KR101506858B1 - 구강 병원균에 대한 항균성과 항바이오 필름 활성을 지닌 천연 추출물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 천연물 소재로부터 분리한 구강 병원균에 대한 항균성과 항바이오 필름(antibiofilm) 활성을 지닌 천연 추출물로서, 더욱 상세하게는, 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 대한 생장억제 활성과 다당류를 생성하는 효소들 중 바이오 필름 형성 활성을 지닌 글루코실트랜스퍼라이제(glucosyltransferase)에 대한 형성억제 활성을 동시에 나타내므로, 이를 유효성분으로 포함하는 의약품은 치아우식증 및 치주질환을 동시에 예방 및 치료할 수 있는 효과는 천연추출물에 관한 것이다.

Description

구강 병원균에 대한 항균성과 항바이오 필름 활성을 지닌 천연 추출물 {Herbal Extract for Having an Antibacterial and Antibiofilm Effect on Oral Pathogen}

본 발명은 천연물 소재로부터 분리한 구강 병원균에 대한 항균성과 항바이오 필름(antibiofilm) 활성을 지닌 천연 추출물로서, 더욱 상세하게는, 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans)에 대한 생장억제 활성과 다당류를 생성하는 효소들에 대한 형성억제 활성을 동시에 나타내는 것을 특징으로 하는 천연추출물에 관한 것이다.

사람의 입안(구강)에는 다양한 종류의 세균들이 군집을 형성하고 있다. 구강의 타액과 분비물에는 다양한 단백질이 존재하는데, 예를 들어 입안에는 라이소자임(Lysozyme)이라는 효소를 포함하고 있는 침이 지속적으로 분비되어 미생물을 제어하고 있지만, 영양분이 가득한 구강환경은 미생물 성장에 최적의 조건이 될 수 있기에 완전한 사멸을 유도하지는 못한다. 특히 구강의 혀나 치태(dental plaque)는 병원성 미생물들의 도피처로 이용되고 있다.

여기서, 구강내 치태(dental plaque)의 군집을 구성하는 미생물인 박테리아(bacteria), 고세균(archaea) 및 진핵 미생물(fungi and yeast) 등은 대부분이 무해한 일반세균이거나, 이들과 공생관계에 있는 미생물이지만, 일부 미생물들은 기회성 병원균(opportunistic pathogen)으로서, 치아우식증(dental cavities; 충치)과 치주질환(periodontal disease; 풍치)과 같은 질환의 원인이 된다.

치아우식증은, 플라크(dental plaque; 치태)를 형성하는 미생물들이 입 속의 영양분을 이용해 발효대사를 진행하여 젖산과 같은 다양한 유기산을 만들고 치아표면의 칼슘을 제거함으로써 유발된다. 상기 플라크는, 침 속에 있는 단백질이 치아에 얇은 막을 형성하고, 그 위에 연쇄상구균의 일종인 스트렙토코쿠스 소브리누스(Streptococcus sobrinus)균 및 스트렙토코쿠스 무탄스(Sterptococcus mutans)가 순서대로 부착해 바이오 필름(biofilm)을 형성함으로써 만들어지고, 푸조박테리움(Fusobacterium)에 의해 더욱 두꺼워진다.

또한, 이러한 플라크는 치아표면에 기계적으로 축적되면서 주변에 존재하는 세균들의 서식처가 되고, 이러한 서식처에는 점차 호기성, 통기성, 그람 양성세균 등의 미생물들이 증식하게 되면서, 치아표면에 유기산을 축적 시키게 되어 치아 에나멜층이 파괴된다. 일단 치아표면의 에나멜층이 유기산에 의해 파괴되면 그 아래의 치아층도 미생물이 분비한 단백질 분해효소에 의해 파괴되고 결국 치아우식증이 유발된다.

치주질환은 치주조직의 염증과 구조의 소실을 야기시키는 질환으로서, 풍치라고도 불린다. 구체적으로, 치주질환은 치아를 떠받들고 있는 치아주위의 조직에 염증이 생기는 질환으로서, 임상적으로 치은출혈(gingival bleeding), 종창(swelling), 및 치주낭(periodontal pocket)의 형성 및 치조골의 파괴 등으로 치아의 상실을 가져오게 된다.

이러한 치주질환의 주요 원인 또한 플라크(plaque)로서, 이러한 플라크가 치주낭 내에 기계적으로 축적되면 주변에 존재하는 세균들의 서식처가 되며, 이러한 서식은 점차 호기성, 통기성, 그람 양성세균으로 점차 이행되어, 치주낭의 심부로 증식되게 된다. 이때 함께 증식된 혐기성 그람음성 세균의 독소 및 모든 산물은 직접 조직을 파괴하거나 면역계를 자극하여, 자극된 면역계에서부터 여러가지 작용에 의한 치주조직 파괴와 더불어 염증을 유발하게 된다.

최근 연구보고에 의하면, 치아 질병의 주요 원인인 플라크의 형성은 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Sterptococcus mutans)와 같은 연쇄상구균(streptococci)이 만들어내는 불용성 글루칸(glucan)으로 구성된 바이오 필름(biofilm)의 형성으로부터 시작되고, 이러한 불용성 글루칸의 합성을 억제할 경우 결과적으로 플라크 형성을 억제할 수 있는 것으로 보고 되고 있다.

이처럼, 플라크 형성에 핵심적인 역할을 하는 불용성 글루칸은 세균의 세포 외부에 다당류를 생성하는 효소인 글루코실트랜스퍼라이제(glucosyltransferase)의 활성에 의해 나타난다. 글루코실트랜스퍼라이제는 세포외부에서 작용하는 분비 효소로써 세포외부에서 환경에 존재하는 당물질로부터 수용성 혹은 불용성 글루칸을 형성한다.

이러한 불용성 글루칸이 지속적으로 축적되어 필름 형태의 얇은 막으로 형성되는 바이오 필름은, 세균이 치아에 부착되거나 세균들 간의 응괴(凝塊)에 큰 도움을 주어 결과적으로 치태를 형성시키는 바, 치아우식 및 치주질환 등의 구강질병 유발에 크게 영향을 미친다. 또한, 세균 응괴(凝塊) 형태로 형성된 바이오 필름은 치아 부착 이외에도 식도 등을 따라 몸 전체로 전이되어 심혈관계 질환 및 체내 염증성 질병을 유발하는 것으로 알려져 있다.

여기서 글루코실트랜스퍼라이제를 분비하는 세균 중 하나인 스트렙토코쿠스 뮤탄스는 연쇄상구균 중에서도 가장 많은 7개의 글루코실트랜스퍼라이제 유전자를 가지고 있기 때문에 스트렙토코쿠스 뮤탄스는 인간과 동물에서 치아우식 및 치주질활의 주요 원인균으로 간주되고 있다.

이처럼, 연쇄상구균이 갖는 글루코실트랜스퍼라이제 중에서 불용성 글루칸을 형성하는 효소를 크게 글루칸수크레이즈(glucansucrase) 및 프룩탄수크레이즈(fructansucrase)로 분류하며 글루칸수크레이즈는 바이오 필름 형성 초기에 작용하며 pH 7의 중성 환경에 가장 높은 활성을 보인다. 반면, 프룩탄수크레이즈는 바이오 필름 형성 중기 이후부터 작용하며 pH 6~5의 산성 환경에서 높은 활성을 나타낸다. 이렇게 생성된 바이오 필름이 기계적으로 축적된 상태를 플라크라 하며 플라크가 생성된 부위는 산성 환경이 조성되어 치아우식 및 치주질환 등의 질병이 유발되게 된다.

한편, 최근에는 글루코실트랜스퍼라이제 활성을 억제하는 물질개발에 대한 연구가 다양하게 시도되고 있다. 예를 들면, 아스페르질루스 테레우스(Aspergillus terreus)의 배양액에서 분리된 뮤타스테인(mutastein)은 항세균 작용은 없지만 스트렙토코쿠스 뮤탄스의 글루코실트랜스퍼라이제 활성을 억제하여 불용성 글루칸의 합성과 부착을 억제한다는 보고가 있다.

또한, 치아우식증 및 치주질환을 예방하기 위해서 구강내 세균을 효과적으로 제거하면서 부작용 없이 안전하게 사용할 수 있는 천연추출물에 관한 연구가 활발하게 이루어지고 있는데, 이는 생약제제들이 이미 민간에서 다양한 목적으로 오래 전부터 사용되어 상대적으로 생체에 대한 안정성이 검증되었기 때문이다.

치아우식증 및 치주질환의 주원인균인 스트렙토코쿠스 뮤탄스에 대한 항균 작용을 나타내는 생약 추출물질로서, 파고자, 자몽씨, 결명자, 당귀, 계피, 프로폴리스, 해조류, 코코아 및 손바닥 선인장 등이 보고 되고 있다.

또한 녹차, 홍차, 오룡차, 마, 및 꿀풀 등의 추출물로부터 분획된 폴리페놀(polyphenol)이 스트렙토코쿠스 뮤탄스의 글루코실트랜스퍼라이제 형성억제 활성 효능을 가지고 있는 것으로 보고 되고 있다.

이처럼 치아우식증 및 치주질환에 효과를 나타내는 천연물 소재에서 추출된 항균성 및 효소 형성억제 활성 물질의 관심도가 높아지는 최근 추세에 따라, 이들 천연물소재를 이용한 구강질환 유발균 및 효소의 형성억제 활성 소재 개발의 필요성이 높아지고 있다.

그러나, 치아우식증 및 치주질환에 효과를 나타내는 종래의 천연추출물은 항균성만을 발휘하거나 또는 바이오 필름을 생성시키는 효소의 형성억제 활성만을 발휘하므로, 구강질환 중 일부 질환의 예방 및 치료에만 국한되어 사용될 수 밖에 없는 문제가 있었고, 다양한 천연물 소재들의 약리활성이 보고되어 있지만 아직 구강질환 유발균에 대한 항균성과 바이오 필름 유발요소인 글루코실트랜스퍼라이제에 대한 형성억제 활성을 동시에 가지는 약리활성에 대한 보고와 연구는 전무한 상태이다.

따라서, 구강질환 유발세균에 대한 항균성과 바이오 필름 유발 효소에 대한 형성억제 활성을 동시에 지닌 천연물 소재 개발의 필요성이 높은 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점과 과거로부터 요청되어온 기술적 과제를 해결하는 것을 목적으로 한다.

본 출원의 발명자들은 심도 깊은 연구와 다양한 실험을 거듭한 끝에, 이후 설명하는 천연추출물은, 소정 농도에서 구강질환 유발균주인 스트렙토코쿠스 뮤탄스에 대한 생장억제 활성과 바이오 필름 형성 활성을 지닌 글루코실트랜스퍼라이제(glucosyltransferase)에 대한 형성억제 활성을 동시에 나타내므로, 구강질환의 원인이 되는 플라크를 생성 단계에서 효율적으로 억제할 수 있을 뿐 아니라 치아우식증 및 치주질환 등 구강질환의 예방 및 치료가 가능함을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명에 따른 천연추출물은, 천연물 소재로부터 분리한 구강 병원균에 대한 항균성과 항바이오 필름(antibiofilm) 활성을 지닌 천연 추출물로서, 구체적으로 스트렙토코쿠스 뮤탄스에 대한 생장억제 활성과 다당류를 생성하는 효소들에 대한 형성억제 활성을 동시에 나타내는 것을 특징으로 한다.

상기 천연추출물은 자연계에서 얻어지는 식물, 동물, 광물 및 미생물과 이들의 대사산물을 추출 등의 공정을 이용하여 그 본질을 변화시키지 않은 상태로 얻어진 추출 물질을 말한다.

천연추출물은, 상기한 천연물 소재를 물 또는 알코올에 넣고 가열하여 추출물을 얻고, 상기 추출물을 농축함으로써 제조될 수 있다.

예를 들어, 건조된 상기 측백나무의 천연물 소재 150 g 정도를 추출병에 넣고 증류수를 부어 80 ~ 121℃의 온도로 5시간 3회 정도 추출하거나, 또는 건조 천연물 소재 150 g을 95 ~ 99% 농도의 에탄올 또는 메탄올에 1 ~ 15배의 부피량으로 넣고 냉각콘덴서가 부착된 추출기에서 70 ~ 80℃로 12시간 정도 가열하여 추출하고, 이러한 추출액을 다시 감압 여과한 후, 고형분을 제거하고 여액을 냉각콘덴서가 달린 농축장치에서 바람직하게는 50 ~ 90 brix로 감압 농축한 후 동결 건조시킴으로써 제조될 수 있다.

하나의 구체적인 예에서, 상기 천연추출물은 측백나무, 흑삼릉, 감태나무, 애기괭이눈, 독활, 애기똥풀 및 동백나무로 이루어진 군에서 선택되는 천연물 소재로부터 분리되는 것일 수 있다.

상기 측백나무(thuja orientalis L)는 측백나무과에 속하는 상록침엽교목으로서 높이 25m, 지름 1m에 달하지만 관목상에 속하며, 작은 가지가 수직으로 벌어지는데, 이와 같이 가지가 수직으로 발달하므로 측백이라는 이름으로 불린다. 한방에서는 잎과 열매를 약재로 사용하는데, 잎의 약성은 양(凉)하고 신미고(辛微苦)하며, 지혈, 양혈, 수렴, 이뇨의 작용을 하여 토혈, 혈변, 대장염, 이질, 고혈압 등의 증상에 사용된다. 열매는 약성이 감(甘)하고 평(平)하며, 자양(滋養), 진정, 윤장(潤腸)의 효능이 있어 신경쇠약, 불면, 심계항진(心悸亢進), 신체허약, 변비 등의 치료제로 쓰인다.

또한, 흑삼릉(Sparganium stoloniferum)은 흑삼릉과의 여러살이풀로서, 연못가와 도랑에서 자라는데, 뿌리줄기가 옆으로 뻗으며 군데군데에서 줄기가 나온다. 뿌리, 줄기는 소종, 통경제, 최유제로 사용하는데, 흑삼릉의 덩이뿌리를 말린 한국약재인 삼릉(三稜)은 향이 없고 담담한 맛이지만 씹으면 약간 쏘며 아린 맛이 있다. 삼릉은 기를 보호하여 기의 흐름을 강하게 해주고 어혈을 없애는 작용이 있어 산후 어혈복통, 월경부조, 월경통, 월경폐색불통, 징가, 적취 등에 사용되며, 음식의 소화가 잘 안되는 식적을 제거시키는 작용도 있다. 약리작용으로 자궁외임신에 대한 유효성, 악성종양인 원발성간암에 대한 효과, 위암, 간암, 식도암, 자궁경부암, 유선암, 직장암, 폐암 등의 호전반응, 뇌혈전, 뇌전색, 뇌일혈로 인한 반신불수에 유효성을 보였고, 관상동맥질환의 심교통증 개선작용, 충수돌기 주위에도 효력을 나타냈다는 것이 알려져 있다.

또한, 상기 감태나무는 산기슭의 양지에 자라는 녹나무과에 속하는 낙옆관목으로 간자목 또는 백동백이라고도 한다. 한국본초도감에 의하면, “산호초(山胡椒)는 녹나무과의 갈잎떨기나무 감태나무(Lindera glauca Blume)의 열매이다. 맛은 맵고 성질은 따뜻하며, 효능은 중풍으로 말 못하는데 및 심복냉통에 사용한다. 중풍으로 갑자기 말을 못하는 증상에는 물에 넣고 달여서 복용하고 복부가 차서 일어나는 통증을 해소시킨다.”라고 기록되어 있다. 따라서, 민간에서는 풍습으로 인한 저림증, 마비, 관절통 및 근육통의 치료, 심복냉통의 치료, 외상출혈, 감기, 두통, 발혈, 악창 종독의 치료에 사용된다.

또한, 상기 애기괭이눈(Shrysosplenium flagelliferum F. Schmidt)은 범의귀과의 쌍떡잎식물이며, 산지의 습한 바위틈에서 자란다. 줄기는 5 ~ 15cm이며 긴털을 갖고, 밑부분에서 가는 기는줄기를 이용해 옆으로 뻗고, 땅에 닫는 부분에 뿌리가 내리고 새싹이 돋는다. 뿌리에서 나온 잎은 자루가 길고 뭉쳐나고 톱니가 있으며, 겉에는 털이 있다. 줄기에서 나온 잎은 어긋나있으며 길이 3 ~ 4mm, 폭 4 ~ 12mm의 부채꼴로 가장 자리에 5 ~ 7개의 털이 있다. 꽃은 4 ~ 5월 노란빛이 도는 연한 녹색으로 피고 줄기 끝에 모여 달린다. 꽃받침은 4개로 갈라지고 수평으로 벌어지며, 갈라진 조각은 타원 모양으로 길이가 1 ~ 2mm이다. 꽃잎은 없고, 수술은 8개이며 꽃받침 보다 짧고, 꽃밥은 노란색이며 암술은 1개이다. 열매는 삭과이고 2개로 얕게 갈라지며 노란색이다. 종자의 길이는 0.6mm의 달걀 모양이고 1개의 모가 난 줄이 있으며 전체에 작은 돌기가 있다. 관상용으로 주로 사용되고, 일부 지역에서는 식용으로 사용한다. 한방에서는 ‘금전고엽초’라고 하며 해독과 종기의 염증에 짓찧어서 붙이는 방법으로 사용한다.

또한, 상기 독활(Aralia continentalis)은 두릅나무과의 여러해살이풀로 땅두릅이라고도 하고 바람에 움직이지 않는다는 뜻으로 독활(獨活)이라고 불린다. 산에서 자라며, 높이는 1.5m이고 꽃을 제외한 전체에 털이 약간 있다. 잎은 어긋나고 길이 50 ~ 100cm, 너비 3 ~ 20cm이며 홀수 2회 깃꼴?입으로서 어릴 때에는 연한 갈색 털이 있다. 작은 잎은 달걀모양 또는 타원형이고 가장자리에 톱니가 있다. 잎 표면은 녹색이고 뒷면은 흰빛이 돌며 잎자루 밑부분 양쪽에 작은 떡잎이 있다. 꽃은 7월 내지 8월에 크고 연한 녹색으로 피고 원추꽃차례가 자라며 총상(總狀)으로 갈라진 가지 끝에 산형꽃차례로 달린 양성화이다. 열매는 장과로 9월 내지 10월에 검게 익는다. 이른봄 어린 순은 식용하며, 가을에 잎이 죽은 다음 흙을 덮어서 어린 순이 길게 자랄 수 있도록 한다. 뿌리는 약용하는데, 거풍승습(祛風勝濕), 통비지통(痛痺止痛), 진통 (鎭痛), 진정(鎭靜), 혈관수축(血管收縮) 등에 효능이 있다.

또한, 상기 애기똥풀(백굴채, Chelidonium majus var. asiaticum Ohwi)은 양귀비과 식물이며, 동아시아 지역에 널리 분포하는 두해살이풀로서 까치다리라고도 한다. 곧은 뿌리는 굵고 등황색이며 원줄기는 높이 30 ~ 80cm이다. 잎과 더불어 분백색이 돌고 상처를 내면 등활색 즙액이 나오기 때문에 애기똥풀이라고 한다. 잎은 어긋나고 1 ~ 2회 우상(羽狀)으로 갈라지며 끝이 둔하고 가장자리에 둔한 톱니와 더불어 결각이 있다. 꽃은 5월부터 8월까지 피고 황색이며 가지끝에서 자란 산형꽃차례에 달린다. 삭과는 원추형이며 길이 3 ~ 4cm이다. 한방에서는 전초를 백굴채라고 하여 쓰는데, 유액에 켈리도닌(Chelidonine), 프로토핀(Protopine), 호모켈리도닌(Hemochelidonine) 등의 알칼로이드가 함유되어 있다. 백굴채는 진통(鎭痛), 鎭咳(진해), 利尿(이뇨), 解毒(해독), 소종(消腫), 중추신경억제(中樞神經抑制), 항종(抗腫), 혈압강하(血壓降下), 항균(抗菌), 관상동맥확장(冠狀動脈擴張) 등에 효능이 알려져 있다.

또한, 상기 동백나무(Camellia japonica)는 차나무과에 속하며 상목교목이며, 겨울부터 이른 봄까지 꽃이 피고 종실은 10월 말경에 수확되며 한 개 과에 3 ~ 5개의 씨앗이 들어있다. 잎은 어긋나며 타원형 또는 긴 타원형이고 가장자리에 물결모양의 잔 톱니가 있다. 표면은 짙은 녹색으로 윤이 나고 뒷면은 황록색으로 털이 없고 두껍다. 원산지는 아시아 지방으로 약 200여종의 분포되어 있는 것으로 보고되고 있다. 한국에서는 그 중 1종(Camellia japonica L.)이 자생분포하고 있으며 비교적 추운 곳에 분포하여 있는 동백종으로 유전자원식물로서 중요성이 강조되고 있다. 또한 약리적 효과로 동백나무 잎은 건선(乾癬), 인후통(咽喉痛), 화상(火傷)에 효능이 있고, 가지와 열매는 머리비듬, 보혈(補血), 비출혈(鼻出血), 어혈(瘀血), 연골증(軟骨症), 월경이상(月經異常), 이뇨(利尿), 인후통(咽喉痛), 장출혈(腸出血), 종독(腫毒), 출혈(出血), 타박상(打撲傷), 토혈(吐血)과 각혈(?血), 행혈(行血), 화상(火傷)에 효능이 있다고 알려진다. 동백에 대한 연구로는 일본의 경우 산차(山茶)라 하여 꽃 말린 것으로 민간에서 토혈증(hematemesis)에 사용한다는 보고가 있으며, 알코올 흡수억제 등이 보고되고 있다. 동백에서 camellin L-pi-pecolic acid 및 eugenol 등의 화합물을 분리 확인한 바 있다. 한편, 국내에서는 동백나무의 항균효과와 관련한 연구는 동백나무 꽃잎과 잎의 항균효과가 보고되어 있다.

하나의 구체적인 예에서, 구체적으로 상기 천연물 소재는 측백나무의 잎, 열매 또는 줄기일 수 있고, 흑삼릉의 전초일 수 있으며, 감태나무의 줄기 또는 잎일 수 있고, 애기괭이눈의 전초이며, 독활 전초이고, 애기똥풀 전초이며, 동백나무의 잎일 수 있다.

상기 스트렙토코쿠스 뮤탄스의 생장억제 활성은 천연추출물의 첨가군과 무첨가군의 스트렙토코쿠스 뮤탄스의 세포 성장 정도를 비교한 상대치로 산정하고, 상기 다당류를 생성하는 효소들에 대한 형성억제 활성은 다당류를 생성하는 효소들 중 글루코실트랜스퍼라이제에 의해 자당이 불용성 글루칸으로 합성되는 정도를 천연추출물의 첨가군과 무첨가군을 비교한 상대치로 산정하였다.

하나의 구체적인 예에서, 상기 스트렙토코쿠스 뮤탄스에 대해 50% 이상의 생장억제 활성과 상기 다당류를 생성하는 효소들 중 글루코실트랜스퍼라이제(glucosyltransferase)에 대해 50% 이상의 형성억제 활성을 동시에 갖기 위한 측백나무의 잎, 열매 또는 줄기 추출물의 함량은, 최소 300 ㎍/㎖ 이상이다.

또한, 상기 스트렙토코쿠스 뮤탄스에 대해 50% 이상의 생장억제 활성과 글루코실트랜스퍼라이제에 대해 50% 이상의 형성억제 활성을 동시에 갖기 위한 감태나무의 줄기 또는 잎 추출물의 함량은, 최소 500 ㎍/㎖ 이상이다.

또한, 상기 스트렙토코쿠스 뮤탄스에 대해 50% 이상의 생장억제 활성과 글루코실트랜스퍼라이제에 대해 50% 이상의 형성억제 활성을 동시에 갖기 위한 애기괭이눈의 전초 추출물의 함량은, 최소 500 ㎍/㎖ 이상이다.

또한, 상기 스트렙토코쿠스 뮤탄스에 대해 50% 이상의 생장억제 활성과 글루코실트랜스퍼라이제에 대해 50% 이상의 형성억제 활성을 동시에 갖기 위한 독활 전초 추출물의 함량은, 최소 1000 ㎍/㎖ 이상이다.

또한, 상기 스트렙토코쿠스 뮤탄스에 대해 50% 이상의 생장억제 활성과 글루코실트랜스퍼라이제에 대해 50% 이상의 형성억제 활성을 동시에 갖기 위한 애기똥풀 전초 추출물의 함량은, 최소 300 ㎍/㎖ 이상이다.

또한, 상기 스트렙토코쿠스 뮤탄스에 대해 50% 이상의 생장억제 활성과 글루코실트랜스퍼라이제에 대해 50% 이상의 형성억제 활성을 동시에 갖기 위한 동백나무의 잎 추출물의 함량은, 최소 300 ㎍/㎖ 이상이다.

또한, 상기 흑삼릉의 추출물은 스트렙토코쿠스 뮤탄스에 대해 50% 이상의 생장억제 활성과 상기 다당류를 생성하는 효소들 중 글루코실트랜스퍼라이제에 대해 형성억제 활성을 동시에 나타내기 위해 추출물의 함량이 100 ㎍/㎖ 이상이다.

글루코실트랜스퍼라이제의 형성억제 활성의 효과는 상기 천연물이 갖는 폴리페놀물질에 의해 나타나는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 출원의 발명자들은 글루코실트랜스퍼라이제의 형성억제 활성을 나타내는 최소 폴리페놀물질의 함량을 밝혀내었다.

상기 측백나무의 잎, 열매 또는 줄기의 폴리페놀 함량은, 갈산(gallic acid)에 의한 검량곡선을 이용하여 건조시료 1g 당 ㎍ 함량(㎍ GAE/g)으로 계산할 때, 395.27±24.39 ㎍ GAE/g 이상이고, 플라보노이드 함량은 루틴(rutin)에 의한 검량곡선을 이용하여 건조시료 1g 당 ㎍ 함량(㎍ RE/g)으로 계산하면 250.14±18.26 ㎍ RE/g 이상이며, 측백나무의 잎, 열매 또는 줄기의 추출물 함량이 1 ㎎/㎖이상일 때, DPPH(2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl hydrate) 라디칼 소거 활성은 96.76 ± 0.59% 이상이고, 아질산염 라디칼 소거 활성은 90.44 ± 1.18% 이상이다.

또한, 흑삼릉 전초의 폴리페놀 함량은, 갈산에 의한 검량곡선을 이용하여 건조시료 1g 당 ㎍ 함량(㎍ GAE/g)으로 계산할 때, 151.62±13.57 ㎍ GAE/g 이상이고, 플라보노이드 함량은 루틴에 의한 검량곡선을 이용하여 건조시료 1g 당 ㎍ 함량(㎍ RE/g)으로 계산하면 61.01±3.62 ㎍ RE/g 이상이며, 흑삼릉 전초의 추출물 함량이 1 ㎎/㎖이상일 때, DPPH(2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl hydrate) 라디칼 소거 활성은 83.74±1.06% 이상이고, 아질산염 라디칼 소거 활성은 60.29±4.12% 이상이다.

또한, 상기 감태나무의 줄기 또는 잎의 폴리페놀 함량은, 갈산에 의한 검량곡선을 이용하여 건조시료 1g 당 ㎍ 함량(㎍ GAE/g)으로 계산할 때, 189.70±4.33 ㎍ GAE/g 이상이고, 플라보노이드 함량은 루틴에 의한 검량곡선을 이용하여 건조시료 1g 당 ㎍ 함량(㎍ RE/g)으로 계산하면 67.50±1.45 ㎍ RE/g 이상이며, 감태나무의 줄기 또는 잎의 추출물 함량이 1 ㎎/㎖이상일 때, DPPH(2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl hydrate) 라디칼 소거 활성은 81.12±0.80% 이상이고, 아질산염 라디칼 소거 활성은 67.64±7.06% 이상이다.

또한, 상기 애기괭이눈 전초의 폴리페놀 함량은, 갈산에 의한 검량곡선을 이용하여 건조시료 1g 당 ㎍ 함량(㎍ GAE/g))으로 계산할 때, 88.51±3.42 ㎍ GAE/g 이상이고, 플라보노이드 함량은 루틴에 의한 검량곡선을 이용하여 건조시료 1g 당 ㎍ 함량(㎍ RE/g)으로 계산하면 39.74±2.60 ㎍ RE/g 이상이며, 애기괭이눈 전초의 추출물 함량이 1 ㎎/㎖이상일 때, DPPH(2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl hydrate) 라디칼 소거 활성은 68.5±0.92% 이상이고, 아질산염 라디칼 소거 활성은 79.01±0.61% 이상이다.

또한, 상기 독활 전초의 폴리페놀 함량은, 갈산에 의한 검량곡선을 이용하여 건조시료 1g 당 ㎍ 함량(㎍ GAE/g)으로 계산할 때, 78.49±2.14 ㎍ GAE/g 이고, 플라보노이드 함량은 루틴에 의한 검량곡선을 이용하여 건조시료 1g 당 ㎍ 함량(㎍ RE/g)으로 계산하면 18.56±1.45 ㎍ RE/g 이상이며, 독활 전초의 추출물 함량이 1 ㎎/㎖이상일 때, DPPH(2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl hydrate) 라디칼 소거 활성은 4.61±0.53% 이상이고, 아질산염 라디칼 소거 활성은 83.82±3.53% 이상이다.

또한, 상기 애기똥풀 전초의 폴리페놀 함량은, 갈산에 의한 검량곡선을 이용하여 건조시료 1g 당 ㎍ 함량(㎍ GAE/g)으로 계산할 때, 101.16±25.69 ㎍ GAE/g 이상이고, 플라보노이드 함량은 루틴에 의한 검량곡선을 이용하여 건조시료 1g 당 ㎍ 함량(㎍ RE/g)으로 계산하면 30.01±1.36 ㎍ RE/g 이상이며, 애기똥풀 전초의 추출물 함량이 1 ㎎/㎖이상일 때, DPPH(2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl hydrate) 라디칼 소거 활성은 10.56±3.10% 이상이고, 아질산염 라디칼 소거 활성은 84.36±2.75% 이상이다.

또한, 상기 동백나무의 잎의 폴리페놀 함량은, 갈산에 의한 검량곡선을 이용하여 건조시료 1g 당 ㎍ 함량(㎍ GAE/g)으로 계산할 때, 455.47±37.08 ㎍ GAE/g 이상이고, 플라보노이드 함량은 루틴에 의한 검량곡선을 이용하여 건조시료 1g 당 ㎍ 함량(㎍ RE/g)으로 계산하면 135.20±4.82 ㎍ RE/g 이상이며, 동백나무의 잎의 추출물 함량이 1 ㎎/㎖이상일 때, DPPH(2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl hydrate) 라디칼 소거 활성은 92.79±0.31% 이상이고, 아질산염 라디칼 소거 활성은 93.08±2.40% 이상이다.

상기 생장억제 활성과 형성억제 활성은 구강질환 예방 및 치료용 항균물질의 유효성을 나타내는 항균성 및 효소형성의 억제능을 판단하기 위한 척도로서, 식물추출물의 경우, 단일물질이 아닌 혼합물질로써 50% 이상의 세균 생장억제력 및 50% 이상의 효소 형성억제력이 확인될 때 항균성 및 효소형성 억제능이 있는 것으로 판단한다.

하나의 구체적인 예에서, 상기 천연추출물은 특정한 제형에 한정됨이 없이 의약품으로 사용될 수 있고, 상기 구강질환 예방 및 치료제의 유효성분으로 상기 천연추출물을 포함하고 있는 약제 제형으로 제조될 수 있다.

비제한적인 예로서, 상기 약제 제형은 액상치약, 구강청정제, 구강용 스프레이, 구강용 티슈 제형, 구강용 연고제 또는 구강용 바니쉬인 등의 형태로 제조될 수 있다.

이러한 약제 제형의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있는바 본 발명에 합체되며, 본 명세서에서는 이에 대한 설명을 생략한다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 천연추출물은 소정 농도에서 구강질환 유발균주인 스트렙토코쿠스 뮤탄스에 대한 생장억제 활성과 다당류를 생성하는 효소들 중 바이오 필름 형성 활성을 지닌 글루코실트랜스퍼라이제(glucosyltransferase)에 대한 형성억제 활성을 동시에 나타내므로, 이를 유효성분으로 포함하는 의약품은 치아우식증 및 치주질환 등의 구강질환을 예방 및 치료할 수 있는 효과가 있다.

특히, 본 발명에 따른 천연추출물을 치약, 구강청정제 등으로 사용하는 경우, 스트렙토코쿠스 뮤탄스의 생장과 글루코실트랜스퍼라이제의 활성을 억제하여 세균침전물인 치태의 형성을 효과적으로 예방할 수 있는 효과가 있다.

또한, 본 발명에 따른 천연추출물은 안전성이 입증된 천연물을 유효성분으로 사용하므로, 부작용이 극히 적은 장점이 있다.

도 1은 본 발명의 실시예 1 내지 7에 따른 천연추출물들의 농도에 따른 글루코실트랜스퍼라이제 활성도(%) 그래프이다;
도 2는 본 발명의 실시예 1 내지 7에 따른 천연추출물들의 글루코실트랜스퍼라이제 형성억제 활성 평가를 위해 자당으로부터 합성된 불용성 글루칸 형성 결과를 보여주는 사진이다;
도 3은 본 발명의 실시예 1 내지 7에 따른 천연추출물들의 농도에 따른 스트렙토코쿠스 뮤탄스의 성장 정도를 보여주는 흡광도 그래프이다;
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 천연추출물들의 스트렙토코쿠스 뮤탄스의 생장억제 활성 확인을 위한 디스크 확산 시험결과를 보여주는 사진이다.

이하, 본 발명의 실시예를 참조하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범주가 이들만으로 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

건조된 측백나무의 잎, 열매 또는 줄기 150g을 분쇄하여 99% 농도의 메탄올을 10배의 부피량으로 넣어 90℃의 온도로 12시간 반응시켜 액체층만을 회수하여 추출하였다. 추출액은 다시 워터만 종이 여과지로 감압 여과한 후, 남은 고형분을 제거하고 나머지 액을 냉각콘덴서가 달린 농축장치에서 감압 농축하여 동결 건조하여 농도 90 brix의 추출액을 제조하였다.

<실시예 2 내지 실시예 7>

천연물로 흑삼릉 전초, 감태나무의 줄기 또는 잎, 애기괭이눈 전초, 독활 전초, 애기똥풀 전초, 동백나무의 잎을 이용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 천연추출물을 제조하였다.

<실험예 1>

천연추출물의 농도에 따른 글루코실트랜스퍼라이제 활성도 평가

본 발명에 따른 실시예 1 내지 실시예 7에서 제조된 천연추출물을 이용하여 글루코실트랜스퍼라이제 형성억제 활성화를 갖는 천연추출물의 농도를 결정하기 위한 실험을 수행하였다. 여기서 효능판정은 50%이상의 형성억제 효능을 나타내는 농도를 최소 농도로 판정하였고, 이는 예방 및 치료목적으로 사용되기 위한 효소의 최소 형성억제 활성 농도이다.

실험 세균으로서 글루코실트랜스퍼라이제의 분리를 위해 사용된 균주는 스트렙토코쿠스 뮤탄스 KCTC3065(Streptococcus mutans, KCTC3065)이며, 뇌심장침출액(brain heart infusion) 배지(sheep brain and heart extract 37%)에 48시간 배양하여 OD_600nm에서 흡광도가 1.5 내지 1.8일 때 접종액으로 사용하였다. 1 L의 뇌심장침출액 배지에 접종액을 2% 접종하여 48시간 배양시킨 후 저온 원심분리기에서 4℃, 7500 x g에서 10분간 원심분리하여 균체를 제거하고, 0.22 ㎛의 필터를 이용하여 남아있는 균체를 완전히 제거하여 상등액만을 회수하였다. 회수된 상등액에서 효소를 분리하여 효소액으로 제조하기 위해 균체가 제거된 배양액에 황산암모늄을 50% 포화시켜 4℃에서 6시간 동안 침전시킨 뒤, 4℃의 저온 원심분리기에서 12,000 x g로 30분간 원심분리하여 침전물을 회수하였다. 이때 회수된 침전물을 50mM 인산완충용액(pH 6.8)에 현탁시킨 다음 동일 용액에 투석막을 이용하여 6시간씩 4회 투석하였고, 투석이 완료된 효소액을 영하 20℃ 냉동고에 보관하였다.

그리고, 2% 자당을 포함하는 10mM 인산완충 용액(pH 6.8) 800㎕에 실시예 1 내지 실시예 7에 따른 천연추출물들을 100, 300, 500, 및 1000㎍/㎖의 농도로 처리하고, 여기에 분리된 효소액 100㎕를 혼합하며, 다시 10mM 인산완충 용액을 이용하여 최종 용량이 1㎖인 효소 반응액을 제조하였다. 효소반응을 37℃, 1.5 ㎖ 마이크로 튜브에서 18시간 동안 반응시켜 불용성 글루칸의 형성을 유도하였다. 반응을 마친 시료는 4℃의 저온 원심분리기에서 12,000 x g로 원심분리한 후 상층액을 제거하고 10mM 인산완충 용액(pH 6.8)으로 2회 씻어낸 뒤 마이크로 튜브 벽면에 부착되어 회수되지 않는 불용성 글루칸의 회수를 위해 10 mM 인산완충 용액(pH 6.8) 1 ㎖을 첨가하고 초음파 세척기에 1시간 동안 수중 파쇄하였다. 불용성 글루칸의 형성정도는 550 nm에서 흡광도를 측정하여 자당 무첨가군과 비교한 상대치로 불용성 글루칸의 형성억제 정도를 확인하였고, 실험은 3회 반복 실험을 통해 각 처리 구의 평균과 표준편차를 산출하고 분산분석을 수행하여 처리구간의 유의성을 확인하고 p. value < 0.05 수준에서 던컨의 다중검정(Duncan's muliple range test)에 따라 분석하였다. 그 결과를 하기 표 1, 도 1 및 도 2에 나타내었다.

이 때, 천연 추출물의 글루코실트랜스퍼라이제 형성억제 정도를 알기 위해 천연 추출물이 무첨가된 대조군을 두어 실험하였고 대조군에서 자당의 약 85%가 불용성 글루칸으로 합성되었다.

글루코실트랜스퍼라이제의 불용성 글루칸 형성율(%)

추출물 농도 (㎍/㎖) 실험군	글루코실트랜스퍼라이제의 불용성 글루칸 형성율(%).
100	300	500	1000
실시예 1 (측백나무)	48.71 %	13.67 %	-	-
실시예 2 (흑삼릉)	65.63 %	64.59 %	62.63 %	60.59 %
실시예 3 (감태나무)	65.56 %	48.59 %	34.92 %	11.96 %
실시예 4 (애기괭이눈)	46.27 %	44.32 %	28.93 %	-
실시예 5 (독활)	64.59 %	60.43 %	54.82 %	29.18 %
실시예 6 (애기똥풀)	60.56 %	19.04 %	-	-
실시예 7 (동백나무)	36.99 %	20.63 %	6.47 %	-

상기 표 1을 참조하면, 글루칸의 형성억제 활성이 50% 이상을 나타내는 천연 추출물의 최소 형성억제 활성 농도는, 측백나무의 경우 300 ㎍/㎖ 이상, 감태나무의 경우, 500 ㎍/㎖ 이상, 애기괭이눈의 경우 500 ㎍/㎖ 이상, 독활은 1,000 ㎍/㎖ 이상, 애기똥풀은 300 ㎍/㎖ 이상, 동백나무는 300 ㎍/㎖ 이상임을 알 수 있다. 다만, 흑삼릉의 경우 1,000 ㎍/㎖ 미만의 농도에서는 글루칸의 형성억제 활성이 50% 이상을 나타내지는 않지만 흑삼릉의 농도가 높아질수록 글루칸의 형성억제 활성도가 비례하여 증가함을 알 수 있다.

최소 형성억제 활성 농도의 분석결과를 살펴보면, 실험에 사용한 천연추출물이 완전히 정제되지 않은 경우에도 매우 높은 형성억제 활성을 나타내고 있는 것을 알 수 있다. 따라서, 상기 천연추출물을 정제하여 사용하는 경우, 소량, 저농도의 천연추출물로도 높은 글루코실트랜스퍼라이제의 형성억제 효능을 가질 수 있음을 예측할 수 있다. 이는 상기 천연추출물을 포함하는 구강 위생제품 생산 시 적은 양을 첨가하더라도 효과적으로 구강질환 예방 및 치료 효과를 수 있음을 의미한다. 다만, 상기와 같이 얻어진 각 천연물소재의 추출물은 식물의 채취 시기, 서식 장소 등 식물의 성장환경에 따라 효능 함량이 달라질 수도 있다.

<실험예 2>

항균 활성 측정(MIC 테스트)

본 발명에 따른 실시예 1 내지 7에서 제조된 천연추출물을 이용하여 충치질환 유발세균의 생육저지 활성, 충치질환 유발세균에 대한 생장억제 활성농도를 결정하기 위한 MIC(minimum inhibitory concentration)실험을 진행하였다. 효능판정은 50%이상의 생장억제 효능을 나타내는 농도를 최소 농도로 판정하였다. 이는 예방 및 치료목적으로 사용되기 위한 세균의 최소 생장억제 활성 농도이다.

구체적으로, 본 실험에서는 동결 바이알(vial)로 분양 받은 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans KCTC3065)를 사용하였고, 스트렙토코쿠스 뮤탄스는 뇌ㆍ심장침출액배지(sheep brain and heart extract 37%)에 접종하여 37℃, 호기성 조건으로 20 내지 24시간 배양하였다. 각각의 실시예들의 구강질환 유발세균에 대한 생장억제 활성농도(㎍/㎖)을 결정하기 위해 각각의 농도별로 준비된 천연추출물을 액체배지에 첨가하고, 연속희석 방법(serial dilution method)을 통해 100, 300, 500, 및 1000 ㎍/㎖ 농도로 희석하여 멸균하였다. 첨가된 배지에 전 배양된 병원성 미생물을 분광광도계 OD_600nm에서 1×10⁶ cell/㎖가 되도록 접종하여 각 균의 성장조건에서 배양하였다. 배양 후 분광광도계를 이용하여 접종 시와 배양 종료후의 600 nm에서 흡광도를 측정하여 생장억제율(%)를 계산하고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

스트렙토코쿠스 뮤탄스에 대한 천연추출물 농도에 따른 생장억제율(%)

추출물 농도 (㎍/㎖) 실험군	스트렙토코쿠스 뮤탄스의 추출물 농도에 따른 생장억제율(%)
100	300	500	1000
실시예 1 (측백나무)	50.20	52.78	65.49	70.07
실시예 2 (흑삼릉)	93.68	93.68	96.91	99.39
실시예 3 (감태나무)	48.06	52.17	52.40	56.32
실시예 4 (애기괭이눈)	42.51	51.71	55.50	56.32
실시예 5 (독활)	12.92	35.47	55.98	83.41
실시예 6 (애기똥풀)	42.47	50.13	64.77	76.66
실시예 7 (동백나무)	27.77	52.36	67.60	74.96

상기 표 2를 참조하면, 측백나무 및 흑삼릉의 천연추출물의 경우 100 ㎍/㎖의 농도에서부터 약 50% 이상의 스트렙토코쿠스 뮤탄스의 생장 억제 효율을 나타냄을 알 수 있다. 특히 흑삼릉의 추출물인 경우에는 100 ㎍/㎖의 농도에서부터 93%이상의 억제 효율을 나타내고 있다.

또한, 감태나무, 애기괭이눈, 애기똥풀, 및 동백나무의 천연추출물을 300 ㎍/㎖ 이상의 농도를 첨가할 경우와 독활의 추출물을 500 ㎍/㎖ 이상의 농도를 첨가할 경우에도 스트렙토코쿠스 뮤탄스의 생장이 50% 이상으로 억제가 가능함을 알 수 있다.

표 2의 실험결과에 따르면, 실시예 1 내지 7의 추출물은 비교적 고농도에서 생장억제 활성을 나타내었지만, 실험에 사용한 시료가 완전히 정제되지 않은 추출물인 것을 감안하면, 실제로 종래의 공개된 연구결과의 천연 추출물보다 비교적 낮은 농도에서 실험한 것으로 볼 수 있는 바, 본원의 추출물을 보다 높은 순도로 정제할 경우에는 본 실험 결과보다 더 낮은 농도의 천연 추출물에서 생장억제 활성을 나타낼 것으로 예측된다. 따라서, 본원의 천연추출물을 이용하여 구강 위생제품을 생산할 경우, 낮은 농도에서도 구강질환 유발 세균의 생장을 효과적으로 억제할 수 있으므로 추출물을 적은 양으로 사용한 경우에도, 구강질환 예방 및 치료에 뛰어난 효과를 발휘할 수 있음을 의미한다.

본 실험 결과는 3회 반복 측정 후 시료군 간의 유의성을 검증하였다. 다만, 상기와 같이 얻어진 각 천연물소재의 추출물은 식물의 채취 시기, 서식 장소 등 식물의 성장 환경에 따라 효능 함량이 달라질 수도 있다.

<실험예 3>

항균 활성 확인을 위한 디스크 확산 시험

고체 상태 배지에서 항균 활성 정도를 알아보기 위하여 디스크 확산방법을 이용한 실험을 실시하였다. 디스크 확산 방법을 이용한 항균 활성 실험은 확산에 의한 물질이동에 따른 항균활성 검사 방법으로 상기 실험예 2의 방법에 비하여 약 10배 높은 농도로 실시 하였으며, 다만, 실시예 1 내지 7의 추출물 중, 확산이 잘 이루어지지 않는 물질인 경우, 실험예 2의 결과와 다른 항균 활성이 나타날 수 있다.

실험에 사용한 구강 병원성 미생물 스트렙토코쿠스 뮤탄스는 0.8 % 한천이 포함된 뇌ㆍ심장침출액배지(sheep brain and heart extract 37%)에 접종하여 37℃, 호기성 조건으로 20 내지 24시간 배양하여 고체배지 접종에 사용하였다. 제작된 고체배지에 배양된 병원성 미생물을 분광광도계 OD_600nm에서 측정하였을 때 1×10⁶ cell/㎖이 되도록 도말 하였다.

실시예 1 내지 7의 천연추출물들은 구강질환 유발세균에 대한 생장억제 활성농도(㎍/㎖)를 결정하기 위해 연속희석방법(serial dilution method)을 통해 100, 1000, 2000, 및 5000 ㎍/㎖ 농도로 희석하고 이를 멸균하여 준비하였다.

희석 멸균된 시료를 6 mm 종이 디스크에 각각 10 ㎕씩 첨가하여 상온에 약 10분간 건조하여 용매를 증발 시킨 후, 적당한 간격으로 병원성 미생물이 도말된 배지에 올려 37℃, 호기성 조건으로 24시간 배양하였다. 그 후 배양을 마친 고체배지에 성장이 억제되어 투명하게 형성된 생장억제환의 반지름의 크기를 측정하여 병원성 미생물의 항균 활성을 결정하였다.

실험은 3회 반복실험을 통해 각 처리 구의 생장억제환 크기 평균과 표준편차를 산출하고 분산분석을 수행하여 처리구간의 유의성을 확인하고 p. value < 0.05 수준에서 던컨의 다중검정(Duncan's multiple range test)에 따라 분석하였다. 그 결과를 하기 표 3 및 도 4에 나타내었다.

디스크 확산법을 이용한 천연추출물 농도에 따른 스트렙토코쿠스 뮤탄스의 항균 활성

추출물 농도 (㎍/㎖) 실험군	추출물 농도에 따른 스트렙토코쿠스 뮤탄스 생장억제환 크기(반지름 기준, 단위: mm)
100	1000	2000	5000
실시예 1 (측백나무)	-	4	5	8
실시예 2 (흑삼릉)	-	9	12	13
실시예 3 (감태나무)	-	-	4.5	5
실시예 4 (애기괭이눈)	4	5	5.5	6.5
실시예 5 (독활)	6.5	9	10	12
실시예 6 (애기똥풀)	-	-	9	14
실시예 7 (동백나무)	-	6	8	10

상기 표 3을 참조하면, 애기괭이눈 및 독활은 100 ㎍/㎖의 농도 이상에서, 측백나무, 흑삼릉 및 동백나무는 1000 ㎍/㎖ 농도 이상에서, 감태나무 및 애기똥풀은 2000 ㎍/㎖ 농도 이상에서 생장억제환이 형성된 것을 알 수 있다.

따라서, 본 실험예 3과 실험예 2의 결과를 종합적으로 분석할 경우, 항균활성물질의 확산 정도는 독활 > 애기괭이눈 > 흑삼릉 > 동백 > 측백나무 > 애기똥풀 > 감태나무 순서로 크다는 것을 예측할 수 있다.

<실험예 4>

총 폴리페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량 측정

상기 실시예 1 내지 7의 천연추출물을 이용하여 총 폴리페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량을 측정하였다. 폴리페놀은 항산화 효과 및 항균활성이 있어 식품이나 의료 등에 응용되는 주요 물질이며, 플라보노이드는 폴리페놀의 일종으로 항균성을 나타내는 물질로 알려져 있다.

총 폴리페놀 함량 측정을 위해 본 발명에 따른 실시예 1 내지 7의 천연 추출물을 농도 1 ㎎/㎖로 희석하고, 희석된 100 ㎕의 추출액에 10% Na₂CO₃ 100 ㎕를 적가한 후 상온에서 5분간 정치(定置)하였다.

상기 추출물 혼합액과 50% 폴리페놀(50% Folin-ciocalteau’s phenol)시약 100 ㎕을 혼합하여 반응시키고 상온조건의 암실에서 60분간 보관한 후 분광광도계를 이용하여 725 nm에서 흡광도를 측정하였다.

갈산(gallic acid)을 0 내지 1,000 ㎎/㎖의 농도로 제조하여 시료와 동일한 방법으로 분석하였고, 얻은 표준 검량선(상관계수 R²=0.9967, 유의수준 P<0.05)으로부터 시료추출물의 총 페놀 함량을 계산하였다.

또한, 추출물의 총 플라보노이드 함량을 측정하기 위해, 모레노(Moreno) 방법(Ref. Nieva Moreno 2000)에 따라 실시예 1 내지 7의 천연추출물(농도 1 ㎎/㎖) 100 ㎕에 10% 염화 알루미늄(aluminum chloride) 100 ㎕을 적가한 후 상온에서 5분간 정치한다. 이러한 추출물 혼합액에 1.0 M 초산 칼륨(potassium acetate) 100 ㎕을 혼합하여 반응시키고, 상온조건에서 40분간 보관한 후 분광광도계를 이용하여 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 루틴(rutin)을 표준물질로 하여 0 내지 1,000 ㎎/㎖의 농도범위에서 얻어진 표준 검량선(상관계수 R²=0.9892, 유의수준 P<0.05)으로부터 추출물의 총 플라보노이드 함량을 계산하였다.

성분의 함량은 식품의약안정청의 권고 사안에 따라 표준 시료인 갈산(gallic acid)과 루틴(rutin)으로부터 작성된 검량 곡선을 이용하여 건조시료 1g 당 ㎍ 함량으로 표시하였고, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량

	총 폴리페놀 함량 (㎍ GAE/g)	총 플라보노이드 함량 (㎍ RE/g)
실시예 1 (측백나무)	395.27 ± 24.39	250.14 ± 18.26
실시예 2 (흑삼릉)	151.62 ± 13.57	61.01 ± 3.62
실시예 3 (감태나무)	189.70 ± 4.33	67.50 ± 10.45
실시예 4 (애기괭이눈)	88.51 ± 3.42	39.74 ± 2.60
실시예 5 (독활)	78.49 ± 2.41	18.56 ± 1.45
실시예 6 (애기똥풀)	101.16 ± 25.69	30.01 ± 1.36
실시예 7 (동백나무)	455.47 ± 37.08	135.20 ± 4.82

상기 표 4를 참조하면, 본 발명에 따른 동백나무의 추출물에서 가장 많은 폴리페놀 함유량을 갖은 것으로 알 수 있고, 총 플라보노이드의 함량은 측백나무에서 가장 많은 함유량을 갖는 것을 알 수 있다.

따라서, 측백나무 및 동백나무의 추출물이 다른 천연추출물보다 항산화 소재로서 더욱 바람직함을 확인할 수 있었다.

실험 결과는 3회 반복 측정 후 평균±표준편차로 나타내었으며, 시료군 간의 유의성을 검증한 후 p<0.05 수준에서 던컨의 다중검정(Duncan's multiple range test)에 따라 분석하였다. 다만, 상기와 같이 얻어진 각 천연물소재의 추출물은 식물의 채취 시기, 서식 장소 등 식물의 성장 환경에 따라 효능 함량이 달라질 수도 있다.

<실험예 5>

항산화 활성 평가 및 아질산염 소거 활성 평가

실시예 1 내지 7에서 제조된 천연추출물을 이용하여, 활성 산소종의 활성 저해 효능 확인을 위한 자유라디칼 소거 활성측정을 위해 DPPH 항산화 활성 테스트를 수행하였다.

DPPH 라디칼 소거능 측정은 본 발명에 따른 실시예 1 내지 실시에 7의 천연추출물을 희석하여 1 ㎎/㎖ 농도의 시료 100 ㎕와 0.2 mM DPPH(2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl hydrate) 100 ㎕를 혼합하여 상온의 암실에서 15분간 반응시킨 후 분광광도계를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였고, 천연 추출물 첨가 시료와 무첨가 시료 사이의 흡광도 차이를 백분율로 나타내었으며, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

또한, 치주질환 염증 치료 효과를 확인하기 위해 항산화 소재로서의 활용 가능성을 측정하기 위해 실시예 1 내지 실시예 7의 아질산염 소거능 테스트를 수행하였다.

아질산염(nitrite) 소거 활성은 카토(Kato)등의 방법(Ref. Kato H, Lee IE 1987)으로 수행 하였다. 1 mM 아질산 용액(NaNO₂) 200 ㎕에 농도 1 ㎎/㎖의 천연물 추출물 200 ㎕를 적가한다. 여기에 0.1 N 염산(HCl)을 100 ㎕을 첨가하여 pH를 1.2로 조절한 후 증류수를 이용하여 반응 용액의 부피를 1 ml로 조정하고 37℃에서 1시간동안 반응 후 100 ㎕을 취하였다. 여기에 2% 아세트산(acetic acid) 500 ㎕와 그리스시약(griess reagent) 50 ㎕을 첨가한 후 상온에서 15분간 반응시킨 뒤 520 nm에서 흡광도를 측정하였고, 추출물 첨가 시료와 무첨가 시료 사이의 흡광도 차이를 백분율로 나타내었으며, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

항산화 활성과 아질산염 소거 활성은 천연물의 폴리페놀류에 의해 발생이 저해 되거나 소거 되는 것으로 알려져 있다.

DPPH 항산화 활성 평가 및 아질산염 소거 활성 평가

	항산화 소거활성 (추출물 1 ㎎/㎖ 활성%)	아질산염 소거활성 (추출물 1 ㎎/㎖ 활성%)
실시예 1 (측백나무)	96.76 ± 0.59	90.44 ± 1.18
실시예 2 (흑삼릉)	83.74 ± 1.06	60.29 ± 4.12
실시예 3 (감태나무)	81.12 ± 0.80	67.64 ± 7.06
실시예 4 (애기괭이눈)	68.5 ± 0.92	79.01 ± 0.61
실시예 5 (독활)	4.61 ± 0.53	83.82 ± 3.53
실시예 6 (애기똥풀)	10.56 ± 3.10	84.36 ± 2.75
실시예 7 (동백나무)	92.79 ± 0.31	93.08 ± 2.40

본 실험의 대조군으로 vitamin C(ascorbic acid) 1 ㎎/㎖을 이용하였고, 이때 대조군인 vitamin C의 소거 활성은 96.64±0.26%으로 측정되었다.

상기 표 5에서 보는 바와 같이, DPPH 항산화 소거활성은 흑삼릉과 독활을 제외한 천연추출물에서 50% 이상의 높은 활성을 나타내는 것을 알 수 있고, 아질산염 소거활성의 경우에는 모든 천연물에서 50% 이상의 높은 활성을 나타내는 것을 알 수 있다.

결과적으로, 상기 실험예 1 내지 실험예 5의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 천연추출물들은 구강질환 유발균주인 스트렙토코쿠스 뮤탄스에 대해 높은 생장억제 활성 및 글루코실트랜스퍼라이제의 형성억제 활성을 동시에 나타내었으며, 측백나무, 흑삼릉 및 동백나무는 우수한 항산화 효능을 나타내었다.

본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 내용을 바탕으로 본 발명의 범주 내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.

Claims (19)

1. 천연물 소재인 애기괭이눈으로부터 분리한 천연 추출물을 유효성분으로 함유하는 구강질환 예방 및 치료용 약학적 조성물로서,
   스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans)에 대한 생장억제 활성과 다당류를 생성하는 효소들에 대한 형성억제 활성을 동시에 나타내고,
   상기 스트렙토코쿠스 뮤탄스에 대해 50% 이상의 생장억제 활성과 상기 다당류를 생성하는 효소들 중 글루코실트랜스퍼라이제에 대해 50% 이상의 형성억제 활성을 동시에 나타내기 위한 추출물 함량의 최소치가 100 내지 1000 ㎍/㎖인 것을 특징으로 하는 구강질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
2. 삭제
3. 제 1 항에 있어서, 상기 천연물 소재를 물 또는 알코올에 넣고 가열하여 추출물을 얻고, 상기 추출물을 농축하여 제조되는 것을 특징으로 하는 구강질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
4. 삭제
5. 삭제
6. 제 1 항에 있어서, 상기 천연물 소재는 애기괭이눈의 전초이고, 상기 스트렙토코쿠스 뮤탄스에 대해 50% 이상의 생장억제 활성과 상기 다당류를 생성하는 효소들 중 글루코실트랜스퍼라이제에 대해 50% 이상의 형성억제 활성을 동시에 나타내기 위한 추출물의 함량이 500 ㎍/㎖ 이상인 것을 특징으로 하는 구강질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 제 1 항에 있어서, 상기 천연물 소재는 애기괭이눈 전초의 폴리페놀 함량이, 갈산에 의한 검량곡선을 이용하여 건조시료 1g 당 ㎍ 함량(㎍ GAE/g)으로 계산할 때, 88.51±3.42 ㎍ GAE/g 이상이고, 플라보노이드 함량은 루틴에 의한 검량곡선을 이용하여 건조시료 1g 당 ㎍ 함량(㎍ RE/g)으로 계산하면 39.74±2.60 ㎍ RE/g 이상이며, 애기괭이눈 전초의 추출물 함량이 1 ㎎/㎖이상일 때, DPPH(2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl hydrate) 라디칼 소거 활성은 68.5±0.92% 이상이고, 아질산염 라디칼 소거 활성은 79.01±0.61% 이상인 것을 특징으로 하는 구강질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
15. 삭제
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제
19. 제 1 항에 있어서, 상기 약학적 조성물의 제형은 액상치약, 구강청정제, 구강용 스프레이, 구강용 티슈 제형, 구강용 연고제 또는 구강용 바니쉬인 것을 특징으로 하는 구강질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.

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