KR102479180B1

KR102479180B1 - SARS-CoV-2 3CL 프로테아제와 RdRp활성을 억제하는 지유 추출 조성물

Info

Publication number: KR102479180B1
Application number: KR1020210170899A
Authority: KR
Inventors: 장문석; 이태희; 이민지; 이승재; 김하영; 민정빈; 박지혜; 최원형; 박욱하
Original assignee: 주식회사 큐제네틱스
Priority date: 2021-04-08
Filing date: 2021-12-02
Publication date: 2022-12-20
Also published as: KR20220139780A

Abstract

본 발명은 신규한 지유 추출물의 SARS-CoV-2 바이러스 3CL 프로테아제와 RdRp활성 억제 용도에 관한 것으로서, 본 발명의 지유추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 3CL 프로테아제와 RdRp 활성을 억제하여 SARS-CoV-2 및 그의 변이체 바이러스에 의한 감염의 예방 또는 치료에 효과가 있다.

Description

SARS-CoV-2 3CL 프로테아제와 RdRp활성을 억제하는 지유 추출 조성물 {Sanguisorba　officinalis　Linne extract having a suppressive effect against enzymatic activity of the SARS-CoV-2 3C-like protease and RNA-dependent RNA Polymerase}

본 발명은 SARS-CoV-2 바이러스가 보유한 3C-like protease (3CL protease)와 RNA-dependent RNA Polymerase (RdRp)의 활성을 억제하는 지유 (Sanguisorba　officinalis　Linne) 추출물의 기능 및 그의 용도에 관한 것이다.

지유는 오이풀을 일컬으며, 장미과에 속하는 여러해살이 풀이다. 한국, 중국, 일본, 러시아 등지에 분포해 있으며, 산과 들에서 자라나는 야생초이다. 예로부터 지유는 해독, 화상, 설사, 호흡기 및 위장 질환 완화제로 이용되어 왔으며, 지유의 항알러지, 항암, 항산화 등 다양한 효능이 보고되고 있다.

일반적으로 식물을 추출하기 위한 용매로는 메탄올 (methanol), 에탄올 (ethanol) 또는 물을 이용하고 있는데, 지유 열수 추출물은 유용한 효능들이 보고되고 있는데, 구강암 (oralcancer)의 세포 증식을 억제하는 항암효과와 면역능 (immunopotentiation)을 강화시키는 효과가 이전의 연구들을 통해 보고되었다. 열수 추출 방식은 다른 방법들과 비교하여 쉽게 천연물질을 추출할 수 있고, 유용한 성분들을 다량으로 얻을 수 있으며, 에탄올 등과 같은 화학성분을 이용하지 않은 추출방식이므로 독성이 낮아 추출물의 효능이 높고 식품섭취로서 안전성이 있다고 할 수 있다. 또한 지유는 산지에서 자라는 약초과로 재배가 용이하고, 자생력이 높으며 쉽게 구할 수 있다는 장점이 있다.

한국등록특허 제 10-17842540000 호에는 '지유 추출물을 유효성분으로 함유하는 패혈증의 예방 또는 치료용 조성물 및 건강기능식품 조성물'이 개시되어 있고 한국공개특허 제2011-0117540호에는 '지유 추출물을 유효성분으로 함유하는 헬리코박터 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강식품'이 개시되어 있으나, 현재까지 문헌상으로 지유 추출물이 신종 바이러스인 SARS-CoV-2 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 감염의 예방, 개선 또는 치료에 유효함이 보고된 적 없다.

본 발명자들은 지유 추출물이 SARS-CoV-2에 의한 감염의 예방 또는 치료 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 지유 추출물을 유효성분으로 하여 SARS-CoV-2의 체내 증식에 필수적 효소인 3CL protease 및 RdRp 활성을 저해시키는 것을 통해 SARS-CoV-2에 의해 유발된 질환에 대해서 치료 및 예방하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 지유 추출물을 유효성분으로 포함하는, 3CL protease와 RdRp활성 억제를 통해 SARS-CoV-2에 의해 유발된 COVID-19에 대한 치료 및/또는 예방용 조성물을 제공한다.

또한, 지유 추출물을 유효성분으로 포함하는 SARS-CoV-2에 의한 감염의 예방 및/또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

또한, 지유를 건조하는 단계;

상기 건조된 지유를 30 내지 120℃에서 용매로 추출하는 단계; 및

상기 추출된 용액을 동결건조하여 분말을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2바이러스에 의한 감염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 지유 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 SARS-CoV-2 특이적인 3CL 프로테아제와 RdRp 활성을 억제함으로써 SARS-CoV-2에 의해 유발된 COVID-19에 대한 치료 효과가 있다.

도 1은 in vitro assay에서 지유 추출물, 음성대조군 및 양성대조군의 3CL 프로테아제 에 대한 활성 억제 결과를 나타낸 도이다. **, p < 0.01; ***, p < 0.001
도 2는 cell-based assay에서 지유 추출물, 음성대조군 및 양성대조군의 SARS-CoV-2 3CL protease에 대한 활성 억제 결과를 나타낸 도이다. *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001
도 3은 in vitro assay에서 지유 추출물, 음성대조군 및 양성대조군의 SARS-CoV-2 RdRp에 대한 활성 억제 결과를 나타낸 도이다. **, p < 0.01; ***, p < 0.001
도 4는 세포수준에서 지유 추출물, 음성대조군, 양성대조군1(GC376) 및 양성대조군2(Remdesivir)의 SARS-CoV-2 증식 억제 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 SARS-CoV-2 감염 햄스터에서 지유 추출물, 음성대조군, 양성대조군의 몸무게 감소 억제결과를 나타낸 도이다. *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001
도 6 은 SARS-CoV-2 감염 햄스터의 폐 조직에서 지유 추출물, 음성대조군, 양성대조군의 바이러스 증식 억제 결과를 RT-PCR을 통해 확인한 도이다. *, p < 0.05
도 7은 SARS-CoV-2 감염 햄스터의 폐 조직에서 지유 추출물, 음성대조군, 양성대조군의 바이러스 증식 억제 결과를 plaque assay를 통해 확인한 도이다. M, mean value
도 8은 SARS-CoV-2 감염 햄스터의 폐 조직에서 지유 추출물, 음성대조군, 양성대조군의 바이러스 증식억제 결과를 조직염색법을 통해 확인한 도이다.
도 9는 SARS-CoV-2 감염 햄스터의 폐 조직에서 지유 추출물, 음성대조군, 양성대조군의 염증 억제 결과를 나타낸 도이다. *, p < 0.05

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 지유 추출물을 유효성분으로 포함하는 SARS-CoV-2에 의한 감염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

SARS-CoV-2는 감염에 의해 호흡기 증후 군을 일으키는 바이러스로서, 법정감염병 제1급으로 지정되어 있다. 현재 세계적 유행병 (pandemic)을 유발하고 있으며 80대 이상의 노령층에서 치사율이 25%에 이를 정도로 매우 심각한 중증을 유발하고 있는 실정이다. 공기중의 비말이나 대인 접촉 등의 경로를 통해 SARS-CoV-2의 비강내 침투가 전파의 주요 원인으로 지목되고 있다.

사람 체내에 유입된 SARS-CoV-2는 세포 표면에 있는 ACE2 (Angiotensin-Converting Enzyme 2) 수용체와 결합하여 세포내로 침투하고 분열, 증식을 통해 다량의 신규 바이러스를 생성한다 (Jackson CB, et al. Mechanisms of SARS-CoV-2 entry into cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 2021 5;1-18). 생성된 SARS-CoV-2는 세포 밖으로 다시 분비되어 다른 세포에 재침투하는 동일한 과정을 반복하여 증식한다. 따라서 SARS-CoV-2의 세포 감염, 세포내 복제 및 증식에 관여하는 기전은 치료제 개발의 주요 타깃이다.

SARS-CoV-2는 델타형을 포함 다수의 변이체들을 발생시키고 있으며, 이들 변이 바이러스는 주로 숙주세포에 침투역할을 하는 스파이크 도메인 (spike domain)내의 유전자 변이 (genetic mutation)에 기인한다 (Harvey, W.T, et al.　SARS-CoV-2 variants, spike mutations and immune escape.　Nat Rev Microbiol　19,　2021 409-424).

SARS-CoV-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)는 2019년에 처음 알려진 급성 중증 호흡기 질환 코로나바이러스 2로써 양성 방향의 단일 사슬 RNA 바이러스(positive-sense single-stranded RNA virus)로 분류된다. 이 바이러스에 의해 감염된 질환을 코로나바이러스감염증-19(Coronavirus disease 2019)로 명명하였으며, 줄여서 COVID-19라고 부르고 있다.

상기 SARS-CoV-2에 의한 질환은 코로나바이러스감염증-19 일 수 있다. 상기 코로나바이러스감염증-19는 호흡기 질환일 수 있다. 상기 호흡기 질환은 폐렴일 수 있다. 상기 코로나바이러스감염증-19의 증상은 발열, 권태감, 기침, 호흡곤란, 가래, 인후통, 두통, 객혈, 오심 및 설사 중 적어도 하나일 수 있다.

상기 SARS-CoV-2바이러스는 그 변이체를 포함할 수 있다.

상기 변이체는 SARS-CoV-2바이러스의 스파이크 단백질 (spike protein)에 변이가 발생한 것을 특징으로 할 수 있다.

한편, SARS-CoV-2바이러스의 스파이크 단백질 (spike protein)에 발생한 변이 외에, 3CL protease와 RdRp의 활성에 관여하는 부위의 유전자가 변이된 바이러스는 보고되지 않았으므로, 3CL protease와 RdRp의 활성을 타깃으로 하는 억제제는 변이 바이러스에도 동일한 치료 효능을 기대할 수 있다고 알려져 있다.

상기 지유 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 3CL프로테아제 (3C-like protease) 활성을 저해 또는 억제시키는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 지유 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 SARS-CoV-2 특이적으로 3CL 프로테아제와 RdRp활성을 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 3CL 프로테아제는 papain-like protease와 더불어 SARS-CoV-2 유전자에 코딩 되어 있으며 SARS-CoV-2의 체내 증식에 필요한 기능성 단백질 생성에 필수적인 단백질이다. (Anirudhan V, et al. Targeting SARS-CoV-2 viral proteases as a therapeutic strategy to treat COVID-19. J Med Virol. 2021 93(5): 2722-2734). SARS-CoV-2가 코딩하는 증식에 필요한 기능성 단백질들은 숙주세포의 단백질 합성체계를 이용하여 하나의 폴리펩타이드 형태로 발현된다. 특이한 점은, 이 폴리펩타이드 내에 공유 결합으로 연결된 각각의 단백질들은 그의 고유 기능을 발휘하지 못하나, protease에 의해 절단되어 독립적으로 존재할 시 기능을 획득할 수 있다 (Anirudhan V, et al. Targeting SARS-CoV-2 viral proteases as a therapeutic strategy to treat COVID-19. J Med Virol. 2021 93(5): 2722-2734). 3CL protease는 폴리펩타이드에 존재하는11개의 cleavage site에 작용하여 기능성 단백질을 생성시키는 반면, papain-like protease는 3개의 cleavage site에 작용하여 기능성 단백질을 생성시키는 것으로 알려져 있다 (Anirudhan V, et al. Targeting SARS-CoV-2 viral proteases as a therapeutic strategy to treat COVID-19. J Med Virol. 2021 93(5): 2722-2734). 따라서 3CL protease를 억제할 시 papain-like protease 비해 다수의 기능성 단백질의 생성을 억제할 수 있기에 본 효소는 SARS-CoV-2치료제 개발을 위한 주요 타깃일 수 있다.

상기 조성물은 RdRp (RNA-dependent RNA polymerase) 활성을 저해 또는 억제시키는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 RdRp는 SARS-CoV-2포함 대부분의 RNA 바이러스에서 RNA 게놈의 복제와 전사를 담당하는 효소이다 (Aftab, S.O., et al. Analysis of SARS-CoV-2 RNA-dependent RNA polymerase as a potential therapeutic drug target using a computational approach. J Transl Med 2020 18, 275).

본 발명자들은 SARS-CoV-2 치료 및 예방제 개발을 위해 223종의 생약 열수추출물을 이용하여 SARS-CoV-2 특이 3CL protease와 RdRp의 효소 활성을 억제하는 물질을 스크린 하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 지유를 이용하여 지유 추출물을 제조하였고, 이를 인 비트로, 세포시험, 및 햄스터를 이용하여 동물실험에 사용하였다. 그 결과, 지유 추출물을 사용하지 않은 음성대조군에 비하여 3CL 프로테아제 및 RdRp억제를 통한 SARS-CoV-2 증식 저해 효과를 나타냄으로써 (도 1 내지 도 9 참조), 본 발명의 지유 추출물은, SARS-CoV-2바이러스에 의한 감염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다.

또한, 하기 실시예 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 실험을 위해 사용한3CLglow assay kit (Montana Molecular, 미국)는 3CL 프로테아제에 의해 절단되는 도메인 (domain)이 GFP 단백질의 c-terminal에 부착되어 있는 GFP 융합(fusion) 단백질을 기반으로 한다. GFP fusion단백질은 형광을 나타내지 않는 반면, c-terminal fusion domain이 3CL 프로테아제에 의해 절단된 순수 GFP단백질은 형광을 나타낸다. 즉, 3CL 프로테아제를 억제하면 GFP fusion단백질로부터 형광 생성 역시 감소한다. 따라서, 형광 생성이 감소한 것을 통해 지유 추출물에 의해 SARS-CoV-2 3CL 프로테아제의 활성이 억제된 것을 확인할 수 있었다.

또한, 하기 실시예 5에서 볼 수 있는 바와 같이, 양성대조군으로 RdRp 억제제 (inhibitor)인 몰누피라비르 (molnupiravir)는 100 mg/kg내지 300 mg/kg, 바람직하게는 250 mg/kg를 함유하는 MC vehicle을 햄스터에 경구 투여할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 몰누피라비르의 함량이 상기 범위 미만이면 햄스터에서 SARS-CoV-2의 억제 효과가 미미하고, 상기 범위를 초과하여 많으면 비용면에서 실익이 적다. 이때 고농도 (250 mg/kg)를 사용한 이유는 몰누피라비르 저농도 (15 mg/kg)를 사용하는 족제비인 패럿 (ferret) (Cox RM et al. Therapeutically administered ribonucleoside analogue MK-4482/EIDD-2801 blocks SARS-CoV-2 transmission in ferrets. Nat Microbiol. 2021 6(1):11-18)과 다르게 햄스터에서는 고농도 몰누피라비르 (molupiravir)가 SARS-CoV-2의 억제 효능을 발휘하기 때문이다 (Rosenke K et al. Orally delivered MK-4482 inhibits SARS-CoV-2 replication in the Syrian hamster model. Nat Commun. 2021 12(1):2295).

상기 지유 추출물은 물, 알코올 또는 이들의 혼합물인 용매로 추출되는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 용매는 물, 에탄올, 탄소수 1 내지 5의 저급 알코올 또는 탄소수 1 내지 5의 저급 알코올 수용액일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 용매를 통한 추출 시 추출온도는 20℃ 내지 130℃, 30℃ 내지 120℃ 인 것이 바람직하고, 90℃ 내지 110℃인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정하지 않는다

상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 발명의 용어 "약학적으로 허용 가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 생리식염수, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이트, 프로필렌글리콜 및 리퀴드 파라핀으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 통상의 담체, 부형제 또는 희석제 모두 사용 가능하다. 상기 성분들은 상기 유효성분인 지유 추출물에 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.

상기 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 60, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제 및 액체 형태로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.

상기 추출물의 약학적 투여 형태는 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 경구로 투여될 수 있으며, 고형제제 또는 액상제제일 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다. 그 투여 용량에 특별한 제약은 없고, 체내 흡수도, 체중, 환자의 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 유효량 범위를 고려하여 제조하도록 하며, 이렇게 제형화된 단위 투여형 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감시하거나 관찰하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나 일정 시간 간격으로 수회 투여할 수 있다. 상기 투여는 바람직하게는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다.

상기 지유 추출물은 오이풀 (Sanguisorba officinalis L.)의 뿌리, 긴오이풀 (Sanguisorba longifolia) 뿌리 또는 이들의 혼합물로부터 추출되는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 본 발명은 지유 추출물을 유효성분으로 포함하는 SARS-CoV-2에 의한 감염 또는 이로인한 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

상기 식품은 건강기능식품 또는 음료 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 지유 추출물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 지유 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 추출물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 지유 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함할 수 있따.

본 발명의 건강기능음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.

상기 건강기능식품 외에 본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 내지 2 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

상기 지유 추출물은 하기의 단계를 포함하는 제조방법으로 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:

1) 지유를 건조하는 단계;

2) 상기 건조된 지유를 30 내지 120℃에서 용매로 추출하는 단계; 및

3) 상기 추출된 용액을 동결건조하여 분말을 제조하는 단계

본 발명은 1) 지유를 건조하는 단계;

3) 상기 추출된 용액을 동결건조하여 분말을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2에 의한 감염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 1) 지유를 건조하는 단계;

3) 상기 추출된 용액을 동결건조하여 분말을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2에 의한 감염의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물 제조방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 지유는 오이풀 또는 긴오이풀을 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있으며, 잎, 뿌리, 줄기 및 가지 등 어느 것도 이용가능하고, 이에 한정하지 않으나 본 발명의 바람직한 실시예에 의하면 오이풀의 뿌리 또는 긴오이풀 뿌리를 이용하는 것이 가장 바람직하다.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 추출 용매는 물, 알코올, 주정 또는 이들의 혼합물 및 유기 용매를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 알코올로는 탄소수1 내지 탄소수5의 저급 알코올을 이용하는 것이 바람직하며, 저급 알코올로는 에탄올 또는 메탄올을 이용하는 것이 바람직하다. 추출방법으로는 열수추출, 진탕추출, Soxhlet 추출 또는 환류 추출을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 추출용매를 건조된 지유의 총 중량에 5 내지 30배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하고, 20배 첨가하여 추출하는 것이 더욱 바람직하다. 추출온도는 20℃ 내지 130℃ 인 것이 바람직하고, 90℃ 내지 110℃인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 2 내지 48시간인 것이 바람직하며, 15 내지 30시간인 것이 더욱 바람직하고, 24시간인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 아울러, 추출 횟수는 1 내지 5회인 것이 바람직하며, 3 내지 4회 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하고, 3회인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 지유 추출물은 30 내지 95% 주정 추출물인 것이 바람직하고, 40 내지 90% 주정 추출물인 것이 보다 바람직하며, 50 내지 80% 주정 추출물인 것이 가장 바람직하고, 상기 50% 미만 주정 추출물의 경우에는 추출 효율이 낮아져 목적으로 하는 SARS-CoV-2바이러스에 의한 감염의 예방 또는 치료효과를 나타내지 못할 수 있고, 80% 초과 주정 추출물의 경우, 지유 추출물의 생산 단가를 높이게 되어 좋지 않다.

상기 제조방법을 통해 제조된 지유 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 3CL 프로테아제와 RdRp 활성을 억제함으로써, SARS-CoV-2에 의한 감염의 예방 또는 치료에 효과를 나타내는 것을 특징으로 할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

다만, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 지유 추출물 제조

건조된 지유(오이풀 (Sanguisorba officinalis Linne)의 뿌리)에 건조 지유 총 중량의 20배 무게의 증류수를 첨가하여 1시간 30분동안 냉침하였다. 그 후 대형 전탕기를 이용하여 100^oC에서 1시간 30분동안 리플럭스(reflux)하여 용액을 추출했다. 추출된 용액을 감압여과하여 불순물을 제거한 뒤, -20^oC에서 동결 건조하여 분말을 제조하였다. 상기 동결건조된 0.2 g 지유 분말을 10 mL 증류수에 넣어 지유 추출물 함유 용액 (20 mg/ml)을 제조하여 인 비트로 (in-vitro) 및 세포시험에 사용하였다. 햄스터를 이용한 동물시험을 위해서는 동결건조된 2 g 지유 분말을 부형제 0.1 g과 섞어 10 mL 증류수에 넣어 지유 추출물 함유 용액을 제조하였다.

실시예 2. 지유 추출물에 의한 SARS-CoV-2 특이 3CL 프로테아제의 활성 억제

2-1. 인 비트로 실험를 이용한3CL 프로테아제 활성 분석

3CL 프로테아제 인비트로 (in-vitro) 활성 분석은 하기와 같이 시험관 수준에서 수행되었다. 본 실험은 SARS-CoV-2 3CL 프로테아제(3C-like protease) inhibitor assay kit (BPS bioscience, 미국)를 이용하였다. 3CL 프로테아제의 활성부위와 결합하면 형광을 나타내는 기질 (substrate)과 테스트 시료를 반응시킨 후 공지의 방법으로 형광을 측정하여 시료의 3CL 프로테아제 억제 효능을 확인하였다. 음성 대조군으로 H₂O를 시료와 같은 부피로 사용하였고, 3CL 프로테아제 활성억제 양성 대조군으로 GC376을 각각 0.1, 1, 10 μM 사용하였다. 반응 부피는 50 μl, 처리된 지유 추출물은 각각 2, 20, 200 μg/ml이다.

그 결과 도 1에 나타난 것과 같이 IC50은 26.8 μg/mL였고, 지유 추출물이 양성대조군과 동등 이상으로 SARS-CoV-2 3CL 프로테아제의 활성을 억제하였다.

2-2. 세포기반분석을 이용한 3CL 프로테아제 활성 분석

293 세포를 이용하여 지유추출물의 3CL 프로테아제 활성 억제 효능을 세포 수준에서 검증(Cell-based assay)하였다. 본 실험을 위해 3CLglow assay kit (Montana Molecular, 미국)를 이용하였다.

293 세포 (1x10³개) 24-well plate에 seeding 하였다. 다음날 (18~24 시간 후) 3CL 프로테아제와 그의 기질인 GFP 융합단백질 (fusion protein)을 포함하는 배큘로바이러스 (baculovirus, 1x10³개) (Montana Molecular, 미국)를 293세포에 감염시켰다. 그 후 지유 추출물을 각각1, 10, 100 μg/ml의 농도로 세포에 처리하였다. 음성 대조군으로 H₂O를 처리하였고, 양성대조군으로 GC376각각 0.1, 1, 10 μM을 사용하였다. 24시간 후 지유 추출물의 억제효과를 형광현미경 (배율 100X, Scale bar=100 μm)을 통해 관찰하였다.

그 결과 도 2에 나타난 것과 같이 형광을 발현하는 세포 숫자가 양성대조군인 GC376과 유사하게 지유 추출물 처리군에서도 현저히 감소하였다. 지유 추출물의 세포수준에서 SARS-CoV-2 3CL 프로테아제 활성억제 IC50는 25.98 μg/ml로서 앞선 in-vitro assay 결과와 매우 유사하였다. 따라서, 지유 추출물이 세포수준에서 SARS-CoV-2 3CL 프로테아제의 활성을 억제하는 현저한 효과가 있음을 확인하였다.

실시예 3. 지유 추출물에 의한 SARS-CoV-2 특이 RdRp 활성 억제

RdRp(RNA-dependent RNA polymerase) 인비트로(in-vitro) 활성 분석은 하기와 같이 시험관 수준에서 수행되었다. 실험에 사용된 제품인 RdRp inhibitor assay kit(Profoldin사, 미국)에서 구입하였다. RdRp에 의해 증폭된 RNA와 결합하면 형광을 나타내는 기질을 기반으로 테스트 시료의 효능을 측정했다. RdRp 활성억제에 대한 음성 대조군으로 H₂O를 사용하였고, 양성대조군으로 Aurintricarboxylic acid (ATA) (Hung HC et al. Inhibition of enterovirus 71 replication and the viral 3D polymerase by aurintricarboxylic acid. J Antimicrob Chemother. 2010 65(4): 676-83)를 사용하였다. 반응 부피는 50 μl이고 처리된 지유 추출물은 각각 2, 20, 200 μg/ml이다.

그 결과 도 3에 나타난 것과 같이, IC50은 66.7 μg/ml였고, 지유 추출물이 양성 대조군과 동등 이상으로 RdRp의 활성을 억제하였다.

실시예 4. VERO-E6 세포에서 지유 추출물에 의한 SARS-CoV-2의 증식 억제

VERO-E6 세포를 96 well plate에 well 당 8x10³ cells/100 μL씩 분주하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 하룻밤 (overnight) 배양하여 시험 당일 약 80%정도 차있는 상태 (confluency) 에 도달하도록 하였다. VERO-E6 세포는 아프리카 초록 원숭이의 신장 상피세포로부터 유래된 세포이고, 바이러스 감염 실험에 사용된다 (Govorkova EA, et al. African green monkey kidney (Vero) cells provide an alternative host cell system for influenza A and B viruses.　J Virol. 1996;70(8):5519-5524). 본 실험의 양성대조군으로 3CL 프로테아제의 inhibitor인 GC376과 RdRp inhibitor인 렘데시비르 (Remdesivir) (Gilead Sciences, 미국)를 사용하였다. 시료농도는 지유추출물의 경우 VERO-E6 세포에 독성이 없는 농도인 8.14 μg/ml을 최고농도로 하여 두배씩 희석하여 최저농도는 0.51 μg/ml로 하였다. GC376과 렘데시비르는 12.5 μg/ml을 최고농도로 하여 두배씩 희석하여 최저농도는 1.56 μg/ml로 하였다. 희석된 시료를 SARS-CoV-2 함유 배양배지 (200 TCID₅₀)에 섞어 200 μl 부피로 조정한 다음 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 1 시간 정치시켰다. 그 후 세포에서 배지를 제거한 다음 시료와 바이러스를 함유하는 배지로 교환하였다. 3 일 배양 후 바이러스 증식에 의해 세포괴사가 유도되는 cytopathic effect (CPE)를 현미경으로 관찰하였고 시료에 의해 바이러스 증식 억제에 의한 CPE 억제 정도를 관측하였다. 본 실험은 3 회 반복되었고 CPE 억제를 위한 시료 농도를 평균값으로 산출하였다.

그 결과 도 4에 나타난 것과 같이, GC376의 CPE 억제 평균값은 3.125 μg/ml, 렘데시비르의 CPE 억제 평균값은 8.333 μg/ml, 지유 추출물의 CPE 억제 평균값은 4.069 μg/ml로 확인되었다. 이를 통해, 본 발명의 지유 추출물은 세포 수준에서 SARS-CoV-2 감염 환자에게 실제 처방하는 약물인 렘데시비르 보다 2배 강한 SARS-CoV-2 증식 억제효과 가 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 5. 햄스터 동물시험에서 지유 추출물에 의한 SARS-CoV-2 증식 억제 효능

5-1 햄스터 이용 SARS-CoV-2 감염 동물모델 구축 및 시험물질 경구 투여

공지 바이러스인 SARS-CoV-2 (NCCP43326)를 계대 배양하여 10⁴ TCID50/mL의 바이러스를 PBS (Phosphate buffered saline) 용액에 준비하였다. 그 후 SARS-CoV-2 바이러스 용액 100 μL를 햄스터의 좌측 비강으로 투여하였다. 바이러스 감염 직 후 음성대조군으로는 부형제인 methylcellulose (MC) vehicle을 경구 투여하였고, 양성대조군으로 RdRp 억제제 (inhibitor)인 몰누피라비르 (molnupiravir) (머크 사, 미국)의 고농도 (250 mg/kg)를 함유하는 MC vehicle을 경구 투여하였다. 지유 추출물의 경우 MC vehicle를 이용하여 100 mg/kg으로 경구 투여하였다. 각각의 시험물질은 매일 2회로 나누어 투여되었다. Student’s t-test를 이용하여 시험물질 투여군간 유의성을 검정하였고, 통계학적 분석은 Prism 7.04 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)를 이용하였으며, p값이 0.05 미만일 경우, 통계학적으로 유의한 것으로 판정하였다.

5-2 SARS-CoV-2 감염 햄스터에서 지유 추출물에 의한 몸무게 감소 억제

실시예 5-1에서와 같이 SARS-CoV-2 감염 햄스터에 바이러스 접종 및 시험물질 투여하고 그 당일부터 7 일 동안 매일 전자저울을 이용하여 개체 별 체중을 측정하였다.

그 결과 도 5에 나타난 것과 같이, SARS-CoV-2 감염 햄스터에 음성 대조군인 vehicle만 투여하였을 시 감염2내지 4일 사이에 몸무게가 감소하였다. 그에 반해, 지유 추출물 투여군은 양성대조군인 몰누피라비르 (molupiravir) 투여군과 유사하게 몸무게 감소를 억제하는 효과가 있었다. 따라서 지유 추출물이 햄스터 동물시험에서 SARS-CoV-2의 분열 및 증식을 강하게 억제하여 생체 내 항상성을 회복시킴으로써 몸무게의 정상화를 유도했음을 알 수 있었다.

5-3 Real time RT-PCR 기법을 이용하여 지유 추출물에 의한 햄스터 폐에서 SARS-CoV-2 증식 억제 확인

감염 3일째 (3 Day post infection, 3 DPI) 햄스터의 폐조직에서 병변 부위 일부를 채취하여 Wizol^™ (WizbioSolution, Seongnam, Korea) 시약 일정량을 넣고 조직 분쇄용 비드를 이용하여 분쇄한 후 상층액으로 부터 total RNA를 추출하였다. 추출된 전체(Total) RNA는 Nanodrop(NanoDrop2000, Thermo scientific)을 이용하여 정량하였다. 전체 RNA 1 μg로부터 WizScript^™ cDNA synthesis kit (WizbioSolution)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 그 후 합성된 cDNA는 probeWizPure™ qPCR Master-UDG (WizbioSolution)를 이용하여 SARS-CoV2의 E gene 특이 프라이머 (primer) 혹은 RdRp 유전자 특이 프라이머를 사용하여 real-time RT-PCR에 적용되었다. real-time RT-PCT에 사용된 프라이머 염기서열은 표 1에 기재되어 있다.

항목	프라이머	서열번호
E gene forward	5'-ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT-3'	1
E gene reverse	5'-ATATTGCAGCAGTACGCACACA-3'	2
RdRp gene forward	5'-ATGAGCTTAGTCCTGTTG-3'	3
RdRp gene reverse	5'-CTCCCTTTGTTGTGTTGT-3'	4

알려진 copy 수의 SARS-CoV-2로부터 유래한 RNA를 이용하여 작성 한 standard curve를 기반으로 폐 조직 유래 바이러스 잔존량을 총 RNA ng 또는 μg 당 바이러스 유전자의 copy 수로 정량 분석하였다.

그 결과 도 6에 나타난 것과 같이, 지유 추출물은 RdRp의 활성을 저해하여 SARS-CoV-2의 증식을 억제하는 몰누피라비르 보다 현저하게 감염동물의 폐 조직 내에서 바이러스 증식을 억제하는 효능이 있음을 확인하였다.

5-4 Plaque assay를 이용하여 지유 추출물에 의한 햄스터 폐에서 SARS-CoV-2 증식 억제 확인

감염 3일째(3 DPI) 햄스터의 폐조직에서 채취한 폐 조직을 1 mg 당 10 μl의 PBS를 첨가하여 균질화(homogenization)하였다. 5,000 rpm에서 3 분간 원심분리 후 상층액을 회수하고 PBS로 연속 희석 (serial dilution)에 의해 부피를 200 μl로 맞춘 후 12-well plate에서 자라는 Vero E6 세포에 처리하였다. 1 시간 동안 15 분 간격으로 바이러스가 골고루 Vero E6 세포에 접촉하도록 흔들어 준 뒤, 상층액을 제거하고 1 % agarose가 포함된 agarose overlay 배지(medium)을 1 ml씩 각 well에 첨가하였다. Agarose overlay 배지가 굳은 것을 확인한 후 12-well plate를 뒤집어 96 시간 동안 배양하여 plaque의 형성 여부를 관찰하였다. Agarose overlay 배지를 제거하고 크리스탈 바이올렛 (crystal violet)으로 염색하였다. 시료의 희석배수와 알려진 copy 수의 바이러스로부터 유래한 plaque 수를 육안으로 비교하여 조직 g당 plaque 수를 산출하였다.

그 결과 도 7에 나타난 것과 같이, 지유 추출물이 RdRp 억제제인 몰누피라비르 보다 햄스터의 폐조직에서 SARS-CoV-2의 증식을 억제하는 현저한 효과가 있음을 알 수 있었다.

5-5 항체조직염색법 (immunohistochemistry)을 이용하여 지유 추출물에 의한 햄스터 폐에서 SARS-CoV-2 증식 억제 확인

감염 3일째 (3 DPI) 햄스터의 폐조직을 채취하여 파라핀 블록을 제조하였고 5 μm 두께로 조직을 절편하였다. 그 후 SARS-CoV-2 특이적인 뉴클레오캡시드 (nucleocapsid)에 대한 항체 (Cat# 40143-MM05; Sino Biological Inc.)를 이용하여 공지의 조직염색법을 사용하여 수행하였다.

그 결과 도 8에 나타난 것과 같이, vehicle 처리군의 경우 햄스터의 폐조직내 상피세포에서 SARS-CoV-2의 감염을 나타내는 강한 갈색반응 (뉴클레오캡시드 반응)이 관찰되었다. 그에 반해, 지유 추출물 처리군의 경우 뉴클레오캡시드 반응이 양성 대조군인 몰누피라비르와 유사하였다. 따라서, 지유 추출물이 햄스터 폐조직에서 SARS-CoV-2의 분열 및 증식을 억제함을 항체조직염색법을 이용하여 확인할 수 있었다.

5-6 지유 추출물의 SARS-CoV-2 바이러스에 의한 햄스터 폐염증 유발 억제 효능

감염 3일째(3 DPI) 햄스터를 각 군당 3 마리 부검하여 오른쪽 폐조직을 10% NBF (neutralized buffered formalin) 용액에 고정한 후 조직병리검사를 수행하였다. 10% NBF에 고정된 폐조직을 이용하여 파라핀 블록을 제조한 후 5 μm 두께로 조직을 절편하였다. 그 후 H&E(Hematoxylin & Eosin) 염색과 광학현미경 관찰에 의해 염증 스코어링 평가하였다. 스코어링은 문헌에 기반하여 염증 정도에 따라 0 - 3점 단위로 점수화 하여 결정하였다 (참고 문헌 9). 0 값은 병변이 없는 수치이고 10% 이하는 1점, 10 % - 50 %는 2점, 50 % 이상은 3 점을 부여하였으며 출혈이나 부종이 관찰될 시 0.5 점을 추가로 부여하였다.

그 결과 도 9에서 나타난 것과 같이, 지유 추출물은 SARS-CoV-2의 감염에 의해 유발된 햄스터 폐조직내의 염증 완화에 양성대조군인 몰누피라비르와 동등 또는 그 이상의 효과가 있음을 확인할 수 었다.

<110> Q Genetics <120> Sanguisorba officinalis Linne extract having a suppressive effect against enzymatic activity of the SARS-CoV-2 3C-like protease and RNA-dependent RNA Polymerase <130> PP21-255 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 202 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> #1 <400> 1 ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT <210> 2 <211> 202 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> #2 <400> 2 ATATTGCAGCAGTACGCACACA <210> 3 <211> 202 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> #3 <400> 3 ATGAGCTTAGTCCTGTTG <210> 4 <211> 202 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> #4 <400> 4 CTCCCTTTGTTGTGTTGT

Claims

지유 추출물을 유효성분으로 포함하는 SARS-CoV-2 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)에 의한 감염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
삭제
삭제
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 3CL프로테아제 (3C-like protease) 활성을 저해시키는 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2에 의한 감염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 RdRp(RNA-dependent RNA polymerase) 활성을 저해시키는 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2에 의한 감염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 지유 추출물은 물, 알코올 또는 이들의 혼합물인 용매로 추출되는 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2에 의한 감염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2에 의한 감염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가지는 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2에 의한 감염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제 및 액체 형태로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가지는 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2에 의한 감염의 예방 또는 치료를 위한 경구용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 지유 추출물은 오이풀 (Sanguisorba officinalis L.)의 뿌리, 긴오이풀 (Sanguisorba longifolia) 뿌리 또는 이들의 혼합물로부터 추출되는 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2에 의한 감염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
지유 추출물을 유효성분으로 포함하는 SARS-CoV-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)에 의한 감염의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
삭제
삭제
제 11항에 있어서,
상기 조성물은 3CL프로테아제 (3C-like protease) 활성을 저해시키는 것을 특징으로 하는 SARS-CoV-2에 의한 감염의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제 11항에 있어서, ,
상기 조성물은 RdRp(RNA-dependent RNA polymerase) 활성을 저해시키는 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2에 의한 감염의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
지유를 건조하는 단계;
상기 건조된 지유를 30 내지 120℃에서 용매로 추출하는 단계; 및
상기 추출된 용액을 동결건조하여 분말을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2에 의한 감염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법.
제 16항에 있어서,
상기 용매는 물, 알코올 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2에 의한 감염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법.
제 16항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2에 의한 감염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법.
제 16항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가지는 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2에 의한 감염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법.
제 16항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제 및 액체 형태로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가지는 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2에 의한 감염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법.