상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 가시오가피, 중국당귀 및 황금 추출물을 유효성분으로 하는 염증성 질환 치료 및 예방용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 사이 조성물을 유효성분으로 하는 관절염 치료제를 제공한 다.
아울러, 본 발명은 가시오가피, 중국당귀 및 황금 추출물을 유효성분으로 하는 염증성 질환 예방용 건강식품을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 가시오가피, 중국당귀 및 황금 추출물을 유효성분으로 하는 염증성 질환 치료 및 예방용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물에 있어서, 가시오가피 1 ~ 10 중량부, 중국당귀 1 ~ 8 중량부, 황금 0.1 ~ 2 중량부인 것이 바람직하며, 가시오가피 3 ~ 7 중량부, 중국당귀 2 ~ 6 중량부, 황금 0.8 ~ 1.2 중량부인 것이 더욱 바람직하다.
생약에 함유된 유효 생리 활성물질의 함량은 산지, 채취시기, 보관기간 및 보관상태에 따라 크게 달라질 수 있으므로 각 생약 추출물의 배합비율 또는 원생약의 혼합비율을 생약 출처별로 엄밀히 검사하여 적절히 배합하는 것이 약효 발현에 유리하다. 다시 말하면, 원생약의 산지, 채취시기, 보관기간 및 보관상태에 따라 동일 중량의 생약 추출물중에 포함되는 유효 생리 활성물질의 함량이 크게는 100배 이상으로 달라질 수밖에 없으므로 생약 조성물의 조성을 한정함에 있어 사용성분의 '중량비' 한정은 커다란 의미를 갖지 못하는 경우가 많다. 따라서, 본 발명의 생약 조성물은 가시오가피, 중국당귀, 황금의 3가지 생약을 각각 추출하여 얻은 생약 엑기스를 배합하여 제조하거나, 또는 원생약을 배합하고 추출하여 활성분획을 분획하여 제조할 수 있으며, 이때의 배합비율은 원생약의 중량비율에 관계없이 엘루스로사이드 E, 리구스틸라이드, 바이칼린의 생약 조성물중의 함유량으로 결정된다. 이로써 본 발명의 생약 조성물은 지표물질인 엘루스로사이드 E 0.5% 중량이상, 리구스틸라이드 0.05% 이상, 바이칼린 1% 이상인 것이 바람직하며, 엘루스로사이드 E 0.5 ∼ 5.0%, 리구스틸라이드 0.05 ∼ 0.5%, 바이칼린 1 ∼ 10% 함유되어 있는 것이 더욱 바람직하다.
서로 일정 함량범위로 함유되어 있을 때 약효 상승효과(synergic effect)를 발현하여 보다 강력한 약효를 나타낼 수 있다. 또한, 본 발명에서 얻은 생약 조성물의 유효성분으로서 상기 성분 이외에의 기타 다른 성분의 작용을 배제 할 수는 없다.
본 발명의 조성물은 가시오가피, 중국당귀, 황금 각각 또는 상기 중량비대로 혼합하여 생약 중량의 5 ~ 10 배의 물 또는 물과 알코올의 혼합용액을 추출용매로 사용할 수 있으며, 이때 상기 혼합용액의 농도는 10 ~ 90% 알코올 혼합용액을 이용하는 것이 바람직하다. 또한 4 ~ 6시간 환류 추출하여 여과한 후 감압 농축하는 것이 바람직하다. 이러한 농축액을 동결건조하여 분말상태의 엑기스를 얻었다.
상기 수득한 분말상태의 엑기스를 이용하여 염증유발인자에 대한 영향을 조사한 결과, 백혈구수는 87% 감소하였으며(도 1 , 도 2 및 표 2), 인터루킨-6은 단백질 레벨(50%) 및 유전자 레벨(100%)에서 모두 감소를 일으켰다(도 3, 도 4, 표 4 및 표 5). 또한, TNF-α는 효과적으로 100% 감소하였으며(도 5 및 표 6), 프로스타글란딘 E2가 감소하였으며(도 6 및 표 7), 프로스타글란딘 E2/프로스타글란딘 D2 가 효과적으로 증가함을 확인하였다(표 8). 프로스프로스타글란딘 E2와 프로스타글란딘 D2는 사이클로옥시지나제-2(Cyclooxygenase-2: COX-2)에 의해 생성된다. 프로스타글란딘 E2은 염증과 통증, 관절조직의 퇴화에 중요한 역할을 하여 연골조직 퇴화, 연골세포 사멸을 유도시키고 관절활액의 섬유화를 증가시켜 관절의 염증과 통증을 악화시킨다(Morgan et al ., Arthritis Rheum, 2004. 50(5): p.1642-9.). 반면에 프로스타글란딘 D2는 프라스타글란딘 J2의 전구물질로 염증성 사이토카인 생성을 억제하고 염증을 조기에 종결지어 염증질환을 치료할 수 있는 새로운 치료 타겟 물질이다(Gilroy et al, Nat Med, 1999. 5(6): p. 698-701). 그러므로 본 발명의 조서물은 염증을 유발하는 프로스타글란딘 E2을 억제하고, 염증반응을 조기에 종결시켜 항염증 작용을 하는 프로스타글란딘 D2을 증가시키므로 염증을 치료하는데 효과적으로 이용할 수 있다.
이를 통해 본 발명의 조성물이 염증성 질환의 치료 및 예방에 효과적으로 이용할 수 있음을 알 수 있었으며, 단일 성분으로 처리할 때보다 본 발명의 비율로 제조하여 처리할 때 더욱 효과적임을 확인하였다. 상기 염증성 질환으로는 통풍, 간직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 천식, 아토피, 크론병, 궤양성 대장염, 급성 및 만성 염증질환, 골관절염, 류마티스관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염 및 근육염인 것을 특징으로 하나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 조성물을 통상의 제제화 법으로 제형화하여 정제, 연질캅셀, 주사제, 연고제, 경피투여제 등의 경구투여용 제제 또는 비경구투여용 제제 등으로 제조할 수 있다. 사람에게 적용함에 있어서, 본 발명의 조성물은 단독으로 투여될 수 있으나, 일반적으로 투여방식과 표준 약제학적 관행(standard phamaceutical practice)을 고려하여 선택된 약제학적 담체와 혼합되어 투여될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 조성물은 전분 또는 락토오즈를 함유하는 정제 형태로, 또는 단독 또는 부형제를 함유하는 캡슐 또는 포낭(ovules) 형태로, 또는 맛을 내거나 색을 띄게 하는 화학 약품을 함유하는 엘릭시르 또는 현탁제 형태로 경구, 구강내 또는 혀밑 투여될 수 있다. 이러한 액체 제제는 현탁제(예를 들면, 메틸셀룰로오즈, 위텝솔(witepsol)과 같은 반합성 글리세라이드 또는 행인유(apricot kernel oil)와 PEG-6 에스테르의 혼합물 또는 PEG-8과 카프릴릭/카프릭 글리세라이드의 혼합물과 같은 글리세라이드 혼합물)와 같은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제와 함께 제조된다. 또한, 비경구적으로 예를 들면, 정맥내, 해면체내, 근육내, 피하 및 관내를 통하여 주사될 수 있다. 비경구 투여를 위해서는 무균의 수용액 형태로서 사용하는 것이 가장 바람직하며, 이때 상기 용액은 혈액과의 등장성을 갖기 위하여 다른 물질들(예를 들면 염(salt) 또는 만니톨, 글루코오스와 같은 단당류)을 함유할 수도 있다. 특히, 본 발명의 조성물은 경피제로도 제조가 가능한 바, 폴리아크릴산 나트륨, 글리세린, 메틸 파라벤 등의 약제학적으로 허용 가능한 습포제 또는 프로필렌 글리콜, 유동 파라핀 및 이소프로필 미리스테이트 등을 함유한 프라스타 제형 등을 제조할 수 있다.
본 발명의 조성물의 인체에 대한 투여용량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환정도에 따라 달라질 수 있으며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할투여할 수도 있다. 예컨대 평균 몸무게가 70 ㎏인 성인환자를 기준으로할 때 정제, 연질캅셀 등으로 제형화하여 경구로 투여하는 경우 일반적으로 50∼ 2400 ㎎/일의 단위투여용량으로 투여되고, 주사제로 투여하는 경우 일반적으로 50 ∼ 400 ㎎/일의 단위투여용량으로 투여되고, 연고제로 투여하는 경우 일반적으로 300 ∼ 2400 ㎎/일의 단위투여용량으로 투여되고, 경피투여제로 투여하는 경우 일반적으로 150 ∼ 1200 ㎎/일의 단위투여용량으로 투여된다. 상기한 투여량은 평균적인 경우를 예시한 것으로서 개인적인 차이에 따라 그 투여량이 높거나 낮을 수 있으며, 이러한 것은 본 발명의 범주에 속하는 것이다. 또한, 이들 조성물의 1일 투여량이 상기 투여용량 미만이면 유의성 있는 효과를 얻을 수 없으며, 그 이상을 초과하는 경우 비경제적일 뿐만 아니라 상용량의 범위를 벗어나므로 역시 바람직하지 않은 부작용이 나타날 우려가 발생한다.
특히, 본 발명의 조성물을 인체에 투여하는 경우 천연추출물의 일반적 특성에 비추어 볼 때 다른 합성 의약품에 비해 부작용의 염려가 없을 것으로 사료된다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 유효성분으로 하는 관절염 치료제를 제공한다.
최근 류마티스 관절염 등 염증성 질환을 치료하는데 IL-6, TNF-α등 주요 염증성 사이토카인을 억제하는 접근법이 큰 주목을 받고있는 추세인데, TNF 사이토카 인에 대한 항체약물(예: Remicade)이나 TNF 수용체 단백질 약물(예: Enbrel)은 최근 시판되어 높은 매출을 올리고 있으며, IL-6 억제제(inhibitor)에 대한 새로운 관절염 약도 개발중에 있다(Goldblatt et al, Clin Exp Immunol, 2005. 140(2): p. 195-204.). 또한 프로스타글란딘 D2을 상승시켜 염증반응을 조기 종결시키는 새로운 기전의 항염증약물 개발의 가능성을 제시하였다(Gilroy et al , Nat Rev Drug Discov, 2004. 3(5): p. 401-16.) 본 발명의 염증성 질환 치료 및 예방용 조성물은 염증성 질환에 효과적이므로 관절염 치료제로서 유용하게 이용될 수 있을 것으로 사료된다.
아울러, 본 발명은 가시오가피, 중국당귀 및 황금 추출물을 유효성분으로 하는 염증성 질환 예방용 건강식품을 제공한다.
본 발명의 염증성 질환 치료 및 예방용 조성물을 함유하는 건강식품으로는 상기 본 발명의 조성물을 유효성분으로 하는 차, 젤리, 즙, 엑기스, 음료 등의 염증성 질환 예방을 목적으로 하는 민간요법제를 들 수 있다. 이와 같이 다양한 형태로 가공된 본 발명의 염증성 질환 예방용 건강식품은 인체에 부작용이 없으면서 항염증 작용이 우수할 뿐 아니라 복용이 용이하고 장기간 보관이 가능하다.
본 발명의 조성물은 염증성 질환 예방을 목적으로 건강식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 각각의 추출물을 그대로 참가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에는 본 발명의 가시오가피, 중국당귀, 황금 생약 추출물이 원료 100 중량부에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없으므로 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 혼합 생약 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸컬릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함하는 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강 식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 슈크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 염증성 질환 치료 및 예방용 조성물 100 ㎖당 일반적으로 0.01 내지 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 내지 0.03 g이다.
상기 외의 본 발명의 혼합 생약 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해 질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 간 기능 개선용 조성물은 천연 과일 주스, 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하지 않지만 본 발명의 염증성 질환 치료 및 예방용 조성물 100 중량부 당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명을 실시예, 실험예 및 제제예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 ,실험예 및 제제예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 실험예 및 제제예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1> 개별 생약 추출물의 제조
<1-1> 가시오가피 추출물의 제조
중국 헤이룽성에서 수입한 가시오가피를 물로 세척하여 협잡물을 제거하고 잘 건조된 상태로 250 g에 2 ℓ의 75%(v/v) 에탄올 수용액을 가해 잘 교반하여 주면서 6 시간 환류 추출하였다. 여액을 취하여 모으고 잔사에 대해서는 1.5 ℓ의 75%(v/v) 에탄올 수용액을 가해 3 시간 재 가온 추출한 후 여액을 모두 합하여 생약추출물이 건조될 때까지 감압 농축하였다. 최종적으로 증류수를 가하여 현탁시킨 후 동결 건조하여 분말상태의 가시오가피 엑기스 21.7 g을 얻었다.
<1-2> 중국당귀 추출물의 제조
중국 간수성에서 수입한 중국당귀는 250 g에 2 ℓ의 50%(v/v) 에탄올 수용액을 가해 잘 교반하여 주면서 6 시간 환류 추출하였다. 여액을 취하여 모으고 잔사에 대해서는 1.5 ℓ의 50% 에탄올 수용액을 가해 3 시간 재 가온 추출한 후 여액을 모두 합하여 생약추출물이 건조될 때까지 감압 농축하였다. 최종적으로 증류수를 가하여 현탁시킨 후 동결 건조하여 분말상태의 중국당귀 엑기스 113.5 g을 얻었다.
<1-3> 황금 추출물의 제조
중국 산시성에서 수입한 황금은 250 g에 2 ℓ의 80%(v/v) 에탄올 수용액을 가해 잘 교반하여 주면서 6 시간 환류 추출하였다. 여액을 취하여 모으고 잔사에 대해서는 1.5 ℓ의 80%(v/v) 에탄올 수용액을 가해 3 시간 재 가온 추출한 후 여액을 모두 합하여 생약추출물이 건조될 때까지 감압 농축하였다. 최종적으로 증류수를 가하여 현탁시킨 후 동결 건조하여 분말상태의 황금 엑기스 133 g을 얻었다.
<
실시예
2> 비교 혼합물의 제조
<2-1> 가시오가피 추출물과 중국당귀 추출물과의 혼합물 제조
상기 실시예 1의 가시오가피 및 당귀의 동결건조 분말을 1:1로 혼합하여 제조하였다.
<2-2> 가시오가피 추출물과 황금 추출물과의 혼합물 제조
상기 실시예 1의 가시오가피 및 황금의 동결건조 분말을 1:1로 혼합하여 제조하였다.
<2-3> 중국당귀 추출물과 황금 추출물과의 혼합물 제조
상기 실시예 1의 중국당귀 및 황금의 동결건조 분말을 1:1로 혼합하여 제조하였다.
<
실시예
3> 생약 추출물의 혼합물 제조
상기 실시예 1의 가시오가피, 중국당귀 및 황금의 동결건조 분말을 5:4:1로 혼합하여 제조하였다.
<
실험예
1> 본 발명의 각 혼합물의
백혈구수에
미치는 영향 조사
McCarty 등(Curr Ther Res Clin Exp 1963; 5: 284-90)의 방법에 따라 8주령의 female BALB/c마우스의 등에 3 ㎖의 여과된 공기를 피하주사하여 공기낭을 생성시켰으며, 상기 실시예에서 제조된 동결건조물을 실험시작 3일째부터 6일째까지 마우스 1 kg당 100 mg씩 경구투여하고, 음성대조구에는 식염수를 투여하였다. 염증은 실험 6일째에 요산제일나트륨(monosodium urate:MSU) 2 mg을 1 ㎖의 PBS에 녹여 주사하여 유발하였으며, 9시간 후 마우스를 CO2로 마취하여 희생시켰다. 희생시킨 마우스로부터 등 부위의 조직과 공기낭의 아래의 조직을 2×2 cm 채취하고, 절개시 공기주머니로부터 채취한 침출액을 분리하여 각각 채취하였으며, 액체질소로 급속동결시킨후 분석실험 때까지 -70℃에서 보관하였다. 채취한 조직의 일부를 24-48시간 포르말린에 고정한 후 파라핀에 담근 후, 섹션하여 헤마톡실린과 에오신염색을 통하여 염색된 백혈수를 측정하였다. 혼합 추출물이 미치는 영향은(실험군-정상군)/(대조군-정상군)×100으로 계산하였다.
그 결과, 백혈구수는 전체적으로 감소하였으며, 이중 본 발명의 실시예 3의 생약 혼합 추출물이 백혈구수를 가장 효율적으로 감소시켰다(도 1, 도 2 및 표 1).
본 발명의 각 혼합물의
백혈구수에
미치는
영향
1
|
실험부위 |
분석법 |
효능1 |
마리수 |
실시예 1-1 |
낭침출액 |
세포 카운트 |
56% 감소 |
10 |
실시예 1-2 |
낭침출액 |
세포 카운트 |
55% 감소 |
10 |
실시예 1-3 |
낭침출액 |
세포 카운트 |
50% 감소 |
10 |
실시예 2-1 |
낭침출액 |
세포 카운트 |
62% 감소 |
10 |
실시예 2-2 |
낭침출액 |
세포 카운트 |
64% 감소 |
10 |
실시예 2-3 |
낭침출액 |
세포 카운트 |
59% 감소 |
10 |
실시예 3 |
낭침출액 |
세포 카운트 |
87% 감소 |
10 |
1염증유발시킨 후 식염수를 복용한 대조구와의 발현수치를 비교하여 미치는 영향을 퍼센트로 나타냄.
모든 실험군은 t-Student 통계처리로부터 유의성있음 p<0.05
<
실험예
2> 본 발명의 각 혼합물의 인터루킨(
interleukin
)-6에 미치는 영향 조사
상기 실험예 1에서 채취한 침출액을 대상으로 인터루킨(IL)-6의 함량을 면역분석용 키트(L-6 Immunoassay Kit: eBioscience, San Diogo, USA)를 사용하여 제조사의 방법대로 분석하였다.
또한, RNA 분리 키트(Ribrous RNeasy mini column; Qiagen, USA)를 이용하여 조직에서 RNA을 추출하여 real-time RT-PCR을 실시하여 IL-6의 m-RNA 함량을 분석하였다. real-time PCR에 사용된 프라이머 서열은 표 3과 같다. 본 발명자들은 GAPDH를 대조군으로 이용하였다. real-time PCR은 3회 반복 수행하였으며, 12.5 ㎕의 2X SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems, USA)에 cDNA 2 ㎕, 각각의 프라이머를 1 ㎕씩 첨가하고 총 부피가 25 ㎕가 되도록 증류수를 첨가하였다. PCR 혼합물은 50℃에서 2분간 처리하고, 95℃에서 10분간 처리하였다. 이후 95℃에서 15초, 60 ℃에서 1분, 40회 반복 수행하였다. 연장 반응 수행시 ABI Prism 7000 Sequence Detection System(Applied Biosystems, USA)으로 real-time PCR 산물 증폭을 정량분석하였다. mRNA 레벨은 대조군인 GAPDH 로 표준화하였다.
그 결과, 전체적으로 인터루킨-6의 단백질 레벨 및 유전자 레벨에서 모두 감소됨을 확인하였으며 그 중 실시예 3이 뛰어난 효과를 보였다(도 3, 도 4, 표 3 및 표 4).
유전자 |
서열번호 |
프라이머 서열 |
GAPDH 정방향 |
1 |
5’-TGCAGTGGCAAAGTGGAGATT- 3’ |
GAPDH 역방향 |
2 |
5’-ATTTGCCGTGAGTGGAGTCAT- 3’ |
IL-6 정방향 |
3 |
5’-GGAGAGGAGACTTCACAG- 3’ |
IL-6 역방향 |
4 |
5’-GCCATTGCACAACTCTTTTC- 3’ |
TNF-α 정방향 |
5 |
5’-CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA- 3’ |
TNF-α 역방향 |
6 |
5’-TGGGAGTAGACAAGGTACAACCC- 3’ |
본 발명의 각 혼합물의 인터루킨-6 단백질에 미치는
영향
1
|
실험부위 |
분석법 |
효능1 |
마리수 |
실시예 1-1 |
낭침출액 |
ELISA |
34% 감소 |
7 |
실시예 1-2 |
낭침출액 |
ELISA |
35% 감소 |
7 |
실시예 1-3 |
낭침출액 |
ELISA |
30% 감소 |
7 |
실시예 2-1 |
낭침출액 |
ELISA |
37% 감소 |
7 |
실시예 2-2 |
낭침출액 |
ELISA |
36% 감소 |
7 |
실시예 2-3 |
낭침출액 |
ELISA |
40% 감소 |
7 |
실시예 3 |
낭침출액 |
ELISA |
50% 감소 |
7 |
1염증유발시킨 후 식염수를 복용한 대조구와의 발현수치를 비교하여 미치는 영향을 퍼센트로 나타냄.
모든 실험군은 t-Student 통계처리로부터 유의성있음 p<0.05
본 발명의 각 혼합물의 인터루킨-6
mRNA
레벨에 미치는
영향
1
|
실험부위 |
분석법 |
효능1 |
마리수 |
실시예 1-1 |
막조직 |
qRT-PCR |
64% 감소 |
8 |
실시예 1-2 |
막조직 |
qRT-PCR |
62% 감소 |
8 |
실시예 1-3 |
막조직 |
qRT-PCR |
64% 감소 |
8 |
실시예 2-1 |
막조직 |
qRT-PCR |
71% 감소 |
8 |
실시예 2-2 |
막조직 |
qRT-PCR |
74% 감소 |
8 |
실시예 2-3 |
막조직 |
qRT-PCR |
78% 감소 |
8 |
실시예 3 |
막조직 |
qRT-PCR |
100% 감소 |
8 |
1 염증유발시킨후 식염수를 복용한 대조구와의 발현수치를 비교하여 미치는 영향을 퍼센트로 나타냄
모든 실험군은 t-Student 통계처리로부터 유의성있음 p<0.05
<
실험예
3> 본 발명의 각 혼합물의
TNF
(
tumor
necrosis
factor
)-α에 미치는 영향 조사
실험예 1에서 체취한 막조직을 대상으로 RNA 분리 키트(Ribrous RNeasy mini column; Qiagen, USA)를 이용하여 조직에서 RNA을 추출하여 real-time RT-PCR을 실시하여 TNF-α의 m-RNA 함량을 분석하였다. real-time PCR에 사용된 프라이머 서열은 표 3과 같다. 본 발명자들은 GAPDH를 대조군으로 이용하였다. real-time PCR은 3회 반복 수행하였으며, 12.5 ㎕의 2X SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems, USA)에 cDNA 2 ㎕, 각각의 프라이머를 1 ㎕씩 첨가하고 총 부피가 25 ㎕가 되도록 증류수를 첨가하였다. PCR 혼합물은 50℃에서 2분간 처리하고, 95℃에서 10분간 처리하였다. 이후 95℃에서 15초, 60 ℃에서 1분, 40회 반복 수행하였다. 연장 반응 수행시 ABI Prism 7000 Sequence Detection System(Applied Biosystems, USA)으로 real-time PCR 산물 증폭을 정량분석하였다. mRNA 레벨은 대조군인 GAPDH 로 표준화하였다.
그 결과, 전체적으로 TNF-α의 유전자 레벨에서 감소됨을 확인하였으며 그중 실시예 3의 효과가 가장 뛰어남을 확인하였다(도 5 및 표 5).
본 발명의 각 혼합물의
TNF
-α
mRNA
레벨에 미치는
영향
1
|
실험부위 |
분석법 |
효능1 |
마리수 |
실시예 1-1 |
막조직 |
qRT-PCR |
69% 감소 |
8 |
실시예 1-2 |
막조직 |
qRT-PCR |
64% 감소 |
8 |
실시예 1-3 |
막조직 |
qRT-PCR |
61% 감소 |
8 |
실시예 2-1 |
막조직 |
qRT-PCR |
72% 감소 |
8 |
실시예 2-2 |
막조직 |
qRT-PCR |
71% 감소 |
8 |
실시예 2-3 |
막조직 |
qRT-PCR |
74% 감소 |
8 |
실시예 3 |
막조직 |
qRT-PCR |
100% 감소 |
8 |
1 염증유발시킨후 식염수를 복용한 대조구와의 발현수치를 비교하여 미치는 영향을 퍼센트로 나타냄
모든 실험군은 t-Student 통계처리로부터 유의성있음 p<0.05
<실험예 4> 본 발명의 각 혼합물의 프로스타그란딘 E2에 미치는 영향 조사
상기 실험예 1에서 채취한 침출액을 대상으로 프로스타그란딘 E2의 함량을 면역분석용 키트(PGE2 Immunoassay kit: Cayman Chemical, Ann Arbor, USA)를 사용하여 제조사의 방법대로 분석하였다.
그 결과, 전체적으로 프로스타그란딘 E2가 감소함을 확인하였으며 그중 실시예 3의 결과가 가장 효과적이었다(도 6 및 표 6).
본 발명의 각 혼합물의
프로스타그란딘E2
에 미치는
영향
1
|
실험부위 |
분석법 |
효능1 |
마리수 |
실시예 1-1 |
낭침출액 |
ELISA |
38% 감소 |
7 |
실시예 1-2 |
낭침출액 |
ELISA |
34% 감소 |
7 |
실시예 1-3 |
낭침출액 |
ELISA |
41% 감소 |
7 |
실시예 2-1 |
낭침출액 |
ELISA |
44% 감소 |
7 |
실시예 2-2 |
낭침출액 |
ELISA |
46% 감소 |
7 |
실시예 2-3 |
낭침출액 |
ELISA |
51% 감소 |
7 |
실시예 3 |
낭침출액 |
ELISA |
69% 감소 |
7 |
1 염증유발시킨후 식염수를 복용한 대조구와의 발현수치를 비교하여 미치는 영향을 퍼센트로 나타냄
모든 실험군은 t-Student 통계처리로부터 유의성있음 p<0.05
<실험예 5> 본 발명의 각 추출물의 프로스타그란딘 D2에 미치는 영향 조사
상기 실험예 1에서 채취한 침출액을 대상으로 프로스타그란딘 D2의 함량을 면역분석용 키트(PGD2 Immunoassay kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, USA))를 사용하여 제조사의 방법대로 분석하였다.
그 결과, 전체적으로 프로스타그란딘 D2가 효과적으로 증가함을 확인하였으며 그중 실시예 3이 가장 효과적임을 확인하였다(도 7 및 표 7). 또한 프로스타그란딘E2/프로스타그란딘D2 비율이 증가하였다(표 8). 염증반응을 일으키는 프로스타그란딘E2와 염증반응을 마무리하여 항염증작용을 하는 프로스타그란딘 D2의 비율이 높으면 염증작용을 감소시키고 항염증작용을 높여 염증질환을 조기에 치료하는데 유용하게 이용할 수 있다.
본 발명의 각 혼합물의
프로스타그란딘D2
에 미치는
영향
1
|
실험부위 |
분석법 |
효능1 |
마리수 |
실시예 1-1 |
낭침출액 |
ELISA |
2.1배 증가 |
7 |
실시예 1-2 |
낭침출액 |
ELISA |
3.1배 증가 |
7 |
실시예 1-3 |
낭침출액 |
ELISA |
2.6배 증가 |
7 |
실시예 2-1 |
낭침출액 |
ELISA |
3.5배 증가 |
7 |
실시예 2-2 |
낭침출액 |
ELISA |
3.3배 증가 |
7 |
실시예 2-3 |
낭침출액 |
ELISA |
3.1배 증가 |
7 |
실시예 3 |
낭침출액 |
ELISA |
5.3배 증가 |
7 |
1 염증유발시킨후 식염수를 복용한 대조구와의 발현수치를 비교하여 미치는 영향을 퍼센트로 나타냄
모든 실험군은 t-Student 통계처리로부터 유의성있음 p<0.05
본 발명의 각 혼합물의
프로스타그란딘E2
/
프로스타그란딘D2
비율에 미치는
영향
1
|
분석법 |
효능1 |
마리수 |
실시예 1-1 |
ELISA |
5.7배 증가 |
7 |
실시예 1-2 |
ELISA |
4.9배 증가 |
7 |
실시예 1-3 |
ELISA |
5.4배 증가 |
7 |
실시예 2-1 |
ELISA |
6.1배 증가 |
7 |
실시예 2-2 |
ELISA |
6.4배 증가 |
7 |
실시예 2-3 |
ELISA |
6.8배 증가 |
7 |
실시예 3 |
ELISA |
9.1배 증가 |
7 |
1 염증유발시킨후 식염수를 복용한 대조구와의 발현수치를 비교하여 미치는 영향을 퍼센트로 나타냄
모든 실험군은 t-Student 통계처리로부터 유의성있음 p<0.05
<실험예 6> HT008의 혼합물의 HPLC 분석
상기 실험예를 통해 가장 효과가 좋은 실시예 3의 혼합물을 “HT008"이라 명명하였으며, 본 실험의 재료로 사용하였고, 고속액체크로마토그래피(HPLC;기종: Waters, 용매 A:1%인산, B:아세토나이트릴, 분석조건: 0에서 60분간 아세토나이트릴 5%에서 50%로 상승후 60~61 min 사이에 아세토나이트릴 50에서 70% 로 상승시킨 후 20분간 70% 아세토나이트릴로 유지, 유속: 1 ㎖/min, 검출기, photodiode array detector 205 nm)로 지표성분의 함량을 측정한 결과는 도 7 및 표 9와 같다. 이후 엘루스로사이드 E의 함량이 1.9%(w/w), 리구스틸라이드의 함량이 0.1%(w/w), 바이칼린의 함량이 2.4%(w/w)가 되게 혼합한 후 증류수에 용해하여 균질하게 하여 혼합물을 제조하였다.
HT008에 함유된 지표성분의 함량분석결과
성분명
|
함량(%)
|
검량곡선
|
함유원료
|
엘루스로사이드, E
|
1.909 ± 0.071
|
Y=1859573.934X-1749470.465,
R2=0.972
|
가시오가피
(Acantopanax senticosus)
|
바이칼린
|
2.465 ± 0.327
|
Y=1774928.297X+3135407.500,
R2=0.975
|
황금
(Scutellaria baicalensis)
|
리구스틸라이드
|
0.148 ± 0.059
|
Y=825706.051X+295628.084,
R2=0.997
|
중국당귀
(Angelica sinensis)
|
<실험예 7> 본 발명의 HT008 추출물의 급성 독성실험
본 발명의 HT008 추출물에 대한 급성 독성을 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
4주령의 특정 병원체 부재(SPF, specific pathogens free) ICR계 마우스를 암수 각각 3 마리씩 4개군(암수 각각 3마리/실험군)으로 나누어, 온도 22± 3℃, 습도 55 ± 10%, 조명 12L/12D 조건의 동물실 내에서 사육하였다. 마우스는 실험에 사용되기 전 1주일 정도 순화시켰다. 실험 동물용 사료(마우스 및 랫트용, Dyets, 미국) 및 음수를 멸균한 후 공급하였으며 자유 섭취시켰다.
상기 실시예에서 제조한 HT008 추출물을 0.5% 트윈(tween) 80에 50 ㎎/㎖ 농도로 조제한 후, 마우스 체중 20 g 당 0.04 ㎖(100 ㎎/㎏), 0.2 ㎖(500 ㎎/㎏) 및 0.4 ㎖(1,000 ㎎/㎏)씩 경구 투여하였다. 시료는 단회 경구 투여하였으며, 투여 후 7일 동안 다음과 같이 부작용 또는 치사 여부를 관찰하였다. 즉, 투여 당일은 투여 후 1 시간, 4 시간, 8 시간, 12 시간 뒤에, 그리고 투여 익일부터 7 일째까지는 매일 오전, 오후 1 회 이상씩 일반 증상의 변화 및 사망 동물의 유무를 관찰하였다. 또한, 투여 7 일째에 동물을 치사시켜 해부한 후 육안으로 내부 장기를 검사하였다. 투여 당일부터 1일 간격으로 체중의 변화를 측정하여 HT008 추출물에 의한 동물의 체중 감소 현상을 관찰하였다.
실험 결과, 시료를 투여한 모든 마우스에서 특기할 만한 임상증상이 나타나지 않았고 폐사된 마우스도 없었으며, 또한 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다.
따라서, 본 발명에 따른 HT008 추출물은 모든 마우스에서 1,000 ㎎/㎏까지 독성변화를 나타내지 않았으며, 경구투여 최소치사량(LD50)이 1,000 ㎎/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단되었다.
<
제제예
1>
HT008
을 유효성분으로 함유하는 관절염 치료제의 제조
본 발명자들은 상기 실험예를 통해 HT008 추출물이 항염증 활성을 가짐을 확인하였으며, 이는 관절염을 예방하는데 유용하게 이용될 수 있다. 이에 본 발명의 HT008 추출물 및 항염증 활성을 갖는 성분을 유효성분으로 함유하는 치료제를 하기와 같이 제조하였다. 또한 하기 치료제의 제제예는 치료제 뿐만 아니라 건강식품의 제조에도 응용하여 사용될 수 있다.
<1-1> 연질캅셀(
soft
gelatin
capsules
)의 제조
HT008 분말 13.5 중량부
글루코사민 22.0 중량부
상어연골추출분말 7.0 중량부
비타민 C 2.5 중량부
비타민 D3 0.0005 중량부
황산망간 0.05 중량부
밀납 5 중량부
팜유 15 중량부
홍화씨유 34.9495 중량부
<1-2> 정제(
tablets
)의 제조
HT008 분말 29.4 중량부
글루코사민 35.0 중량부
167상어연골추출분말 10.0 중량부
비타민 C 5.8 중량부
비타민 D3 0.0005 중량부
황산망간 0.05 중량부
결정셀룰로오즈 10.0 중량부
유당 9.0495 중량부
스테아린산마그네슘 0.7 중량부
<
제제예
2>
HT008
을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방용 건강식품의 제조
본 발명의 HT008 추출물을 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다.
1. 조리용 양념의 제조
조리용 양념 100 중량부에 HT008 추출물 8 ~ 12 중량부로 혼합하여 간 기능 개선용 조리용 양념을 제조하였다.
2. 스프 및 육즙(gravies)의 제조
본 발명의 HT008 추출물 8 ~ 12 중량부를 스프 및 육즙 100 중량부에 첨가하여 간 기능 개선용 육가공 제품, 면류의 스프 및 육즙을 제조하였다.
3. 유제품(dairy products)의 제조
본 발명의 HT008 추출물 8 ~ 12 중량부를 우유 100 중량부에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
4. 선식의 제조
현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 발법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.
검은콩, 검은깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.
본 발명의 HT008 추출물을 진공 농축기에 감압, 농축하고 분무, 열풍 건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다.
상기에서 제조한 곡물류, 종실류, 및 본 발명의 추출물을 다음과 같은 비율로 배합하여 제조하였다.
곡물류(현미 30 중량부, 율무 15 중량부, 보리 20 중량부),
종실류(들깨 7 중량부, 검은콩 8 중량부, 검은깨 7 중량부),
HT008 추출물의 건조분말(20 중량부).
<
제제예
3>
HT008
을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방용
건강음료의
제조
1. 탄산음료의 제조
설탕 5 ~ 10 중량부, 구연산 0.05 ~ 0.3 중량부, 카라멜 0.005 ~ 0.02 중량부, 비타민 C 0.1 ~ 1 중량부, HT008 추출물 8 ~ 12 중량부의 첨가물을 혼합하고 여기에 79 ~ 94 중량부의 정제수를 섞어서 시럽을 만들고, 상기 시럽을 95 ~ 98℃에서 20 ~ 180초간 살균하여 냉각수와 1:4의 비율로 혼합한 다음 탄산가스를 0.5 ~ 0.82 중량부를 주입하여 탄산음료를 제조하였다.
2. 염증성 질환 예방용 기능성 음료의 제조
비타민 C 0.1 중량부, 과당 5.8 중량부, 백설탕 3.8 중량부, 구연산 0.12 중량부, 사과산 0.03 중량부, 구연산나타륨 0.04 중량부 및 치자청색소 0.02 중량부에 본 발명의 HT008 추출물 8 ~ 12 중량부를 배합하여 계량된 물에 완전히 용해시켰다. 상기 용해된 음료를 총량이 1 중량부가 되도록 계량된 정제수로 조정하였다.
3. 건강 음료의 제조
액상과당 0.5 중량부, 올리고당 2 중량부, 설탕 2 중량부, 식염 0.5 중량부, 물 75 중량부과 같은 부재료와 HT008 추출물 8 ~ 12 중량부를 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강 음료를 제조하였다.
4. 야채 주스의 제조
본 발명의 HT008 추출물 20 g을 토마토 또는 당근 주스 1 ℓ에 가하여 건강 증진용 야채 주스를 제조하였다.
5. 과일 주스의 제조
본 발명의 HT008 추출물 20 g을 사과 또는 포도 주스 1 ℓ에 가하여 건강 증진용 과일 주스를 제조하였다.