KR100851783B1 - Ｂｈｈ １７ 복합생약추출물을 유효성분으로 함유하는골절 질환의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

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최도영
백용현
허정은
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경희대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 황기, 계지, 자초, 갈근, 지각 및 황백의 복합생약추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 황기, 계지, 자초, 갈근, 지각 및 황백의 복합생약추출물은 조골세포의 증식 및 분화 촉진, 알칼린 포스파타 제(ALP, akaline phosphatase) 활성 촉진, 혈관 내피세포 성장인자(VEGF, vasal endothelial growth factor)의 분비 촉진 및 골절 동물모델에서 골유합 촉진 효과를 나타내므로 골절 질환의 예방 및 치료용 약학조성물 및 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다.
골절 질환, 약학조성물, 건강기능식품

Description

ＢＨＨ １７ 복합생약추출물을 유효성분으로 함유하는 골절 질환의 예방 및 치료용 조성물{Composition comprising an extract of mixted herbal BHH 17 for preventing and treating fractural disease}
도 1은 실시예1의 BHH17 처리 시 조골세포 (Saos-2)의 생존 정도를 나타낸 도이고,
도 2는 실시예1의 BHH17 처리 시 조골세포 (Saos-2)에서 알칼리 포스파타아제 (ALP) 활성 정도를 나타낸 도이며,
도 3은 실시예1의 BHH17 처리 시 조골세포 (Saos-2)에서 혈관생성촉진인자 (VEGF)의 분비 활성을 나타낸 도이고,
도 4는 실시예1의 BHH17 처리 시 사람의 하악골에서 분리한 조골세포에서 생존 정도를 나타낸 도이며,
도 5는 실시예1의 BHH 17 처리 시 사람의 하악골에서 분리한 조골세포에서 알칼리 포스파타제(ALP) 활성 정도를 나타낸 도이고,
도 6a는 골절 질환 동물모델의 염증 부위에서 실시예1의 BHH 17 투여 후, 골유합 정도를 형태학적으로 관찰한 결과를 나타낸 도이며,
도 6b는 골절 질환 동물모델의 막성뼈발생 단계에서 실시예1의 BHH 17 투 여 후, 골유합 정도를 형태학적으로 관찰한 결과를 나타낸 도이고,
도 6c는 골절 질환 동물모델의 연골형성 단계에서 실시예1의 BHH 17 투여 후, 골유합 정도를 형태학적으로 관찰한 결과를 나타낸 도이며,
도 6d는 골절 질환 동물모델의 연골내 골화 단계에서 실시예1의 BHH 17 투여 후, 골유합 정도를 형태학적으로 관찰한 결과를 나타낸 도이고,
도 7은 골절 질환 동물모델에서 실시예 1의 BHH 17 투여 후, 골형성에 관여하는 유전자의 발현정도를 나타낸 도이다.
본 발명은 황기, 계지, 자초, 갈근, 지각 및 황백의 복합생약추출물을 유효성분으로 함유하는 골절 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
골절이란 외부로부터의 물리적 충격이나 압박으로 뼈의 연속성이 파괴되는 것이다. 골절은 뼈의 손상에 그치지 않고 그 가까이에 있는 신경 ·근육 ·혈관 등의 손상을 수반하는 일이 적지 않다. 그 결과 말초근의 마비나 근육의 구련(拘攣) ·위축 등을 일으키기 때문에 골절된 수족의 운동기능 회복이 충분하지 못하게 된다. 신체적 징후는 골절된 부분의 기형·부어오름·피부의 변색 등과 함께 정상적으로 움직이지 못하게 되는 것이다. 골절은 어느 경우나 같은 방식으로 치유되는데, 손상된 뼈에는 곧바로 새로운 조직이 만들어져 골절선을 따라 확장되면서 부서 진 조각들을 서로 결합시킨다. 이 조직은 처음에는 부드럽고 물렁하지만 나중에는 골화(骨化)되고 딱딱해진다. 재형성되는 동안은 뼈가 무게를 받거나 골절된 뼈 사이가 움직이지 않도록 보호해야 한다. 따라서 감염, 화농 등을 염려하는 치료 뿐 만 아니라 운동기능 회복을 포함하는 적극적인 골절의 치료가 필요하다.
정상적으로 또는 병적으로 골절이 잘 생기는 경우는 다음과 같다. 어린이들은 칼슘침착이 덜 되어 뼈가 약하고 노인, 특히 폐경기가 지난 여자들은 나이가 들어감에 따라 뼈가 약해지는 골다공증(骨多孔症, osteoporosis)이 생긴다. 골절은 위의 2가지 경우에서 특히 잘 발생한다. 골격의 병리학적인 변화 때문에 뼈가 약해지기도 하는데, 이러한 경우에 아주 작은 압박만 가해져도 골절이 일어난다. 그 밖에 보건·영양·유전 등의 다른 요인이 골절이 쉽게 생기는 정도와 골절된 뒤 치유력에 영향을 미친다.
혈관신생 (angiogenesis)은 기존의 혈관에서 새로운 혈관이 만들어지는 일련의 과정으로, 혈관을 구성하고있는 내피세포의 이동 (migration)과 세포간 장벽인 세포외기질 (ECM; extracellular matrix)을 통과하는 침윤(invasion), 성장(proliferation), 혈관이 만들어지는 단계인 분화(tube-like formation)의 단계를 거치며 이에 대한 유도물질과 억제물질 간의 균형에 의하여 정교하게 조절되는 것으로 알려져 있다 (Schott RJ and Morrow LA, Cardiovasc . Res ., 27(7), pp1155-1161, 1993). 이는 고도로 조절되는 과정으로 상처치유과정 및 배 또는 황체 엑스의 발생을 제외한 정상상태에서는 거의 일어나지 않는다 (Folkman J and Shing Y, J. Biol.Chem., 267(16), pp10931-10934, 1992). 전반적으로 혈관형성은 연관된 기 저막의 효소에 의한 퇴화로 시작되는 몇 가지의 단계와 연관되어 있다. 게다가, 혈관신생에는 혈소판-유래성장인자 (platelet-derived growth factor), 골형성단백질-2 (BMP-2; bone morphogenic protein-2), 혈관내피세포성장인자 (VEGF; vascular endothelial growth factor), 및 섬유아세포성장인자 (bFGF: basic fibroblast growth factor, FGF-2: fibroblast growth factor)와 같은 혈관신생인자에 의한 적절한 자극이 필요하다 (Folkman J and Shing Y, J. Biol . Chem ., 267(16), pp10931-10934, 1992; Ferrara N, Recent Prog . Horm . Res ., 55, pp15-35, 2000; Burgess WT and Maciag T, Annu . Rev . Biochem ., 58, pp575-606, 1989).
최근에는 혈류공급의 영향을 비교적 많이 받는 근골격계에서도 혈관생성의 중요성이 부각되면서 치료성 혈관신생이 각광을 받기 시작하였고, 골유합, 골형성, 골이식, 국소 허혈성 골괴사 등에서 혈관형성의 촉진이 이들의 치료에 도움을 주는 것으로 알려져 활용되고 있다 (안재훈 등, 대한정형외과학회지, 34, pp631-642, 1999). 모세혈관에서 혈장단백질의 투과를 증가시키는 사이토카인 (cytokine)으로서, 세포의 분열과 이동을 촉진하고 세포소멸의 억제를 통해 새로 형성된 혈관의 생존을 유지시키며, 혈관세포의 이동을 촉진시켜 새로운 세포의 발생 및 분화를 촉진시키는 VEGF는 최근 연구에서 뼈 성장 조절에 대한 역할에 많은 관심이 집중되었으며, BMP-2 보다 조골세포의 증식에 더 강력한 유도활성을 갖는다고 보고되었다 (Midy V and Plouet J, Biochem. Biophys . Res . Commun ., 199(1), pp380-386, 1994). 또한 스타틴 (statin)이 VEGF 및 BMP-2 같은 골 동화 요소의 발현을 촉진시키고, 이에 따라 조골세포 (osteoblast)의 증식 및 석회화 (calcification)를 촉진 됨이 보고되었다 (Maeda T. et al., Endocrinology, 144(2), pp681-692, 2003).
골은 석회화된 견고한 표면과 골수로 불리는 내부의 세포 성분이 결합된 특수조직이다. 생리적으로 상이한 이 두 구조의 결합은 일생을 두고 지속되는 골의 재형성 (bone remodeling) 과정에 기인한 것인데, 이는 골에 가해지는 호르몬이나 물리적 자극에 의해 골수에 있는 파골세포 (osteoclast)들이 골의 표면으로 모여 골을 파들어 가면서 파괴하는 골흡수 (bone resorption)와 흡수가 일어난 자리에 모여든 조골세포 (osteoblast)에 의한 골기질의 합성 (bone formation)으로 설명된다 (Park JS, Natl . Nutr ., 215, pp25-31, 2000).
골표면에 위치하는 조골세포는 세포막에 당단백 효소인 알칼리 포스파타제 (ALP; alkaline phosphatase)를 가지고 있으며 Ⅰ형 콜라겐 (Col Ⅰ; type I Collagen), 오스테오칼신 (OCN; osteocalcin), 오스테오폰틴 (OPN; osteopontin), 뼈 시알로단백 (BSP; bone sialoprotein)과 같은 골기질 물질을 분비하고 석회화시키는 역할을 한다 (Collier FM et al., Endocrinology , 139(3), pp1258-1267, 1998).
현재 관절염, 골절, 골다공증등에 상용되는 치료제들(스테로이드 계열 및 비스테로이드계통(NSAIDS)의 진통제인 아스피린, 이소프로펜, 나프록센 소디움 및 여성호르몬 제제)는 소화장애, 위장관 장애 및 신장기능 감소 등과 같은 전신적인 부작용을 유발하여 환자의 연령이 증가할수록 부작용 발생의 빈도가 높아져 노년층에서 많이 유발되는 골관절 질환의 치료시 장기간에 걸친 전신 투여는 많은 문제점을 내포하고 있다(Kahvecioglu S et al., Nephrology, 11(3), pp232-7,2006, Hoefert et al., Orthopade., 35(2), pp206-209, 2006).
따라서 골절의 치료 및 골재생에 있어 부작용을 극소화하며 효과가 우수한 새로운 처방의 필요성이 대두 되고 있으며 이에 따라 한약물의 신약개발에 대한 관심이 세계 각국으로부터 집중되고 있다.
황기(Astragalus membranaceus)는 콩과의 다년생 초본으로, 뿌리를 건조시켜 사용하고, 글루쿠론(glucuron)산, 당액질, 수종의 아미노산, 엽산 등이 유효성분으로 함유되어 있다. 황기는 강심작용이 있으며, 관상동맥 또는 전신의 말초혈관을 확장시켜 혈압 강하 및 이뇨작용을 가진다. 또한, 간장을 보호하여 간 글리코겐의 감소를 막는 작용, 진정작용, 자궁수축, 혈당치의 감소를 유도하는 효과가 있다(정 보섭외, 향약대사전, 영림사, pp662-664, 1998).
계지(Cinnamomum cassia)는 장나무과의 상록교목식물인 계수나무(또는 계피나무라고도 함)의 어린 가지로, 맵고 달며 성질은 따뜻하고 심과 폐와 방광에 작용한다. 위를 튼튼하게 하고, 중풍을 억제하며 진통, 강심작용이 있고 피부혈관을 확장시키고 한선을 자극하여 땀을 내어 해열작용을 하며 바이러스의 억제작용을 한다고 알려져 있으며, 오한, 발열, 두통, 몸의 통증, 땀이 나지 않는 경우나 심계항진 등에 사용한다. 긴 원주형으로 많은 가지가 있으며 길이는 30-70cm, 굵은 쪽의 지름은 0.3-1cm이다. 표면은 홍갈색이나 갈색으로 세로의 능선이 있고 가는 주름과 작은 덩어리 모양의 잎과 가지가 붙어있던 흔적이 있으며, 질은 단단하고 부서지기 쉬우며 절단하기 쉽고, 광서, 광동성이 주산지이며 월남, 스리랑카, 인도 등지에서도 재배된다. 계지의 약리실험 결과로 발한작용, 해열작용, 진통작용, 강심작용, 항알레르기작용, 항바이러스작용 및억균작용 등이 밝혀졌으나, 현재까지 계지의 골유합, 골재생 활성에 의한 골절 치료 효과가 교시되거나 개시된 바는 없다. 감소를 막는 작용, 진정작용, 자궁수축, 혈당치의 감소를 유도하는 효과가 있다(정 보섭외, 향약대사전, 영림사, p 453, 1998)
자초(Lithospermum erythrorhizon; Siebold & Zuccarini)는 지리적으로는 일본, 만주, 중국에 분포하며, 지치과에 속하며, 우리나라 전국 각처의 산야지초원에 자생하였으나 지금은 드물게 나타나며 전라남도 진도 지방에서 많이 재배한다. 자초뿌리에는 홍색을 띤 나프토키논(naphthoquinone) 유도체인 시코닌(Shikonin), 아세틸 시코닌(Acetylshikonin), 이소부티릴 시코닌(Isobutyryl shikonin), β,β-디메틸아크릴 시코닌(β,β-dimethylacryl shikonin), 이소발레릴 시코닌(Isovaleryl shikonin), α-메틸-n-부티릴 시코닌(α-methyl-n-butyryl shikonin), 그리고 β-히드록시이소발레릴 시코닌(β-hydroxyisovaleryl shikonin)등이 함유되어 있으며, 한방에서는 뿌리를 건위, 강장, 황달, 임질, 개선(疥癬), 익기(益氣), 해독, 해열, 이대소변(利大小便), 청열(淸熱), 종창, 화상, 동상, 습진, 물집, 피임약 등에 약재로 사용하며, 민간에서는 불로약으로 사용하기도 한다. 이외에도 항염증, 항균 그리고 항바이러스 효과 등이 있는 것으로 알려져 있다. 감소를 막는 작용, 진정작용, 자궁수축, 혈당치의 감소를 유도하는 효과가 있다(정 보섭외, 향약대사전, 영림사, p 891, 1998)
갈근(Pueraria thunbergiana Benth)은 한국 전 국토에 자생하는 칡(Pueraria lobata Ohwi)의 주피를 제거한 뿌리로서, 그 성분으로는 이소플라본(isoflavone) 푸에라린(puerarin), 푸에라린 자이로사이드(puerarin xyloside), 다이드제인(daidzein), 베타시토스테롤(β-sitosterol), 아락킨 산(arackin acid) 또는 다량의 전분이 함유되어 있다. 갈근과 관련한 약리 작용으로 항산화 작용, 항염 작용, 혈압 강하 작용, 알코올 중독 예방 작용, 간 보호 작용, 숙취 억제 작용, 항천식 작용 등이 보고되었다. (박관하 외, 한국농화학회지, 44(1), p38 ~ 39, 2001) 이와 관련하여 이소플라본과 관련한 성분 연구가 많이 보고 되어 있고, 갈근으로부터 추출되는 플라본은 뇌 및 관상동맥의 혈류량을 증가시킬 수 있어 뇌하수체 후엽 호르몬에 의해 발생하는 급성신근허혈을 예방할 수 있다. 또한 다이드제인의 소염에 대한 효능이 밝혀졌으며, 이에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. (정보섭 외, 향약대사전, p 704, 영림사, 1998)
지각(citrus aurantium fruit)은 운향(Rutaceae)에 속하는 탱자나무, 광귤나무의 성숙하기 직전의 미성숙 과실로서, 건조하여 사용한다(정보섭외, 향약대사전, p 793, 영림사, 1998).
황백(Phellodendron amurensis)은 황벽나무의 껍질을 약재로 이르는 말로, 황경피라고도 한다. 낙엽활엽 교목으로 높이 10m 정도로 자라는데, 껍질에는 코르크가 발달했으며 속껍질은 황색이다. 우리나라에서는 제주,전남 지역을 제외한 전지역에서 분포하고, 일본, 만주, 중국,아무르 및 우수리 등지에 분포하며, 잡목 숲 또는 산속의 계곡에서 자란다. 황백은 혈당을 저하시키는 작용을 하며, 폐렴쌍구균, 인형결핵균, 포도상구균 등을 억제함과 동시에 종양세포의 번식을 저지시키고, 살균작용을 한다. 또한 일반 알칼로이드가 지니는 전신작용을 하지 않기 때문에 다 량으로 투여해도 부작용이 없으므로 정장제뿐 아니라 건위제로 사용할 수 있다. 또한 이 약재에 대하여 여러 세균의 내성(耐性)도 생기지 않으므로 유행성 눈병이 유행할 때 세안 소독약으로도 사용할 수 있다. 그 외에도 혈압강하, 중추신경계 억제, 항염증 등의 효과도 보고되어 있으나, 현재까지 황백의 골유합, 골재생 활성에 의한 골절 치료 효과가 교시되거나 개시된 바는 없다.(정보섭 외, 향약대사전, p 790, 영림사, 1998)
지금까지 황기, 계지, 자초, 갈근, 지각 및 황백을 복합 처방 시 이들의 골유합 및 골재생에 대한 연구는 보고된 바 없다.
이에 본 발명자들은 황기, 계지, 자초, 갈근, 지각 및 황백의 복합생약추출물을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물의 조골세포의 증식 및 분화 촉진, 알칼린 포스파타제(ALP, akaline phosphatase) 활성 촉진, 혈관 내피세포 성장인자(VEGF, vasal endothelial growth factor)의 분비 촉진 및 골절 동물모델에서 골유합 촉진 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 조골세포의 증식 및 분화 촉진, 알칼린 포스파타제(ALP, akaline phosphatase) 활성 촉진, 혈관 내피세포 성장인자(VEGF, vasal endothelial growth factor)의 분비 촉진 및 골절 동물모델에서 골유합 촉진 효과를 갖는 황기, 계지, 자초, 갈근, 지각 및 황백의 복합생약추출물을 유효성분으로 함유하는 골절 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 황기, 계지, 자초, 갈근, 지각 및 황백의 복합생약추출물을 유효성분으로 함유하는 골절 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 황기, 계지, 자초, 갈근, 지각 및 황백의 복합생약추출물을 유효성분으로 함유하는 골절 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본원에서 정의되는 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물 및 에탄올의 혼합용매, 보다 바람직하게는 30 내지 70% 에탄올 혼합용매에 가용한 추출물을 포함한다.
본원에서 정의되는 상기 추출물은 황기 : 계지 : 자초 : 갈근 : 지각 : 황백이 1~5 : 1~5 : 1~5 : 1~5 : 1~5 : 1~5, 바람직하게는 1~2 : 1~2 : 1~2 : 1~2 : 1~2 : 1~2의 중량비(w/w)로 배합된 복합생약추출물임을 특징으로 한다.
본원에서 정의되는 골절 질환은 완전골절, 불완전골절, 분쇄성골절, 개방성골절, 폐쇄성골절, 압박성골절, 치밀성골절, 분열성골절 또는 병리적골절로부터 선택된 하나 이상의 질환, 바람직하게는 완전골절, 폐쇄성골절 등을 포함한다.
본 발명의 추출물은 포르모노네틴, 알기닌, 신남산, 다이드제인, 다이드진, 푸에라린, 팔마틴, 베르베린 및 베타-디-글루코피로노사이드 등을 함유한다.
이하, 본 발명의 추출물을 수득하는 방법을 상세히 설명한다.
본 발명의 복합생약추출물은 동일한 양의 황기, 계지, 자초, 갈근, 지각 및 황백을 세절하여 그것의 약 1 내지 20배, 바람직하게는 약 5 내지 15배에 달하는 부피의 물, C1 내지 C4의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 30 내지 70% 에탄올로, 실온에서 약 0.5 내지 48시간, 바람직하게는 1 내지 30시간 동안 열수 추출, 냉침 추출, 환류냉각 추출, 초음파 추출 등의 추출방법, 바람직하게는 환류냉각 추출방법을 이용하여 추출한 추출액을 감압 여과하여 얻은 추출물을 약 40 내지 80℃, 바람직하게는 약 60 내지 70℃에서 감압 농축한 후, 증류수를 가해 현탁하여 진공 동결건조, 열풍건조 또는 분사방식에 의한 건조, 바람직하게는 동결건조하여 본 발명의 복합생약추출물을 수득할 수 있다.
본 발명의 황기, 계지, 자초, 갈근, 지각 및 황백 복합생약추출물을 유효성분으로 함유하는 골절 질환 예방 및 치료용 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 ~ 50 중량% 포함한다.
본 발명은 상기의 제조공정으로 얻어진 황기, 계지, 자초, 갈근, 지각 및 황백 복합생약추출물을 유효성분으로 함유하는 골절 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 추출물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.
본 발명의 추출물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 추출물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과의 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 추출물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출액에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.0001 내지 100 ㎎/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 ㎎/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 추출물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제조공정으로 얻어진 황기, 계지, 자초, 갈근, 지각 및 황백 복합생약추출물을 유효성분으로 함유하는 골절 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 등이 있다.
또한, 골절 질환의 예방 및 개선 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제, 액제등의 형태를 포함한다. 본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 계지 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.
상기 외에 본 발명의 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 추출물은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 추출물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 복합생약추출물( BHH 17)의 제조
경희의료원 한방병원에서 황기, 계지, 갈근, 자초, 지각 및 황백을 250g씩 구입하여 불순물을 제거하여 세절한 후 황기, 계지, 갈근, 자초, 지각 및 황백을 250g씩 2L의 50%(v/v) 에탄올 수용액을 가해 교반하면서 6시간 동안 환류냉각 추출방법을 이용하여 추출액을 추출하고 여과지로 여과한 후, 37℃에서 농축하고 1-2일 동안 동결 건조하여 분말 상태의 황기, 계기, 갈근, 자초, 지각 및 황백의 복합생약추출물 37g을 수득하였고, 하기 실험예의 시료로 사용하였다. (이하, BHH 17이라 명명함.)
참고예 1. 조골세포 배양
사람유래 조골세포-유사(osteoblast-like) 세포주인 Saos-2세포 (ATCC 등록번호; HTB-85)는 ATCC (American Type Culture Collection, 미국)로부터 구입하였으며, 15% 우태아혈청(FBS)과 1 % 페니실린/스트렙토마이신(인비트로젠사, 캘리포니아, 미국)이 첨가된 배지 (McCoy's 5A, Gibco BRL, 미국)를 이용하여 배양하였다.
참고예 2. 사람의 하악골에서 분리한 조골세포 배양
정형외과 환자의 하악골에서 얻어진 조직으로부터 콜라겐에이즈 Ⅱ형을 이용하여 세포를 수득하였으며, 15% 우태아혈청(FBS)과 1 % 페니실린/스트렙토마이신(인비트로젠사, 캘리포니아, 미국), 5mg/ml 아스코르브산과 10-8M 덱사메타손(Dexamethason)이 첨가된 배지(McCoy's 5A, Gibco BRL, 미국)를 이용하여 배양하였다.
실험예 1. 조골세포 성장 촉진 활성 측정
상기 참고예 1에서 배양한 조골세포에 실시예 1의 BHH 17을 처리시, 성장촉진효과를 알아보기위해, 문헌에 기재된 WST-8 어세이 방법(셀 카운팅 키트-8, 도진도 분자 테크날리지, 도쿄)을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(Hayashi Y et al., Brain Res. 29, p1025(1-2):29-34, 2004).
조골세포-유사(osteoblast-like) 세포인 Saos-2 세포를 1x104 세포수/웰의 농도로 96-웰 플레이트에 분주한 후, 실시예 1의 BHH 17을 농도별 (0.01, 0.1, 1, 10, 100㎍/㎖)로 100㎕씩 첨가하여 72시간 동안 배양하였다. 10㎕의 WST-8 (수용성 테트라졸염;2-(2-메톡시-4-나이트로페닐)-3-(4-나이트로페닐)-5-(2,4-다이설포페닐 )-2H-테트라졸리움, 모노소티움 염)을 가하고 2시간 동안 더 배양하여 WST-8 포르마잔이 형성되어 발색되면 ELISA 판독기를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 대조군에 대한 시료처리군의 흡광도(%)를 이용하여 세포생존율을 측정하였고, 그 결과를 하기 표 1 및 도 1에 나타내었다.
실험군 BHH17의 농도(㎍/㎖) 세포생존율(%)
대조군 0 100
BHH 17 투여군 0.01 109.4± 1.5
0.1 123.5± 2.2
1 119.1± 1.9
10 126.7± 0.8**
100 224.5± 1.1***
**: p < 0.01 ***:p < 0.001
실험 결과, 상기 표 1에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 BHH 17을 0.1 내지 100㎍/㎖를 첨가한 조골세포(Saos-2)는 대조군에 비해 세포생존율이 높았고, 실시예 1의 BHH 17의 농도가 높아질수록 세포생존율이 높아졌으며, 특히 100㎍/㎖의 농도에서 224.5%로 세포생존율이 유의하게 가장 높았다. 따라서 실시예 1의 BHH17은 조골세포 성장촉진에 탁월한 효과가 있음을 알 수 있었다.
실험예 2. 알칼리 포스파타제 (ALP)의 활성 측정
상기 참고예 1에서 배양한 조골세포의 분화에 실시예 1의 BHH 17이 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해 골 형성의 지표가 되는 효소로써 조골 세포의 분화 중기에 생성되는 혈청효소인 알칼린 포스파타제(ALP, alkaline phosphatase)의 활성을 측정하였다 (Zhao Y et al., Biol. Pharm. Bull., 28(8), pp1371-1376, 2005).
알칼린 포스파타제 활성은 세포 내 알칼린 포스파타제가 파라-니트로페닐포스페이트(pNPP; p-nitrophenylphosphate)를 파라-니트로페놀(p-nitrophenol)과 인산염(phosphate)으로 분해하여 발색하는 정도를 키트(ALP kit, 시그마알드리치사, MO, 미국)를 이용하여 측정하였다. 조골세포-유사(osteoblast-like)세포인 Saos-2 세포를 1x104 세포수/웰의 농도로 96-웰 플레이트에 분주한 후, 실시예 1의 BHH 17을 농도별 (0.01, 0.1, 1, 10, 100㎍/㎖)로 100㎕씩 첨가하여 72시간 동안 배양하였다. 그런 후 Saos-2 세포를 0.1 % 트리톤 X-100 (Triton X-100, 시그마, 미국)으로 용해시키고, 초음파 기계 (브란슨사, 미국)로 처리 후 12,000g, 4℃에서 10분간 원심 분리하였다. 상등액을 반응 완충액과 함께 37℃에서 3분간 배양한 후 0.1 N NaOH를 이용하여 반응을 정지시키고, 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준선은 파라-니트로페놀(p-nitrophenol, 시그마 알드리치사, MO, 미국)을 사용하여 정량하였고, 이를 근거로 시료의 알칼린 포스파타제의 량을 환산하였고, 그 결과를 하기 표 2 및 도 2에 나타내었다.
실험군 BHH17의 농도(㎍/㎖) ALP 활성(%)
대조군 0 100
BHH 17 투여군 0.01 143.5± 2.1*
0.1 142.9± 1.7*
1 147.9± 0.9**
10 149.8± 1.3*
100 151.3± 1.8*
**: p < 0.01 ***:p < 0.001
실험결과, 상기 표 2에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 BHH 17을 처리한 조골세포의 경우 대조군과 비교하여 알칼린 포스파타제의 활성이 훨씬 더 높았고, 실시예 1의 BHH 17의 농도가 높아질수록 ALP 활성이 높아졌으며, 특히 100㎍/㎖의 농도에서 151.3 %로 ALP 활성이 유의하게 가장 높았다. 따라서 실시예 1의 BHH 17은 조골세포의 분화를 촉진하는데 탁월한 효과가 있음을 알 수 있었다.
실험예 3. 혈관내피성장인자(VEGF) 분비 촉진 활성 측정
실시예 1의 BHH 17이 상기 참고예 1에서 배양한 조골세포에서의 혈관내피성장인자(VEGF, vascular endothelial growth factor)분비에 미치는 영향을 알아보기 위해 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(Huh et al., J Ethnopharmacol, 104(3), 345-350, 2006, Geiger et al., J Bone Miner Res. 20(11), 2028-2035, 2005).
조골세포-유사(osteoblast-like) 세포인 Saos-2 세포를 1x104 세포수/웰의 농도로 96-웰 플레이트에 분주한 후, 실시예 1의 BHH 17을 농도별(0.1, 10㎍/㎖)로 100㎕씩 첨가하여 72시간 동안 배양한 다음, -70 ℃에 보관하여 ELISA 키트 (VEGF ELISA 키트, R&D 시스템사, MN, 미국)를 이용하여 혈관내피성장인자(VEGF, vascular endothelial growth factor)의 발현되는 양을 정량하였다. 항체가 표지된 키트의 플레이트에 상기 배양액을 100㎕씩 분주하여 반응시키고, 인산염완충액 (PBS)으로 세척하여 퍼록시다제가 부착된 염소 항-마우스 면역글로불린G (peroxidase-labelled goat anti-mouse IgG, R&D 시스템사., MN, 미국)와 반응시킨 후, 다시 세척하여, 기질(TMB; 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘)을 이용하여 발색시키고 반응을 종료시킨 후 ELISA 판독기를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 하기 표 3 및 도 3에 나타내었다.
실험군 BHH17의 농도(㎍/㎖) VEGF 활성(%)
대조군 0 100
BHH 17 투여군 0.1 123.8
10 137.5
실험결과, 상기 표 3에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 BHH 17을 첨가한 조골세포에서 123.8% 내지 137.5%로 대조군과 비교하여 혈관생성촉진인자인 VEGF의 분비가 훨씬 많이 증가하였고, 그 농도가 높아질수록 VEGF가 더 많이 분비되었다. 따라서, 실시예 1의 BHH 17은 VEGF를 분비하여 혈관생성을 촉진시키는데 탁월한 효과가 있음을 알 수 있었다.
실험예 4. 사람의 하악골에서 분리한 조골세포의 성장 촉진 활성 측정
실시예 1의 BHH 17의 상기 참고예 2에서 배양한 조골세포의 증식에 대한 영향을 알아보기 위해 WST-8 어세이 방법(셀 카운팅 키트-8, 도진도 분자 테크날리지, 도쿄)을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.
사람의 하악골에서 분리한 조골세포를 1x104 세포수/웰의 농도로 96-웰 플레이트에 분주한 후, 실시예 1의 BHH 17을 농도별 (0.01, 0,1, 1, 10, 100 ㎍/㎖)로 100㎕씩 첨가하여 72시간 동안 배양하였다. 10㎕의 WST-8(수용성 테트라졸염;2-(2-메톡시-4-나이트로페닐)-3-(4-나이트로페닐)-5-(2,4-다이설포페닐)-2H-테트라졸리움, 모노소티움 염)를 가하고 2시간 더 배양하여 WST-8 포르마잔이 형성되어 발색되면 ELISA 판독기를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 대조군에 대한 시료처리군의 흡광도(%)를 이용하여 세포생존율을 측정하였고, 그 결과를 하기 표 4 및 도 4에 나타내었다.
실험군 BHH17의 농도(㎍/㎖) 세포생존율(%)
대조군 0 100
BHH 17 투여군 0.01 118.9
0.1 121.1
1 119.9
10 128.0
100 139.5
실험 결과, 상기 표 4에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 BHH 17을 0.1 내지 100㎍/㎖를 첨가한 조골세포는 대조군에 비해 세포생존율이 높았고, 실시예 1의 BHH 17의 농도가 높아질수록 세포생존율이 높아졌으며, 특히 100㎍/㎖의 농도에서 139.5%로 세포생존율이 탁월하게 높았다. 따라서 실시예 1의 BHH17은 하악골에서 분리한 조골세포의 성장촉진에 탁월한 효과가 있음을 알 수 있었다.
실험예 5. 사람의 하악골에서 분리한 조골세포의 알칼린포스파타제(ALP) 활성 측정
상기 참고예 2에서 배양한 조골세포의 분화에 실시예 1의 BHH 17이 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해, 키트(ALP 키트, 시그마 알드리치사, MO, 미국)를 이용하여 알칼린 포스파타제(ALP, alkaline phosphatase)의 활성을 측정하였다.
사람의 하악골에서 분리한 조골세포를 1x104 세포수/웰의 농도로 96-웰 플레이트에 분주한 후, 실시예 1의 BHH 17을 농도별 (0.01, 0.1, 1, 10, 100㎍/㎖)로 100㎕씩 첨가하여 72시간 동안 배양하였다. 그런 후 조골세포를 0.1% 트리톤 X-100 (Triton X-100, 시그마, 미국)으로 용해시키고, 초음파 기계 (브란슨사, 미국)로 처리 후 12,000g, 4℃에서 10분간 원심 분리하였다. 상등액을 반응 완충액(reaction buffer)과 함께 37℃에서 3분간 배양한 후, 0.1 N NaOH를 이용하여 반응을 정지시키고, 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준선은 파라-니트로페놀 (p-nitrophenol;시그마 알드리치사, MO, 미국)을 사용하여 정량하였고, 이를 근거로 시료의 알칼린 포스파타제의 양을 환산하였고, 그 결과를 하기 표 5 및 도 5에 나타내었다.
실험군 BHH17의 농도(㎍/㎖) ALP 활성(%)
대조군 0 100
BHH 17 투여군 0.01 118.5
0.1 120.3
1 146.1
10 149.5
100 162.1
실험결과, 상기 표 5에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 BHH 17을 처리한 조골세포의 경우 대조군과 비교하여 알칼린 포스파타제의 활성이 훨씬 더 높았고, 실시예 1의 BHH 17의 농도가 높아질수록 ALP 활성이 높아졌으며, 특히 100㎍/㎖의 농도에서 162.1%로 ALP 활성이 가장 높았다. 따라서 실시예 1의 BHH 17은 사람의 조골세포에서도 분화를 촉진하는데 탁월한 효과가 있음을 알 수 있었다.
실험예 6. 랫트를 이용한 골유합 동물 모델에서 실시예 1의 BHH 17의 효능 측정
6-1. 실험동물의 준비
골유합 동물모델에서 실시예 1의 BHH 17의 효능을 측정하기 위하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.
8주령의 280g의 SD계 수컷 랫트(대한바이오링크)인 폐쇄성골절모델(BCMF, Bone closed fracture model)군에 실시예 1의 BHH 17을 총 2 주 동안 1일 간격으로 200 mg/kg을 경구투여한 후, 대조군과 비교하여 조직 형태학적인 관찰을 수행하였고, 골유합에 관여하는 유전자를 확인해 보았다.
6-2. 조직 형태학적 관찰
상기 실험예 6-1에서 제작한 골절모델에 실시예 1의 BHH 17을 2주간 투여한 후 H&E(hematoxylin-eosin)로 염색하여 현미경으로 관찰하였다. 또한 VEGF 항체를 이용하여 VEGF항체로 면역 염색한 다음, 골유합에 관여하는 VEGF의 발현양상을 염증 부위 및 막성뼈발생 단계, 연골형성 단계, 연골내 골화단계에서 확인하였고, 그 결과를 도 6a 내지 6d에 나타내었다.
실험 결과, 도 6a 내지 6d에서 나타난 바와 같이, 염증부위 및 골형성(ossification)단계에서 VEGF 발현이 두드러지게 증가하는 것을 알 수 있었고, 골유합 초기 유착 및 마지막 단계에서 VEGF 발현이 증가함을 알 수 있었다.
6-3. 골유합에 관여하는 유전자 발현 분석
상기 실험예 6-1에서 제작한 골절모델에 실시예 1의 BHH 17을 2주간 투여한 후, 골유전자 발현 양상을 알아보기 위한 실험을 하기와 같이 수행하였다.
골절을 유도시킨 후, 실시예 1의 BHH 17을 투여하지 않은 대조군 및 실시예 1의 BHH 17 투여군의 골절 조직에서 RNA를 분리하여, 골유합에 관여하는 유전자인 콜라겐 타입 I(collagen type I, Col I), 오스테오칼신(osteocalcin, OCN), 오스테오폰틴(osteopontine, OPN) 및 VEGF 유전자의 발현 양상을 RT-PCR 방법을 통하여 알아보았다. RT-PCR은 트리졸 시약(TRIzol reagent, Invitrogen Corporation, CA, USA)을 사용하여 실시예 1의 BHH 17을 투여한 랫트 대퇴골 (femur)의 RNA를 준비하였다. 키트(Reverse transcription system, Promega, madison, USA)를 이용하여, RNA 10 ㎍, 역전사효소 (AMV Reverse transcriptase) 12 unit, RNase 저해효소 (RNasin RNase inhibitor) 20 unit, 프라이머 (oligo(dT) primer) 0.25㎍, 0.7 mM dNTPs, 5 mM 염화마그네슘 (MgCl2), 완충액 (Reverse transcription 1X buffer)의 조성으로 42 ℃에서 60분간 역전사 공정을 수행하였다. 상기 공정으로부터 수득한 각각의 cDNA는 DNA 중합효소(Taq DNA polymerase, Promega, madison, USA) 1.25 unit, 1.5 mM MgCl, 0.2 mM dNTPs, 0.8 pM 프라이머, 1X 완충액(PCR buffer)의 조성으로 중합효소연쇄반응(PCR;polymerase chain reaction)을 실시하였다. PCR에 의하여 생성된 산물을 1.2% 아가로즈 겔에서 전기영동을 실시한 후, EtBr(ethidium bromide)로 염색하여 특정 밴드를 확인하였다. 지표 유전자로는 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 사용하였으며, PCR에 사용된 프라이머는 하기 표 6에 표시하였다.
유전자 프라이머의 서열
GAPDH 정방향 (서열번호1) 5´CCTGGCCAAGGTCATCCATGACAACTTTGG3´
역방향 (서열번호2) 5´CATGAGGTCCACCACCCTGTTGCTGTAGCC3´
OCN 정방향 (서열번호3) 5´GAGGACCCTCTCTCTGCTCACTCTGCTGGC3´
역방향 (서열번호4) 5´GTGGTGCCATAGATGCGCTTGTAGGCGTCC3´
OPN 정방향 (서열번호5) 5´CTCGGATGAATCTGACGAATCTCACCATTC3´
역방향 (서열번호6) 5´CTTACTCTTAGGGTCTAGGACTAGCTTGTC3´
ColⅠ 정방향 (서열번호7) 5´TGGTCTTGGAGGAAACTTTGC3´
역방향 (서열번호8) 5´AGTATCTCCTTTGGCACCATC3´
VEGF 정방향 (서열번호9) 5´ATGAAGTGGTGAAGTTCATGG3´
역방향 (서열번호10) 5´CACATCTGCAAGTACGTTCG3´
실험 결과, 실시예 1의 BHH 17을 투여한 골절모델에서 대조군과 비교하여 Col I과 OCN의 발현이 두드러지게 증가하였고, OPN과 VEGF의 발현도 증가하였다. 이로부터 BHH 17을 투여한 골절모델에서는 골유합에 관여하는 유전자 발현이 증가함을 알 수 있었다(도 7 참조).
실험예 7. 랫트를 이용한 독성실험
실시예 1의 BHH 17 성분인 갈근이 안전한 물질인지 알아보기 위해 6주령의 특정병원부재 (SPF) SD계 랫트를 이용하여 독성 실험을 수행하였다.
대조군 및 갈근 투여군 각각 6마리를 준비하여 여기에 갈근을 0.5% 메틸셀룰로스 용액에 현탁시켜 2g/kg의 용량으로 1일 1회 2주간 경구 투여한 다음, 동물의 폐사 여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하였고, 혈액학적 검사 및 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.
실험결과, 갈근 투여군에서 폐사하거나 특기할만한 임상증상이 발견되는 일이 없었고, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사 및 부검소견에서도 독성이 관찰되지 않았다. 따라서 본 발명에 따른 갈근은 모든 랫트에서 2000mg/kg까지 독성변화를 나타내지 않으며, 경구 투여 최소 치사량 (LD50)은 2000 mg/kg 이상인 안전한 물질로 판단되었다.
하기에 본 발명의 추출물을 함유하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 산제의 제조
실시예 1의 BHH 17 20 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예 2. 정제의 제조
실시예 1의 BHH 17 10 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 3. 캅셀제의 제조
실시예 1의 BHH 17 10 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 4. 주사제의 제조
실시예 1의 BHH 17 10 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
Na2HPO4,12H2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예 5. 액제의 제조
실시예 1의 BHH 17 20 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 6. 건강 식품의 제조
실시예 1의 BHH 17 1000 ㎎
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 ㎎
비타민 B1 0.13 ㎎
비타민 B2 0.15 ㎎
비타민 B6 0.5 ㎎
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 ㎎
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 ㎎
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 ㎎
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 ㎎
산화아연 0.82 ㎎
탄산마그네슘 25.3 ㎎
제1인산칼륨 15 ㎎
제2인산칼슘 55 ㎎
구연산칼륨 90 ㎎
탄산칼슘 100 ㎎
염화마그네슘 24.8 ㎎
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제제예 7. 건강 음료의 제조
실시예 1의 BHH 17 1000 ㎎
구연산 1000 ㎎
올리고당 100 g
매실농축액 2 g
타우린 1 g
정제수를 가하여 전체 900 ㎖
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
본 발명의 황기, 계지, 자초, 갈근, 지각 및 황백의 복합생약추출물은 조골세포의 증식 및 분화 촉진, 알칼린 포스파타제(ALP, akaline phosphatase) 활성 촉진, 혈관 내피세포 성장인자(VEGF, vasal endothelial growth factor)의 분비 촉진 및 골절 동물모델에서 골유합 촉진 효과를 나타내므로 골절 질환의 예방 및 치료용 약학조성물 및 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (7)

  1. 황기: 계지: 자초: 갈근: 지각: 황백이 1~5 : 1~5 : 1~5 : 1~5 : 1~5 : 1~5의 중량비(w/w)로 배합된 30 내지 70% 에탄올 가용복합생약추출물을 유효성분으로 함유하는 폐쇄성골절 질환의 예방 및 치료용 약학조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 황기: 계지: 자초: 갈근: 지각: 황백이 1~5 : 1~5 : 1~5 : 1~5 : 1~5 : 1~5의 중량비(w/w)로 배합된 30 내지 70% 에탄올 가용복합생약추출물을 유효성분으로 함유하는 폐쇄성골절 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품.
  7. 삭제
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