KR20110109246A - 여우오줌풀 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 여우오줌풀(Carpesium macrocephalum) 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증 관련 질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 CM의 추출물은 LPS-자극된 RAW264.7 마크로파지 세포에서 각 Synthetase(iNOS 및 COX-2)의 생성, JNK 인산화, 및 Akt-IκB 신호전달 경로를 저해하여서 NO, PGE₂ 및 전염증성 사이토카인(TNF-α 및 IL-6) 생성을 억제하고, 또한 인 비보(in vivo) 항 염증 실험에서 CM 투여는 혈관 투과성을 현저하게 감소시키는 효과를 가지고 있어서 본 발명의 추출물을 염증 질환들의 개선, 예방, 및 치료에 유용성을 가진다.

Description

여우오줌풀 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물{A COMPOSITION COMPRISING Carpesium macrocephalum EXTRACT}

여우오줌풀 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로 더욱 상세하게는 여우오줌풀 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증 개선 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

염증은 신체에 영향을 주는 다양한 이상과 질환에 연관된다. 가령, 관절 내에서 염증은 뼈와 관절 파괴 질환, 예를 들면, 골다공증뿐만 아니라 관절염과 류머티스 질환, 예를 들면, 점액낭염(bursitis), 건염(tendonitis), 근염(myositis), 골관절염(osteoarthritis)의 증상 및 이들에 의해 유발되는 구조적 변형을 악화시키는 것으로 알려져 있다.

염증은 또한, 다양한 심혈관 질환과 대사 질환 과정, 예를 들면, 죽상경화증, 혈전증, 비만과 연관된 인슐린 저항성의 원인이 되는 것으로 알려져 있다. 죽상경화증은 뇌졸중과 심근경색의 가능성을 증가시키고, 인슐린 저항성은 당뇨를 유발한다.

염증은 또한, 신경 장애, 예를 들면, 알츠하이머병을 발생시키는 것으로 생각된다.

실제로, 여러 연구에서 염증은 광범위한 만성 퇴행성 질환과 연관되고 있다. 이런 연구를 통하여, 염증 반응을 제공하는 신호전달 캐스케이드를 유도하는 친-염증성 화학물질(사이토카인)을 생산하는 특정 세포(대식세포)가 확인되었다. 이들 사이토카인은 외래 병원체와 감염성 병원체, 외상이나 만성적 상해, 비정상적인 화학적 또는 물리적 스트레스에 기인된 염증 반응에서 중요한 역할을 수행한다.

따라서, 염증성 사이토카인의 방출, 또는 염증성 사이토카인, 특히 대식세포로부터 유래된 인터루킨-1(IL-1)의 신호전달을 조절하는 치료법이 개발되었다. 가령, U.S. Patent 5,635,478(Vignery)에서는 IL-1 방출을 조절하여 류머티스 관절염을 치료하기 위한 칼시토닌 유전자 관련된 펩티드(CGRP)의 용도를 개시한다. 고도로 특이적인 CGRP가 IL-1을 조절하는데 유효하긴 하지만, 이의 이용에는 많은 비용이 소요되고, 연장된 이용에서 독성 효과의 여부가 아직 확인되지 않았다.

한편, Carpesium(Compositae) 종은 아시아에 널리 분포한다. Carpesium 종의 씨, 뿌리, 잎 줄기 및 꽃은 해열제, 지혈제, 구충제 및 진통제로 한국 및 중국에서 전통의약으로 사용되어 왔다(Lee CB: Illustrated Flora of Korea: HyangmoonSa, Seoul, 1993).

Carpesium 종 중에서, 본 발명자들은 여우오줌풀(Carpesium macrocephalum;CM)에 중점적을 두었다. CM은 그것의 항균 및 세포독성 성질을 조사하였다(Phytochemical constituents of Carpesium macrocephalum F(R).etS(AV). 2004; 27: 1029-1033.). Carpesium 종의 파이토케미컬 구성성분에 대한 기존의 보고는 sesquiterpene lactone이 주된 구성성분이고 CM으로부터 carabron, tomentosin 및 ivalin와 같은 몇 sesquiterpene lactone이 포함된 것으로 보고되었다(Phytochemical constituents of Carpesium macrocephalumF(R).etS(AV). 2004; 27: 1029-1033). However, 그러나 그들의 생물학적 활성은 아직 알려지지 않았다.

Nitric oxide (NO)는 NO synthase에 의해서 L-arginine으로부터 전환되고, 면역반응에 중요한 역할을 한다(Weinstein SL, Gold MR, DeFranco AL: Bacterial lipopolysaccharide stimulates protein tyrosine phosphorylation in macrophages. Proc Natl Acad Sci USA 1991;88:4148-4152.) . 그것의 비조절된 분비는 감염 동안 타겟 조직의 염증성 손상을 야기한다(MacMicking J, Xie QW, Nathan C: Nitric oxide and macrophage function. Annu Rev Immunol 1997;15: 323-350;Bogdan C: Nitric oxide and the immune response. Nat Immunol 2001;2: 907-916).

NO 및 prostaglandin E₂ (PGE₂)는 유도적인 NOS (iNOS) 및 cyclooxygenase (COX)-2와 같은 효소에 의해 염증 부위에서 생성된 주지된 매개자들이다. 염증에서, NO의 증가는 주로 iNOS에 의해서 야기되고, 그것은 사이토카인 또는 lipopolysaccharide (LPS) 자극에 의하여 마크로파지에서 업-레귤레이트된다(Bogdan C: Nitric oxide and the immune response. Nat Immunol 2001;2: 907-916;The role of arachidonic acid oxygenation products in pain and inflammation. Annu Rev Immunol 1984;2: 335-357).

마찬가지로, COX-2의 과발현은 PGE₂의 증가된 생성을 야기한다(The role of arachidonic acid oxygenation products in pain and inflammation. Annu Rev Immunol 1984;2: 335-357).

전-염증성(pro-inflammatory) 사이토카인인 종양 괴사 인자(TNF)-α는 T 세포 및 마크로파지를 활성화하고 다른 전-염증성 사이토카인들을 업-레귤레이트하여서 염증을 유발하고 지속시키는데 작용을 한다(Cunha FQ, Poole S, Lorenzetti BB, Ferreira SH: The pivotal role of tumour necrosis factor alpha in the development of inflammatory hyperalgesia. Br J Pharmacol 1992;107: 660-664.). Interleukin (IL)-6도 마크로파지에서 LPS 자극에 의해서 분비되는 전-염증성 사이토카인 중에 하나이다. 염증이 일어나는 동안에, IL-6의 증가는 세포 또는 조직 손상을 야기할 수 있다(Feldmann M, Brennan FM, Chantry D et al: Cytokine assays: role in evaluation of the pathogenesis of autoimmunity. Immunol Rev 1991;119: 105-123.).

따라서 이들 매개자들의 억제는 염증 질환의 효과적인 예방책일 수 있다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 염증 질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 염증 질환 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 유효량의 여우오줌풀(Carpesium macrocephalum) 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증 관련 질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 여우오줌풀 추출물은 알코올 또는 물 추출물인 것이 바람직하고, 상기 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올 또는 부탄올인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 유효량은 0.0001 내지 100 mg/kg 체중 범위인 것이 바람직하 고, 0.008에서 0.2mg/kg체중인 것이 더욱 바람직하며, 0.005내지 0.1mg/kg 체중인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 NO 또는 PGE₂ 생성을 억제하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 전염증성(proinflammatory) 사이토카인 생성을 억제하는 것이 바람직하고, 상기 전염증성 사이토카인은 TNF-α, IL-1β, IL-8, IL-13, 또는 IL-6인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명에서 'Proinflammatory cytokine'이란 inflammation-promoting cytokine, 즉 염증 반응을 하도록 촉진하는 사이토카인을 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 염증 관련 질환은 류마티스성 관절염, 만성 염증성 장 질환, 퇴행성 신경질환, 앨러지성 비염, 천식, 및 아토피성 피부염으로 구성된 군으로부터 선택된 질환인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 또 다른 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 혈관 투과성을 감소시키는 것을 특징으로 하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 여우오줌풀(Carpesium macrocephalum) 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증 관련 질환 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명의 조성물은 여우오줌풀 추출물을 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 NO, PGE_{2 ,} TNF-α 및 IL-6와 같은 전염증성(proinflammatory) 매개체의 발현, 생산, 분비 및/또는 방출을 저해하기 위하여 본원에 언급된 임의의 용량으로 투여될 수 있다.

적용 및/또는 공급업체에 따라, 성분은 다양한 물리적 형태, 예를 들면, 액체 또는 분말 형태로 특정 효능의 추출물, 순수성분, 부형제와 혼합된 성분일 수 있다.

임의의 방법을 이용하여 여우오줌풀 성분을 준비할 수 있다. 예로써, 통상적인 수확, 건조, 분말화 방법을 이용하여 여우오줌풀 분말을 준비할 수 있다. 이에 더하여, 여우오줌풀은 통상적으로 경동시장 등에서 상업적으로 구입가능하다.

본 발명의 조성물은 여우오줌풀로부터 추출된 성분을 함유할 수 있다. 가령, 본 발명의 약학 또는 식품 조성물은 여우오줌풀 분말 및 여우오줌풀 추출물을 함유할 수 있다. 이에 더하여, 조성물은 여우오줌풀 성분을 임의의 양으로 함유할 수 있다. 가령, 본 발명의 조성물은 적어도 1%(가령, 적어도 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90%)가 여우오줌풀 성분일 수 있다. 전형적으로, 조성물은 대략 0.001 ㎎ 내지 1000 ㎎의 여우오줌풀 성분을 함유한다.

더욱 구체적으로, 조성물은 한가지 이상의 여우오줌풀 성분을 함유할 수 있다. 여우오줌풀 성분의 예에는 제한없이, 건조된 여우오줌풀, 여우오줌풀 분말, 여우오줌풀 추출물이 포함된다. 여우오줌풀 성분은 Carpesium 과에 속하는 식물 종으로부터 획득될 수 있다.

본 발명의 조성물은 한가지 이상의 제약학적으로 허용가능한 부형제, 예를 들면, 크로스카멜로오스 소듐, 말토덱스트린, 규화된 미세결정 셀룰로오스, 이산화규소, 스테아르산, 히드록실 프로필 메틸 셀룰로오스(HPMC), 락토오스, 글루코오스, 수크로오스,옥수수 전분, 감자 전분, 셀룰로오스 아세테이트, 에틸 셀룰오로스 등을 함유할 수 있다. 희석제 및 다른 첨가제, 예를 들면,한가지 이상의 제약적으로 허용가능한 결합제, 충전제, 지지제, 증점제, 미각개선제, 착색제, 보존제, 단백질, 항균제, 킬레이트화제, 불활성 가스, 안정화제, 조절제, 유화제 또는 이들의 혼합물이 사용된 조성물의 형태에 맞게 사용할 수 있다.

조성물의 이들 성분은 다양한 전달 시스템을 갖는 형태로 가공될 수 있다. 가령, 이들 성분은 가공되고 캡슐, 정제, 겔 정(gel tab), 마름모꼴 정제, 스트립, 과립, 분말, 농축액, 용액, 로션, 크림 또는 현탁액에 포함될 수 있다. 이들 성분은 예로써, 스프레이, 분무 또는 에어로졸을 통한 천식, 아나필락시스 및/또는 다른 급성 쇼크 질환에서 호흡기로 투여될 수도 있다.

이들 성분은 독립적으로 또는 다른 식품과 공동으로 조제하여, 미리-조정된 영양 보조제, 보충 식품, 예를 들면, 1회용 바를 제공할 수 있다. 한 실례에서, 조성물은 정제 형태로 투여되는 한가지 성분 및 캡슐 형태로 투여되는 다른 성분을 함유할 수 있다. 더욱 구체적으로, 조성물은 다양한 투여 경로, 예를 들면, 정맥내, 근육내, 피하, 비강, 설하, 수막강내, 국소 또는 피내용으로 조제될 수 있다.

투여되는 조성물의 용량은 치료되는 질환 또는 이상에 따라 점진적으로 증가될 수 있다. 가령, 관절염의 치료에서, 조성물은 짧게는 대략 6 내지 12시간, 길게는 대략 2주 간격의 다중 연속 투약으로 투여될 수 있다. 일일 용량은 염증성 압통(tenderness), 부종, 통증으로부터 증상 완화를 달성하는 기간 동안 투여된다. 용량은 이들 증상으로부터 완화를 유지하기 위하여 변경될 수 있다.

치료는 수주 또는 수개월의 기간, 또는 선택적으로 만성 질환이나 이상의 경우 무기한으로 진행된다.

본 발명의 여우오줌풀 추출물을 함유하는 본 발명의 전형적인 조성물은 통상의 공정에 따라 정제 형태로 제조될 수 있다. 다른 투여 매체, 예를 들면, 겔 정(gel tab), 캡슐, 액체, 서방 조제물 등은 제약 분야에 널리 공지된 제조 기술에 따라 조제될 수 있다.

본 발명의 여우오줌풀 분말 또는 이것의 추출물의 동결건조 분말은 치료적으로 유효한 양으로 이산화실리콘에 첨가하고 폴리백에 위치시키며 균일하고 균질하게 혼합될 때까지 섞는다. 생성된 혼합물은 Patterson Kelley(P.K.) 100 배합기(Patterson-Kelley Co., East Stroudsburg, Pennsylvania)에 위치시킨다. 이후, 20-메시(mesh) 스크린이 구비된 Sweco 분리기(Sweco, Inc., Florence, Kentucky)를 통하여 P.K. 100 배합기: 덱스트로스, 크로스카멜로오스 소듐, 규화된 미세결정 셀룰로오스로 직접 이동시킨다. 생성된 조성물은 15분간 P.K. 100 배합기에서 혼합한다.

이후, 식물-기초된 스테아르산 분말은 Sweco 분리기를 통하여 P.K. 100 배합기로 직접 이동시킨다. 생성된 혼합물은 추가로 5분간 혼합한다. 생성된 혼합물은 토트(tote) 또는 슈퍼 색(super sack)에 넣고 압착하며 통상적인 장치로 정제로 찍어낸다. 각 개별 정제의 허용가능 중량 범위는 대략 250 ㎎ 내지 500 ㎎이다. 각 정제에서 여우오줌풀의 양은 대략 120~1500 ㎎이다.

본 발명의 조성물의 연성 겔 캡슐은 크릴 오일을 함유하도록 제조될 수 있다. 상기 캡슐은 통상적인 캡슐 제조 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 각 캡슐에서 크릴 오일의 양은 대략 300 ㎎이다.

또한, 본 발명은 본 발명의 추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강 기능성 식품 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 식품 조성물은, 예를 들어, 츄잉껌, 캐러멜 제품, 캔디류, 빙과류,과자류 등의 각종 식품류, 청량 음료, 미네랄 워터, 알코올 음료 등의 음료 제품, 비타민이나 미네랄 등을 포함한 건강기능성 식품류일 수 있다.

이 때, 상기 식품 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.001 내지 99.9 중량%로 가할 수 있으며, 음료 중에는 100 ㎖를 기준으로 0.001 내지 0.1 g, 더 바람직하게는 0.05 내지 0.1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 추출물을 함유하는 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 건강기능성 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 기능성 식품 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료 의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택 되는 것이 일반적이다.

이하 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명에서 본 발명자들은 CM이 NO, PGE₂ 및 전염증성 사이토카인 생성을 다운 레귤레이트한다는 것을 발견하고 LPS-자극된 RAW264.7 세포에서 그것의 항-염증 작용의 분자적 메카니즘을 조사하였다.

여우오줌풀(Carpesium macrocephalum; 이하 'CM'이라 함)은 해열제, 지혈제, 구충제 및 진통제로 한국 및 중국에서 전통의약으로 사용되어 왔다. 그러나 CM의 항염증 활성에 대해서는 아직 보고되지 아니하였다. 본 발명은 CM의 메탄올 추출액이 RAW264.7 murine 마크로파지 세포에서 LPS-유도된 염증 반응을 조절하는지를 확인하였다. CM 추출물은 NO, PGE_{2 ,}TNF-α및 IL-6와 같은 전염증성(proinflammatory) 매개체의 LPS-유도된 분지를 저해하였다. CM은 또한 iNOS의 생선 및 COX-2 발현을 다운조절하였다. MAPKs 중 하나인 JNK는 CM 처리에 의하여 브러킹되었다. CM은 또한 Akt 활성화 및 IκB 분해를 억제하였다. 또한 CM 추출물은 용량 의존적으로 인 비보에서 혈관투과성을 억제하였다.

염증은 해로운 미생물에 대한 방어 기작이지만 이 상태의 만성적인 존재는 류마티스성 관절염, 만성 염증성 장 질환, 퇴행성 신경질환, 앨러지성 비염, 천식, 아토피성 피부염과 같은 많은 질환과 관련되어 있다(Kaminska B: MAPK signaling pathways as molecular targets for anti-inflammatory therapy-from molecular mechanisms to therapeutic benefits. Biochim Biophys Acta 2005;253262; Complementary and alternative medicine: herbs, phytochemicals and vitamins and their immunologic effects. J Allergy Clin Immunol 2009;123: 283-294;Denburg JA: Allergy and allergic diseases: the new mechanisms and therapeutics.Humana Press: Totowa, New Jersey, 1998.).

NO 생성 및 iNOS 발현은 염증 및 발암과 같은 몇 몇 질환의 발병과 관련이 있다고 여겨진다(Mordan LJ, Burnett TS, Zhang LX: Inhibitors of endogenous nitrogen oxide formation block the promotion of neoplastic transformation in C3H10T1/2 fibroblasts. Carcinogenesis 1993;14: 1555-1559.). 따라서 조직에서 iNOS 조절은 염증의 치료에 중요하다(Chan MM, Hunag HI, Fenton MR, Fong D: Biochem Pharmacol 1998; 55: 1955-1962.)

본 발명에서는 본 발명자들은 CM이 LPS-자극된 RAW264.7 세포에서 iNOS 발현을 저해하여서 NO 생성을 저해한다는 것을 발견하였다. CM에 의한 NO 및 PGE₂ 생성의 감소는 iNOS 및 COX-2 단백질 발현의 저해로부터 야기된다.

LPS는 IκB kinase (IKK) 또는 Akt kinase 활성을 증가시켜서 IκB 분해 및 인산화를 통해서 NF-κB 활성화를 촉진하고 IκB는 Akt 신호전달의 타겟인 것으로 알려졌다(Ozes ON, 등. Nature 1999;401: 82-85.).

본 발명의 결과는 CM이 Akt의 인산화를 현저하게 감소시킨다는 것을 나타낸다. 이 저해는 IκB 분해의 억제와 관련이 있고, 이것은 Akt 불활성화가 TNF-α, IL-6, iNOS 및 COX-2를 포함하는 다운스트림 생산물의 수준을 감소시키는 CM 매개된 항-염증 작용과 관련 있을 것이라는 것을 나타낸다.

LPS는 MAPKs와 같은 세포내 신호 물질을 촉진하여 염증성 사이토카인 및 NO 분비를 촉발한다(Guha M, Mackman N: LPS induction of gene expression in human monocytes. Cell Signal 2001;13: 85-94.). MAPKs 신호 전달 경로는 다양한 다른 세포 자극에 의해서 활성화되고 다양한 반응을 매개한다(Map kinase signaling pathways and hematologic malignancies. Blood 2003;101: 4667-4679.)

Chiu 및 Lin (2008)은 JNK 신호전달은 iNOS 및 COX-2 발현 조절에 주된 중요성이 있다는 것을 제안하였다(Chiu FL, Lin JK: Tomatidine inhibits iNOS and COX-2 through suppression of NF-κB and JNK pathways in LPS-stimulated mouse macrophages. FEBS Lett 2008;16: 2407-2412.). 그들은 LPS-자극된 RAW264.7 마크로파지 세포에 각 MAPKs 저해제를 처리한 후에 iNOS 및 COX-2 생산을 측정하였다. iNOS 및 COX-2 레벨에서 LPS-유도된 증가는 p38 및 ERK의 저해제에 의해서 영향을 받지 않았지만, JNK 저해제에 의해서는 저해되었다.

따라서 본 발명의 데이터는 CM 추출물이 JNK 활성화를 저해하여서 유도적인 iNOS 및 COX-2 단백질의 발현을 강력하게 저해할 수 있다는 것을 제안한다. 결론적으로, CM 처리는 NO 및 PGE2 생성을 감소시킬 수 있다.

인 비보에서 항염증 활성의 측정에서 CM은 아세트산 유도된 혈관 투과성을 용량 의존적으로 현저하게 감소시켰다. 혈관 투과성 모델에서, 염증 반응의 전형적인 첫 번째 단계에서, 염증의 매개체들이 자극에 따라서 분비되고 소동맥과 소정맥을 확장시켜서 혈관 투과성을 증가시킨다(Vogel HG, Vogel WH: Drug Discovery and Evaluations, Pharmacological Assays, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, 1997.). 혈관 투과성은 혈관과 그 밑에 있는 조직 사이에 체액과 분자들의 이동으로 정의하고 그것은 세포내 혈관내피 연결부(endothelial junction)를 분해하는 여러 염증성 인자에 의해 조절된다(Weis SM, Cheresh DA: Pathophysiological consequences of VEGF-induced vascular permeability. Nature 2005;22:497-504.).

따라서 혈관 투과성의 저해는 항염증 약제가 작용하는 방법 중 하나이다(Whittle BA: The use of changes in capillary permeability in mice to distinguish between narcotic and nonnarcotic analgesics, Br J Pharmacol Chemother 1964;22: 246-253.). 따라서 CM 처리는 염증 질환을 위한 임상적 사용 가능성을 보여준다.

이하 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

CM 은 LPS -유도된 NO 및 PGE ₂ 생성에 대하여 저해 효과를 가진다

마크로파지에 대한 CM의 세포독성을 조사하기 위해서, RAW264.7 세포들을 24시간 동안 5에서 40μg/ml 의 농도의 CM으로 배양하고 MTT 분석을 수행하였다. 도 1a에서 알 수 있는 바와 같이, 세포 생존성은 20μg/ml 이하 농도에서 감소하지 않았다. 따라서 이후의 분석에서는 CM의 최대 농도를 20μg/ml에서 사용하였다.

iNOS-매개된 NO 분비의 조절은 염증 과정에서 주된 기여 인자 중 하나이다(MacMicking J, Xie QW, Nathan C: Nitric oxide and macrophage function. Annu Rev Immunol 1997;15: 323-350.). NO 생성에 대한 CM의 효과를 조사하기 위해서, NO의 안정한 최종 산물인 nitrite의 축적을 Griess 시약에 의해서 측정하였다. 도 1b에서 알 수 있는 바와 같이, 대조군 또는 CM 단독으로는 NO 생성에 대해서 어떠한 효과를 가지지 않지만, LPS 단독으로는 NO 레벨을 현저하게 증가시켰다. LPS와 CM을 같이 세포에 배양한 경우에는 용량 의존적으로 NO 생성의 감소를 야기하였다.

PGE₂는 염증 부위에서 상당한 양이 합성되고 강력한 혈관확장제로 작용하고 히스타민과 같은 다른 매개체와 상승적으로 작용한다(The role of arachidonic acid oxygenation products in pain and inflammation. Annu Rev Immunol 1984;2: 335-357).

따라서 본 발명자들은 CM이 RAW264.7 세포에서 LPS-자극된 PGE₂ 생성을 감소시킬 수 있는지를 조사하였다. 도 1c에서 알 수 있는 바와 같이, CM 처리는 LPS-자극된 RAW264.7 세포에서 용량 의존적으로 PGE₂ 생성을 저해하는 것을 발견하였다.

CM 은 iNOS 및 COX -2 mRNA 및 단백질 발현에 대해서 저해 효과를 가진다

NO 및 PGE₂ 발현은 각각 iNOS 및 COX-2의 합성에 의해서 크게 조절된다고 보고되었다(Bogdan C: Nitric oxide and the immune response. Nat Immunol 2001;2: 907-916;The role of arachidonic acid oxygenation products in pain and inflammation. Annu Rev Immunol 1984;2: 335-357). 따라서 본 발명자들은 LPS-자극된 RAW264.7 세포에서 iNOS 및 COX-2 mRNA 및 단백질 발현 수준에 대한 CM의 효과를 조사하였다. LPS 단독의 자극은 iNOS 및 COX-2 모두의 mRNA 및 단백질 발현을 현저하게 유도하였다. CM은 용량 의존적으로 iNOS 및 COX-2 발현을 감소시켰다(도 2a 및 b).

이들 결과들은 LPS-유도된 NO 및 PGE₂ 생성에 대한 CM 처리의 저해 효과는 iNOS 및 COX-2 발현의 억제에 기인할 수 있다는 것을 나타낸다.

CM 은 전-염증성( pro - inflammatory ) 사이토카인 생성에 대해 저해 효과를 가진다

TNF-α 및 IL-6와 같은 전염증성 사이토카인은 여러 염증성 질환에서 중요한 역할을 한다(Feldmann M, Brennan FM, Chantry D et al: Cytokine assays: role in evaluation of the pathogenesis of autoimmunity. Immunol Rev 1991;119: 105-123.). 본 발명자들은 ELISA에 의해서 LPS-유도된 TNF-α 및 IL-6 분비에 대한 CM의 효과를 조사하였다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, LPS로 자극된 RAW264.7 세포는 TNF-α 및 IL-6의 레벨이 현저하게 증가하지만, CM은 용량 의존적으로 TNF-α 및 IL-6 생성을 감소시킨다. TNF-α 및 IL-6 mRNA의 레벨은 또한 같은 형태로 CM에 의해서 감소되었다(도시 안함).

이들 데이터는 CM이 TNF-α 및 IL-6와 같은 전-염증성 사이토카인을 다운 레귤레이트하는 능력을 가졌고 전사 과정도 이 감소에 관여한다는 것을 나타낸다.

CM 은 Akt 및 NF -κB 활성화에 대한 억제 효과를 가진다

Nuclear factor kappa-B (NF-κB)는 IL-6 및 TNF-α와 같은 전염증성 사이토카인 및 iNOS, COX-2의 조절에 관여하는 주지된 전사인자이다(Annu Rev Immunol 12: 141-179). LPS는 IκB 분해를 통하여 NF-κB 활성화를 증가시킨다고 알려졌다(Li Q, Lu Q, Bottero V, Estepa G, Morrison L, Mercurio F, Verma IM: Enhanced NF-κB activation and cellular function in macrophages lacking IκB kinase 1 (IKK1). Proc Natl Acad Sci USA 2005;102: 12425-12430.). Akt는 IκB 분해를 통한 NF-κB 활성화에 대한 신호 매개체로 알려졌다(Nat Rev Mol cell biol 2000; 20: 1626-1638.).

따라서 본 발명자들은 CM 이 RAW264.7 세포에서 Akt의 LPS-자극된 인산화 및 IκB의 분해를 완화시킬 수 있는지를 조사하였다.

도 4에서 알 수 있는 바와 같이, Atk 인산화는 LPS 자극에 의해서 크게 증가하고, CM은 LPS-유도된 Akt 인산화를 현저하게 저해하는 것을 알 수 있었다. 또한 IκB-α는 LPS 자극 후에는 현저하게 분해되고 용량의존적으로 CM에 의해서는 증가하였다. 이들 결과는 CM 처리 후에 iNOS 및 COX-2의 다운 레귤레이션은 Akt 감소를 통한 NF-κB 활성화의 저해에 기인한다는 것을 나타낸다.

CM 은 JNK 발현에 대한 억제 효과를 가진다

Mitogen activated protein kinases (MAPKs)은 세포내 네트워크에 관여하는 중요한 매개체로 알려져있다. 이것들은 세포외 신호로부터 NF-κB, TNF-α 및 IL-6와 같은 전염증성 물질의 생성을 조절한다(Kaminska B: MAPK signaling pathways as molecular targets for anti-inflammatory therapy-from molecular mechanisms to therapeutic benefits. Biochim Biophys Acta 2005;253262.).

CM에 의한 NO 및 염증성 사이토카인 생선의 저해가 MAPK 경로를 통해서 조절되는지를 조사하기 위해서, 본 발명자들은 ERK, P38 및 JNK와 같은 MAPKs의 LPS-유도된 인산화에 대한 CM의 효과를 조사하였다. CM으로 처리된 LPS-자극된 세포는 JNK 인산화를 억제하지만, 용량 의존적으로 ERK의 레벨을 증가시킨다(도 5).

이들 데이터는 CM이 MAPK 경로에서 JNK 인산화를 억제하여 LPS 유도된 마크로파지에서 염증성 매개체의 생성을 저해한다는 것을 알 수 있다.

인 비보( in vivo )에서 혈관 투과성에 대한 CM 의 억제 효과

혈관으로부터 체액(fluid)의 용출에 대한 CM의 효과는 초산 유도된 증가된 혈관 투과성 동안에 복막(peritoneum)에서 누출되는 염료의 양을 정량화하여서 실험하였다.

도 6은 마우스에서 혈관 투과성 실험의 결과를 보여준다. CM의 투여는 마우스에서 용량 의존적으로 아세트산 유도된 혈관 투과성을 감소시켰다. 0.008, 0.04, 및 0.2 mg/kg의 CM의 경구 투여량은 각각 21.8, 31.6 및 34.6%의 저해 활성을 나타내었다.

본 발명에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 CM의 추출물은 LPS-자극된 RAW264.7 마크로파지 세포에서 각 Synthetase(iNOS 및 COX-2)의 생성, JNK 인산화, 및 Akt-IκB 신호전달 경로를 저해하여서 NO, PGE₂ 및 전염증성 사이토카인(TNF-α 및 IL-6) 생성을 억제한다. 또한 인 비보(in vivo) 항 염증 실험에서 CM 투여는 혈관 투과성을 현저하게 감소시켰다. 이들 데이터는 염증 질환들 치료에 CM이 유용성을 가진다는 것을 알 수 있다.

도 1은 세포 생존률 및 NO 및 PGE₂의 생성에 대한 CM의 효과를 나타내는 그림이다.
도 1a는 RAW 264.7 세포를 표시된 농도의 CM으로 처리하였다. 세포 생존률은 MTT 분석에 의하여 결정하였다. 세포를 표시된 양의 CM으로 1시간 동안 전처리하고, LPS로 처리한 후, 그 배지를 18시간 수집하여 nitrite (1b) 및 PGE₂ (1c) 생성에 대한 분석을 수행하였다. 도 1c의 하단 x축에 기재된 양들도 1b와 같이 + 또는 -는 LPS 처리를 숫자는 CM의 농도(㎍/ml)를 나타낸다. 데이터는 평균±SEM으로 나타낸다 (n=3). *p<0.05 및 ***p<0.001임.
도 2는 LPS-유도된 iNOS 및 COX-2의 발현에 대한 CM의 효과를 나타내는 그림.
도 2a는 RAW 264.7 세포를 표시된 양의 CM으로 1시간 동안 전처리하고, LPS로 처리한 후, 6시간 배양 후 총 RNA 얻어서 RT-PCR을 수행하였다. GAPDH를 내부 대조군으로 사용하였다.
도 2b는 웨스턴 블럿에 의한 iNOS 및 COX-2 단백질 발현의 정량화를 나타낸다. 전체 세포 단백질은 10% SDS-PAGE로 분리하였다. 베타-actin을 내부 대조군으로 사용하였다.
도 3은 LPS-유도된 TNF-알파 및 IL-6 생성에 대한 CM의 효과를 나타내는 그림.
RAW 264.7 세포 (24-웰 플레이트의 웰 당 2x10⁵ 세포)를 CM으로 1시간 동안 전처리하고, LPS로 자극한 후, LPS 자극 후 12시간 후 그 상등액을 얻었고,TNF-알파(3a) 및 IL-6 (3b)의 농도를 통상적으로 구할 수 있는 샌드위치 ELISA 키트를 사용하여 측정하였다. 데이터는 평균±SEM으로 나타낸다 (n=3). **p<0.01 및 ***p<0.001임. 유의성은 Student t-테스트에 의하여 결정하였다(†〈0.001).
도 4는 LPS-유도된 Akt 인산화 및 IκB 발현에 대한 CM의 효과를 나타낸 그림.
RAW 264.7 세포를 대조군을 제외하고는 표시된 농도의 CM으로 1시간 동안 전처리하고, LPS로 자극한 후, LPS 자극 후 12시간 후 그 상등액을 얻었고, 인산화된 Akt 및 IκB 발현을 웨스턴 블럿에 의하여 검출하였다. 베타-액틴을 내부 대조군으로 사용하였다.
도 5는 MAPKs의 LPS 유도된 인산화에 대한 CM의 효과를 나타낸 그림. RAW 264.7 세포 (24-웰 플레이트의 웰 당 2x10⁵ 세포)를 CM으로 1시간 동안 전처리하고, LPS로 자극한 후, LPS 자극 후 12시간 후 그 상등액을 얻었고, MAPKs의 단백질의 신호를 웨스턴 블럿으로 검출하였다.
도 6은 마우스에서 초산-유도된 혈관 투과성에 대한 CM의 효과를 나타낸 그림.
Con은 비처리 군을 나타낸다. Sodium salicylate 처리군(SS, 300mg/kg 체중)을 양성 대조군으로 사용하였다. CM (0.008, 0.04 및 0.2mg/kg 체중)을 경구적으로 투여하였다. 혈관 투과성을 650nm에서 흡광도로 나타내었다.
각 군은 5마리를 포함하였다. 데이터는 평균±SEM으로 나타낸다 (n=3). **p<0.01 및 ***p<0.001임. 유의성은 Student t-테스트에 의하여 결정하였다(†〈0.001).

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

본 발명의 DMEM, FBS, penicillin 및 streptomycin은 Hyclone (Logan, UT, USA)로부터 구입하였다. TRIzol 시약은 Molecular Research Center, Inc (Cincinnati, OH, USA)로부터 구입하였다. AccuPowerTM RT Premix, AccuPowerTM PCR Premix 및 primers for iNOS, COX-2 및 GAPDH에 대한 프라이머는 BIONEER (Seoul, KOR)로부터 구입하였다. PGE₂ Biotrak 효소-염증 시스템은 GE 헬쓰케어(Little Chalfont, Buckinghamshire, UK)로부터 구입하였다. 마우스 TNF-α 및 IL-6 ELISA 세트(BD OptEIA^TMSet) 및 TMB Substrate Reagent 세트는 BD Biosciences(FranklinLakes,SD,USA)로부터 구입하였다.

iNOS에 대한 항체는 Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY, USA)로부터 구입하였다. COX-2, IκB (inhibitor of kappa B) 및 액틴에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하였다. phospho-ERK (extracellular signal-regulated kinase), phospho-p38, phospho-JNK (c-Jun N-terminal kinase) 및 phospho-Akt에 대한 항체는 Cell Signaling Technology Inc. (Beverly, MA, USA)로부터 구입하였다. ECL 검출 시약 및 PVDF 막은 Amersham Biosciences (Piscataway, NJ, USA)으로부터 구입하였다. LPS, MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyl tetrazolium bromide), Evans blue, sodium salicylate, 아세트산 및 다른 모든 화학물질들은 Sigma Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다.

실시예 1: 식물 및 추출과정

CM의 메탄올 추출물은 한국생명공학연구원(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology;KRIBB)의 Plant Extract Bank로부터 제공받았다. 바우처 specimen (KRIB 0007217)은 한국생명공학연구원(KRIBB)의 Plant Extract Bank의 식물표본실(herbarium)에 기탁되었다.

본 발명에서 사용된 식물은 2006년 8월에 대한민국 전라남도에서 수집한 것이다. 그 식물학적 입증(authentication)은 KRIBB의 식물 분류학자인 강신호 박사에 의해서 수행되었다. The dried whole plants of CM (40g)의 건조된 전체 식물을 분말로 갈아서 50 ℃에서 20분간 1500 psi 압력에서 200 accelerated(Dionex,Camberly,UK)에서 메탄올 (200ml)로 추출하였다. 그 추출 수율은 12.09%이었다. 그 추출물은 각 처리를 위해서 DMSO에 녹였다.

실시예 2: 세포 배양

RAW264.7 세포들을 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)로부터 구입하여, 10% 열 불활성화된 FBS(fetal bovine serum) 및 항생물질(100 U/ml의 penicillin, 100μg/ml의 streptomycin)이 보충된 DMEM 배지에서 37℃에서 5% CO₂ 습도 조건에서 배양하였다.

실시예 3: 세포 생존성 분석

세포 생존에 대한 CM의 효과를 조사하기 위해서, RAW26.7 세포를 96-웰(well) 플레이트(plate) 상에 1x10⁴cells/well의 농도로 삼중(triplicate)으로 시딩(seeding)하였고, 4시간 동안 배양하였다. 세포들을 24시간 동안 여러 농도의 CM(0, 10, 20, 40 및 80μg/ml). 처리 후에, 그 배지를 버리고, 100ml의 MTT(0.5mg/ml)을 포함하는 DMEM를 각 웰(well)에 첨가하고 37℃에서 4시간 동안 배양을 수반하였다. 배양 후, 그 배지를 버리고 200ml DMSO를 첨가하여서 formazan 염료를 녹였다. 흡광도를 540nm에서 측정하고 그 값을 대조군 세포들과 비교하여서 결정하였다.

실시예 4: nitrite 생성의 결정

배양 배지에서 Nitrite 농도는 Griess 시약에 의하여 결정되었다. 그 배양 상등액(100μl)을 10분 동안 Griess 시약(100μl, 1% sulfanilamide, 0.1% N-1-naphthyl ethylenediamine)과 혼합한 후 chromophoric azo-유도체 분자의 흡광도를 550nm에서 마이크로플레이트 리더로 측정하였다. 신선한 배양 배지를 모든 실험의 블랭크로 사용하였다. 질산 나트륨(sodium nitrite)의 희석 범위는 각 샘플에서 나이트라이트의 양을 가지는 표준 곡선에 대해 사용하였다.

실시예 5: Enzyme - linked immunosorbent assay ( ELISA )

사이토카인(TNF-α 및 IL-6)의 측정은 ELISA에 의해서 결정되었다. RAW264.7 세포들 (2x10⁵cells /well, 24-웰 플레이트)은 60분 동안 CM으로 전처리되었고 혈청의 존재하에서 LPS(100ng/ml)로 자극되었다. 그 배양된 RAW264.7 세포의 상등액을 LPS 자극 후 12시간 후에 수집한 후에 하고 TNF-α 및 IL-6의 농도를 제조업자의 지시에 따라서 BDOptEIA^TM Set를 사용하여 통상적인 샌드위치 ELISA에 의해서 측정하였다 . 그 생성된 색을 분광계적 마이크로타이터 플레이트 리더(MolecularDevicesCorp.,Sunnyvale,CA,USA)를 사용하여 450nm에서 측정하였다. PGE₂생성은 PGE₂ Biotrak Enzymeimmunoassay System을 사용하여 결정하였다.

실시예 6: RNA 분리 및 RT - PCR

전체 RNA는 제조업자의 지시에 따라서 TRIzol 시약을 사용하여 세포로부터 분리한 다음에 2μg을 Oligo (dT) 18 프라이머 및 AccuPowerTM RT Premix를 사용하여 cDNA를 제조하기 위하여 역전사하였다. PCR 증폭은 제조업자의 지시에 따라서 수행하였다.

그 증폭은 다음 조건 하에서 thermal cycler (Hercules, CA, USA)에서 수행되었다: 95℃에서 30초간 변성, 65℃ (iNOS) 또는 55℃ (COX-2)에서 30초간 어닐링 그리고 30 (iNOS) 또는 22 사이클 (COX-2) 동안 72℃에서 40초간 익스텐션. 전변성(Predenature)을 94℃에서 3분간 수행하고 최종 익스텐션을 72℃에서 5분간 수행하였다. PCR 산물들을 1.5% 아가로스 젤 상에서 전기영동하고 ethidium bromide로 염색하였다.

실시예 7: SDS - PAGE 및 면역블럿팅

그 세포들을 50mM TrisHCl (pH 8.0), 1% Nonidet P-40 (NP-40), 150mM sodium chloride, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS), 프로테이즈 및 포스파테이즈 저해제 칵테일을 포함한느 버퍼에서 라이시스시켰다. 세포 파쇄액으로부터 온 동량의 샘플을 10% SDS PAGE 젤 전기영동으로 분리하고 polyvinylidene fluoride (PVDF)로 트랜스퍼하였다. 그 막을 5% 탈지 분유를 포함하는 TBS로 상온에서 2시간 동안 불로킹하였다. 그 후에, 그 막을 4℃에서 밤새 1차 항체로 반응시키고 면역 복합체를 상온에서 1시간 동안 horseradish peroxidase-부착된 항체로 배양하였다. 2차 항체의 적용 후, 막을 Luminescent image analyzer (LAS-3000; Fujifilm, Tokyo, Japan)에 의해서 ECL 검출 키트을 사용하여 시각화를 위해서 발색하였다.

실시예 8:마우스에서 초산-유도된 혈관 투과성 테스트

Male BALB/c 마우스(5 주령)를 NARA biotech Co. Ltd (Seoul, Korea)으로부터 구입하여, 1주일 동안 동물 사육장치에서 유지시켰다. 그 마우스들을 물과 음식들을 자유롭게 접근시키면서 24±1℃에서 12시간-낮-밤 사이클을 유지시켰다. 동물 실험은 연구소의 가이드라인에 따라서 수행하였다. 케어를 위한 프로토콜은 대한민국 건국대학교 Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)로부터 사전 승인을 받았다.

혈관 투과성 테스트는 Whittle (Whittle,1964)에 의해서 기재된 변형된 방법을 사용하여 수행하였다. 그 마우스들을 다섯 군으로 나누었다. CM을 경구투여하였다. 양성 대조군은 sodium salicylate (300mg/kg)를 피하주사하였고 동량의 식염수 용액을 비투여 군에는 주사하였다. 투여 30분 후, 1% Evans blue (5ml/kg in PBS)를 각 동물의 꼬리정맥으로 정맥주사하였다. 물질의 투여 60분 후, 0.6% 초산(10ml/kg in PBS)을 복강내 투여하였다. 60분 후, 마우스들을 경추 탈골(cervical dislocation)을 시켜서 희생시켰다. 식염수 용액(5ml)을 복강내에 주사하였고 그 세척액을 수집하였다. 그 수집된 세척액을 10분간 1000rpm에서 원심분리한 후 상등액에서 Evans blue의 흡광도를 분광기(Molecular,Sunnyvale,CA)로 650nm에서 측정하였다.

실시예 9: 통계 분석

그 결과는 RT-PCR 및 웨스턴 블럿의 결과를 나타낸 것을 제외하고는 삼중으로 수행된 적어도 세 번의 독자적인 실험의 평균±SEM으로 나타내었고, 대표적인 실험을 도면으로 나타내었다. 처리군을 Bonferroni 테스트를 가지는 원-웨이 (analysis of variance;ANOVA)을 사용하여 비교하였다. 통계적 유의성은 p<0.05, p<0.01 및 p<0.001일때 유의성이 있다고 간주하였다.

Claims (10)

1. 유효량의 여우오줌풀(Carpesium macrocephalum) 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증 관련 질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 여우오줌풀 추출물은 알코올 또는 물 추출물인 것을 특징으로 하는 염증 관련 질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
3. 제 2항에 있어서, 상기 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올 또는 부탄올인 것을 특징으로 하는 염증 관련 질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
4. 제 1항에 있어서, 상기 유효량은 0.0001 내지 100 mg/kg 체중 범위인 것을 특징으로 하는 염증 관련 질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
5. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 NO 또는 PGE₂ 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 염증 관련 질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
6. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 전염증성(proinflammatory) 사이토카인 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 염증 관련 질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
7. 제 6항에 있어서, 상기 전염증성 사이토카인은 TNF-α, IL-1β, IL-8, IL-13,또는 IL-6인 것을 특징으로 하는 염증 관련 질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
8. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증 관련 질환은 류마티스성 관절염, 만성 염증성 장 질환, 퇴행성 신경질환, 앨러지성 비염, 천식, 및 아토피성 피부염으로 구성된 군으로부터 선택된 질환인 것을 특징으로 하는 염증 관련 질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
9. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 혈관 투과성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 염증 관련 질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
10. 여우오줌풀(Carpesium macrocephalum) 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증 관련 질환 개선용 건강식품 조성물.
    

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