CN109602769A - 辣木叶提取物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种辣木叶提取物及其制备方法和用途,还提供了一种含有该辣木叶提取物的药物组合物。该辣木叶提取物中含有黄酮和多酚,对DPPH自由基和ABTS自由基具有良好的清除效果;可以单独地或作为药物组合物中的活性成分用于治疗牙周炎和骨保护。辣木为天然可食用物质,在治疗牙周炎的同时减少药物的毒副作用,可以长期使用。
Description
技术领域
本发明涉及一种辣木叶提取物,特别涉及一种辣木叶提取物在牙周炎中的应用。
背景技术
牙周炎是累及牙周支持组织(牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质)的慢性感染性疾病,往往引发牙周支持组织的炎性破坏。牙周炎主要分为慢性牙周炎、侵袭性牙周炎、反映全身疾病的牙周炎、坏死性牙周病。
牙周炎危害巨大,治疗的关键是抑制炎症破坏和骨吸收。现有技术中,最常用的治疗是先行牙周基础治疗,即清除菌斑、牙结石等,在基础治疗结束后再进行全身或局部药物治疗。
最常用药物为非甾体类抗炎药(NSAIDs)和局部抗菌药物。然而,这些药物具有明显的副作用,尤其是胃肠道反应及毒性积累,使其不能长期使用。
辣木作为天然可食用植物,具有增进营养、食疗保健的功能,广泛应用于医药、保健等方面,被誉为“生命之树”,“植物中的钻石”。辣木本身可食用,无毒副作用。发明人认为,辣木叶可能也具有增进营养、食疗保健的功能,并对其进行了深入研究。
鉴于此,针对现有技术中问题,发明人对现有技术进行改进,研究出了一种辣木叶提取物、含有辣木叶提取物的药物组合物及其制备方法和应用。
发明内容
为了解决上述问题,本发明人进行了锐意研究,结果发现:通过采用特定的提取液提取辣木,可以使得辣木叶提取物的抗氧化物性能较好;该提取物单独地或作为药物组合物中的活性成分用于牙周炎的治疗,可以起到对牙周炎抗炎和骨保护作用,并且无副作用,从而完成了本发明。
本发明的目的在于提供以下方面:
第一方面,本发明提供一种辣木叶提取物,该提取物中,
多酚的含量为59-123mg/g;
黄酮的含量为26-68mg/g;
所述辣木叶提取物清除DPPH自由基的IC50值为0.088-0.303mg/ml。
第二方面,本发明还提供了一种辣木叶提取物的制备方法,所述制备方法包括以下步骤:
(1)粉碎辣木叶,使用提取溶液回流提取辣木叶粉;
(2)提取结束后,减压抽滤除去不溶物,收集提取液,浓缩干燥后即为辣木叶提取物。
第三方面,本发明提供了一种治疗牙周炎的药物组合物,所述组合物中含有辣木叶提取物。
辣木叶提取物单独使用,或作为活性成分与其他辅料共同使用;辣木叶提取物或药物组合物经胃肠道给药,优选口服给药。
优选地,辣木叶提取物或药物组合物以溶解或分散于溶剂的溶液形式使用;所述药物组合物中的辣木叶提取物复溶于溶剂中,以辣木叶提取物的重量计,浓度为100~900ug/mL;
药物组合物溶液中还含有辅料,所述辅料为药学可接受的用于辅助或改善辣木叶提取物使用或制备的非活性物质,包括但不限于增溶剂和增稠剂、矫味剂、渗透压调节剂中的一种或多种。
第四方面,本发明还提供了一种辣木叶提取物、上述方法制得的辣木叶提取物、药物组合物在制备治疗牙周炎药物中的用途。
进一步的,在制备抑制治疗牙槽骨吸收药物中的用途。
根据本发明提供的辣木叶提取物,具有以下有益效果:
(1)本发明提供的辣木叶提取物中含有黄酮和多酚,具有抗炎和促进骨生长作用;辣木叶本身可食用,无毒副作用,可以用于炎症治疗;
(2)本发明提供的辣木叶提取物和药物组合物可以抑制牙槽骨吸收,可起到骨保护的作用;
(3)本发明提供的辣木叶提取物可以抑制炎症因子TNF-α、IL-6的表达和促进IL-10的表达,并抑制p38磷酸化;提示辣木叶提取物可能通过阻断p38MAPK信号通路减少巨噬细胞向M1巨噬细胞极化,抑制炎症反应及破骨细胞分化,从而起到对牙周炎的抗炎和骨保护作用;
(4)本发明提供的辣木叶提取物和药物组合物制备方法简单,步骤少,提取率高,重复性好。
附图说明
图1示出实施例1中不同梯度乙醇浓度的辣木叶提取物中黄酮多酚含量示意图;
图2示出实施例2中不同梯度乙醇浓度的辣木叶提取物的DPPH自由基清除能力;
图3示出实施例2中不同梯度乙醇浓度的辣木叶提取物的ABTS自由基的清除能力;
图4示出实施例2中不同梯度乙醇浓度的辣木叶提取物的FRAP能力;
图5示出实验例4中MTT法检测细胞存活率的结果图;
图6示出实验例5中qRT-PCR法测定IL-10表达的结果图;
图7示出实验例5中qRT-PCR法测定IL-6表达的结果图;
图8示出实验例5中qRT-PCR法测定TNF-α表达的结果图;
图9示出实验例6中ELISA法测定IL-10表达的结果图;
图10示出实验例6中ELISA法测定IL-6表达的结果图;
图11示出实验例6中ELISA法测定TNF-α表达的结果图;
图12示出实验例7中Western blotting检测的电泳图;
图13示出实验例7中Western blotting检测统计图;
图14(a)示出实验例9中对照组建模前大鼠牙槽骨的CBCT图;(b)示出对照组建模后大鼠牙槽骨的CBCT图;(c)示出对照组建模后给予生理盐水2周后的大鼠牙槽骨的CBCT图;
图15(a)示出实验例9中实验组建模前大鼠牙槽骨的CBCT图;(b)示出实验组建模后大鼠牙槽骨的CBCT图;(c)示出实验组建模后给药2周后的大鼠牙槽骨的CBCT图。
具体实施方式
下面通过对本发明进行详细说明,本发明的特点和优点将随着这些说明而变得更为清楚、明确。
在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。尽管在附图中示出了实施例的各种方面,但是除非特别指出,不必按比例绘制附图。
以下详述本发明。
本发明提供了一种辣木叶提取物的制备方法,所述制备方法包括以下步骤:
(1)粉碎辣木叶,使用提取溶液提取辣木叶粉;
(2)提取结束后,减压抽滤除去不溶物,收集提取液,浓缩干燥后即为辣木叶提取物。
其中,在步骤(1)中,将辣木叶粉碎后可以扩大比表面积,提高提取率。优选粉碎用后的辣木叶粉可以全部通过60目筛。
所述提取溶液为乙醇溶液或水。其中乙醇的体积分数为0-70%,优选为50-70%,可以提取更多的黄酮和多酚,提取产物具有更好的抗氧化能力。
在提取时,辣木叶和提取溶液的料液比为1:10-50,优选为1:20-30,最优选为1:20,可以有效提高辣木叶提取物的产率,并减少提取溶液的使用量和降低后续处理的时间。
由于辣木叶提取物中含有还原性物质,加热提取时还原性物质很容易受热氧化,提取时最好控制温度;然而当提取温度过低时会过分延长提取时间或降低提取率。
较好地,提取的温度为40-90℃,优选为40-60℃,最优选为50℃;此时,提取时间为1-4.0h,优选为1.5-2.0h,可以使得辣木叶提取物保持较高的抗氧化性。
优选地,提取2-3次;例如2次。
在步骤(2)中,提取结束后,优选趁热过滤去除其中的不溶物,更优选减压抽滤,可以减少过滤的难度和时间。
收集提取液,将提取液浓缩为净膏状,再冻干处理,得到的固体即为辣木叶提取物。
在一种优选的实施方式中,将提取两遍后提取液合并,使用旋转蒸发仪浓缩为净膏状,将净膏状物质进行冻干,粉碎,得到粉末状提取物。
根据得到的固体重量,在本发明提供的辣木叶提取物的制备方法中,辣木叶提取物的提取收率可以达到26%-70%。
本发明还提供了一种通过上述方法得到的辣木叶提取物,所述辣木叶提取物中含有含量更高的黄酮和多酚。所述黄酮是指具有2-苯基色原酮基本母核的一类化合物的总和,所述多酚是指结构中具有多元酚的一类化合物的总和。
其中,多酚的含量为59-123mg/g;黄酮的含量为26-68mg/g。
所述辣木叶提取物具有良好的抗氧化能力,特别的,对DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、ABTS(2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)和具有较好的清除效果,其清除效果高于相同质量浓度BHT(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚)和VC(维生素C)的对DPPH、ABTS的清除效果。
优选地,所述辣木叶提取物清除DPPH自由基的IC50值为0.088-0.303mg/ml。
优选地,所述辣木叶提取物清除ABTS自由基的IC50值为0.23-0.78mg/ml。
所述辣木叶提取物清除ABTS自由基的IC50值为0.23-0.78mg/ml。
所述辣木叶提取物清除DPPH自由基的清除率为0.07-0.28(7-28%);清除ABTS自由基的清除率为0.2-0.9(20-90%)。
所述辣木叶提取物的总还原能力为200~300mg/g。
不受任何理论的束缚,本发明人认为,辣木叶提取物中含有的黄酮、多酚等物质可能具有抗炎、抗氧化、促进骨生长的作用,基于此,本发明提供了一种治疗牙周炎的药物组合物,所述组合物中含有辣木叶提取物。
其中,辣木叶提取物单独使用,或作为活性成分与其他辅料共同使用。辣木叶提取物或药物组合物经胃肠道给药,优选口服给药。
在一种优选的实施方式中,药物组合物以溶解于溶剂的溶液形式使用;使用时将辣木叶提取物复溶于溶剂中,以辣木叶提取物的重量计,使用时浓度为100~900ug/mL。
所述溶剂为水,优选为注射用水或去离子水,更优选为无菌去离子水。
为了提高药物组合物溶液的制剂可加工性,还可以在该溶液中添加辅料。
进一步地,所述辅料为药学可接受的用于辅助或改善辣木叶提取物使用或制备的非活性物质,包括但不限于增溶剂和增稠剂、矫味剂、渗透压调节剂中的一种或多种。
所述增溶剂包括乙醇、十二烷基硫酸钠、聚乙二醇、吐温、丙二醇、甘油、泊洛沙姆中的一种或组合。
所述增稠剂包括黄原胶、果胶、羧甲基纤维素钠、淀粉、糊精、琼脂、聚氧化乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇中的一种或组合。
所述矫味剂包括蔗糖、葡萄糖、糖精钠、香精、挥发油中的一种或组合。
所述渗透压调节剂为氯化钠、葡萄糖、右旋糖酐或甘露醇中的一种或组合。
将辣木叶提取物单独地或与其他辅料均匀地溶解/分散在溶剂中即可。
所述含有辣木叶提取物的药物组合物还可以按照现有技术中常用的方法制备为片剂、胶囊剂、颗粒剂、泡腾剂、散剂或者丸剂。
本发明还提供了一种上述辣木叶提取物、或上述药物组合物在制备治疗牙周炎药物中的用途。
炎症发病中涉及M1、M2巨噬细胞极化,并与p38MAPK信号通路有关。研究发现,辣木叶提取物可以抑制炎症因子TNF-α、IL-6的表达,促进IL-10的表达,并抑制p38磷酸化;辣木叶提取物通过阻断p38MAPK信号通路的转导,减少巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化,使其向M2型巨噬细胞极化,进而减少促炎因子的释放,增加抗炎因子的表达,抑制炎症反应及破骨细胞分化,从而达到对牙周炎的抗炎和骨保护作用。
进一步的,研究发现,辣木叶还提取物可以抑制牙槽骨吸收。因此,本发明还提供了一种上述辣木叶提取物或药物组合物在制备抑制治疗牙槽骨吸收药物中的用途。
辣木为天然可食用物质,其中含有黄酮、多酚等多种抗氧化成分,具有抗炎和骨保护作用,在治疗牙周炎的同时减少药物的毒副作用,可以长期使用,安全性好。
实施例
实施例1
准确称取过60目筛的1.0g辣木叶粉,将辣木叶粉和乙醇溶液漩涡振荡混合均匀后回流提取。提取结束后,趁热减压抽滤,浓缩后冻干,得到辣木叶提取物。
提取条件为:提取温度为50℃、料液比为1:20、纯水、提取时间为2h。
实施例2
准确称取过60目筛的1.0g辣木叶粉,将辣木叶粉和乙醇溶液漩涡振荡混合均匀后回流提取。提取结束后,趁热减压抽滤,浓缩后冻干,得到辣木叶提取物。
提取条件为:提取温度为50℃、料液比为1:20、乙醇体积分数为50%、提取时间为2.0h。
实施例3
准确称取过60目筛的1.0g辣木叶粉,将辣木叶粉和乙醇溶液漩涡振荡混合均匀后回流提取。提取结束后,趁热减压抽滤,浓缩后冻干,得到辣木叶提取物。
提取条件为:提取温度为50℃、料液比为1:20、乙醇体积分数为70%、提取时间为1.5h。
对比例
对比例1
提取方法和实施例1相同,区别仅在于提取条件不同。提取条件为:提取温度为50℃、料液比为1:20、乙醇体积分数为90%、提取时间为1.0h。
实验例
实验例1
测定实施例1-3和对比例1中制得的提取液中多酚和黄酮的含量,如图1所示,在实施例1-3中制得的提取液中,多酚含量和黄酮含量均显著高于对比例1。
实验例2
测定实施例1-3和对比例1中制得的辣木叶提取物对DPPH自由基、ABTS自由基和辣木叶提取物的总还原能力(FRAP能力)。同时,在相同条件下以BHT(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚)、VC(维生素C)为阳性对照进行对照试验。结果如图2-4所示。
其中,由图2可知,不同浓度乙醇提取的辣木叶提取物对DPPH自由基的清除能力较BHT和VC低,但表现出明显的抗氧化性,IC50值为0.088-0.303mg/ml。
由图3可知,不同浓度乙醇提取的辣木叶提取物对ABTS自由基的清除能力均较BHT和VC低,但表现出明显的抗氧化性。
由图4可知,不同浓度乙醇提取的辣木叶提取物对总还原能力FRAP较BHT和VC低,但具有明显的还原能力。
实验例3
以Pg.LPS(牙龈卟啉单胞菌脂多)刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7形成牙周炎细胞模型后,取对数期生长细胞,以5×104细胞密度接种96孔板,分别以浓度为100ug/mL、300ug/mL、500ug/mL、700ug/mL、900ug/mL的实施例1制得的辣木叶提取物进行干预。设置调0组(只有细胞培养液,不含细胞和辣木叶提取物),以MTT法检测各组细胞存活率。
结果如图5所示,纵坐标为细胞存活率,横坐标为辣木叶提取物浓度,随着辣木叶提取物浓度的增加,细胞存活率逐渐降低,但各组细胞存活率均在85%以上。
实验例4
以Pg.LPS刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7形成牙周炎细胞模型后,分别以浓度为100ug/mL、300ug/mL、500ug/mL、700ug/mL、900ug/mL的实施例1制得的辣木叶提取物进行干预,提取细胞中总RNA,逆转录成cDNA后进行qRT-PCR。各干预组与Pg.LPS组相比较,测定IL-10、IL-6和TNF-α。
引物信息如下:
结果如图6所示,与对照组Pg.LPS(细胞模型组)相比,IL-10在辣木叶提取物干预后表达上调,500ug/mL效果最好,并且与浓度具有一定的依赖性;
由图7和图8中可知,IL-6及TNF-α在辣木叶提取物干预后表达下调,500ug/mL效果最佳,与浓度具有一定的依赖性。
上述结果经t检验,P<0.05,具有统计学意义。
结果表明,辣木叶提取物对牙周炎细胞的炎症因子具有抑制作用。
实验例5
以Pg.LPS刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7形成牙周炎细胞模型后,分别以不同浓度的100ug/mL、300ug/mL、500ug/mL、700ug/mL、900ug/mL的实施例1制得的辣木叶提取物进行干预。取细胞上清液,各干预组与Pg.LPS组相比较,ELISA法检测炎症因子IL-10、IL-6和TNF-α表达。
结果如图9所示,与对照组Pg.LPS(细胞模型组)相比,IL-10在辣木叶提取物干预后表达上调,500ug/mL效果最好,并且与浓度具有一定的依赖性;
由图10和图11可知,IL-6及TNF-a在辣木叶提取物干预后表达下调,500ug/mL效果最好,并且与浓度具有一定的依赖性。上述结果经t检验,P<0.05,具有统计学意义。
结果表明,辣木叶提取物对牙周炎细胞的炎症因子具有抑制作用。
实验例6
以Pg.LPS刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7形成牙周炎细胞模型后,分别以浓度为100ug/mL、500ug/mL的由实施例1制得的辣木叶提取物进行干预,提取细胞中总蛋白,进行Western blotting检测。
结果由图12和图13中可知,与对照组Pg.LPS(细胞模型组)相比,应用100ug/mL辣木叶提取物进行干预后,p-p38MAPK没有明显变化;而应用500ug/mL辣木叶提取物进行干预后,p-p38MAPK被明显抑制。并且,结果具有统计学意义(P<0.01)。
说明辣木叶提取物可以阻断p38MAPK信号通路的转导。
实验例7
建立牙周炎动物模型
以丝线结扎+高糖饲料喂养建立牙周炎动物模型:
选3月龄雄性SD大鼠,体重200-300g。以10%水合氯醛(0.4mL/100g)行腹腔注射麻醉后,将右上颌第二磨牙牙龈与牙根面稍加分离,双股4-0丝线结扎第二磨牙,并将结扎线尽量置于龈沟内,术后采用高糖饲料(keyes2000,南通特洛菲饲料科技有限公司)和200g/L高糖水进行喂养。每三天观察一次线结是否脱落,若脱落重新结扎。术后2周观察牙周临床指标判断建模是否成功。
牙周临床指标如下:
牙龈指数(GI)2.60±0.55,牙周袋探诊深度(PD)1.40±0.42(mm),松动度(TM)1.40±0.55,牙槽骨吸收值0.27±0.14(mm),由此判断建模成功。
牙周指数评价
建模成功后随机分为两组,每组5只,分笼饲养。实验组以500ug/mL的由实施例1制得的辣木叶提取物进行灌胃给药;对照组局部注射等量生理盐水。给药2周后,对各组动物的牙周指数进行评价。其中,x为平均值,s为标准差。
结果如下:
表1实验组与对照组牙龈指数(GI)测定结果(x±s)
经过t检验,P<0.05,具有统计学意义。
表2实验组与对照组牙周袋探诊深度(PD)测定结果(x±s,mm)
经过t检验,P<0.05,具有统计学意义。
表3实验组与对照组松动度(TM)测定结果(x±s)
由上表可知,辣木叶提取物干预2周后,实验组各项牙周指数均有所降低,炎症状况减轻;而对照组各项牙周指数继续增大,炎症状况加重。表明辣木水提取物能减轻牙周炎炎症。
实验例8
取实验例8中成功建模的动物10只,随即分为两组,实验组以500ug/mL的实施例1中制得的辣木叶提取物进行局部给药;对照组局部注射等量生理盐水。干预2周后,进行CBCT扫描(锥形束CT),并对牙槽骨吸收度进行评价。建模成功后,颊侧牙槽嵴顶至颊尖距离均增大,增大值即牙槽骨吸收程度。
在CBCT图中,平面直径为牙槽嵴顶至颊尖距离;数据由系统距离测量工具测出。
图14为对照组,由图14(a)中可知,牙周建模前,牙槽骨附着水平位于牙颈部,颊侧牙槽嵴顶距离颊尖1.25mm;
图14(b)中可知,丝线结扎2周后,牙槽骨向根方退缩,颊侧牙槽嵴顶距颊尖1.52mm;
图14(c)中可知,注射生理盐水2周后,牙槽骨继续向根方吸收,累及根分叉,颊侧牙槽嵴顶距离颊尖2.16mm。
图15为实验组,由图15(a)中可知,牙周建模前,牙槽骨附着水平位于牙颈部,颊侧牙槽嵴顶距离颊尖1.27mm;
由图15(b)中可知,丝线结扎2周后,牙槽骨向根方退缩,颊侧牙槽嵴顶距离颊尖1.55mm;
由图15(c)中可知,辣木叶提取物作用2周后,牙槽骨吸收速度降低,直至停止。颊侧牙槽嵴顶距离颊尖1.63mm。
具体数据如下:
表4实验组与对照组牙槽嵴顶至颊尖距离(x±s,mm)
经过统计,实验组牙槽骨吸收值仅增加0.078±0.031(mm),而对照组牙槽骨吸收值增加0.548±0.102(mm)(P<0.05)。
上述结果可以清晰表明,辣木叶提取物对牙槽骨吸收具有抑制作用。
以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明,不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解,在不偏离本发明精神和范围的情况下,可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进,这些均落入本发明的范围内。本发明的保护范围以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种辣木叶提取物,其特征在于,该提取物中,
多酚的含量为59-123mg/g;
黄酮的含量为26-68mg/g;
所述辣木叶提取物清除DPPH自由基的IC50值为0.088-0.303mg/ml。
2.根据权利要求1所述的辣木叶提取物,其特征在于,所述提取物由包括以下步骤的方法制成:
(1)粉碎辣木叶,使用提取溶液回流提取辣木叶粉;
(2)提取结束后,减压抽滤除去不溶物,收集提取液,浓缩干燥后即为辣木叶提取物。
3.一种权利要求1或2所述的辣木叶提取物的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括以下步骤:
(1)粉碎辣木叶,使用提取溶液回流提取辣木叶粉;
(2)提取结束后,减压抽滤除去不溶物,收集提取液,浓缩干燥后即为辣木叶提取物。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,在步骤(1)中,所述提取溶液为水或乙醇水溶液,其中乙醇的体积分数为0-70%。
5.根据权利要求3所述制备方法,其特征在于,在步骤(1)中,辣木叶和提取溶液的料液比为1:10-50,优选为1:20-30;
在步骤(1)中,提取的温度为40-90℃,优选为40-60℃;
提取时间为1-4.0h,优选为1.5-2.0h。
6.治疗牙周炎的药物组合物,所述组合物中含有权利要求1-5之一所述辣木叶提取物。
7.根据权利要求6所述的药物组合物,其特征在于,辣木叶提取物单独使用,或作为活性成分与其他辅料共同使用;
辣木叶提取物或药物组合物经胃肠道给药,优选口服给药。
8.根据权利要求6或7所述药物组合物,其特征在于,药物组合物以溶解或分散于溶剂的溶液形式使用;
所述药物组合物中的辣木叶提取物复溶于溶剂中,以辣木叶提取物的重量计,浓度为100~900ug/mL;
药物组合物溶液中还含有包括增溶剂和增稠剂、矫味剂、渗透压调节剂中的一种或多种的辅料。
9.一种权利要求1或2所述的辣木叶提取物或权利要求2-7之一所述方法制备的辣木叶提取物,或权利要求6-8之一所述的药物组合物在制备治疗牙周炎药物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途,其特征在于,所述辣木叶提取物在制备抑制治疗牙槽骨吸收药物中的用途。
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