CN110519997B - 通过辣木叶提取物和杜仲提取物的复合物的抗生、抗氧化、抗炎、抑制牙周骨损失和再生牙周骨缓解牙龈炎和牙周炎的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于预防、改善或治疗牙周病的组合物，其含有辣木提取物和杜仲皮提取物作为活性成分。更具体地，根据本发明的辣木提取物和杜仲皮提取物的复合组合物在改善包括牙龈炎和牙周炎的牙周病方面提供协同效应。特别是，其表现出通过抗氧化、抗菌或抗炎作用，改善牙槽骨损失和再生牙槽骨等直接预防或改善牙周病的效果。因此，其可有效地用作食物、药品、准药品等。

Description

通过辣木叶提取物和杜仲提取物的复合物的抗生、抗氧化、抗 炎、抑制牙周骨损失和再生牙周骨缓解牙龈炎和牙周炎的 方法

技术领域

本申请要求2017年3月24日提交的韩国申请号10-2017-0037935的较早申请日的权益和优先权，其内容通过引用整体并入本文。

本发明涉及一种用于预防和改善牙龈炎和牙周炎的组合物。更具体地，其涉及一种用于预防和改善牙龈炎和牙周炎的组合物，其含有源自天然物质的活性成分，所述天然物质能够除了通过缓解牙龈炎和牙周炎症状之外的缓解受损牙龈组织的炎症、抑制牙槽骨丧失及其再生来直接治疗牙周炎。

背景技术

牙周病是代表性的慢性炎症性疾病[Williams,1990；Williams和Paquette,2000]。牙龈炎和与其相关的牙槽骨的损失是已知的[Sallay等人,1982；Samejima等人,1990]。由它们引起的各种细菌和炎症的增殖被认为是主要原因[Listgarten,1987]。最近，众所周知，由一氧化氮引起的氧化应激可导致疾病[Lohinai等人,1998]，已知抗炎药、抗氧化药和抗骨质疏松药在牙周病的预防和治疗方面表现出较好的结果[Kim等人,2012；Lee等人,2014；Park等人,2016；Cheenpracha等人,2010；Das等人,2015]。

目前，尽管已知具有适当组分的功能性食物或其成分具有药用效果[Lee等人,2008；Choi等人,2014ab；Choi等人,2015；Kang等人,2015]，但辣木叶和杜仲皮复合提取物的改善牙龈炎和牙周炎的效果从未被研究过。

发明内容

技术问题

本发明旨在提供一种用于预防、改善或治疗包括牙龈炎和牙周炎的牙周病的组合物，其含有天然物质作为活性成分。具体地，本发明的目的在于开发一种用于预防、改善或治疗牙周病的食物组合物和药物组合物，其具有除了缓解牙周病症状之外的再生受损牙龈组织或直接治疗牙槽骨损失的效果。

技术方案

本发明提供了一种用于预防、改善或治疗牙周病的组合物和一种用于制备其的方法及其用途，所述组合物含有辣木提取物和杜仲皮提取物作为有效成分。

更具体地，在示例性实施方案中，提供了一种组合物和一种用于制备其的方法及其用途，其中辣木提取物是辣木叶提取物，并且杜仲皮提取物是杜仲皮提取物。

更具体地，在示例性实施方案中，本发明提供了一种组合物和一种用于制备其的方法及其用途，其中辣木提取物和杜仲皮提取物的提取溶剂是水、C₁-C₄低级醇或其混合物。

更具体地，在示例性实施方案中，本发明提供了一种组合物和一种用于制备其的方法及其用途，其中辣木提取物和杜仲皮提取物的重量比是1:1至8:1或8:1至2:1(辣木提取物:杜仲皮提取物)。

更具体地，在示例性实施方案中，本发明提供了一种组合物和一种用于制备其的方法及其用途，其中辣木叶提取物或杜仲皮提取物的提取溶剂是水、C₁-C₄醇或其混合物。

在另一个示例性实施方案中，本发明提供了一种组合物和一种用于制备其的方法及其用途，其中牙周病是牙龈炎或牙周炎。

在另一个示例性实施方案中，本发明提供了一种用于预防或改善牙龈炎和牙周炎的组合物和一种用于制备其的方法及其用途，所述组合物是食物组合物或药物组合物。

在另一个示例性实施方案中，本发明提供了一种组合物和一种用于制备其的方法及其用途，所述组合物进一步含有一种或多种选自由以下组成的组的提取物：石榴、桔梗花根、栀子、黄芩、荷叶、中国桑叶、姜、牡丹根、牛膝、红三叶草、蒲公英和蒲公英根提取物作为活性成分。

更具体地，在另一个示例性实施方案中，本发明提供了一种组合物和一种用于制备其的方法及其用途，其中石榴提取物含有0.5-3mg/g的鞣花酸。

更具体地，在另一个示例性实施方案中，本发明提供了一种组合物和一种用于制备其的方法及其用途，其中桔梗花根、栀子、黄芩、荷叶、中国桑叶、姜、牡丹根、牛膝、红三叶草、蒲公英和蒲公英根提取物的提取溶剂是水、C₁-C₄低级醇或其混合物。

以下给出更详细的描述。

本发明的发明人已研究了对人类安全的各种天然物质改善牙周病的功效。在这样做时，他们已确定使用辣木提取物和杜仲皮提取物一起在改善牙周病方面提供显著的协同效应。特别是，已确定了除了缓解牙周病症状之外的再生受损牙龈组织或直接治疗牙槽骨损失的效果。

[提取物]

根据本发明组合物含有辣木提取物和杜仲皮提取物作为活性成分。

另外，根据本发明的组合物任选地含有一种或多种选自由以下组成的组的提取物：石榴、桔梗花根、栀子、黄芩、荷叶、中国桑叶、姜、牡丹根、牛膝、红三叶草、蒲公英和蒲公英根提取物作为活性成分。石榴提取物是指石榴浓缩物。

辣木(Moringa)是一种原产于印度的小树。但是，其在世界各地种植，并且在广泛使用辣木的地区大量生长。辣木科含有13个物种。最广为人知的物种是辣木(Moringaoleifera)。辣木是一种伞形灌木，其高度为4-8米。其具有30-70cm长的落叶性叶子。花是白色的和芳香的和三角形的，长的绿色果实(豆荚)为30-40cm长。其是一种多用途树，在印度西北部的喜马拉雅山脚下大量生长，并在整个热带地区种植。已知辣木(Moringa，Moringaoleifera)由于高蛋白质和维生素含量以及各种药理活性(包括抗高血糖、抗炎和抗癌活性)而具有高营养价值。已知与其他植物相比，辣木的花、根、种子、叶和果实中的植物化学物质(如维生素、类黄酮、氨基酸等)丰富。在辣木的各个部分中，叶子用于抗氧化目的，因为其富含β-胡萝卜素、蛋白质、维生素C、钙等，并且据报道其对皮肤炎症或皮肤伤口有效。此外，据报道，辣木叶有效地保护肝功能、诱导细胞凋亡并抑制癌细胞的增殖等。具体地，将辣木叶用于本发明。

杜仲皮(Eucommia bark)是指杜仲树(杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)(杜仲科(family Eucommiaceae)))的茎皮，其中去除了周皮。其是板形的，并且边缘部分向内略微弯曲。长度和宽度不均匀并且厚度是3-7mm。外表面是浅棕色或灰棕色。有些具有明显的皱纹图案或垂直分割图案，并且有些则相对较薄。当粗糙的皮被解开时，观察到明显的皮孔。内表面是光滑的和棕色的或深棕色的，并且具有垂直皱纹。表面很脆弱并且容易断裂。当其破裂时，出现细小、致密、银色和弹性的橡胶线(thread)。当在显微镜下观察横截面时，厚的落皮层位于最外侧。在落皮层内，几层木栓细胞规则排列。这些细胞的细胞壁是木质化的，并且栓内层位于其下方。韧皮部占据了大部分区域，同时石细胞环呈5-7排横向排列，每个环具有3-5个石细胞。髓放线由2-3排细胞组成，位于木栓层附近，有时倾向于一侧。可在髓附近观察到包括白色古塔胶的薄壁细胞。这些薄壁细胞在韧皮部内特别丰富。杜仲皮已被用作高血压、病毒感染、肾脏疾病和肝脏疾病的代表性草药[Hsieh和Yen,2000；Kwan等人,2003；Zhao等人,2008]。

桔梗花根是桔梗花(桔梗(Platycodon grandiflorum A.De Candolle)，桔梗科(family Campanulaceae))的根，其中去除了或未去除周皮。其具有薄的长梭形或圆锥形状并且常常是分枝的。主根长10-15cm，并且直径是1-3cm。外表面是灰褐色、淡棕色或白色。根的上端具有去除的茎的凹陷疤痕。根附近具有细小的侧向皱纹和纵向沟纹。除冠部之外，根的较大部分覆盖有粗糙的纵向皱纹、侧向沟纹和皮孔样侧线。质地坚硬但容易断裂。横截面不是纤维的。皮质部比木质部略薄，几乎是白色，具有分散的裂缝。木质部是白色至淡棕色，并且组织比皮质稍密。韧皮部宽，外面的韧皮部弯曲，并且韧皮部束大部分被压缩和退化。输浆管(lactiferous tube)分散成束并含有黄棕色颗粒状物质。成束的输乳管与筛管一起布置在韧皮部内部。形成层形成一个环。木质部具有宽的髓放线和多边形导管(vessel)，单独或聚集在一起以辐射状排列。

栀子(Gardeniae fructus)是栀子(Gardenia jasminoides Ellis)(茜草科(family Rubiaceae))的成熟果实或通过热水的果实。根据文献(新编中药志)，栀子(gardeniae，Gardenia jasminoides Ellis)被称为山栀子(mountain gardeniae，山栀子)并且韩国栀子(大花栀子(Gardenia jasminoides Ellis var.grandiflora Nakai))被称为大栀子(big gardeniae，大栀子)或水栀子(aqua gardeniae，水栀子)。然而，韩国植物的命名法将两者视为同一物种。栀子在日本和中国分布，并且已知其果实具有发热缓解、利胆和止血活性。

黄芩(Scutellariae radix)是黄岑(Scutellaria baicalensis Georgi)(唇形科(family Labiatae))的根，其中去除或不去除周皮。锥形根扭曲并弯曲。外表面是黄棕色至深黄色。质地坚硬但易碎并且易于切割。切面是黄色并且中间部分是红棕色。黄芩是无气味的，并且味道略带苦味。已知具有抗菌、抗炎、降血压、止血、肝脏治疗、发热缓解、止吐和利尿活性。主要化学成分包括连翘酚、甾醇化合物、皂甙、齐墩果酸等。

荷叶是荷花(莲(Nelumbo nucifera))的叶子。荷花的叶和花分别从长的叶柄和由根茎引起的长花茎出现并漂浮在水面上。叶子来自根茎并且挂在叶柄的尖端上，所述叶柄已长到1-2m的高度。其直径是40cm左右，并且不被水弄湿。脉络径向分散，并且边缘是平坦的。叶柄是多刺的，并且内部的孔与地下的茎的孔相通。因为肉眼看不见的细毛密集地堆积在叶子的表面上，因此水滴在叶子上滚动并且不变湿。荷叶有效地抵御热量和水分、止血并缓解血栓形成。因此，其停止由热量和水分引起的腹泻，解渴，通过清除头部和眼睛的风热来治疗头晕，并且有助于治疗各种类型的出血，如咯血、鼻出血、血尿、子宫出血等。还已知荷叶具有抗菌和降血压活性、强化胃，并且有助于美容护理和活力。

中国桑(柘树(Cudrania tricuspidata Bureau))的叶子长约6-10cm，并且从枝条变化生长。叶子具有尖的或钝的椭圆形状。边缘常常分成2或3个部分，并且不是锯齿状的。生长在岩石之间或山丘上的树的叶子很小，并且具有明显分裂的边缘和长尾巴。叶子很厚。正面和叶柄具有细毛。背面具有绒(pile)。叶子在秋天变黄。

姜(生姜(Zingiber officinale))是姜科(family Zingiberaceae)，姜目(orderZingiberales)的多年生植物。其原产于东南亚，并且作为蔬菜种植。根茎生长在侧面。其是肉质、块状和黄色的，味道刺激并且闻起来香。由鞘形成的假茎直立于根茎的每个节点。其高度达到30-50cm，并且叶子在上部排列成两排。交替生长的叶子是柳叶刀形的，其中底部具有小的宽度和长的鞘。花不在韩国绽放。但是，在热带地区，在8月份围绕着鞘的20-25cm长的花茎出现，并且花从其尖端处的花蕾绽放。花来自苞叶之间并且长4-7.6cm。萼片呈桶状。花冠的末端分成三个部分，并且每个分开的部分都具有一个尖端。花具有一个雄蕊，并且花药是黄色的。其具有一个下位子房，并且样式像线一样薄。

牡丹根是指牡丹(芍药(Paeonia lactiflora Pallas))或芍药属(genusPaeonia)(芍药科(family Paeoniaceae))的其他植物的根。其是圆柱形的，有时是弯曲的，长5-20cm，并且直径是10-25mm。大根被纵向切割。外表面是白色或棕色，具有明显的纵向皱纹，常常具有侧根皱纹或疤痕，并具有横向伸长的皮孔。根的上部常常具有茎的疤痕或未去除的棕色皮质。质地坚硬且难以破裂。横截面是颗粒状的并且非常致密。在放大镜下，形成层是明显的，乳白色或棕色，并且观察到径向路径。

牛膝(Achyranthis radix)是尖叶牛膝(Achyranthes japonica Nakai)或牛膝(Achyranthes bidentata Blume)(苋科(family Amaranthaceae))的根。其是具有许多侧根的圆柱形的主根，长5-20cm并且直径是3-5mm，在顶部具有根茎的短的残余物。外表面是灰黄色至淡黄色。质地坚硬且脆，并且断裂的表面呈角状，黄白色至黄棕色。

红三叶草(Trifolium pratense L)是豆科(family Fabaceae)的多年生草。其具有许多其他名称，包括三叶草(trifolium)。其原产于地中海和西南亚的海岸，并且在世界各地广泛分布和种植。红三叶草用作饲料，并且幼叶常常在春天稍微浸入沸水中后作为蔬菜食用。已知红三叶草由于其祛痰作用而有效治疗咳嗽或哮喘。其可分为地上部分和根部分。具体地，将地上部分用于本发明。

蒲公英(Dandelion)(蒲公英(Taraxacum platycarpum))是属于被子植物门(phylum Angiospermae)的双子叶植物纲的植物，并且生长在田地的向阳的一侧。其没有茎，并且叶子从根成簇生长并向侧面蔓延。叶子具有倒柳叶刀的形状，长6-15cm并且宽1.2-5cm。其具有像羽毛一样的深压痕并且是锯齿状，且边缘略带毛。

蒲公英的根长7-8.5mm，并且冠毛长6mm，且是淡白色。

在本发明中，术语“提取物”包括从提取获得的提取物和可从提取物获得的所有形式的提取物，包括提取物的稀释或浓缩溶液、通过干燥提取物获得的干燥产物、提取物的粗纯化产物或纯化产物、其混合物等。

在不对本发明的目的产生不利影响的范围内，根据本发明的提取物除了每种植物的特定部分外，还可含有其叶、茎、树皮、根、花、花蕾、果实、种子、树液和整株植物。

根据本发明的提取物可由本领域普通技术人员使用本领域已知的任何适当方法来制备。例如，其可通过溶剂提取来制备。溶剂提取物可通过粉碎整株植物或其任何部分(例如，使用搅拌器)并且然后用提取溶剂处理来获得。在粉碎之前可进行干燥过程。另外，溶剂提取物可通过加压方法(如减压蒸馏、冷冻干燥、喷雾干燥等)制备成粉末。

提取溶剂没有特别限制，可使用本领域已知的任何溶剂。提取溶剂的非限制性实例包括：水；C₁-C₄低级醇，如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等；多元醇，如甘油、丁二醇、丙二醇等；基于烃的溶剂，如乙酸甲酯、乙酸乙酯、丙酮、苯、己烷、乙醚、二氯甲烷等；或其混合物。具体地，水或C₁-C₄低级醇可单独使用或组合使用。可通过使用溶剂进行一次或多次提取来制备溶剂提取物，并且可通过在减压下进行蒸馏并且然后冷冻干燥或喷雾干燥来将溶剂提取物制备成干燥的提取物。

提取溶剂的量可根据使用的提取溶剂而变化。例如，基于相应植物的干重，其可以1-20倍或5-20倍、更具体为5-10倍、最具体为5-8倍的量使用。

溶剂提取可在100℃-150℃和0.1-0.3MPa下进行5-10小时，但不限于此。

此外，本领域已知的各种提取方法，例如浸渍、浸泡、渗滤、煮解、煎煮、热连续提取、水-醇提取、逆流提取、微波辅助提取、超声提取、超临界流体提取、植物提取(例如，使用氢氟烃溶剂)等可单独使用或组合使用。

根据本发明的红三叶草提取物可含有基于总的红三叶草提取物为50-400mg/g的异黄酮。据认为，根据本发明的红三叶草提取物可含有上述浓度的异黄酮的原因是区域、使用部分、制备方法(例如，提取溶剂)等的差异。然而，本发明不限于此。

根据本发明的杜仲皮提取物可含有基于总杜仲皮提取物为1.0-15mg/g的松脂醇二葡萄糖苷。据认为，根据本发明的杜仲皮提取物可含有上述浓度的松脂醇二葡萄糖苷的原因是区域、使用部分、制备方法(例如，提取溶剂)等的差异。然而，本发明不限于此。

根据本发明的辣木提取物可含有基于总的辣木提取物为1.2-5mg/g的黄芪甙。据认为，根据本发明的辣木提取物可含有上述浓度的黄芪甙的原因是区域、使用部分、制备方法(例如，提取溶剂)等的差异。然而，本发明不限于此。

石榴(石榴(Punica granatum L))是一种原产于亚洲西南部、印度西北部和美国加利福尼亚的植物，并且目前广泛分布于亚热带和热带地区。从很久以前起，石榴，尤其是红石榴，一直被称为滋补品。具体地，已知其对预防高血压和动脉硬化具有良好效果。其含有38％-47％的大量水溶性糖，并且还含有各种维生素和矿物质。

具体地，本发明中使用的石榴可以是红石榴，但不特别限于此。具体地，可使用来自伊朗、加利福尼亚、乌兹别克斯坦、土耳其或韩国的红石榴。例如，土耳其石榴品种包括Hicaznar石榴品种、Cekirdeksiz VI石榴品种、Silifke Asisi石榴品种、Katirbasi石榴品种、Lefan石榴品种等，但不限于此。根据本发明的石榴提取物可根据石榴的区域、收获时间等而变化。

在本发明中，术语“浓缩物”包括通过下述方法获得的浓缩物和可从浓缩物获得的所有形式的浓缩物，包括浓缩物的稀释溶液、通过干燥浓缩物获得的干燥产物、浓缩物的粗纯化产物或纯化产物、其混合物等。

具体地，石榴果肉可用于制备根据本发明的石榴浓缩物。

根据本发明的石榴浓缩物可如下制备。例如，在洗涤石榴后，将外皮和种子完全去除。在短时间内在高温下灭菌后，通过添加淀粉降解酶使石榴中含有的多糖(如淀粉)降解。然后，在通过添加添加剂(如明胶、二氧化硅、皂土、硅溶胶、单宁、纤维素、酪蛋白酸钾等)任选地控制石榴浓缩物的浊度、颜色、粘度等之后，可通过在加热下浓缩制备石榴浓缩物。此外，过滤步骤可包括在各个步骤之间。例如，一个或多个过滤步骤可包括在去除外皮和种子的步骤与在高温下灭菌的步骤之间、用淀粉降解酶处理的步骤与浓缩步骤之间或在浓缩步骤之后。

更具体地，浓缩物可通过以下步骤制备：

S1)去除石榴的外皮和种子并仅获得石榴果肉的步骤；

S2)将石榴果肉在100℃-105℃下灭菌50-80秒，并且然后冷却至48℃-55℃的步骤；

S3)用淀粉降解酶在48℃-55℃下处理冷却的石榴果肉的步骤；以及

S4)将降解的石榴果肉以70℃-100℃和400-850mbar的高温和高压在顺序加热下浓缩两次或更多次并以40℃-80℃和100-350mbar的低温和低压在顺序加热下浓缩一次或多次的步骤。

任选地，过滤步骤可包括在步骤S1与步骤S2之间、步骤S3与步骤S4之间或在步骤S4之后。

在下文中，更详细地描述每个步骤。

S1)去除石榴的外皮和种子并仅获得石榴果肉

本发明提供仅使用不含石榴外皮和种子的石榴果肉的提取物。石榴的外皮和种子可能引起副作用。例如，外皮中含有的石榴某些生物碱可能对身体功能产生负面影响，并且中毒可能通过影响呼吸系统和肌肉而引起癫痫、惊厥、昏迷等。并且，石榴种子的提取物可能引起过敏性副作用，如一些人舌头肿胀。

S2)将石榴果肉在100℃-105℃下灭菌50-80秒，并且然后冷却至48℃-55℃将石榴果肉灭菌并且然后冷却。灭菌在100℃-105℃下进行50-80秒，更具体地快速进行55-70秒，并且冷却具体在48℃-55℃下进行。

S3)用淀粉降解酶在48℃-55℃下处理冷却的石榴果肉

用淀粉降解酶处理冷却的石榴果肉。处理可具体地在48℃-55℃下进行10-60分钟，更具体地在48℃-55℃下进行20-40分钟。作为淀粉降解酶，可使用本领域已知的各种淀粉降解酶而没有特别限制。例如，可使用果胶酶、蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等。具体地，可使用果胶酶。

S4)将降解的石榴果肉以70℃-100℃和400-850mbar的高温和高压在顺序加热下浓缩两次或更多次并以40℃-80℃和100-350mbar的低温和低压在顺序加热下浓缩一次或多次

将降解的石榴果肉以高温和高压以及低温和低压在顺序加热下浓缩。

具体地，其可以高温和高压在加热下浓缩两次或更多次，更具体地三次或更多次，并且可以低温和低压在加热下浓缩一次或多次，更具体地两次或更多次，总共三次或更多次。

以高温和高压在加热下的浓缩在70℃-100℃和400-850mbar下进行。在以上温度和压力范围内，温度和压力可针对在加热下浓缩的每次运行变化而没有限制。具体地，在加热下浓缩可首先在70℃-85℃和400-550mbar下进行，第二次在85℃-92℃和550-750mbar下进行并且第三次在92℃-100℃和750-850mbar下进行。更具体地，在加热下浓缩可首先在78℃-82℃和450-500mbar下进行，第二次在85℃-90℃和600-650mbar下进行并且第三次在92℃-98℃和800-850mbar下进行。

以低温和低压在加热下浓缩在40℃-80℃和100-350mbar下进行。在以上温度和压力范围内，温度和压力可针对在加热下浓缩的每次运行变化而没有限制。具体地，在加热下浓缩可第四次在60℃-80℃和250-350mbar下进行并且第五次在40℃-60℃和100-250mbar下进行。更具体地，在加热下浓缩可第四次在65℃-72℃和300-330mbar下进行并且第五次在45℃-55℃和100-150mbar下进行。

根据本发明的石榴浓缩物含有基于石榴浓缩物的总重量为0.5-3mg/g的鞣花酸。据认为，根据本发明的石榴浓缩物含有高含量的鞣花酸的原因是区域、仅使用果肉、制备方法(例如，浓缩方法、加热温度和压力)等的差异。然而，本发明不限于此。

[组合物]

本发明提供了一种用于预防、改善或治疗牙周病的组合物。更具体地，本发明提供了一种用于预防、改善或治疗牙周病的组合物，其含有辣木提取物和杜仲皮提取物作为活性成分。

根据本发明组合物含有辣木提取物和杜仲皮提取物作为活性成分。

此外，根据本发明的组合物任选地含有一种或多种选自由以下组成的组的提取物：石榴、桔梗花根、栀子、黄芩、荷叶、中国桑叶、姜、牡丹根、牛膝、红三叶草、蒲公英和蒲公英根提取物作为活性成分。

在本发明中，“含有作为活性成分”意指以能够表现出用根据本发明的组合物预防、改善或治疗牙周病的效果的量添加。此外，可加入用于递送至靶细胞、稳定化等的各种佐剂成分，以配制成各种形式。

在根据本发明的组合物中，各成分可以下列比率含有。

辣木提取物与杜仲皮提取物的重量比可以是1:1-8:1或8:1-2:1(辣木提取物:杜仲皮提取物)。更具体地，辣木提取物与杜仲皮提取物的重量比可以是2:1-4:1(辣木提取物:杜仲皮提取物)。在以上重量比范围内实现了优异的协同效应。

此外，根据本发明的组合物的每种提取物(和浓缩物)可在约0.0001％-90％、0.001％-90％、0.01％-90％、0.1％-90％、0.1％-90％、0.1％-80％、0.1％-70％、0.1％-60％、0.1％-50％、0.1％-40％、0.1％-30％、0.1％-20％或0.1％-10％范围内包含在最终组合物中。

另外，根据本发明的组合物可含有约0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或99％或更高范围内的本发明复合物。

％可基于基于组合物总体积的总重量或体积计算为重量，并且浓度可根据组合物或使用所述组合物的产品的所希望效果来控制。

根据本发明的组合物可通过混合通过上述方法制备的辣木提取物和杜仲皮提取物来制备。此外，其可通过任选地与一种或多种选自由以下组成的组的提取物混合来制备：通过上述方法制备的石榴、桔梗花根、栀子、黄芩、荷叶、中国桑叶、姜、牡丹根、牛膝、红三叶草、蒲公英和蒲公英根提取物。此外，可引入另外的方法以改善组合物的储存、分布和稳定特性。

根据本发明的组合物可制备成各种产品。例如，其可制备成食物组合物、药物组合物、口服产品等。

本发明提供了一种含有上述组合物中的一种的药物组合物。本发明提供了一种通过施用上述组合物中的一种来预防、改善或治疗牙周病的方法。

根据本发明的药物组合物可单独含有药学有效量的辣木提取物和杜仲皮提取物以及任选地含有一种或多种选自由以下组成的组的提取物：石榴、桔梗花根、栀子、黄芩、荷叶、中国桑叶、姜、牡丹根、牛膝、红三叶草、蒲公英和蒲公英根提取物。此外，其可进一步含有一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

术语“药学上可接受的”意指生理学上可接受并且当施用至人时，通常不引起过敏反应，如胃肠病症和头晕或与其类似的反应，同时不对活性成分的作用产生负面影响的无毒组合物。

载体、赋形剂或稀释剂的实例可包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油等。此外，药物组合物可进一步含有填充剂、抗凝剂、润滑剂、润湿剂、芳香剂、乳化剂、防腐剂等。

“药学有效量”是指与阴性对照组相比表现出所希望效果的量，特别是足以改善、预防和/或治疗牙周病的量。

此外，本发明的药物组合物可制备成制剂，其可在使用本领域已知的方法施用至哺乳动物后提供活性成分的快速、持续或延迟释放。制剂可以是粉末、颗粒、片剂、乳液、糖浆、气溶胶、软或硬明胶胶囊、无菌注射溶液或灭菌粉末。

本发明的药物组合物可口服或胃肠外施用，但施用途径不限于此。肠胃外施用途径的实例可包括透皮、鼻内、腹内、肌肉内、皮下或静脉内途径。对于口服施用，组合物可配制成片剂、胶囊、扁囊剂、胶囊锭(gelcap)、溶液、混悬液等。片剂或胶囊可通过常用方法与药学上可接受的赋形剂(如粘合剂(例如预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)、填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)、润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)、崩解剂(例如马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠)或润湿剂(例如月桂基硫酸钠))一起制备。可根据本领域熟知的方法包衣片剂。用于口服施用的液体制剂可以是溶液、糖浆或混悬液，但不限于此。在使用之前，其可作为无水形式存在以与水或其他合适的载体混合。使用药学上可接受的添加剂，如悬浮剂(例如山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)、乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯树胶)、非水性载体(例如杏仁油、油性酯、乙醇或分馏植物油)或防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)，可通过常用的方法制备液体制剂。根据需要，制剂可含有缓冲盐、风味剂、着色剂或甜味剂。可制备用于口服施用的制剂以提供活性成分的缓慢、控制或持续释放以治疗牙周病。

本发明组合物的优选施用剂量可由本领域技术人员适当地确定，尽管其根据患者的病状和体重、疾病程度、组合物类型、施用途径和施用周期而变化。

本发明的组合物可单独使用或与手术、放射疗法、激素疗法、化学疗法或使用生物反应调节剂的方法组合使用。例如，本发明的药物组合物可被施用或与已知具有改善、预防和/或治疗牙周病作用的化合物组合施用。

本发明提供了一种含有所述组合物的食物组合物。本发明还提供了一种用于通过施用所述组合物预防或改善牙周病的方法。

根据本发明的食物组合物可单独含有营养学上有效量的辣木提取物和杜仲皮提取物，或者可进一步含有一种或多种营养学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

本发明的食物组合物包括所有类型的加工天然物质，包括食物、功能性食物、营养补充剂、保健食品、食品添加剂等。可根据本领域已知的常用方法将食物组合物制备成各种形式。

食物的类型没有特别限制。可向其添加活性成分的食物的实例包括饮品、肉、香肠、面包、饼干、年糕、巧克力、糖果、小吃、小甜饼、比萨饼、方便面、其他面条、口香糖、乳制品(包括冰淇淋)、汤、饮料、酒精饮料、维生素复合物、奶制品、加工奶制品和常见保健食品。

根据本发明的辣木提取物和杜仲皮提取物的复合物可单独或与另一种食物或食物成分组合添加到食物中，并且可根据常用方法适当地使用。活性成分的混合量可根据使用目的(用于预防或改善)适当地确定。通常，基于食物的总重量，保健食品中复合物的量可以是0.1-90wt％。然而，为了健康或卫生目的，当长时间摄取时，所述量可以更小。此外，活性成分可以比上述范围更大的量使用，因为其没有安全问题。

除了特定比率的辣木提取物和杜仲皮提取物的复合物作为必需成分之外，本发明的食物组合物可含有其他成分而没有特别限制。其可任选地含有一种或多种选自由以下组成的组的提取物：石榴、桔梗花根、栀子、黄芩、荷叶、中国桑叶、姜、牡丹根、牛膝、红三叶草、蒲公英和蒲公英根提取物，并且可进一步含有通常用于饮品中的各种风味剂、天然碳水化合物等。天然碳水化合物的实例包括糖，如单糖，例如葡萄糖、果糖等；二糖，例如麦芽糖、蔗糖等；和多糖，例如糊精、环糊精等；以及糖醇，例如木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等。此外，天然风味剂(奇异果甜蛋白或甜叶菊提取物(例如莱鲍迪甙A、甘草甜素等))或合成风味剂(糖精、阿斯巴甜等)可有利地用作风味剂。

此外，本发明的食物组合物可含有各种营养素、维生素、矿物质(电解质)、风味剂如合成风味剂和天然风味剂、着色剂、增量剂(奶酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH控制剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇类、碳酸饮料中使用的碳酸化剂等。此外，其可含有用于制备天然果汁、果汁饮品或蔬菜饮品的果肉。

此外，本发明提供了一种含有所述组合物的口腔产品。口腔产品有效地预防或改善牙周病。口腔产品可以是牙膏、漱口剂、口腔喷雾剂、口香糖、膏剂、贴剂等。

根据使用的类型和目的，口腔产品可进一步含有足量的选自由以下组成的组的常用添加剂：研磨剂、保湿剂、粘结剂、发泡剂、甜味剂、防腐剂、补救剂(remedial agent)、风味剂、酸度控制剂、增白剂等。

例如，研磨剂可以是选自由以下组成的组的一种或多种：磷酸二钙、沉淀二氧化硅、碳酸钙、水合氧化铝、高岭土、碳酸氢钠(NaHCO₃)等。保湿剂可以是选自由以下组成的组的一种或多种：甘油、山梨糖醇、非结晶山梨糖醇、丙二醇、聚乙二醇、木糖醇等，但不限于此。粘结剂可以是选自由以下组成的组的一种或多种：角叉菜胶、黄原胶、羧甲基纤维素钠、羧乙烯基聚合物、海藻酸钠、锂皂石等，但不限于此。发泡剂可包括选自以下的组的一种或多种：阴离子表面活性剂(如月桂基硫酸钠、月桂酰肌氨酸钠等)、缩合聚合物(如脱水山梨糖醇脂肪酸酯)、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯、聚氧丙烯等，但不限于此。甜味剂可包括选自以下的组的一种或多于两种：糖精钠、阿斯巴甜、甘草酸等，但不限于此。防腐剂可包括选自以下的组的一种或多种：对羟基苯甲酸酯、苯甲酸钠等。补救剂可以是氟化钠、氟磷酸钠、氟化锡、氟化胺、氯己定、氨甲环酸、尿囊素、己酸、多磷酸盐、酶、草药提取物等。风味剂可以是以适当比率混合的薄荷油、留兰香油、薄荷醇、香芹酮等。酸度控制剂可以是磷酸、磷酸钠、柠檬酸、柠檬酸钠、琥珀酸、琥珀酸钠、酒石酸、酒石酸钠等，并且优选的酸度是约5-8。增白剂可以是二氧化钛，但不限于此。

根据本发明的组合物可以试剂盒的形式提供。

根据本发明的组合物包含在容器中。容器可包括瓶子、金属管、层压管、塑料管、分配器、加压容器、阻隔容器、包装、隔室、紧凑容器、可容纳组合物的盘或其他类型的容器，如注射或吹塑成其中保留有分散介质或组合物的瓶子、分配器或包装的塑料容器，但不限于此。试剂盒可含有关于试剂盒或组合物的使用的说明。所述说明可在单独的纸中描述，或者可在容器的表面上或在容器的包装材料的表面上描述。所述说明可包括词、短语、缩写、图片、符号等，但不限于此。例如，所述说明可包括关于如何使用、应用或维护试剂盒或组合物的说明。容器可含有预定量的组合物。

[牙周病的改善、预防和/或治疗]

根据本发明的组合物有效地改善、预防和/或治疗牙周病。

更具体地，根据本发明的组合物具有缓解和改善牙周病症状的作用，并且此外，通过伤口愈合、抗炎和抑制牙槽骨损失及使其再生直接治疗对牙龈和牙周组织的损伤。

牙周病可以是选自由以下组成的组的一种或多种疾病：口腔炎、牙龈炎、牙周炎、牙槽骨破裂、牙槽骨骨质疏松症、牙槽骨骨软化、牙槽骨骨质减少、牙槽骨骨营养不良等。具体地，其可能是牙龈炎或牙周炎。

根据本发明的组合物对人体是安全的，因为其含有天然物质作为活性成分。特别是，其具有除了通过缓解牙龈炎和牙周炎症状之外的伤口愈合、抗炎和抑制牙槽骨损失及使其再生来直接治疗牙龈和牙周组织损伤的效果。因此，其可有效地用作在各种应用(食物、药品、准药品等)中预防、改善或治疗牙周病(包括牙龈炎和牙周炎)的组合物。

附图说明

附图示出了本发明的优选实施方案，并与前述公开内容一起用于提供对本发明的技术特征的进一步理解，并且因此，本发明不应被解释为局限于附图。

图1示出了通过用11种天然物质处理牙龈炎诱导的动物模型并且然后测量牙龈组织中IL-1β的含量来研究抗炎效果的结果。

图2示出了通过用5种天然物质处理牙周炎诱导的动物模型并且然后测量牙槽骨体积来研究牙槽骨损失抑制效果的结果。

图3示出了通过根据辣木叶提取物和杜仲皮提取物的混合比率测量体重变化来研究牙龈炎和牙周炎改善效果的结果。

图4示出了通过根据辣木叶提取物和杜仲皮提取物的混合比率测量牙龈组织中炎症标志物IL-1β的含量来研究牙龈炎和牙周炎改善效果的结果。

图5示出了通过根据辣木叶提取物和杜仲皮提取物的混合比率测量牙龈组织中炎症标志物TNF-α的含量来研究牙龈炎和牙周炎改善效果的结果。

图6示出了通过根据辣木叶提取物和杜仲皮提取物的混合比率测量牙龈组织中表现出抗氧化作用的MDA含量来研究牙龈炎和牙周炎改善效果的结果。

图7示出了通过根据辣木叶提取物和杜仲皮提取物的混合比率测量牙槽骨中破骨细胞的数量来研究牙龈炎和牙周炎改善效果的结果。

图8示出了通过根据辣木叶提取物和杜仲皮提取物的混合比率通过测量牙槽骨体积研究抑制牙槽骨损失和再生牙槽骨的效果来研究牙龈炎和牙周炎改善效果的结果。

图9示出了通过根据辣木叶提取物和杜仲皮提取物的混合比率测量颊沟中总的存活需氧细菌的数量来研究通过抗菌作用的牙龈炎和牙周炎改善效果的结果。

具体实施方式

在下文中，将参考附图详细描述本发明的优选实施方案。在描述之前，应理解的是，基于允许发明人适当地定义术语以获得最佳解释的原则，说明书和所附权利要求中使用的术语不应被解释为局限于一般和字典含义，而是基于与本发明的技术方面相对应的含义和概念来解释。因此，本文提出的描述仅是用于说明目的的优选实例，并非旨在限制本公开的范围，因此应理解，在不脱离本公开的范围的情况下，可对其进行其他等同和修改。

实施例

1.测试物质的制备

根据以下描述的制备方法制备石榴、桔梗花根、栀子、黄芩、辣木、荷叶、中国桑叶、姜、牡丹根、牛膝、杜仲皮、红三叶草、蒲公英和蒲公英根(即14种天然物质)的提取物。对于每种原料，在所述提取条件下制备两个或更多个批次，并分析提取产率、成分含量、特性等。

1.1浓缩石榴粉末的制备

如下制备石榴浓缩物。

首先，在去除异物并分选出受损果实后，洗涤1000kg石榴。切下分离的果实，并且去除果皮和种子，以获得450kg石榴果肉。在过滤后，将石榴果肉在100℃-105℃下灭菌60秒，并且然后冷却至48℃-55℃。通过每1000L所得石榴汁加入70-100mL果胶酶，将淀粉在48℃-55℃下降解30分钟。然后，在每10000L石榴汁中加入900g皂土以保持浊度和颜色并提供有利于饮用的粘度后，将混合物在48℃-55℃下搅拌10分钟。然后，在减压下通过1.5-mm和1-mm过滤器过滤后，将混合物在加热下浓缩(顺序地，在80℃和475mbar下至12Brix，在87℃和626mbar下至17Brix，在95℃和847mbar下至31Brix，在70℃和312mbar下至43Brix，以及在49℃和118mbar下至65Brix)。然后，由通过0.15-mm过滤器过滤混合物获得含有1.8-3.0mg/g的鞣花酸的石榴浓缩物。最后，通过将石榴浓缩物与糊精以9:1的比率混合并且然后将其喷雾干燥来制备含有0.5-3mg/g的鞣花酸的浓缩石榴粉末。

1.2包括辣木的13种天然物质的提取物的制备

如下制备桔梗花根、栀子、黄芩、辣木、荷叶、中国桑叶、姜、牡丹根、牛膝、杜仲皮、蒲公英和蒲公英根提取物。

作为杜仲皮，使用干燥(烘焙)的杜仲皮。作为辣木，使用辣木叶。作为红三叶草提取物，含有8％异黄酮的提取物购自Biosearch Life公司(西班牙)。

精确称量30kg各干燥原料，洗涤干净并且然后在提取器中用3:20(kg:kg)的原料:溶剂比在121℃和0.15MPa下提取6小时。将此程序重复2次。作为溶剂，使用水。在通过过滤提取物去除固体内容物后，将滤液在减压下浓缩，以获得25Brix(±5Brix)的浓缩物。在以浓缩物:糊精比为9:1(kg:kg)混合后，通过喷雾干燥将浓缩物制成粉末。使每种粉末状提取物经受成分分析以标准化原料和制备过程，并通过体内和体外实验评估安全性和功效。

2.14种天然物质的功效的评估

对于EPD模型，研究了在1.1中制备的浓缩石榴粉末和在1.2中制备的13个样品的牙龈炎和牙周炎改善效果。

2.1.通过动物实验评估功效

评估了浓缩石榴粉末和含有辣木叶的13种提取物(桔梗花根、栀子、黄芩、辣木、荷叶、中国桑叶、姜、牡丹根、牛膝、杜仲皮、红三叶草、蒲公英和蒲公英根)中的每种的牙龈炎和牙周炎改善效果。

另外，评估了单独或组合的辣木叶提取物(MF)和杜仲皮提取物(EC)的牙龈炎和牙周炎改善效果。

2.1.1通过动物实验评估14种天然物质提取物的功效

评估了浓缩石榴粉末和含有辣木叶的13种提取物(桔梗花根、栀子、黄芩、辣木、荷叶、中国桑叶、姜、牡丹根、牛膝、杜仲皮、红三叶草、蒲公英和蒲公英根)中的每种的牙龈炎和牙周炎改善效果。

使用具有结扎诱导的实验性牙周炎(EPD)的大鼠评估牙龈炎和牙周炎改善效果。在颈段部分结扎后24小时，以5mL/kg(200mg/kg)的剂量口服施用溶解在无菌蒸馏水中的每种提取物，每天一次持续10天，并且观察牙龈组织中的白细胞介素(IL)-1β的量和牙槽骨体积变化以及组织病理学变化。将口服施用5mg/kg吲哚美辛(IND)(其是一种非甾体抗炎药(NSAID))的组用作对照组。

测试物质的组合物和施用

将浓缩石榴粉末和含有辣木叶的13种提取物(桔梗花根、栀子、黄芩、辣木、荷叶、中国桑叶、姜、牡丹根、牛膝、杜仲皮、红三叶草、蒲公英和蒲公英根)中的每种溶解在无菌蒸馏水中至浓度为40mg/mL，并在颈段部分结扎后24小时以5mL/kg(200mg/kg)的剂量口服施用，每天一次持续10天。另外，在颈段部分结扎后24小时，以5mL/kg(5mg/kg)的剂量口服施用溶解在无菌蒸馏水中的IND至浓度为1mg/mL，每天一次持续10天。对于正常对照组和EPD(牙周病)对照组，仅施用无菌蒸馏水代替具有相同剂量和频率的天然物质提取物。

牙周病的诱导

根据由本发明的发明人先前报道的方法[Lee等人,2014；Park等人,2016]，使实验动物习惯于实验室环境10天，并且通常使用吸入器(Surgivet，美国威斯康星州沃基肖)和呼吸机(型号687,Harvard Apparatus，英国剑桥)，用3％异氟烷(Hana Pharm.公司，韩国华城)、70％ N₂O和28.5％ O₂的混合气体吸入麻醉。将左切牙的颈段部分用3-0尼龙缝线结扎，以诱导牙周炎和牙龈。对于正常对照组，不结扎切牙的颈段部分。

牙龈组织中白细胞介素(IL)-1β变化的研究

在EPD 11天后，将牙龈组织匀浆并使其经受用IL-1β大鼠ELISA试剂盒(Abcam,Cambridge,UK)测量。根据制造商的说明进行所述实验。将100μL匀浆样品和参比标准品加入每个孔中，并且然后在37℃培养箱中温育2小时。在去除上清液并向每个孔中加入100μL1x生物素缀合的抗体后，在37℃培养箱中进行温育1小时。在从每个孔中取出上清液并洗涤3次后，加入100μL 1x辣根过氧化物酶缀合的抗生物素蛋白，并在37℃下进行温育1小时。在向每个孔中加入90μL 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺后，在37℃下进行温育15-30分钟。在向每个孔中加入50μL终止溶液后，用酶标仪(Tecan,Mannedofr,瑞士)在450nm波长下测量吸光度。

牙槽骨体积变化的研究

根据Crawford等人[1987]的方法测量牙槽骨损失。在样品施用后10天(EPD11后11天)处死大鼠，并尽可能地暴露牙齿和牙龈。将经受EPD的两颗牙齿之间的牙龈末端与切牙末端之间的区域表示为mm/大鼠。

2.1.1.1.通过14种天然物质提取物的牙周病诱导模型中牙龈组织中IL-1β含量的 变化来研究牙龈炎和牙周炎改善效果(图1)

对于EPD对照组，与正常对照组相比，牙龈组织中的IL-1β显著增加(p<0.01)。与EPD对照组相比，以此顺序，施用IND和辣木叶、黄芩、红三叶草、牛膝、栀子、杜仲皮、蒲公英根、石榴、蒲公英、姜和桔梗花根提取物的组显示出IL-1β含量的显著降低(p<0.01)。同时，与EPD对照组相比，施用荷叶、中国桑叶和牡丹根提取物的组未显示出牙龈组织中IL-1β含量的显著变化。

2.1.1.2.通过14种天然物质提取物的牙周病诱导模型中牙槽骨体积的变化来研 究牙龈炎和牙周炎改善效果(图2)

对于EPD对照组，与正常对照组相比，牙槽骨体积显著减小(p<0.01)。与EPD对照组相比，以此顺序，施用IND和红三叶草、杜仲皮、辣木叶、牛膝和栀子提取物的组显示出牙槽骨体积的显著增加(p<0.01或p<0.05)。同时，与EPD对照组相比，施用石榴、桔梗花根、黄芩、荷叶、中国桑叶、姜、牡丹根、蒲公英和蒲公英根的组未显示出牙槽骨体积的显著变化。

2.1.2通过动物实验评估辣木叶提取物(MF)、杜仲皮提取物(EC)及其复合物的功 效

使用具有结扎诱导的实验性牙周炎(EPD)的大鼠评估牙龈炎和牙周炎改善效果。以5mL/kg(200mg/kg)的剂量口服施用溶解在无菌蒸馏水中的辣木叶提取物(MF)和杜仲皮提取物(EC)的9种复合组合物(MF:EC＝1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1和8:1；mg:mg)，每天一次持续10天，并且观察体重、牙槽骨、口腔组织中存活需氧细菌的数量、牙龈中的白细胞介素(IL)-1β和肿瘤坏死因子(TNF)-α含量、脂质过氧化(丙二醛(MDA)含量)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和髓过氧化物酶(MPO)的活性的变化，以及组织病理学变化。参考先前的报道[Kang等人,2016]，与单独的MF和EC组合物相比，表现出药用效果的统计学显著(p<0.01或p<0.05)增加的复合组合物被认为是表现出协同效应的MF:EC复合组合物。将口服施用5mg/kg吲哚美辛(IND)(其是一种非甾体抗炎药(NSAID))的组用作对照组。

【表1】

EPD＝实验性牙周病；

IND＝吲哚美辛；

MF＝辣木叶(鼓槌树的叶子部分；多油辣木(Moringa oleifera lam))；

EC＝杜仲皮(杜仲(Eucommia ulmoides oliver)的茎皮部分)。

测试物质的组合物和施用

将适量的MF或EC直接溶解在无菌蒸馏水中，并在结扎颈段部分后24小时，以5mL/kg的剂量口服施用，每天一次持续10天。将仅MF或EC的组合物溶解在无菌蒸馏水中至浓度为40mg/mL，并以5mL/kg(200mg/kg)的剂量口服施用。通过将MF和EC(100:100、66:134、40:160、28:172、22:178、134:66、160:40、172:28和178:22mg:mg)溶解在5mL蒸馏水中制备MF:EC复合组合物(1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1和8:1)，并以5mL/kg(200mg/kg)的剂量口服施用。另外，将IND溶解在无菌蒸馏水中至浓度为1mg/mL，并在结扎颈段部分后24小时，以5mL/kg(5mg/kg)的剂量口服施用，每天一次持续10天。对于正常对照组和EPD对照组，仅口服施用无菌蒸馏水代替具有相同剂量和频率的天然物质提取物或IND以施加相同的应激。

牙周病的诱导

根据由本发明的发明人先前报道的方法[Lee等人,2014；Park等人,2016]，使实验动物习惯于实验室环境10天，并且通常使用吸入器(Surgivet，美国威斯康星州沃基肖)和呼吸机(型号687,Harvard Apparatus，英国剑桥)，用3％异氟烷(Hana Pharm.公司，韩国华城)、70％ N₂O和28.5％ O₂的混合气体吸入麻醉。将左切牙的颈段部分用3-0尼龙缝线结扎，以诱导牙周炎和牙龈。对于正常对照组，不结扎切牙的颈段部分。

体重增加的研究

为了测量体重增加，使用电子秤在整个实验期间测量体重的变化。通过在结扎后1天的样品施用的第一天和10天后的样品施用的最后一天测量体重来测量体重增加。

体重增加＝处死当天的体重-样品施用开始时的体重(结扎后24小时)。

牙龈组织中白细胞介素(IL)-1β和TNF-α变化的研究

在EPD 11天后，将牙龈组织匀浆并使其经受用IL-1β和TNF-α大鼠ELISA试剂盒(Abcam，英国剑桥)测量。根据制造商的说明进行所述实验。将100μL匀浆样品和参比标准品加入每个孔中，并且然后在37℃培养箱中温育2小时。在去除上清液并向每个孔中加入100μL 1x生物素缀合的抗体后，在37℃培养箱中进行温育1小时。在从每个孔中取出上清液并洗涤3次后，加入100μL 1x辣根过氧化物酶缀合的抗生物素蛋白，并在37℃下进行温育1小时。在向每个孔中加入90μL 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺后，在37℃下进行温育15-30分钟。在向每个孔中加入50μL终止溶液后，用酶标仪(Tecan,Mannedofr，瑞士)在450nm波长下测量吸光度。

MDA含量的研究

为了测量脂质过氧化标志物MDA，将牙龈组织从与牙齿的结扎部分相邻的部分分离，并通过加入50mM Tris-HCl、0.1mM EGTA和1mM苯甲基磺酰氟(pH 7.4)缓冲液用均化器进行匀浆。将200μL反应混合物(8.1％(w/v)十二烷基硫酸钠、1500μL 20％(v/v)乙酸、1500μL 0.8％(w/v)硫代巴比妥酸和700μL DW)加入100μL匀浆化的牙龈组织中。在95℃下温育1小时并以3000x g进行离心10分钟后，使用UV/VIS分光光度计在650nm下测量上清液的吸光度。

破骨细胞数量的测量

通过用TRAP染色并计数TRAP阳性多核细胞的数量来确定破骨细胞的数量。使用TRAP染色试剂盒(Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯)根据制造商的说明进行TRAP染色。在脱蜡和水合后，将载玻片浸入固定溶液(25mL柠檬酸盐溶液，65mL丙酮，8mL 37％甲醛)中30秒，并且然后用流水洗涤10分钟。在将45mL蒸馏水、0.5mL快速石榴石GBC溶液、0.5mL亚硝酸钠溶液、0.5mL萘酚AS-BI、2mL乙酸盐溶液和1mL酒石酸盐溶液的混合溶液滴加在37℃的载玻片上后，在37℃的潮湿室中进行平均温育约16小时。然后，在用100％乙醇洗涤后，用甲基绿进行染色1小时以用于复染。使用光学显微镜计数在牙槽骨表面上形成的TRAP阳性多核破骨细胞(具有3个或更多个细胞核)的数量。

牙槽骨体积变化的研究

根据Crawford等人[1987]的方法测量牙槽骨损失。在样品施用后10天(EPD11后11天)处死大鼠，并尽可能地暴露牙齿和牙龈。将经受EPD的两颗牙齿之间的牙龈末端与切牙末端之间的区域表示为mm/大鼠。

存活需氧细菌数量变化的测量

为了计数存活需氧细菌，拔出结扎的左侧切牙并取出牙周组织并浸入0.3mL脑心浸液肉汤(BHI,Becton,Dickenson and Company,USA)中。将组织匀浆，稀释至1:100和1:1000，并且然后接种到血琼脂。在5％ CO₂的条件下于37℃下温育48小时后，计数菌落数量并计算存活细菌数量。

存活细菌数量＝菌落数量×10⁵CFU/g组织。

2.1.2.1.牙周病诱导模型的体重变化(图3)

对于EPD对照组，在结扎后7天(施用开始后6天)确认与正常对照组相比体重的显著(p<0.05)降低，并且与正常对照组相比，在整个10天施用期间还观察到体重的显著(p<0.01)降低。同时，对于施用单独的MF和EC组合物以及MF:EC 1:1和8:1复合组合物的组，与EPD对照组相比，从施用开始后8天确认体重的显著(p<0.01或p<0.05)增加。另外，与EPD对照组相比，从施用MF:EC 4:1和6:1复合组合物的组施用开始后6天、从施用MF:EC 1:2、1:4和2:1复合组合物的组施用开始后7天、从分别施用MF:EC 1:6和1:8复合组合物的组施用开始后9和10天后确认体重的显著(p<0.01或p<0.05)增加。与EPD对照组相比，施用单独的MF和EC或复合组合物的所有组均显示出体重增加的显著(p<0.01)增加。

2.1.2.2.通过牙周病诱导模型的牙龈组织中IL-1β含量的变化来研究牙龈炎和牙 周炎改善效果(图4)

对于EPD对照组，与正常对照组相比，确认了牙龈组织中IL-1β含量的显著(p<0.01)增加。对于包括仅施用200mg/kg EC组合物的组的所有测试组，与EPD对照组相比，确认了IL-1β含量的显著(p<0.01)降低。具体地，与施用单独的MF和EC组合物的组相比，施用MF:EC 2:1和4:1复合组合物的组显示出牙龈组织中IL-1β含量的显著(p<0.01或p<0.05)降低。

2.1.2.3.通过牙周病诱导模型的牙龈组织中TNF-α含量的变化来研究牙龈炎和牙 周炎改善效果(图5)

对于EPD对照组，与正常对照组相比，确认了牙龈组织中TNF-α含量的显著(p<0.01)增加。对于包括施用200mg/kg MF:EC 1:1复合组合物的组的所有测试组，与EPD对照组相比，确认了TNF-α含量的显著(p<0.01)降低。具体地，与施用单独的MF和EC组合物的组相比，施用MF:EC 2:1和4:1复合组合物的组显示出牙龈组织中TNF-α含量的显著(p<0.01或p<0.05)降低。

2.1.2.4.通过牙周病诱导模型的牙龈组织中MDA含量的变化通过抗氧化作用来研 究牙龈炎和牙周炎改善效果(图6)

对于EPD对照组，与正常对照组相比，确认了牙龈组织中MDA含量的显著(p<0.01)增加。对于包括施用200mg/kg MF:EC 1:2复合组合物的组的所有测试组，与EPD对照组相比，确认了MDA含量的显著(p<0.01)降低。具体地，与施用单独的MF和EC组合物的组相比，施用MF:EC 2:1和4:1复合组合物的组显示出牙龈组织中MDA含量的显著(p<0.01或p<0.05)降低。

2.1.2.5.通过测量牙周病诱导模型中牙槽骨中破骨细胞的数量来研究牙龈炎和 牙周炎改善效果(图7)

与正常对照组相比，EPD对照组显示出破骨细胞数量的715.63％变化。同时，与EPD对照组相比，以200mg/kg的剂量施用单独的IND、MF和EC组合物以及MF:EC 1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1和8:1复合组合物的组分别显示出-50.19％、-34.48％、-43.68％、-36.40％、-43.30％、-41.00％、-35.63％、-34.87％、-63.22％、-57.09％、-41.76％和-34.48％的变化。

2.1.2.6.通过测量牙周病诱导模型的牙槽骨体积的变化来研究牙龈炎和牙周炎 改善效果(图8)

对于EPD对照组，与正常对照组相比，确认了牙槽骨体积的显著(p<0.01)减小。对于包括施用200mg/kg MF:EC 6:1复合组合物的组的所有测试组，与EPD对照组相比，确认了牙槽骨体积的显著(p<0.01)增加。具体地，与施用单独的MF和EC组合物的组相比，施用MF:EC 2:1和4:1复合组合物的组显示出牙槽骨体积的显著(p<0.01或p<0.05)减小。

2.1.2.7.通过测量牙周病诱导模型的颊沟中的总的存活需氧细菌的数量来研究 牙龈炎和牙周炎改善效果(图9)

对于EPD对照组，与正常对照组相比，确认了颊沟中总存活需氧细菌数量的显著(p<0.01)增加。对于排除施用5mg/kg IND的组(其显示出与EPD对照组相似的存活细菌数量)的所有测试组，与EPD对照组相比，确认了存活细菌数量的显著(p<0.01)减少。具体地，与施用单独的MF和EC组合物的组相比，施用MF:EC 2:1和4:1复合组合物的组显示出颊沟中总存活需氧细菌数量的显著(p<0.01或p<0.05)减少。

Claims (8)

1.一种用于预防或改善牙周病的组合物，其包含辣木叶提取物和杜仲皮提取物作为活性成分，

其中所述辣木叶提取物与所述杜仲皮提取物的重量比是2:1至4:1，

其中所述辣木叶提取物通过使用水作为提取溶剂来制备，并且含有基于总的辣木叶提取物的1.2mg/g至5mg/g的黄芪甙，并且

其中所述杜仲皮提取物通过使用水作为提取溶剂来制备，并且含有基于总的杜仲皮提取物的1.0mg/g至15mg/g的松脂醇二葡萄糖苷。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述辣木叶提取物与所述杜仲皮提取物的重量比是2:1或4:1。

4.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述牙周病是牙龈炎或牙周炎。

5.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述组合物进一步包含一种或多种选自由以下组成的组中的提取物：石榴、桔梗花根、栀子、黄芩、荷叶、中国桑叶、姜、牡丹根、牛膝、红三叶草、蒲公英和蒲公英根提取物作为活性成分。

6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述石榴提取物包含0.5-3mg/g的鞣花酸。

7.根据权利要求5所述的组合物，其中所述桔梗花根、栀子、黄芩、荷叶、中国桑叶、姜、牡丹根、牛膝、红三叶草、蒲公英和蒲公英根提取物通过使用水、C₁-C₄低级醇或其混合物作为提取溶剂来制备。

8.根据权利要求1所述的组合物在制备用于预防或改善牙周病的产品中的用途。

Images