적용 가능한 천연물 및 생약재를 선별하기 위해 30 종의 생약재에 대한 엘라스타제 저해 능력 및 에스트로젠 활성을 스크리닝(screening)하여, 그 중에서 효과가 우수한 5 종을 하기와 같은 실험에 의하여 찾아내었다.

<예비실험 1>

(1) 생약재의 엘라스타제 저해 활성 측정

엘라스타제 저해율은 제임스 등이 실시한 방법과 동일하게 실시하여 측정하였다. 즉, 메톡시-석시닐-알라-알라-프로-발-p-니트로아닐리드(MeO-succinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilide)를 기제로 한 후 p-니트로아닐린(p-nitroaniline)의 방출 농도를 25℃에서 410 nm의 흡광도로 하였다. 각 생약재에서 추출한 갈색 고형물을 10 ㎍/ml농도가 되도록 메탄올에 녹인 후 여기에 기제로서 0.1M HEPES 완충용액(pH 7.5), 0.5M NaCl, 9.8% DMSO, 1% BSA, 인간 백혈구 엘라스타제(시그마사 제품) 1 ㎍/ml와 메톡시-석시닐-알라-알라-프로-발-p-니트로아닐리드 1.12 mM을 일정량씩 가하여 반응시켰다. 공실험(blank test)은 상기 성분 중 엘라스타제가 존재하지 않은 조건에서 실시하였다. 엘라스타제 저해율은 410 nm에서 1 ㎍의 p-니트로아닐린(p-nitroaniline) 방출시기를 기본단위로 정하였다(K.K.Lee, J.H.Kim, International J. Cosmetic Science, 1999, 21, 71~82).

엘라스타제 저해율(%) = (1 - X/Y) x 100

X : 엘라스타제 저해제 첨가시 저해율

Y : 엘라스타제 저해제 무첨가시 저해율

(2) 생약재의 에스트로젠 활성 측정

재조합 효모 분석법(recombinant yeast assay)은 인간 에스트로젠수용체[Saccharomyces cerevisiae ER+ LYS8127(YER)]를 발현하는 재조합 효모를 사용하며, 베타-갈락토시데이즈(β-galactosidase)활성의 유도 유무로 여러 화합물의 호르몬 활성을 평가할 수 있는 방법이다. 17β-에스트라디올(17β-estradiol, E2) 및 에스트로젠성 물질은 재조합 효모(Saccharomyces cerevisiae ER + Lys 8127) 내로 유입되어 발현벡터(expression vector)에 의해 발현된 호르몬 수용체와 결합하고 이는 다시 수용벡터(receptor vector)에서 베타-갈락토시데이즈의 발현을 유도하게 된다. 에스트로젠 활성은 베타-갈락토시데이즈의 발현되었는지를 베타-갈락토시데이즈에 의해 전환되는 o-니트로페놀(o-nitrophenol)의 황색 발색을 측정함으로서 검출된다.

양성 대조군으로 사용한 17β-에스트라디올(E2)는 10^-9 M의 베타-갈락토시데이즈 유도 활성을 100으로 할 때 생약 추출물 농도 10 ㎍/ml에서 에스트로젠 활성을 측정한 결과를 표 1에 나타내었다.

(3) 실험 결과

시료군	엘라스타제 저해율(%)	에스트로젠 활성(%)
대조군	0	100
갈근	30	135
승마	22	125
석류	20	123
오미자	24	129
당귀	26	131
율무	05	20
창출	01	11
복분자	11	50
옥죽	7	24
계피	1	72
산사자	5	38
익지인	2	45
원지	1	93
산수유	8	64
진피	12	55
산조인	10	102
작약	14	28
백복령	3	91
토사자	8	87
단삼	1	109

본 발명자들은 상기 실험 결과에 근거하여 엘라스타제의 활성을 저해하고 동시에 에스트로젠 활성이 우수하여 궁극적으로 인체 적용시 피부탄력 및 피부 윤택을 증가시키는 효과가 있는 원료로 갈근, 승마, 석류, 오미자 및 당귀를 선택하였다.

<예비실험 2 : 혼합생약추출물의 제조 및 활성평가>

(1) 혼합생약추출물의 제조

하기에 나타낸 표 2의 처방대로 약재들을 동량의 무게를 달아 혼합하고, 약재 무게의 10배 중량의 물을 첨가하여 가압 멸균기(autoclave)에서 3시간 동안 가압 추출한 후 150 메쉬(mesh)로 여과하였다. 여과액은 약 5%의 고형분을 함유하였으며 상기 고형분이 30%가 될 때까지 감압 농축기를 이용하여 60 ~ 70℃에서 농축하였다.

	생약재
1	대조군
2	갈근 + 당귀
3	갈근 + 당귀 + 오미자
4	갈근 + 당귀 + 오미자 + 승마
5	갈근 + 당귀 + 오미자 + 승마 + 석류

(2) 혼합생약추출물의 엘라스타제 저해 활성 측정

엘라스타제 저해율은 제임스 등이 실시한 방법과 동일하게 실시하여 측정하였다. 즉, 메톡시-석시닐-알라-알라-프로-발-p-니트로아닐리드(MeO-succinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilide)를 기제로 한 후 p-니트로아닐린(p-nitroaniline)의 방출 농도를 25℃에서 410 nm의 흡광도로 하였다. 각 생약재에서 추출한 갈색 고형물을 일정비율의 무게로 메탄올에 녹인 후 여기에 기제로서 0.1M HEPES 완충용액(pH 7.5), 0.5M NaCl, 9.8% DMSO, 1% BSA, 인간 백혈구 엘라스타제(시그마사 제품) 1 ㎍/ml와 메톡시-석시닐-알라-알라-프로-발-p-니트로아닐리드 1.12 mM을 일정량씩 가하여 반응시켰다. 공실험(blank test)은 상기 성분 중 엘라스타제가 존재하지 않은 조건에서 실시하였다. 엘라스타제 저해율은 410 nm에서 1 ㎍의 p-니트로아닐린(p-nitroaniline) 방출시기를 기본단위로 정하였다(K.K.Lee, J.H.Kim, International J. Cosmetic Science, 1999, 21, 71~82).

엘라스타제 저해율(%) = (1 - X/Y) x 100

X : 엘라스타제 저해제 첨가시 저해율

Y : 엘라스타제 저해제 무첨가시 저해율

(3) 혼합생약추출물의 에스트로젠 활성 측정

재조합 효모 분석법(recombinant yeast assay)은 인간 에스트로젠수용체[Saccharomyces cerevisiae ER+ LYS8127(YER)]를 발현하는 재조합 효모를 사용하며, 베타-갈락토시데이즈(β-galactosidase)활성의 유도 유무로 여러 화합물의 호르몬 활성을 평가할 수 있는 방법이다. 17β-에스트라디올(17β-estradiol, E2) 및 에스트로젠성 물질은 재조합 효모(Saccharomyces cerevisiae ER + Lys 8127) 내로 유입되어 발현벡터(expression vector)에 의해 발현된 호르몬 수용체와 결합하고 이는 다시 수용벡터(receptor vector)에서 베타-갈락토시데이즈의 발현을 유도하게 된다. 에스트로젠 활성은 베타-갈락토시데이즈의 발현되었는지를 베타-갈락토시데이즈에 의해 전환되는 o-니트로페놀(o-nitrophenol)의 황색 발색을 측정함으로서 검출된다.

양성 대조군으로 사용한 17β-에스트라디올(E2)는 10^-9 M의 베타-갈락토시데이즈 유도 활성을 100으로 할 때 생약 추출물 농도 10 ㎍/ml에서 에스트로젠 활성을 측정한 결과를 표 3에 나타내었다.

(4) 실험결과

	생약재	엘라스타제 저해율(%)	에스트로젠 활성(%)
1	대조군	0	100
2	갈근 + 당귀	42	144
3	갈근 + 당귀 + 오미자	48	156
4	갈근 + 당귀 + 오미자 + 승마	59	162
5	갈근 + 당귀 + 오미자 + 승마 + 석류	72	175

본 발명자들은 예비실험 2을 통해 엘라스타제 저해 활성과 에스트로젠 활성이 우수하다고 판단된 5종의 생약재들인 갈근, 당귀, 오미자, 승마 및 석류 중 여러 생약재를 혼합하여 추출 사용할 때 엘라스타제 저해 활성 및 에스트로젠 활성이 더욱 증가함을 알 수 있었다.

<예비실험 3 : 멀티플라본엑스의 제조 및 활성 평가>

(1) 멀티플라본엑스의 제조

갈근, 당귀, 오미자, 승마 및 석류를 동일량 취하여 혼합하고, 약재 무게의 10배 중량의 물을 첨가하여 가압멸균기(autoclave)에서 3시간 동안 가압추출한 후 150 메쉬(mesh)로 여과하였다. 여과액의 고형분은 약 5%이었다.

상기에서 제조한 생약추출물에 트립톤(tryptone) 1.0%, 염화나트륨(sodium chloride) 1.0%, 효모추출물(yeast extract) 0.5%로 구성된 영양배지(nutrient agar; LB broth)를 0.8%농도로 용해한 후 50리터 발효조에서 37℃, 40 rpm, pH 7.0조건에서 48시간 동안 발효하였다. 이후 상기 발효물을 0.2 ㎛ 필터가 장착된 한외여과로 여과하여 균체를 완전히 제거하고 발효물의 고형분이 30%가 될 때까지 감압 농축기를 이용하여 60 ~ 70℃에서 농축하였다. 농축액에 브틸렌글리콜을 50%농도가 되도록 첨가하여 발효에 의해 활성화된 성분을 가용화시켜 멀티플라본엑스를 제조하였다.

(2) 멀티플라본엑스의 엘라스타제 저해 활성 측정

상기에서 제조한 멀티플라본엑스의 엘라스타제 저해율은 제임스 등이 실시한 방법과 동일하게 실시하여 측정하였다. 즉, 메톡시-석시닐-알라-알라-프로-발-p-니트로아닐리드(MeO-succinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilide)를 기제로 한 후 p-니트로아닐린(p-nitroaniline)의 방출 농도를 25℃에서 410 nm의 흡광도로 하였다. 각 생약재에서 추출한 갈색 고형물을 일정비율의 무게로 메탄올에 녹인 후 여기에 기제로서 0.1M HEPES 완충용액(pH 7.5), 0.5M NaCl, 9.8% DMSO, 1% BSA, 인간 백혈구 엘라스타제(시그마사 제품) 1 ㎍/ml와 메톡시-석시닐-알라-알라-프로-발-p-니트로아닐리드 1.12 mM을 일정량씩 가하여 반응시켰다. 공실험(blank test)은 상기 성분 중 엘라스타제가 존재하지 않은 조건에서 실시하였다. 엘라스타제 저해율은 410 nm에서 1 ㎍의 p-니트로아닐린(p-nitroaniline) 방출시기를 기본단위로 정하였다(K.K.Lee, J.H.Kim, International J. Cosmetic Science, 1999, 21, 71~82).

엘라스타제 저해율(%) = (1 - X/Y) x 100

X : 엘라스타제 저해제 첨가시 저해율

Y : 엘라스타제 저해제 무첨가시 저해율

(3) 멀티플라본엑스의 에스트로젠 활성 측정

상기에서 제조한 멀티플라본엑스의 에스트로젠 활성을 측정하기 위해 사용된 재조합 효모 분석법(recombinant yeast assay)은 인간 에스트로젠수용체[Saccharomyces cerevisiae ER+ LYS8127(YER)]를 발현하는 재조합 효모를 사용하며, 베타-갈락토시데이즈(β-galactosidase)활성의 유도 유무로 여러 화합물의 호르몬 활성을 평가할 수 있는 방법이다. 17β-에스트라디올(17β-estradiol, E2) 및 에스트로젠성 물질은 재조합 효모(Saccharomyces cerevisiae ER + Lys 8127) 내로 유입되어 발현벡터(expression vector)에 의해 발현된 호르몬 수용체와 결합하고 이는 다시 수용벡터(receptor vector)에서 베타-갈락토시데이즈의 발현을 유도하게 된다. 에스트로젠 활성은 베타-갈락토시데이즈의 발현되었는지를 베타-갈락토시데이즈에 의해 전환되는 o-니트로페놀(o-nitrophenol)의 황색 발색을 측정함으로서 검출된다.

양성 대조군으로 사용한 17β-에스트라디올(E2)는 10^-9 M의 베타-갈락토시데이즈 유도 활성을 100으로 할 때 생약 추출물 농도 10 ㎍/ml에서 에스트로젠 활성을 측정한 결과를 표 4에 나타내었다.

(4) 실험결과

	생약재	엘라스타제 저해 활성(%)	에스트로젠 활성(%)
1	갈근 + 당귀 + 오미자 + 승마 + 석류 ( 장내유산균 발효 전)	72	175
2	갈근 + 당귀 + 오미자 + 승마 + 석류 ( 장내유산균 발효 후)	98	220

본 발명자들은 예비실험 3을 통해 엘라스타제 저해 활성 및 에스트로젠 활성이 우수하다고 판단된 5종의 생약재들인 갈근, 당귀, 오미자, 승마 및 석류 중 여러 생약재를 혼합하여 추출 사용할 때 보다 장내유산균으로 발효한 경우 엘라스타제 저해 활성 및 에스트로젠 활성이 더욱 증가함을 알 수 있었다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가진다. 또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.

본 발명의 조성물은 피부 탄력 및 피부 윤택 개선을 위하여, 활성 성분으로 5종의 생약성분을 함유하는 것으로 이하에서 각각 활성성분에 대하여 설명한다.

본 발명에서 사용하는 갈근(葛根, Pueraria lobata)은 보통 칡이라 불리며 주요성분으로 이소플라보노이드(isoflavonoid)인 디옥시미로에스트롤(deoxymiroestrol)과 푸에라린(puerarin)을 다량 함유하고 있다. 그 외 약효 성분은 미로에스테롤(miroesterol), 퓨에라린-3-모노아세테이트(puerarin-3-monoacetate), 디아드진(diadzin), 제니스틴(genistin), 가와크후린(kawakhurin), 수화 가와크후린(kawakhurin hydrate), 미리피신(mirificin), 코우메스트롤(coumestrol), 미리피코우메스탄 글리콜(mirificoumestan glycol), 수화 미리피코우메스탄(mirificoumestan hydrate) 등이 존재하며, 한방에서 갈근은 기육을 풀어 주는 작용을 하므로 감기 몸살이나 발진성 질환, 항강통(項强痛) 등에 해표 시킬 목적으로 사용되며, 비장과 위장의 기를 상승하게 도와주어 진액을 만들어 갈증을 해소하게 하고 지사시키는 작용을 한다. 또한, 갈근과 관련한 약리 작용으로는 항알콜중독(antidipsotropic) 작용, 간보호 작용, 숙취 억제 작용, 항산화 활성 작용 등이 알려져 있다.

당귀(當歸, Angelicae gigantis Radix)에는 코우마린류(coumarins)는 노다케닌(nodakenin), 페유테다논(peucedanone), 마르메신(marmesin), 데쿠르시놀(decursinol), 7-히드록시-6-(2R-히드록시-3-메칠부트-3-에닐)코우마린(7-hydroxy-6-(2R-hydroxy-3-methylbut-3-enyl)coumarin), 디메칠수베로신(demethylsuberosin), 데쿠르신(decursin), 데쿠르시놀 앤젤레이트(decursinol angelate), 이소임페라토린(isoimperatorin)이 존재한다. 혈액순환이 잘 안 되고 손발이 차가운 사람에게 알맞은데, 노화된 피부에 탄력을 주며 피부를 맑고 깨끗하게 유지시켜 준다. 잔주름 개선, 매끄러운 피부 유지, 보혈, 진정 작용, 모세 혈관 탄력강화, 조직 재생 기능이 있다. 월경의 이상에는 당귀를 주축으로 사용하면 좋고, 어혈을 없애는 작용을 하는데, 당귀 수산은 타박상에 좋은 약이다.

오미자(五味子, Schizandrae fructus)는 오미자과(Schizabdraceae)의 오미자나무의 과실이며, 유기산(레몬산 10 ~ 13%, 사과산 7 ~ 10%, 포도주산 0.8%), 당분 1.5%, 탄닌질, 안토시안색소, 팩틴, 정유, 수지약 8%, 사포닌 약 5%, 아스코르빈산 200 ~ 600 mg% 등을 성분으로 한다. 씨에는 시잔드린 A, B, C, 시잔드롤 A, B 고미신 B, C, D, F, G, 시잔드렐 A, B 등의 항산화효과가 있는 리그난화합물을 함유하며, 열매가 여문 것(검붉은 것)일수록 리그난 화합물의 함량이 많다. 오미자는 맛이 시어 수렴효과가 강하여 피부의 땀샘을 조절하며 방어기능을 하고, 진액생성을 촉진시키며 갈증을 풀어주며 혈당을 내려준다. 또한, 주름 제거 및 피부 탄력에 효과가 있으며. 오미자 삶은 물에 머리를 감으면 모발의 발육을 촉진하고 흰머리가 생기지 않는 효과가 있는 것으로 알려져 있다(약초의 성분과 이용, 과학백과사전출판사편, 일월서각, 1991 / 상용 약용식물도감, 약품식물 연구회편, 신일상사, 2000).

승마(升麻, Cimicifuga racemosa)는 여성의 에스트로젠과 같은 작용을 하는 물질이 함유되어 있다. 또한 항염증, 항경련과 같은 효과를 나타내며 분만직후의 여성의 자궁에 좋은 강장제가 된다. 1950년 이후로 표준화된 승마 추출물 제제가 갱년기 증상, 월경장애, 월경전 증후군 등의 치료에 이용된다는 많은 임상자료가 발표되었으며, 또한 독일연방공화국 보건당국은 월경전 증상 및 월경곤란 등의 증상에 승마추출물의 효능을 정식으로 승인한 바 있듯이 승마는 에스트로젠 효과를 조절함으로 부인과 질환에 깊이 관련되어 우수한 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다.

석류(石榴, Punica granatum)는 뿌리와 줄기껍질에 펠레티에린, 아이소펠레티에린, 메틸아이소펠레린, 프세우도펠레티에린 등의 알칼로이드가 0.3 ~ 0.5% 들어 있다. 뿌리껍질의 알칼라로이드는 대부분(총염기의 30 ~ 40%)이 아이소펠레티에린이다. 알칼로이드함량은 나무의 품종, 부위, 자란 해수 등에 따라 차이나는데 보통 뿌리껍질에 0.2 ~ 0.7%, 나무껍질에 약 0.5% 들어 있다. 또한 뿌리와 줄기에는 탄닌질이 22~25% 들어 있는데 엘라그산의 글루코사이드 형태로 있다. 그밖에 우르솔산(열매 0.6%, 잎 0.45%), 베룰린산(나무껍질 0.15%, 잎 0.2%), 만니톨, 에쿠이몰 등이 있다. 열매껍질에는 탄닌질(28%)이 열매즙에는 당(10 ~ 12%), 유기산 등, 꽃에는 색소성분인 푸니신이 들어 있다. 석류는 여성의 과일로 주목받고 있는 석류의 주효한 효능은,　석류 속에 특히 많이 함유된 고유의 성분에서 알 수 있는데, 당질, 아미노산, 비타민, 산류 외에 풍부한 칼륨과 펙틴, 탄닌 성분 등의　작용이 수렴, 정혈, 항산화 작용을 하지만, 무엇보다 중요한 석류의　성분은, 지구상의 어떤 식물보다 인체에서 분비되는 여성호르몬과　구조가 거의 동일한 에스트라디올, 에스토론으로 불려지는 에스트로젠 계열의 호르몬이 석류종자 1kg당 10-18mg이 함유되어 있다는　　사실은 이미 발표되었으며, 석류속의 여성호르몬은 화학호르몬이나 합성호르몬에 비교하면, 수용성이며 인체에서 분비되는 호르몬과 거의 흡사하므로, 몸 안의 수용체가 받아들이기가 용이하고, 필요량을　소모하고 나면 잔량이 몸에 축적되지 않고 배설되기 때문에 안전할　것으로 보이며, 에라그산은 탄닌과 결합한 에라그탄닌이 가수분해　되면 에라그산이 되는데, 강한 항암작용이 있음이 발견되었고, 항산화작용, 산의 분비 억제 등에 효과가 있으며, 영국에서는 에이즈 치료에도 가능성을 연구하고 있고, 또한 호르몬의 기능과 관련하여 노인성 치매, 남성 전립선염 예방에도 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 한방에서의 석류의 효능은 신을 보하는 약제로 쓰는데, 석류의　신맛이 수렴작용이 강해서 몸 안에 물을 가두어 신진대사를 보다 원활히 하기 때문이고, 석류꽃을 구내염, 후두염, 편도선염 등 구강염증에 쓰거나, 껍질을 구강과 장의 질환, 복통, 구충제로 쓰기도 하며, 잎을 구토방지나 식욕증진에 쓰기도 하였다. 또한 장을 수렴하고 설사와 출혈을 멈추어 설사, 이질, 유정, 대하에 특효가　있는 것으로 알려져 있다.

본 발명은 상기와 같은 주요 유효 성분이 혼합조성으로 인하여 상승작용을 나타내며, 이 때문에 인체 적용시 피부탄력 및 피부 윤택을 증가시키는 매우 뛰어난 효과를 나타내는 것이다.

상기 추출물은 각 성분을 별도로 추출하여 혼합하거나, 상기 약재를 혼합한 후 추출하는 것에 의하여 제조될 수 있다. 즉, 약재를 혼합하여 추출하는 것도 가능하고(혼합추출), 각각의 성분별로 추출한 후 추출물을 혼합하는 것도 가능하다. 바람직하게는 약재를 혼합한 후 혼합 추출하는 것이 좋다. 추출법은 통상의 추출법, 즉, 물 등의 용매를 이용하여 추출하는 것이 가능하다.

혼합 추출의 경우, 본 발명의 조성물의 구성비를 좀더 자세하게 설명하면 갈근 100 중량부에 대하여 건조된 약재로서 당귀 70 ~ 120 중량부, 오미자 70 ~ 120 중량부, 승마 70 ~120 중량부, 석류 70 ~ 120 중량부를 함유한다.

또한, 본 발명은 상기의 혼합추출물을 장내유산균(Streptococcus thermophilus)으로 발효시켜서 추출한 멀티플라본엑스를 화장료 조성물에 적용할 수 있게 함으로써, 피부 탄력 및 피부 윤택을 증가시킬 수 있는 기능성 화장품을 제공할 수 있게 한 것이다. 특히, 본 발명에 따라 제조된 멀티플라본엑스는 엘라스타제 저해 활성 및 에스트로젠 활성이 매우 우수하다.

구체적으로, 본 발명은 갈근, 승마, 석류, 오미자 및 당귀를 혼합하여 일정량의 장내유산균(Streptococcus thermophilus)을 접종하여 발효된 원료에 대하여 용매로서 물, 에탄올, 메탄올, 글리세린, 부틸렌글리콜 및 프로필렌글리콜로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 용매를 1 ~ 20배의 부피량으로 가해서 용매 추출하는 것이 바람직하다. 이는 식물성 혼합물 부피 기준 1배 미만의 용매를 가하면 추출 용매가 너무 적어서 충분하게 유효 성분을 추출할 수 없으며, 식물성 혼합물 부피 기준 20배를 초과하여 용매를 가하면 추출액 건조시 불필요한 비용 및 시간이 소요되기 때문이다. 이때 추출 방법으로는 냉각 콘덴서가 장치되어 용매가 증발되는 것을 방지한 상태에서 40 ~ 100℃, 2 ~ 20시간 가열하여 추출하거나 4 ~ 40℃, 1 ~ 15일간 침적시켜 유효성분을 추출하는 방법을 사용하는 것이 유효 성분의 추출 효율에 있어서 바람직하다.

본 발명에 따라 약재 혼합물을 용매 추출한 추출액은 화장료 조성물 전체 중량 기준으로 분말 또는 액상의 형태로 0.001 ~ 30 중량%범위에서 혼합하여 사용하는 것이 바람직하다. 이는 0.001 중량%미만이면 상술한 엘라스타제 저해 활성 및 에스트로젠 활성이 미미하고 30 중량%를 초과하여 사용하면 제조하고자 하는 화장료 형태의 성상으로 제조하는데 필요한 필수 구성 성분을 충분하게 사용하지 못하기 때문이다.

본 발명에 따른 약재 혼합물의 멀티플라본엑스는 화장수(스킨로션), 영양로션, 영양크림, 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어로션, 샴푸 및 헤어크림 등의 제형으로 이루어진 종래 화장료 조성물에 첨가하여 사용할 수 있다.

<실시예 1> 생약 추출물의 제조

하기에 나타낸 표 5의 처방대로 약재들의 무게를 달아 혼합하고, 약재 무게의 10배 중량의 물을 첨가하여 가압멸균기(autoclave)에서 3시간 동안 가압추출한 후 150 메쉬(mesh)로 여과하였다. 여과액의 고형분은 약 5%이었다.

한약명	생약명	중량
갈근(葛根)	Pueraria lobata	1 kg
승마(升麻)	Cimicifuga racemosa	1 kg
석류(石榴)	Punica granatum	1 kg
오미자(五味子)	Schizandrae fructus	1 kg
당귀(當歸)	Angelicae gigantis	1 kg

<실시예 2> 멀티플라본엑스의 제조

상기 실시예 1에서 제조한 생약추출물에 트립톤(tryptone) 1.0%, 염화나트륨(sodium chloride) 1.0%, 효모추출물(yeast extract) 0.5%로 구성된 영양배지(nutrient agar; LB broth)를 0.8%농도로 용해한 후 50리터 발효조에서 37℃, 40 rpm, pH 7.0조건에서 48시간 동안 발효하였다. 이후 상기 발효물을 0.2 ㎛ 필터가 장착된 한외여과로 여과하여 균체를 완전히 제거하고 발효물의 고형분이 30%가 될 때까지 감압 농축기를 이용하여 60 ~ 70℃에서 농축하였다. 농축액에 브틸렌글리콜을 50%농도가 되도록 첨가하여 발효에 의해 활성화된 성분을 가용화시켜 멀티플라본엑스를 제조하였다.

<실험예 1> 멀티플라본엑스의 엘라스타제 저해 활성

엘라스타제 저해율은 제임스 등이 실시한 방법과 동일하게 실시하여 측정하였다. 즉, 메톡시-석시닐-알라-알라-프로-발-p-니트로아닐리드(MeO-succinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilide)를 기제로 한 후 p-니트로아닐린(p-nitroaniline)의 방출 농도를 25℃에서 410 nm의 흡광도로 하였다. 각 생약재에서 추출한 갈색 고형물을 일정비율의 무게로 메탄올에 녹인 후 여기에 기제로서 0.1M HEPES 완충용액(pH 7.5), 0.5M NaCl, 9.8% DMSO, 1% BSA, 인간 백혈구 엘라스타제(시그마사 제품) 1 ㎍/ml와 메톡시-석시닐-알라-알라-프로-발-p-니트로아닐리드 1.12 mM을 일정량씩 가하여 반응시켰다. 공실험(blank test)은 상기 성분 중 엘라스타제가 존재하지 않은 조건에서 실시하였다. 엘라스타제 저해율은 410 nm에서 1 ㎍의 p-니트로아닐린(p-nitroaniline) 방출시기를 기본단위로 정하였다(K.K.Lee, J.H.Kim, International J. Cosmetic Science, 1999, 21, 71~82).

엘라스타제 저해율(%) = (1 - X/Y) x 100

X : 엘라스타제 저해제 첨가시 저해율

Y : 엘라스타제 저해제 무첨가시 저해율

실험 결과, 하기 표 6에 나타낸 바와 같이 멀티플라본엑스의 농도가 증가함에 따라 엘라스타제 저해율도 증가하였으며, 100 ㎍/ml이상에서는 엘라스타제를 완전히 저해할 수 있는 것으로 나타났다.

멀티플라본엑스 농도(㎍/ml)	10	50	100	500	1000
엘라스타제 저해율(%)	53	82	100	100	100

<실험예 2> 멀티플라본엑스의 에스트로젠 활성

재조합 효모 분석법(recombinant yeast assay)은 인간 에스트로젠수용체[Saccharomyces cerevisiae ER+ LYS8127(YER)]를 발현하는 재조합 효모를 사용하며, 베타-갈락토시데이즈(β-galactosidase)활성의 유도 유무로 여러 화합물의 호르몬 활성을 평가할 수 있는 방법이다. 17β-에스트라디올(17β-estradiol, E2) 및 에스트로젠성 물질은 재조합 효모(Saccharomyces cerevisiae ER + Lys 8127) 내로 유입되어 발현벡터(expression vector)에 의해 발현된 호르몬 수용체와 결합하고 이는 다시 수용벡터(receptor vector)에서 베타-갈락토시데이즈의 발현을 유도하게 된다. 에스트로젠 활성은 베타-갈락토시데이즈의 발현되었는지를 베타-갈락토시데이즈에 의해 전환되는 o-니트로페놀(o-nitrophenol)의 황색 발색을 측정함으로서 검출된다.

양성 대조군으로 사용한 17β-에스트라디올(E2)는 10^-9 M의 베타-갈락토시데이즈 유도 활성을 100으로 할 때 생약 추출물의 농도에 따른 에스트로젠 활성을 측정한 결과를 표 7에 나타내었다.

실험결과, 하기 표 7에 나타낸 바와 같이 멀티플라본엑스의 농도가 증가할수록 에스트로젠 활성이 증가하였으며, 50 ㎍/ml이상에서는 더 이상 증가하지 않았다. 본 발명인 멀티플라본엑스는 1 ㎍/ml의 저농도에서도 우수한 에스트로젠 활성을 나타낸다는 것을 알 수 있었다.

멀티플라본엑스 농도(㎍/ml)	1	5	10	50	100
에스트로젠 활성(%)	153	176	220	242	243

<실험예 3> 멀티플라본엑스의 피부 탄력 측정

본 실험예에서 본 발명 화장료 조성물을 인체에 적용하고 피부 탄력 증강 정도를 평가하였다. 30 ~ 40대의 건강한 여성 15명을 대상으로 하기 제제예 1에서 제조한 본 발명의 멀티플라본엑스를 함유한 에센스를 세안 후 1 g씩 1일 2회에 걸쳐 오른쪽 얼굴피부에만 도포하게 하고 왼쪽 얼굴피부에는 도포하지 않은 상태로 2개월 경과 시까지 유지시켰다. 이후 피부탄력도를 큐토메타(Cutometer, Model명 MPA 580, CK Electronic, 독일)를 이용하여 측정한 결과를 도 1에 나타내었다. 피부탄력도는 피부를 본 기기가 피부를 잡아당겼다가 다시 놓고, 이를 반복할 때 그 수치가 1에 가까울수록 피부탄력이 좋고, 0에 가까울수록 피부탄력이 나쁜 것으로 표현된다. 하기 도 1에서 보는 바와 같이 도포 전 상태를 유지시킨 왼쪽 얼굴피부의 탄력도 수치는 각각 0.72이었고, 제제예 1로부터 수득된 화장료를 2개월 동안 일정량 반복 도포한 경우에는 0.93로 약 30%가 상승하였음을 확인할 수 있어서, 우수한 피부탄력도 개선효과를 나타냄을 알 수 있었다.

<실험예 4> 멀티플라본엑스의 피부 탄력 측정

본 실험예에서 본 발명 화장료 조성물을 인체에 적용하고 피부 윤택 증강 정도를 평가하였다. 30 ~ 40대의 건강한 여성 15명을 대상으로 하기 제제예 1에서 제조한 본 발명의 멀티플라본엑스를 함유한 에센스를 세안 후 1 g씩 1일 2회에 걸쳐 얼굴피부에 도포하게 하여 약 2개월 경과 후 얼굴 피부의 윤택정도를 스스로 평가하도록 하였다. 실험결과, 표 8에 나타낸 바와 같이 실험자 대부분이 피부 윤택성이 증가하였다고 판단하였다.

구분	매우 우수	우수	보통	변화없음
피부 윤택성 증가	6	7	2	0

본 발명의 멀티플라본엑스를 함유하는 화장료 조성물을 이용한 에센스의 바람직한 제조예는 다음과 같다.

<제제예 1> 본 발명의 멀티플라본엑스를 함유하는 화장료 조성물을 이용한 에센스의 제조

성분	함량(중량 %)
멀티플라본엑스	2.0
글리세린	10.0
프로필렌글리콜	5.0
셀룰로오스검	0.3
히아론산 추출물	10.0
pH 조절제	적량
향	미량
방부제	미량
색소	미량
정제수	to 100

<제제예 2> 본 발명의 멀티플라본엑스를 함유하는 화장료 조성물을 이용한 영양 화장수의 제조

성분	함량(중량 %)
멀티플라본엑스	2.0
밀납	3.0
유동 파라핀	4.0
글리세린	10.0
카르복시비닐폴리머	0.1
폴리솔베이트 60	1.1
프로필렌글리콜	5.0
pH 조절제	적량
향, 방부제, 색소	미량
정제수	to 100

<제제예 3> 본 발명의 멀티플라본엑스를 함유하는 화장료 조성물을 이용한 팩의 제조

성분	함량(중량 %)
멀티플라본엑스	2.0
폴리비닐알코올	14.0
글리세린	10.0
셀룰로오스검	0.3
PEG 4000	1.0
프로필렌글리콜	5.0
pH 조절제	적량
향, 색소, 방부제	미량
정제수	to 100

<제제예 4> 본 발명의 멀티플라본엑스를 함유하는 화장료 조성물을 이용한 영양크림의 제조

성분	함량(중량 %)
멀티플라본엑스	2.0
유동 파라핀	10.0
프로필렌글리콜	5.0
밀납	7.0
글리세린	10.0
폴리솔베이트 60	1.3
pH 조절제	적량
향, 방부제, 색소	미량
정제수	to 100

Claims (5)

1. 활성성분으로 갈근, 승마, 석류, 오미자 및 당귀를 포함하는 생약재를 혼합하여 추출한 후 스트렙토 써모필루스(Streptococcus thermophilus)으로 발효시켜서 추출한 멀티플라본엑스를 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 생약 추출물에서 각 구성성분의 함량은 갈근 100 중량부에 대하여 건조된 약재로서 당귀 70 ~ 120 중량부, 오미자 70 ~ 120 중량부, 승마 70 ~120 중량부, 석류 70 ~ 120 중량부인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 생약 추출물은 물, 에탄올, 부틸렌글리콜 또는 프로필렌글리콜로 추출한 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 멀티플라본엑스를 분말 또는 액상의 형태로 0.001 ~ 30 중량%범위에서 함유함을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
5. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 스킨, 로션, 크림, 파운데이션, 에센스, 젤, 팩, 폼 클렌징, 비누 및 피부외용 연고로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형으로 이루어진 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   

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