KR20020086109A - 두충 추출물을 포함하는 경조직 재생 촉진제 조성물 - Google Patents
두충 추출물을 포함하는 경조직 재생 촉진제 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 두충 추출물을 포함하는 경조직 재생 촉진제 조성물에 관한 것으로, 두충의 물, 저급알콜 또는 유기용매 추출물을 포함하는 본 발명의 조성물은 알칼리성 포스파타아제의 활성을 유도함으로써 조골세포의 분화와 미네랄화(mineralization)를 촉진하고, 콜라겐의 합성을 증가시킴으로써 경조직의 기질을 견고히 하며, 조골세포의 ERK2 (Extracellular signal-Regulated Kinase 2)를 활성화시켜 조골세포의 증식이나 분화 작용을 유도할 수 있을 뿐만 아니라, 조골세포의 성장을 농도 의존적으로 증가시키므로, 골다공증, 치조골 파손과 같은 경조직 질환 또는 치주질환과 같은 골대사질환의 예방 및 치료제로 유용하다.
Description
본 발명은 두충 추출물을 포함하는 경조직 재생 촉진제 조성물에 관한 것이다.
인체에 존재하는 경조직은 크게 뼈와 치아로 분류된다. 이와 같은 경조직에 문제가 생겨 발생하는 대표적인 질환으로는 골다공증과 치주질환이 있다.
이러한 경조직은 신체의 형태를 유지하면서 체중을 지지해주며 근육을 부착시켜 운동을 할 수 있게 하는 기관으로, 조골세포에 의한 골형성과 파골세포에 의한 골흡수가 함께 일어나는 지속적인 리모델링 (remodeling)을 통해 균형을 유지하고 있다. 이런 대사는 물리적 영향, 호르몬 체계와 국소인자에 의해 조절이 이루어지는데 여러 가지 요인에 의해 골흡수가 골형성을 초과하여 골량이 한계 이하로 감소하면 골다공증과 같은 골질환이 발생한다.
조골세포는 골의 유기물질인 오스테오이드 (osteoid)를 침착시킴으로서 골형성을 이루게 하는데 오스테오이드는 제 1형 콜라겐, 오스테오칼신 (osteocalcin), 오스테오넥틴 (osteonectin), 시알로프로테인 (sialoprotein) 등으로 구성되어 있다. 형성된 오스테오이드는 후에 무기질 침착작용을 거치는데 이때 조골세포가 무기질을 유도하여 인산화칼슘이 결정체인 수산화인회석 (hydroxyapatite)을 이루어 오스테오이드에 침착되게 한다.
조골세포의 생화학적 지표로는 알칼리성포스파타아제 (alkaline phosphatase), 제 1형 콜라겐, 오스테오칼신 등이 임상적으로 이용된다. 알칼리성포스파타아제는, 증식이 끝나면 바로 배출되는 초기 활성 지표로서 기질의 무기질화가 일어나기 시작하면 감소한다.
콜라겐은 골기질 단백질의 일종으로 골 유기질의 약 90%를 차지하며(Schonau and Rauch,Horm. Res.,49(suppl 5): 50-59,1997) 그 대부분은 피부와 같은 유전자에서 만들어지는 1형 콜라겐으로서 소량의 5형 콜라겐과 함께 존재한다. 콜라겐은 단순한 구조단백질이 아니라 골에서 무기염의 침착장소를 제공하고 조골세포의 분화증식에 관여하므로 석회화능, 골의 리모델링 등의 골 기능에 중요한 역할을 담당하고 있다. 또한 조골세포의 초기 활성 지표로 조골세포의 전조세포 분화가 일어날 때 생산된다. 히드록시프롤린 (hydroxyproline)은 콜라겐 함량의 약 14 %를 차지하며 이 비율은 비교적 일정한 편이다.
오스테오칼신은 기질의 무기질화가 일어나는 동안 발현되는 칼슘결합단백질이며 후기 활성 지표로서 이용된다. 조골세포에서 MAP 키나아제 족의 일종인 ERK2(extracellular signal-regulated kinase 2)는 PDGF-BB, EGF, 인슐린, IGF-I, 포르볼 에스테르, 에스트로젠과 같은 골-활성제(bone-active agent)들에 의하여 유도된다. ERK는 조골세포의 증식에 아주 중요한 역할을 한다고 알려져 있다 (Hipskind, B. A. and Bilbe, G.,Frontiers in Bioscience,3, d804-816, 1998).
두충 (Cortex Eucommiae)은 두충나무(Eucommia ulmoidesOliv.)의 줄기 껍질을 건조한 것을 지칭한다. 알려진 성분으로는 주로 리그난류(lignans)와 이리도이드류(iridoids)가 있다. 그외에 에리쓰로(erythro)- 및 쓰레오-구아이아실글리세롤 (threo-guaiacylglycerol), 울모프레놀(ulmoprenol), 노나코산(nonacosane), β-시토스테롤(sitosterol), 베툴린(betulin), 베툴린산(betulinic acid), 우르솔산(ursolic acid) 및 바닐릭산(vanillic acid) 등이 존재한다. 현재 알려진 약리작용으로는 혈압강하, 항고지혈, 진정 및 진통작용, 소염작용, 세망내피계 탐식 작용(reticuloendothelial phagocytic function), 이뇨효과 등이 있다 (Chinese Matera medica 1998). 두충 추출물은 15-25 g/kg의 양으로 5일간 계속하여 마우스에 경구투여해도 마우스가 사망하지 않으므로 아주 안전한 약물이라고 사료된다. 하지만 골조직에 대한 효과는 아직 보고된 바 없다.
생약으로부터 경조직의 재생을 유도하는 물질을 개발하기 위해 노력해온 본 발명자들은 두충 추출물이 조골세포 증식 작용 등을 가져 경조직 재생 촉진제로서 이용될 수 있음을 밝혀내고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 두충 추출물을 포함하는, 인체에 독성이 없고 안전하며 골다공증, 치조골 파괴를 수반하는 치주질환과 같은 경조직 관련 질환의 치료 및 예방에 사용할 수 있는 경조직 재생 촉진제 조성물을 제공하는 데 있다.
도 1은 두충 추출물을 1일간 투여했을 때 조골세포-유사세포 (osteoblast-like cell)인 UMR-106 세포의 알칼리성 포스파타제 활성에 대한 효과를 나타낸 것이다.
도 2는 두충 추출물을 2일간 투여했을 때 조골세포인 MC3T3-E1 세포의 알칼리성 포스파타제 활성에 대한 효과를 나타낸 것이다.
도 3은 두충 추출물을 7일간 투여했을 때 조골세포인 MC3T3-E1 세포의 알칼리성 포스파타제 활성에 대한 효과를 나타낸 것이다.
도 4는 UMR-106 세포에서 두충 추출물 투여에 의한 콜라겐 합성량을 나타낸 것이다.
도 5는 MC3T3-E1 세포에서 두충 추출물 투여에 의한 콜라겐 합성량을 나타낸 것이다.
도 6은 UMR-106 세포에서 두충 추출물 투여에 의한 ERK2의 활성유도를 나타낸 것이다.
도 7은 MC3T3-E1 세포에서 두충 추출물에 의한 세포성장 유도를 나타낸 것이다.
도 8은 조골세포-유사세포 (osteoblast-like cell)인 UMR-106 세포의 세포생존율에 대한 두충 추출물의 효과를 나타낸 것이다.
도 9는 MC3T3-E1 세포의 세포생존율에 대한 두충 추출물의 효과를 나타낸 것이다.
본 발명은 두충(Cortex Eucommiae) 추출물을 포함하는 경조직 재생 촉진제 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 두충 추출물은 두충을 물, 저급 알콜 또는 유기용매 등의 추출용매로 추출하여 얻을 수 있는데, 저급알콜로는 메탄올, 에탄올 등을, 유기용매로서는 아세톤, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에테르, 에틸아세테이트, 헥산 등을 예시할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 두충 추출물은 두충에 약 5 내지 50배, 바람직하게는 약 10배의 추출용매를 가하고, 약 5 내지 80℃, 바람직하게는 약 30 내지 55℃에서 15분 내지 48시간, 바람직하게는 30분 내지 12시간 동안 추출한 후에, 이를 통상의 방법에 따라 여과, 농축 및 동결건조하여 얻을 수 있다.
본 발명의 조성물에서 유효성분으로 포함되는 두충 추출물은 알칼리성 포스파타아제의 활성을 유도함으로써 조골세포의 분화와 미네랄화(mineralization)를 촉진할 뿐만 아니라 콜라겐의 합성을 증가시킴으로써 경조직의 기질을 견고히 하는 효과를 나타낸다. 또한, 조골세포의 ERK2 (Extracellular signal-Regulated Kinase 2)를 활성화시켜 조골세포의 증식이나 분화 작용을 유도할 수 있으며, 조골세포의성장을 농도 의존적으로 증가시킨다.
따라서, 두충 추출물을 포함하는 본 발명의 조성물은 경조직 재생 촉진제로서 사용될 수 있으며, 골다공증, 치조골 파괴를 수반하는 치주질환과 같은 경조직 관련 질환의 예방 및 치료제로 유용하다.
더구나, 이러한 유용성에도 불구하고 두충 추출물은 독성을 나타내지 않기 때문에 본 발명의 조성물은 매우 안전하여 남녀노소 및 건강 상태에 구애없이 널리 적용될 수 있는 장점이 있다. 또한, 기존의 골질환 치료제에 첨가하여 상승효과를 유발하기 위해서도 사용될 수 있으며, 키가 작은 어린이의 키를 크게 할 목적으로도 사용될 수도 있다.
본 발명의 조성물은 주성분인 두충 추출물만으로 구성될 수 있으나, 기타의 약제학적 담체, 부형제 및 첨가제를 더 포함할 수도 있다. 또한, 목적에 따라 다른 활성성분과 혼합하여 효과를 증진시킬 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 두충 추출물을 치주질환에 사용할 경우 항염증 효과를 갖는 약물을 함께 포함시켜 투여하면 보다 탁월한 효과를 얻을 수 있다.
본 발명의 경조직 재생 촉진제 조성물은 임상적으로 투여시에 약제학적으로 허용되는 담체와 두충 추출물을 배합하여 경구 또는 비경구 투여에 적합한 고체, 반고체 또는 액체 형태의 약제학적 제제로 제형화시켜 투여할 수 있다. 이러한 목적으로 적합하게 사용할 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체는 고체이거나 액체일 수 있으며 희석제, 향미제, 가용화제, 윤활제, 현탁제, 결합제, 붕해제 중의 어느 하나 또는 그 이상일 수 있다. 본 발명의 조성물로부터 제조되는 제제의 예로는 정제, 알약, 분말, 새세이, 엘릭서, 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 등을 예시할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 사람의 경우 두충 추출물의 통상적인 1일 투여량은 1 내지 1,000 ㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 10 내지 100 ㎎/㎏ 체중의 범위일 수 있고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 활성 성분의 실제 투여량은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
이하 구체적인 제제의 제조예를 들어 본 발명을 설명하나 본 발명이 이들 예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 두충 추출물의 제조
두충 300 g을 1,000 ㎖의 70 % 메탄올에 넣고 환류 냉각기를 사용하여 3시간씩 3회 추출하였다. 추출물을 회전식 증발기(rotary evaporator)로 농축하고 동결건조기로 건조하였다.
실시예 2: 알칼리성 포스파타아제 활성에 대한 효과
(단계 1) 세포배양
랫트의 조골세포-유사세포 (osteoblast-like cell)인 UMR-106 세포(ATCC CRL-1661, Rockville, MD) 및 마우스 유래의 MC3T3-E1 세포(이화여대 천종윤 교수로부터 제공받음)를 10 % 우태아혈청 (fetal bovine serum; FBS), 100 IU/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배지에 넣고 5 % CO2, 37℃로 유지되는 세포배양기에서 배양하였다.
혈청속의 성분들이 미칠 수 있는 영향을 배제하기 위하여 두충 추출물을 투여하기 24시간 전에 우태아혈청 대신에 우혈청 알부민을 0.1 % 첨가한 배지로 교환한 후 두 세포배양물에 두충 추출물을 각각 10 ㎍/㎖ 농도로 투여하였다.
(단계 2) 알칼리성 포스파타아제 활성 측정
각 세포 배양물에서 배지를 제거한 후 PBS (phosphate buffered saline)를 넣고 세포 스크래퍼 (cell scraper)로 긁어 모았다. 이를 30초간 초음파(Ultra cells, Sonics & Materials Inc. Danbury, CT, USA)로 분해시킨 후, 5,000 rpm에서 3분간 원심분리하여 상층액을 취하여 측정용 시료로 하였다. 알칼리성 포스파타아제의 활성을 측정하기 위하여 알칼리성 포스파타아제 측정 키트(alkaline phosphatase assay kit; 영동제약)를 이용하여 500 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 두충 추출물을 1일간 투여한 UMR-106 세포군 (10 ㎍/㎖)에서 조골세포분화의 지표인 알칼리성 포스파타아제의 활성이, 두충을 투여하지 않은 대조군에 비하여 32 %가 증가하였다 (도 1). 또한, 두충 추출물을 MC3T3-E1 세포에 2일간 투여한 경우 대조군에 비하여 0.1 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖ 및 10 ㎍/㎖의 농도에서 각각 79 %, 72 % 및 25 %의 알칼리성 포스파타아제 활성증가를 유발하였으며(도 2), 7일간 투여할 경우 대조군에 비하여 0.1 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖ 및 10 ㎍/㎖의 농도에서 각각 67 %, 74 % 및 39 %의 증가를 유발하였다 (도 3). 따라서 두충추출물이 알칼리성 포스파타제의 활성 증가를 유도함으로서 조골세포의 분화를 유도하여 골의 미네랄화(mineralization)에 지대한 영향을 미침을 알 수 있다.
실시예 3: 콜라겐 함량에 대한 효과
상기 실시예 2의 단계 1과 동일한 방법으로 UMR-106 세포 및 MC3T3-E1 세포를 배양한 후 두충 추출물을 24시간 투여하였다.
세포에서의 콜라겐 합성을 확인하기 위해 SircolR콜라겐 측정 키트(Biocolor Ltd., Northern Ireland)를 사용하여 제공되는 매뉴얼에 따라 실험하였다 (Kim, S. J. 등,Biochem. Biophys. Res. commun.,278, 712-718, 2000).
그 결과, UMR-106 세포에 두충 추출물을 0.1 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖ 및 10 ㎍/㎖의 농도로 투여하였을 경우 골기질 (bone matrix)을 구성하는 주요 단백질인 콜라겐의 합성은 대조군에 비하여 각각 86 %, 40 % 및 40 %씩 증가하였다 (도 4). 또한, MC3T3-E1 세포에 두충 추출물을 0.1 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖ 및 10 ㎍/㎖의 농도로 투여하였을 경우 콜라겐 합성은 대조군에 비하여 각각 30 %, 37 % 및 63 % 씩 증가하였다 (도 5).
따라서 본 발명의 조성물에서 유효성분으로서 포함되는 두충 추출물은 콜라겐의 합성을 증가시킴으로써 경조직의 기질을 견고히 하는 효과를 나타냄을 확인하였다.
실시예 4: ERK2 활성에 미치는 효과
두충 추출물이 ERK2 (Extracellular signal-Regulated Kinase 2)의 활성에미치는 효과를 다음과 같이 조사하였다. ERK (Extracellular signal-Regulated Kinase)는 성장인자들에 의한 세포막 수용체의 활성화로부터 세포의 증식, 분화 및 유전자 발현의 변화를 연결시켜주는 중요한 신호전달 단백질이다 (Siddhanti 등,Endocrinology,136, 4834-4841 (1995); Hipskind and Bilbe,Front Biosci.,1, D804-816, 1998).
상기 실시예 2의 단계 1과 동일한 방법으로 UMR-106 세포를 배양하고, 두충 추출물을 10 ㎍/㎖ 농도로 투여한 후 0분, 10분, 30분에 세포를 분리하여 다음과 같이 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 전기영동(SDS-PAGE) 및 웨스턴 블럿팅에 의해 ERK2 활성을 측정하였다.
각 세포 배양물에서 배지를 제거한 후 PBS를 넣고 세포 스크래퍼로 긁어 모았다. 이를 30초간 초음파로 분해한 후, 단백질 정량을 하여 각 웰에 동량의 단백질을 포함한 시료 30 ㎕가 들어가게 조절하였다. 5× 램리 시료 완충액(Laemmli's sample buffer)를 가하여 물에서 5분간 끓인 후 로딩하여 100 V로 전기영동하였다. SDS-PAGE는 분리 젤 7.5 %를 사용하였다.
SDS-PAGE를 시행한 후, 미니 트랜스-블럿 일렉트로포레틱 트랜스퍼 셀(Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell(Bio-Rad))을 이용하여 100 V에서 1시간 동안 니트로셀룰로스 막으로 단백질을 이동, 부착시켰다. 0.1 % 트윈 20을 포함하는 PBS 용액(PBS-T)에 5 % 탈지우유를 녹여 만든 블로킹 용액에 니트로셀룰로스 막을 담가 4℃ 냉장고에서 하룻밤을 보관하였다. 니트로셀룰로스 막에 1차 항체(anti-phospho ERK Ab; 입수처: New England Biolab, USA)를 PBS-T에 1:1000으로 희석한 용액을 가하여 1시간동안 반응시켰다. 니트로셀룰로스 막을 PBS-T로 15분간 1회, 5분간 3회 세척한 후, 2차 항체로서 서양고추냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)에 결합된 염소 항-토끼 IgG(Pierce)를 PBS-T에 1:1000으로 희석한 용액을 가하여 40분간 반응시켰다. ERK 2 (42 kDa) 단백질의 밴드는 증진된 화학발광(enhanced chemiluminescence (ECL), Pierce) 방법을 써서 확인하였다 (Harlow E. and Lane D.,Antibodies: A laboratory manual.,726, 1988).
그 결과, 인산화되어 활성을 띤 phospho-ERK 2의 단백질량은 두충 추출물의 투여 후 시간 의존적으로 증가하며, 30분이 지나 최고를 기록하였다. 이 결과는 두충 추출물이 조골세포의 ERK2를 활성화시켜, 조골세포의 증식이나 분화 작용을 일으킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 5: 세포성장 시험
상기 실시예 2의 단계 1과 동일한 방법으로 MC3T3-E1 세포를 배양한 후 두충추출물을 투여하였다.
세포성장 시험은 에체베리 등의 방법으로 실시하였다 (Etcheverry, S. B. 등,Archives of Biochemistry and Biophysics,338, 7-14, 1997). 24 웰 플레이트에서 자란 MC3T3-E1 세포에 두충 추출물을 10 ㎍/㎖의 농도로 24시간 동안 처리하고 PBS로 세척한 후 상온에서 10분간 5 % 글루타르알데히드/PBS 용액에 고정하였다. 그 후 0.5 % 크리스탈 바이올렛/25 % 메탄올 용액에 10분간 염색하였다. 염색용액을 버린 후 플레이트는 물로 세척 후 건조시켰다. 세포로 흡수된 염료는 웰당0.5 ㎖의 0.1 M 글라이신/HCl 완충액, pH 3.0/30 % 메탄올 용액으로 추출한 후 시험관으로 옮겨 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 7에서 보는 바와 같이 두충 추출물은 MC3T3-E1 세포의 성장을 농도 의존적으로 증가시켰다.
실시예 6: 세포독성 시험
두충 추출물의 투여농도를 각각 0, 0.01, 0.1, 1 및 10 mM 농도로 한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 세포들을 배양하였다.
MTT 분석법을 이용하여 세포 생존율을 측정하였다. 즉, 96 웰 마이크로플레이트에서 24시간 동안 두충 추출물 처리를 하거나 하지 않은 세포를 2시간 동안 5 ㎕ MTT (1.5 ㎎/㎖)와 함께 배양한 후 50 ㎕ 이소프로판올 용액에 용해시키고 580 nm에서 분광 광도계로 측정하였다.
그 결과로서, 두충 추출물 투여량에 따른 조골세포 UMR-106 세포 및 MC3T3-E1 세포의 생존곡선을 도 8과 도 9에 각각 나타내었다. 두충 추출물 투여 후의 세포생존율 (cell viability)은 두충 추출물을 투여하지 않은 대조군과 유사하여 본 발명의 투여농도에서 두충 추출물에 의한 세포독성은 유발되지 않음을 확인할 수 있었다. UMR-106 세포에서 두충 추출물은 오히려 대조군에 비하여 세포생존율을 증가시키고 있다.
본 발명의 조성물은 골다공증, 치조골 파손과 같은 경조직 질환의 치료 및예방을 위하여 적용할 수 있는 경조직 재생 촉진제로서 매우 안전하기 때문에 남녀노소 및 건강 상태에 구애없이 널리 적용될 수 있다. 그리고 기존의 골질환 치료제에 첨가하여 상승효과를 유발하기 위해서 사용될 수 있다. 또한 키가 작은 어린이의 키를 크게 할 목적으로 사용될 수도 있다.
Claims (6)
- 두충(Cortex Eucommiae) 추출물을 포함하는 경조직 재생 촉진용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서,상기 두충 추출물이 두충을 물, 저급알콜 또는 유기용매로 추출하여 얻은 것임을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제2항에 있어서,상기 저급알콜이 메탄올 또는 에탄올임을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제2항에 있어서,상기 유기용매가 아세톤, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에테르, 에틸아세테이트 또는 헥산임을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제1항에 있어서,골다공증 및 치조골 파괴를 수반하는 치주질환을 포함하는 경조직 관련 질환의 치료 및 예방을 위해 사용하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제1항에 있어서,어린이의 키 성장을 목적으로 사용하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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