KR20150046916A - 간 섬유화 또는 간경화 치료 또는 예방용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인진, 울금 및 단삼 중 적어도 하나 이상의 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 간섬유화 또는 간경화의 치료 또는 예방용 약학 조성물 또는 건강기능식품으로서, 본 발명에 따르는 인진, 울금 및 단삼 중 적어도 하나 이상의 추출물은 항섬유화 활성을 가져, 간섬유화 또는 간경화의 치료 또는 예방의 효과를 나타낼 수 있다.

Description

간 섬유화 또는 간경화 치료 또는 예방용 조성물{Compositions for treating or preventing liver fibrosis or cirrhosis}

본 발명은 간 섬유화 또는 간경화의 예방 또는 치료에 도움이 되는 약학 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.

간은 소화기계와 전신순환계 사이에 위치함으로써 소화기계로 들어온 생체외 물질로부터 전신을 방어하는 기능을 수행하고 있는 매우 중요한 장기이다.

일단 생체 내로 들어온 생체외 물질이 간을 통과하는 까닭에 간은 영양소외에도 많은 독성물질에 대한 노출위험이 다른 장기보다 많아 그만큼 손상될 확률도 다른 장기에 비해 높다.

간조직 중에는 영양물질흡수 및 대사, 저장, 혈장단백질합성 등과 같은 간의 주요기능을 수행하는 간세포(hepatocyte), 간내 대식세포(macrophage)인 쿠퍼세포(Kupffer cell), 간손상시 결합조직을 과다합성함으로써 간섬유화를 초래하는 간성상세포(hepatic stellate cell, lipocyte; HSC) 및 내피세포(Endothelial cell), 오목세포(Pit cell) 등이 존재한다. 이중 간세포는 간조직을 구성하는 전체세포의 약90% 이상을 차지하며, 간의 주요기능을 수행하는 실질세포 (parenchymal cell)로써 간질환시 간기능 저하는 바로 이 간세포 손상으로 인해 초래되는 것이다.

간 섬유화의 가장 흔한 원인은 HBV 및 HCV와 같은 바이러스이다. 그러나 최근에는 알코올성 및 비알콜성 지방간(no-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)는 계속 증가하는 추세에 있다. 최근, 한국 간 질환 연구 학회(Korean Association for the Study of the Liver Diseases)에 따르면, 사무직 직장인들 사이에서 비알콜성 지방간의 발생이 20년 전에 비하여 3배 정도 증가하였다고 하며,약 30%정도 이르렀다. 비알콜성 지방간은 오직 간 조직에서만 지방이 축적되는 단순 지방증에서부터 섬유증 단계까지 발전된 비알콜성 지방간염(non-alcoholic steato hepatitis, NASH)까지 다양한 범위를 포함한다. 비알콜성 지방간 환자들 사이에서 10%는 비알콜 지방간염으로 발전하고, 20~30%는 결국 간경화로 발전한다. 한번 간 경화가 발생하면, 원인은 다르게 시작되었을지라도 간 세포 암종(carcinoma)의 발생이 증가하며, 몇 십년 뒤에는 이들 중 30~40%의 환자는 간경화 합병증으로 인하여 사망한다.

한편, 근래에 이르러 건강과 장수에 대한 관심이 집중되면서 천연물 성분이 나타내는 다양한 생리활성 연구가 다각적으로 수행되고 있다. 이러한 물질은 천연물이라는 측면에서 큰 가치가 있다. 따라서, 항섬유화 효능을 갖는 천연물질 탐색에 대한 지속적인 연구가 필요한 시점이다.

따라서 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 항섬유화 효능을 지녀, 간섬유화 또는 간경화의 치료 또는 예방용으로 사용 가능한 약학 조성물 또는 건강기능 식품을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 인진, 울금 및 단삼 중 적어도 하나 이상의 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 간섬유화 또는 간경화의 치료 또는 예방용 약학 조성물 및 건강기능 식품을 제공한다. 즉, 본 발명은 인진, 울금 및 단삼 중 적어도 하나 이상의 추출물의 의약 용도를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 기재된 구성은 가장 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고, 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

간섬유화는 간질환의 가장 초기적이고 기본적인 질환으로 그 원인과 발생기전 및 형태가 다양하고 복잡하다. 간단하게 섬유화는 생화학적으로 빠른 두 과정인 결합조직 단백의 합성(fibrogenesis)과 결합조직의 퇴행(fibrolysis)의 진행에 의해서 나타나며, 두 과정의 균형이 깨어질 때 간조직 중 결합조직의 축적이 일어나고 과도하게 되면 간섬유화에 이어서 간경화가 일어나게 된다.

간섬유화를 조직학적 연구를 통해보면 간섬유화의 결합조직축적에 관여하는 단백질로는 콜라겐, 세포외부 당단백질, 프로테오글리칸, 엘라스틴 등이 있다. 인체에 가장 많이 존재하는 단백질 중 하나인 콜라겐은 1500개의 잔기로 구성된 특유의α-체인을 가지며 아미노산배열은 (Gly-Xaa-Yaa)n으로 표시되고, Yaa 위치에 프롤린 또는 라이신을 함유한다. 세포내부공간에서의 삼중나선형성과 세포외부에서의 교차결합(cross linking)형성으로 콜라겐구조가 안정화되는데 경화된 간에는 이렇게 안정화된 불용성의 콜라겐섬유의 광범위한 침착이 일어난다. 간경화는 만성적인 간손상에 의해 간조직 중 결합조직이 과다축척 되면서 정상적인 간소엽의 육각형구조가 파괴된 상태이며 반면에 간섬유화는 간소엽의 육각형구조는 유지한 상태로 간조직 중 결합조직만 과다축척된 상태를 의미한다. 간섬유화 및 경화는 간조직 중 염증반응이 지속되어 쿠퍼세포 및 지방세포(lipocyte)가 활성화되면서 간조직 중 결합조직으로 대치되는데 이 과정을 스트로말리페어(stromal repair)라 한다. 이에 의해 간조직 중 결합조직의 양이 정상에 비해 10배 정도 증가하게 되어 동양혈관(sinusoid)에 결합조직이 축적됨으로써 동양혈관 내의 통로가 좁아져 혈액과 간세포간의 물질교환이 원활하지 못하게 되는 카필라리제이션이 초래된다.

한편, 면역학적 수준의 연구를 보면 여러가지 원인에 의해 간세포가 손상을 받으면 여러 세포들의 상호작용에 의해 각종 사이토카인(cytokine) 및 산소 자유라디칼 등이 생성되고 정상세포외기질(ECM)이 손상을 받게되면, 세포외기질의 이상증식이 유발되어 간섬유증으로 진행된다. 일반적으로 간섬유증은 간경변과는 달리 가역적이고, 얇은 섬유원으로 구성되며, 결절형성이 없는 것으로 알려져있고 간손상의 원인이 소실되면 정상회복이 가능할 수 있으나, 이러한 간섬유증 과정이 반복적으로 계속되면서 세포외기질 간의 교환결합이 증가하여 두꺼운 섬유원을 형성하고 결절이 있는 비가역적인 간경변으로 진행된다. 세포외기질은 콜라겐, 당단백질, 및 프로테오글리칸 등으로 구성된다. 간섬유화시 세포외기질의 과다생성은 간내포식세포(macrophage)인 쿠퍼세포가 활성화됨으로써 분비되는 여러 사이토카인에 의해 간성상세포(hepatic stellate cell, HSC)의 활성화가 촉진됨으로써 결합조직의 합성이 증가되는 것으로 알려져있다. 쿠퍼세포는 손상된 간세포의 포식세포(phagocytosis)에 의해 활성화되거나 여러 간독성물질에 의해 직접 활성화되어 TGF-β, TGF-α, TNF-α, PDGF, IL 등을 분비하며 이 사이토카인에 의해 쿠퍼세포 자신이 다시 활성화되는 자가활성화(autocrine) 작용을 받는다. 또한 측분비(paracrine) 작용으로 쿠퍼세포가 분비한 사이토카인들에 의해 지방세포가 활성화되며 이와 같은 사이토카인을 지방세포가 직접 분비하여 자신이 분비한 사이토카인에 의해 다시 자기자신이 활성화되는 자가활성화작용을 받는다.

이와 같은 일련의 반응으로 활성화된 간성상세포는 세포외기질의 생성이 왕성해지면서 반면에 금속단백분해효소(metalloproteinase)와 콜라겐분해효소(collagenase) 등의 세포외기질 분해효소의 생성을 억제함으로써 간조직 중 결합조직이 과다축적되는 것이다. 사이토카인은 호르몬과 유사한 당단백질로 분자량은 대부분 80kD 이하이며 대부분 혈액세포(blood cell), 간질세포(stromal cell), 상피세포(epithelial cell)에서 합성되고 염증반응시 서로 다른 종류의 세포간의 신호전달목적으로 사용된다. 사이토카인은 피코몰 농도로 세포표면의 수용체를 통해 측분비 및 자가활성화작용으로 주변의 세포에 신호를 전달한다. TGF-β는 지금까지 알려진 사이토카인 중에서 결합조직 생성을 가장 많이 촉진하는 섬유조직발생 사이토카인으로 알려졌다. TGF-β는 간성상세포를 활성화시켜 콜라겐 등의 세포외기질 생산을 유도하며 세포외기질을 분해하는 단백질분해효소의 합성을 저해하고 지방세포 내 레티노이드의 저장량을 감소시키며 간세포(hepatocyte)의 DNA합성을 저해한다. 그 외 섬유화에 중요한 사이토카인 PDGF는 지방세포의 증식을 촉진하는 것으로 보고되고 있다.

현재, 간섬유화에 사용하는 처방제로는 vit E 등의 항산화제 및 UDCA 그리고 기타 당뇨병 치료제인 메트포민(Metformin), 피글리타존(Piglitazone) 등이 있으나, 모두 간섬유화를 직접적으로 억제하지는 못하고 보조하는 역할로 알려져 있다. 본 발명에서는 종래의 간섬유화를 보조하는 역할이 아닌, 특정 약재, 즉 인진, 울금 및 단삼 각각 또는 이들의 조합들이 TGF-β를 통하여 쥐의 간세포 섬유화를 유도한 뒤 그 섬유화 정도가 완화되었음을 입증함을 통하여, 추후 간섬유화 또는 간경화의 치료를 할 수 있는 약으로 개발할 수 있다는 착안을 통하여 본 발명을 연구하였다. 특히, 종래의 연구들은 대부분 DMN으로 섬유화를 유도하였었지만, 본 발명의 세포실험에서는 TGF-β로 직접 섬유화를 유도하였으며, 본 발명의 조성물을 통하여 섬유화 정도가 완화되었다는 것을 보였다는 점, 본 발명에서 세포실험에 사용한 LX-2 세포는 인간에서 유래한 간성상세포로서 종래의 연구들에 비하여 더욱 임상효과를 기대할 수 있다는 점, 또한, 기존의 연구에서 항섬유화의 지표는 AST, ALT, bilirubin 등 이었으나, 본 발명의 지표들은 섬유화의 직접적 표식인 콜라겐 및 α-SMA로서 본 발명에 따른 조성물이 간섬유화 및 간경화에 효과를 보다 명확히 보이고 있다는 점에서 큰 의의가 있다.

보다 구체적으로 본 발명의 특징을 설명하면, 종래에 가미청간탕이라 불리던 인진(Artemisia capillaris), 택사(Alismaorientale), 백출(Atractylodes japonica), 단삼(Salvia miltiorrhiza), 울금(Curcuma wenyujin), 산사(Crataeguspinnatifida), 구기자(Lyciumchinense), 지실(Poncirustrifoliate) 및 감초(Glycyrrhizauralensis)를 포함하는 간염을 치료하던 한약재에서 종래의 가미청가탕의 조성물의 배합보다, 인진, 울금 및 단삼 각각의 약재 및 이들의 조합이, 종래의 가미청간탕보다 예상치 못한 현저하게 높은 항섬유화 효과를 지니는 약재를 발견한 데에 그 의의가 있다. 즉, 종래의 한약재들은 조합물을 구성하는 각각의 한약재 효과를 알 수 없는 것이 대부분이었으며, 그 중에는 효과가 떨어지는 것도 있을 수 있으며, 경우에 따라서는 반대되는 효과가 있어 원하는 효능을 상쇄시키는 한약재가 섞여있을 수도 있으나, 본 발명에서는 항섬유화 효과가 있는 것을 선별하였으며, 이들의 조합으로 인하여 항 섬유화 효과를 극대화 시킬 수 있는 조성물을 발명해 내었다. 일반적으로 몸에 좋은 약재를 여러가지를 혼합한 것이 보다 더 효능이 좋을 것으로 예상하기 쉬우나, 본 발명은 종래의 가미청간탕과 같이 여러 가지 약재를 혼합한 것보다, 보다 더 높은 항섬유화 효능을 가진 각각의 약재를 발견해 냈다는 것에 그 의의가 있다.

또한, 기존의 한방적인 연구로는 한약재의 단미 혹은 기존에 사용하던 처방 자체에 대한 연구는 진행되어 왔지만, 본 발명은 또한 약재의 간섬유화에 초점을 맞추고 세포독성 및 세포, 동물 실험을 통하여 간섬유화 억제 작용을 명확히 연구하여 증명하였다는 데에 그 의의가 있다.

또한, 본 발명은 간섬유화 또는 간경화의 치료 또는 예방용 약학 조성물 또는 건강기능식품을 구성하는데, 인진, 울금 또는 단삼 등의 천연물을 이용하였는바 안전성 보장 측면에서 큰 가치가 있다. 상기와 같은 안전성 측면은 각각 한약재의 농도별로 세포 독성 실험을 진행하여, 인체에 무해함을 실험적으로 확인하였다.

따라서, 본 발명은 인진, 울금 및 단삼 중 적어도 하나 이상의 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 간섬유화 또는 간경화의 치료 또는 예방용 약학 조성물 및 건강기능식품을 제공하는 것을 목적으로 한다. 즉 본 발명은 인진, 울금 및 단삼 중 적어도 하나 이상의 추출물의 의약 용도를 제공한다. 본 발명에 따른 약학조성물 또는 건강기능식품은 항섬유화 효과가 있어서, 간섬유화 또는 간경화의 치료 또는 예방의 효과를 가지게 된다.

본 발명에서 건강기능식품이란 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 또는 가공한 식품 모두를 지칭하며, 예를 들어 건강보조식품, 기능성 식품, 영양제, 보조제 등을 모두 포함한다.

본 발명에 따른 약학 조성물 또는 건강기능식품은 인진, 울금 및 단삼 중 적어도 하나 이상의 추출물을 유효성분으로 함유하며, 바람직하게, 인진 및 울금 중 적어도 하나 이상의 추출물을 유효성분으로 함유한다. 본 발명의 또 다른 바람직한 일 실시예에 따르면, 인진, 울금 및 단삼 추출물 모두를 유효성분으로 함유할 수 있다. 또한, 바람직하게, 인진, 울금 및 단삼 추출물 이외의 종래의 가미청간탕의 유효성분 중 택사, 백출, 산사, 구기자 및 지실을 더 포함하지 않는 것을 특징으로 한다. 상기와 같은 조합은 한의학의 군신좌사 원리에 따라 최적합한 약제를 선별하여 최소의 한약재로 최대의 효과를 이끌어 내는 조합구성으로서, 상기와 같은 조합구성은 본 기술분야의 통상의 기술자로서 용이하게 생각해 낼 수 없는 조성물이라 할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 맛의 향상을 위하여 감초를 더 첨가할 수 있으나, 감초의 첨가로 인하여 인진, 울금 및 단삼 추출물의 효능을 상쇄시키지 아니할 것으로 예상된다.

본 발명에서 사용되는 인진(茵蔯, Artemisia capillaris)은 국화과의 사철쑥, 바람직하게 한약재에서는 인진의 지상부를 말린 약재를 의미하며, 습열(濕熱)로 인한 황달 즉 급성간염으로 발열, 전신황색, 소변이 붉고 적은 증상 등에 사용한다. 또한 만성간염, 간경변증, 간암, 담낭염, 담낭결석에도 사용하며, 습진, 옴, 버짐, 풍진 등의 피부질환과 돌림병으로 열이 몹시나고 발광하는 증상에도 사용한다.

본 발명에서 사용되는 단삼(丹蔘, Salvia Miltiorrhiza)은 꿀풀과에 속하는 쌍떡잎식물 통화식물목의 여러해살이풀로, 부인의 생리불순, 생리통, 산후복통에 쓰이고, 어혈성의 심복부 동통과 타박상을 치료하며, 불면증, 피부발진 등에 사용한다.

본 발명에서 사용되는 울금(鬱金, Curcuma wenyujin)은 생강과 식물로서, 바람직하게 한약제에서는 울금의 뿌리줄기 부분을 의미하며, 담즙분비, 배설촉진, 관상동맥안의 반괴형성을 감소시킨다고 보고된다.

본 발명에 사용되는 추출물은 통상적인 용매 추출방법에 이용되는 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올, 에틸아세테이트 등의 적당한 용매를 이용하여 추출할 수 있으며, 항섬유화 효과를 가질 수 있게 하는 추출물이라면 어느 추출방법이든 무관하다. 다만, 바람직하게, 물(더 바람직하게는 열수)이 추출용매로 이용된다.

또한, 본 발명에서 상기 약학 조성물 또는 건강기능식품은 인진, 울금 및 단삼 추출물이 모두 유효성분으로 포함될 때의 그 함량을 함량은 3~4 : 0.5~1.5 : 0.5~1.5 의 중량비로 포함되는 것이 보다 바람직하다. 유효성분의 함량이 상기 범위인 경우에 항섬유화 효과가 있으나 구성비율은 적절하게 조정할 수 있다.

본 발명에 따르는 인진, 울금 및 단삼 중 적어도 하나 이상의 추출물은 항섬유화 작용을 통하여 간섬유화 또는 간경화의 치료 또는 예방 개선 용도의 약학 조성물 또는 건강기능식품 등 본 발명의 목적을 이루고자 하는 방법으로 사용할 수 있다.

항섬유화라는 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 약학적 조성물은, 매일 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 g/kg이 투여될 수 있으며, 약 0.1 mg/kg 내지 약 1 g/kg의 1일 투여 가능하다. 필요에 따라 편리성을 위하여 1일 총 투여량이 나누어지고 하루 동안 여러 번 나누어 투여될 수 있다. 그러나 상기 투여량은 투여 경로 및 제형, 환자의 상태(연령, 성별, 체중 등), 치료하고 있는 상태의 심각성, 인진, 울금 및 단삼 중 적어도 하나 이상의 추출물의 순도와 함량 등에 따라 다양할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 유효성분은 쥐, 생쥐, 가축 인간 등 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 예를 들어 경구투여 또는 비경구 투여 중 어떠한 것에 의해서도 투여될 수 있다. 비경구 투여로는 정맥주사, 근육 주사, 피하 주사, 직장투여 등을 들 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 고형 제제, 반고형제제 또는 액상 제제일 수 일 수 있다. 고형 제제는 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 좌제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 고형 제제에는 부형제, 착향제, 결합제, 방부제, 붕해제, 활택제, 충진제 등이 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 반고형 제제로는 크림제, 로션제, 유화제, 리니멘트제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 적당한 착색제, 착향제, 안정화제, 점성화제, 계면활성제 등을 첨가하여 제조할 수 있다. 액상 제제로는 물, 알코올, 프로필렌글리콜 용액 같은 용액제, 현탁액제, 유제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 적당한 착색제, 착향제, 안정화제, 점성화제 등을 첨가하여 제조할 수 있다.

예를 들어, 산제는 본 발명의 유효 성분과 유당, 전분, 미결정셀룰로오스 등 약제학적으로 허용되는 적당한 부형제를 단순 혼합함으로써 제조될 수 있다. 과립제는 본 발명의 유효 성분; 약제학적으로 허용되는 적당한 부형제; 및 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필셀룰로오스 등의 약제학적으로 허용되는 적당한 결합제를 혼합한 후, 물, 에탄올, 이소프로판올 등의 용매를 이용한 습식과립법 또는 압축력을 이용한 건식과립법을 이용하여 제조될 수 있다. 또한 정제는 상기 과립제를마그네슘스테아레이트 등의 약제학적으로 허용되는 적당한 활택제화 혼합한 후, 타정기를 이용하여 타정함으로써 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 건강기능식품은 본 발명에 따르는 인진, 울금 및 단삼 중 적어도 하나 이상의 추출물을 식품 첨가물로 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 물질들을 그대로 첨가하거나, 다른 식품 또는 다른 식품 성분과 함께 병용하여 사용하는 등 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 인진, 울금 및 단삼 중 적어도 하나 이상의 추출물의 유효성분의 혼합양은 사용목적(건강 또는 치료)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 안정성 면에서 아무런 문제가 없기에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수도 있다.

상기 식품의 종류에는 특별히 제한은 없다. 본 발명에 따른 유효물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 초콜렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로오즈와 같은 디사카라이드 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자이리톨, 소르비톨, 에르트리톨 등의 당알콜 등을 사용할 수 있다. 감미제로는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100ml당 일반적으로 약 0.01~0.04g, 바람직하게는 0.02~0.03g이다.

상기 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명에 따른 물질은 천연과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

본 발명에 따르는 인진, 울금 및 단삼 중 적어도 하나 이상의 추출물은 항섬유화 활성을 가져, 간섬유화 또는 간경화의 치료 또는 예방의 효과를 나타낼 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 약학 조성물 또는 건강기능식품은 식물 유래로서 천연물로서의 안전성 측면에서의 가치가 매우 높다.

본 명세서에 첨부되는 다음의 도면들은 본 발명의 바람직한 실시예를 예시하는 것이며, 전술한 발명의 내용과 함께 본 발명의 기술사상을 더욱 이해시키는 역할을 하는 것이므로, 본 발명은 그러한 도면에 기재된 사항에만 한정되어 해석되어서는 아니된다.
도 1은 LX-2 세포에서의 각 약재의 세포 독성 결과이다.
도 2는 LX-2 세포에서의 각 약재의 콜라겐-1 mRNA 발현을 나타내는 결과이다.
도 3은 LX-2 세포에서의 각 약재의 α-SMA mRNA 발현을 나타내는 결과이다.
도 4는 LX-2 세포에서의 각 약재의 콜라겐-1 단백질 발현을 나타내는 결과이다.
도 5는 DMN- 유도된 쥐 간 섬유화에 있어서 각 약재의 효과를 나타내는 결과이다.
도 6은 각 약재의 mRNA 수준의 콜라겐-1 및α-SMA 에서의 효과를 나타내는 결과이다.
도 7은 각 약재의 단백질 수준의 콜라겐-1 및α-SMA 에서의 효과를 나타내는 결과이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

1. 추출물의 제조

하기 표 1 내지 3에 해당되는 약재는 경희대학교, 한방병원, 한약 제제과(Department of Pharmaceutical Preparation of Korean Medicine, Korean Medical Hospital, Kyung Hee University)로부터 얻었으며, 대한약전(Korean Pharmacopoeia) 9판의 표준에 따라 얻어졌다.

하기 표에 기재된 각각의 약재들 및 상기 표 1 내지 3의 기재된 약재들은 100℃의 온도에서 2시간 동안 가열 맨틀을 이용하여 가열하였다. 체로 여과된 용매는 회전 증발기(Model Ne-1; EYELA CO., Japan)을 통하여 농축되었으며, 동결건조기(Mode FD-1, EYELA CO.)를 이용하여 건조되었다. 이러한 추출물에 증류수를(1g/10ml)를 첨가하였으며 2시간 동안 95℃에서 가열하였다. 이렇게 가열된 용액은 14,000 rpm에서 20분간 원심분리 되어, 상등액이 얻어졌다. 0.2-㎛ 필터를 통하여 여과 시킨 후에, 추출물은 실험 분석을 위하여 -70℃에서 보관되었다.

	학명	중량(g)
KCGT(A) (종래 가미청간탕의 구성, 비교예 1 조합 A)	인진 (Artemisia capillaris)	30
	택사 (Alismaorientale)	15
	백출 (Atractylodes japonica)	12
	단삼 (Salvia miltiorrhiza)	8
	울금 (Curcuma wenyujin)	8
	산사 (Crataeguspinnatifida)	8
	구기자 (Lyciumchinense)	8
	지실 (Poncirustrifoliata)	6
	감초 (Glycyrrhizauralensis)	6
총계		101

	학명	중량(g)
KCGT(B) (비교예 2, 조합 B)	인진(Artemisia capillaris)	30
	택사 (Alismaorientale)	15
	단삼(Salvia miltiorrhiza)	8
	울금(Curcuma wenyujin)	8
총계		61

	학명	중량(g)
KCGT(C) (조합 C)	인진 ( Artemisia capillaries )	30
	단삼 ( Salvia miltiorrhiza )	8
	울금 ( Curcuma wenyujin )	8
총계		46

2. 추출물의 분석방법

세포 배양

실험에 사용한 LX-2 세포는 Dr. Scott Friedman 를 통하여 제공받았다. 세포 배양은 5% CO₂, 37℃의 습한 조건에서, FBS(fetal bovine serum; Lonza, Allendale, USA) 10%가 더 첨가된 DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium; Lonza, Allendale, USA)에서 배양되었다.

TGF -β1 처리

70% confluence에 도달한 후에, 세포는 혈청 기아상태를 진행하며, 0.2%의 BSA(Bovine serum albumin)을 48시간 동안 추가한다. 그 이후, 상기 약재들을 1시간 동안 처리한 후, TGF-β1 (5ng/ml;PeproTech, Rocky Hill, USA)를 20시간 동안 처리한다.

세포 독성 분석

LX-2 세포는 TGF-β1와 레티놀과 함께 상기 약재들 또는 이들의 조합이 처리되었으며, 3-(4, 5-dimethylthiazole-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT, Invitrogen, Carlsbad, CA)을 통하여 세포 독성이 분석되었다.

Real Time PCR 분석

RT PCR 분석에 사용된 유전자 및 프라이머리 시퀀스는 하기 표 4에 나타내었다. 항존유전자, Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)는 내생의 대조군으로 사용되었다.

Gene		Forward primer (5’-3’)	Reverse primer (5’-3’)
Human	GAPDH	CATGGCCTTCCGTGTTCCTA	GCGGCACGTCAGATCCA
	Collagne-1	GAG ACT GTT CTG TTC CTT GTG TAA CTG	CCC GGT GAC ACA TCA AGA CA
	α-SMA	TGC CTG ATG GGC AAG TGA	CTG GGC AGC GGA AAC G
Rat	GAPDH	GCCACATCGCTCAGACACC	CCCAATACGACCAAATCCGT
	Collagen-1	CGA TGG CGT GCT ATG CAA	ACT CGC CCT CCC GTT TTT
	α-SMA	CCATGTACCCAGGCATTGCT	GGGAGCGAGGGCTGTGAT

단백질 발현의 분석 ( Western blot analysis )

LX-2 세포에서 β-액틴, 콜라겐 타입 Ⅰ(콜라겐 -1) 및 α-smooth muscle actin(α-SMA)의 단백질 수준은 웨스턴 블롯 방법을 통하여 결정되었다. 50㎍의 세포 라이세이트가 SDS-PAGE 투여된다. 일차 항체 및 이들의 희석액은 쥐 단일 클론 β-액틴 (1:2000 희석액; santacruz, Califonia, USA), 토끼 단일클론 콜라겐-1 (1:1000 희석액; abcam, Cambridge, UK) 및 토끼 단일클론 α-SMA (1:200 희석액; abcam, Cambridge, UK)이다. 이러한 반응은 HRP-conjugated 이차 항체를 통하여 발색되었다. 블랏은 ECL detection system(Davinch-Chemi Imaging System; CoreSciences, Seoul, Korea)를 통하여 발현되었다. β-액틴은 대조군 로딩 단백질과 같이 사용되었다.

섬유화 모델 및 조직 준비

200 내지 225g의 7주차 수컷 Sprague-Dawley 쥐를 각각 12시간 동안 명암 주기에서 물 및 표준 쥐 사료를 자유롭게 섭취하도록 하였다.쥐들은 일주일당 3일 연속으로 4주간 N-Nitrosodimethylamine (DMN, 10㎍/kg; Upelco, Bellefonte, USA)이 투여되었다. DMN 투여 이후에, 쥐들은 phosphate buffered saline(PBS) 또는 일회 분량의 인진, 단삼, 울금 및 이들의 조합인 조합 C를 경구 투여를 통하여 처리하였다. 경구 투여 이주 후, 동물들은 희생시키고, 이들의 간 샘플을 얻어냈다. RNA 및 단백질은 직접 샘플이 절단되자마자, 표준 기술로 추출되었다. 면역조직화학 분석을 위하여 샘플들은 4%의 phosphate-bufferd formalin에서 2일 동안 고정되어 파라핀에 담겼다.

a) 대조군, b) 염분 처리된 DMN 쥐, c) 1g/kg의 인진이 처리된 DMN 쥐, d) 1g/kg의 단삼이 처리된 DMN 쥐, e) 1g/kg의 울금이 처리된 DMN 쥐 및 f) 2g/kg의 조합 C가 처리된 DMN 쥐의 6가지 군이 준비되었다.

기타

H&E 염색, M-S 염색, 면역조직화학적 분석은 종래의 방법으로 수행되었으며, 이미지 분석은 Image-J 프로그램을 이용하였다.

통계처리

모든 수치는 평균의 평균 ±S.D 오차로 표현되었다(SEM;**, P<0.01; ***P<0.001; ns, not significant). 통계적 유의성은 one-way ANOVA 방법에 따라 결정되었으며, Student-Newman-Keulsmultiple comparison test 또는 unpaired Student t-test가 시행되었다. 통계학적 유의성은 P 값이 0.05 수준에서 허용되었다.

보다 구체적으로, 도 1 내지 7에서 통계적 유의성은 one-way ANOVA 방법에 따라 결정되었다; 평균±SEM 값; *, P<0.05; **, P<0.01;***, P<0.001.

3. 결과

<세포실험, 생체외 in vitro>

1) LX-2 세포에서의 셀 독성

LX-2 세포는 96 well pate에서 2시간 동안 배양되었다. 그리고 난 뒤 세포는 5ng TGF-β1의 각기 다른 농도로 21시간 동안 약재와 같이 처리되었으며, TGF-β1은 대조군으로 사용되었다.

대조군과 비교하면, 표 1에 기재된 모든 약재인 인진, 택사, 백출, 단삼, 울금, 산사, 구기자, 지실, 감초, 조합 A, 조합 B, 조합C 모두 투여량 농도가 높아짐에도 불구하고, LX-2 세포에 현저한 독성 효과를 나타나지 않았다(도 1 참조).

2) mRNA 수준의 콜라겐-1 및 α-SMA

표 1의 각각의 약재, 표 1에 따른 조합A 및 표 2에 따른 조합 C는 mRNA 수준의 콜라겐-1의 발현을 확인하기 위하여 처리하였고, 그 결과를 도 2a 및 도 2b에 나타냈다. 결과적으로, 인진, 단삼, 울금 및 산사에 있어서 mRNA 수준의 콜라겐-1이 농도 의존적으로 감소함이 발견되었다(도 2의 A, C, D 및 E 참조)

LX-2 세포의 TGF-β1처리 이후에, 표 1의 각각의 약재, 표 1에 따른 조합A 및 표 2에 따른 조합 C는 mRNA 수준의 α-SMA의 발현을 확인하기 위하여 처리하였으며, 그 결과를 도 3a 및 도 3b에 나타냈다. 결과적으로, 인진, 단삼, 울금 및 조합 A 및 조합 B에 있어서 mRNA 수준의 α-SMA이 농도 의존적으로 감소함이 발견되었다(도 3a의 A, C, D 및 도 3b의 J 및 K 참조)

3) 단백질 수준의 콜라겐-1 및α-SMA

LX-2 세포에서 TGF-β1 5ng/ml 처리 이후에, 표 1의 각각의 약재, 표 1에 따른 조합A 및 표 2에 따른 조합 C는 단백질 수준의 콜라겐-1의 발현을 확인하기 위하여 처리되었으며, 그 결과는 도 4에 나타냈다. 결과적으로, 1mg/ml의 인진, 울금, 단삼, 조합 A 및 B에서 콜라겐-1 단백질 발현의 현저한 감소가 나타났다. 또한, 동일한 방법으로 α-SMA 의 단백질 수준을 측정하였으나, 검정색으로 주변 밴드가 나타나서, 대조군과 각 약재의 효과를 구별할 수 없어서, 이 결과는 제외하였다.

즉, mRNA 및 단백질 수준에서 콜라겐-1 및α-SMA의 모두의 감소 효과를 보인 것이 인진, 단삼, 울금이었다.

<동물실험, 생체 내 in vivo>

1) DMN 유도된 쥐의 간

본 발명자들은 in vitro 실험에서 다른 약재들 보다 현저하게 높은 효과를 보이는 3가지 약재인 인진, 울금, 및 단삼을 밝혀내었으며, 이들 각각 및 이들의 조합인 조합 C를 제조하였다.

In vivo에서 약재의 항섬유화 효과를 탐색하기 위하여, 쥐의 간 섬유화 모델이 DMN 투여에 의하여 제조되었다. DMN 처리를 받은 쥐는 대표적인 H&E 이미지와 같이 섬유화가 진행되었다. 그러나, 다른 쥐의 간 세포는 단지 DMN 처리를 한 쥐의 간 세포 모델 보다 더 손상되지는 않았다(도 5a의 A참조).

또한, M-S 염색을 실험하였다. 이 방법은 조직내의 콜라겐 섬유의 발견을 위하여 사용된다. 상기 콜라겐 섬유는 푸른색으로 염색되며, 핵산은 검게 염색되고, 배경은 붉은색으로 염색 되었다. 이 실험에서, DMN 처리가 된 쥐의 간 모델은 조직 내의 콜라겐 섬유가 매우 많이 염색된 것을 발견하였으며, 조합 C 및 각각의 약재가 처리된 쥐의 간 세포는 조직 내 염색된 콜라겐이 감소하는 것을 발견하였다(도 5a의 B 참조).

또한, IHC를 사용하여, 본 발명자들은 DMN 투여 쥐 모델 이후에 PBS 구강 주입과 DMN 투여 쥐 모델 이후의 약재 추출물 구강 주입을 비교하였다. PBS와 DMN을 처리한 쥐의 모델은 향상된 α-SMA와 콜라겐-1 발현을 보였다. 그러나, 약재 처리가 된 쥐의 간 모델에서는 콜라겐-1 및 α-SMA가 극적으로 감소하였다(도 5b의 C, D 참조).

2) mRNA 수준의 콜라겐-1 및 α-SMA

간 조직내의 콜라겐-1 및α-SMA의 발현을 나타내기 위하여 RT PCR이 사용되었으며, 그 결과는 도 6에 나타내었다. 결과적으로, 인진, 울금, 단삼 및 조합 C가 또한 섬유화 쥐에서 섬유화 관련 유전자의 mRNA 발현이 감소되었음을 알 수 있다(도 6 A, B 참조). 특히 콜라겐-1과 관련하여서는 도 6의 A를 참고하여 보았을 때, 각각의 약재보다 이들의 조합인 조합 C의 효과가 더 높음을 알 수 있었다.

3) 단백질 수준의 콜라겐-1 및 α-SMA

간 조직 내의 콜라겐-1 및α-SMA의 발현을 나타내기 위하여 웨스턴 블롯이 사용되었으며, 그 결과는 도 7에 나타내었다. 결과적으로 모든 약재에서 현저하게 높은 콜라겐-1 및 α-SMA의 감소가 됨을 알아냈으며, 특히 α-SMA의 감소가 보다 더 현저함을 알 수 있었다(도 7 참조). 또한, 콜라겐-1 및 α-SMA 감소는 각각의 약재보다 이들의 조합인 조합 C의 효과가 더 높음을 알 수 있었다.

Claims (6)

1. 인진, 울금 및 단삼 중 적어도 하나 이상의 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 간섬유화 또는 간경화의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 약학 조성물은 인진, 울금 및 단삼의 추출물을 모두 포함하는 것을 특징으로 하는 간섬유화 또는 간경화의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
3. 제2항에 있어서,
   상기 인진, 울금 및 단삼 추출물의 함량은 3~4 : 0.5~1.5 : 0.5~1.5 의 중량비로 포함되는 것을 특징으로 하는 간섬유화 또는 간경화의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
4. 인진, 울금 및 단삼 중 적어도 하나 이상의 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 간섬유화 또는 간경화의 치료 또는 예방용 건강기능식품.
5. 제4항에 있어서,
   상기 건강기능식품은 인진, 울금, 및 단삼의 추출물을 모두 포함하는 것을 특징으로 하는 간섬유화 또는 간경화의 치료 또는 예방용 건강기능식품.
6. 제5항에 있어서,
   상기 인진, 울금 및 단삼 추출물의 함량은 3~4 : 0.5~1.5 : 0.5~1.5 의 중량비로 포함되는 것을 특징으로 하는 간섬유화 또는 간경화 치료 또는 예방용 건강기능식품.

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