KR20110080678A

KR20110080678A - 팥꽃나무에서 분리한 아피게닌을 유효성분으로 함유하는 치주인대세포에서 항염 효과를 나타내는 조성물

Info

Publication number: KR20110080678A
Application number: KR1020100001013A
Authority: KR
Inventors: 김은철; 정길생; 김윤철
Original assignee: 원광대학교산학협력단
Priority date: 2010-01-06
Filing date: 2010-01-06
Publication date: 2011-07-13

Abstract

본 발명은 팥꽃나무에서 분리한 아피게닌을 유효성분으로 함유하는 항치주염 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명의 조성물은 치주 인대 세포에서 뛰어난 항염 효과를 나타내므로, 치주 질환의 예방, 개선 및 치료를 위한 의약 조성물 및 식품 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

팥꽃나무에서 분리한 아피게닌을 유효성분으로 함유하는 치주인대세포에서 항염 효과를 나타내는 조성물{A veterinary composition comprising apigenin isolated from the extract of Daphne Genkwa showing anti-inflammatory effects on periodontal ligament cells}

본 발명은 팥꽃나무에서 분리한 아피게닌을 유효성분으로 함유하는 항치주염 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

[문헌 1] Page RC and Schroeder HE, Laboratory Investigation 34, pp.23549, 1976

[문헌 2] Yamaji Y et al, Infection and Immunity 63, pp.35763581, 1995

[문헌 3] Garrison SW and Nichols FC, Journal of Periodontal Research 24, pp.8895, 1989 　

[문헌 4] Page RC, Journal of Periodontal Research 26, pp.230242, 1991　

[문헌 5] Agarwal S et al, Journal of Periodontal Research 30, pp. 382389, 1995　

[문헌 6] McGuire JR et al, Journal of Periodontology 60, pp.176181, 1989　

[문헌 7] Giannopoulou C et al, Journal of Clinical Periodontology 26, pp.4955, 1999

[문헌 8] Chang YC et al, Journal of Clinical Periodontology 28, pp.277282, 2001　

[문헌 9] Chang YC et al, Journal of Periodontal Research 37, pp.279285, 2002　

[문헌 10] Katono T et al, Archives of Oral Biology 54, pp.146155, 2009　

[문헌 11] Pi SH et al, Journal of Periodontal Research Electronic publicationin ahead, 2009

[문헌 12] Lekic P and McCulloch CA, The Anatomical Record 245, pp.327341, 1996

[문헌 13] Hou LT and Yaeger JA, Journal of Periodontology 64, pp.12091218, 1993

[문헌 14] Min KS et al, Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontics 102, pp.803808, 2006

[문헌 15] Min KS et al, Journal of Endodontics 32, pp.3943, 2006

[문헌 16] Pi SH et al, Journal of Periodontal Research 42, pp.331339, 2007

[문헌 17] Bang MH et al, Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry 48, pp.418-420, 2005

[문헌 18] Mosmann T, Journal of immunological methods 65, pp.55-63, 1983

[문헌 19] Pi SH et al, Journal of Periodontal Research 42, pp.103114, 2007

[문헌 20] Jeong GS et al, International Immunopharmacology 9, pp.241246, 2009

[문헌 21] Li B et al, European Journal of Pharmacology 614, pp.58-65, 2009

치주 질환은 치은염(gingivitis)과 치주염(periodontitis)으로 나뉘며, 치주인대와 인접조직을 손상시켜 발생하는 만성 염증 질환으로 염증이 치료되지 못하고 지속되면 치주조직이 서서히 파괴되어서 이가 흔들리게 되고 심하면 빠지게 된다(Page RC and Schroeder HE, Laboratory Investigation 34, pp.23549, 1976). 치주염은 다인성 질병으로 치아를 둘러싼 지지조직에 생긴 염증이며 치태(Microbial plaque)내의 세균 및 독소에 의해 발생되는 질환으로 치아 표면의 박테리아에 의한 숙주(host)의 방어 기전에 따른 결과로 알려져 있다(Yamaji Y et al, Infection and Immunity 63, pp.35763581, 1995 ; Garrison SW and Nichols FC, Journal of Periodontal Research 24, pp.8895, 1989).

리포폴리싸카라이드(lipopolysaccaride)는 내독소 물질로 잇몸아래 존재 하는 거의 모든 그람 음성균의 세포외막에 존재하며, 다형핵 백혈구 침윤(polymorphonuclear leukocyte infiltration), 부종(edema), 혈관 비대(vascular dilatation) 등의 염증으로 인하여 발병 하는 치주 질환을 일으키는 것으로 알려져 있다(Page RC, Journal of Periodontal Research 26, pp.230242, 1991). 더욱이, 리포폴리싸카라이드는 잇몸(gingiva), 치주 인대(periodontal ligament), 치조골(alveolar bone) 등과 연관된 치주 조직의 파괴에 주요하게 작용을 하며, 이러한 치주 조직의 파괴는 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-8(IL-8), 조직괴사인자-α (tumor necrosis factor-α), 프로스타글란딘(PG) 등 염증 촉진 인자들의 생성을 통해 일어난다(Agarwal S et al, Journal of Periodontal Research 30, pp. 382389, 1995). 흡연은 치주 질환의 발병률을 증가시키는 중요한 환경적인 유해 요소이다. 많은 연구를 통해서 담배 연기는 특히 치주 조직의 염증과 면역 반응에 영향을 준다고 보고되어 있다(McGuire JR et al, Journal of Periodontology 60, pp.176181, 1989). 몇몇의 연구에서는 니코틴(nicotine)이 담배연기에서 주요하게 염증반응을 증가시키는 것으로 보고되어 있다(Giannopoulou C et al, Journal of Clinical Periodontology 26, pp.4955, 1999 ; Chang YC et al, Journal of Clinical Periodontology 28, pp.277282, 2001 ; Chang YC et al, Journal of Periodontal Research 37, pp.279285, 2002).

니코틴과 리포폴리싸카라이드 혼합물은 조골세포(osteoblasts)안에서 매트릭스 메탈로프로티네이즈(matrix metalloproteinases)-1, 2, 3 과 티슈 타입 플라스미노겐 활성제(tissue-type plasminogen activators)의 발현을 증가시킨다고 알려져 있다(Katono T et al, Archives of Oral Biology 54, pp.146-155, 2009). 최근 연구를 통해 니코틴과 리포폴리싸카라이드 혼합물이 휴먼 치주 인대 세포 (human periodontal ligament cells)에서 염증 반응 관련인자들인 나이트릭 옥사이드(nitric oxide, NO), 프로스타글란딘-E₂(PGE₂), iNOS(inducible nitric oxide synthase) 와 싸이클로옥시게나제-2(Cyclooxygenase-2, COX-2)등을 증가시킨다고 밝혀져 있다(Pi SH et al, Journal of Periodontal Research Electronic publicationin ahead, 2009).

치주 인대 (periodontal ligament, PDL)는 치아를 둘러싸고 있으면서 치아에 가해지는 힘을 완충하는 작용을 가지고 있고 또한 치조골이나 백악질의 재생 및 재형성에도 관여하며 치근의 흡수에도 관여 한다(Lekic P and McCulloch CA, The Anatomical Record 245, pp.327341, 1996). 또한 치주 인대 세포는 치주 조직들을 보조하는 세포이면서 동시에 염증성 매개물질들을 생성하는 세포로 알려져 있다(Hou LT and Yaeger JA, Journal of Periodontology 64, pp.12091218, 1993). 따라서 치주 인대 (PDL) 세포는 치주 질환의 기전 연구에 사용 되어 왔으며, 특히 병리학적 감퇴와 조직 염증의 연관된 경로를 이해하는데 사용되고 있는 세포이다(Hou LT and Yaeger JA, Journal of Periodontology 64, pp.12091218, 1993).

HO(heme oxygenase)-1의 주요 기능은 햄(Heme)의 산화를 유도하여 담록소(biliverdin), 유리형 철분(free iron)과 일산화탄소(carbon monoxide)로 분열시킨다. 담록소는 빌리베르딘 리덕타제(biliverdin reductase)에 의해서 빌리루빈(bilirubin)으로 변환되는데, 이는 항산화 효과가 있고 ROS 소거제(scavenger) 역할을 한다. 또한 일산화탄소는 항염 효과가 있으며 유리형 철분은 페레틴 합성(Ferritin synthesis)에 관여하며, 세포보호효과를 나타낸다. HO-1 경로는 사람의 치주 인대세포에서 손상된 세포를 회복시키는 기전과 세포가 스트레스 상황에 적응하는 것과 관련된 기전 모두에 중요한 영향을 준다(Min KS et al, Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontics 102, pp.803808, 2006 ; Min KS et al, Journal of Endodontics 32, pp.3943, 2006 ; Pi SH et al, Journal of Periodontal Research 42, pp.331339, 2007). 또한 선행 연구에서 니코틴과 리포폴리싸카라이드 혼합물로 자극시킨 PDL 세포에서 HO-1 발현을 억제 하였을 때 iNOS, COX-2 발현과 NO, PGE₂ 생성이 억제 된다는 사실을 증명하였다(Pi SH et al, Journal of Periodontal Research Electronic publicationin ahead, 2009).

본 연구에 사용된 아피게닌(apigenin)은 플라보노이드(flavonoid) 계열의 물질로 팥꽃나무에서 분리가능한 화합물이다.

이에 본 발명자들은 아피게닌이 사람의 치주 인대 (PDL) 세포에서 니코틴과 리포폴리싸카라이드 혼합물을 이용한 촉진된 염증반응을 억제하는 활성 및 HO-1 기전 간의 상호 관계를 알아보고자, 아피게닌의 효과를 실험한 결과, 치주 인대 세포에서 아피게닌의 탁월한 뛰어난 항염 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 수행하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 (1)로 표기되는 팥꽃나무에서 분리한 아피게닌을 유효성분으로 함유하는 치주염증 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 (1)로 표기되는 팥꽃나무에서 분리한 아피게닌을 유효성분으로 함유하는 치주염증 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 팥꽃나무는 국내에서 채집, 구입 또는 수입이 가능한 나무를 포함한다.

본원에서 정의되는 “치주염증 질환”은 치주염, 치은염 등의 염증 질환을 포함한다.

본원에서 정의되는 추출물은 정제수를 포함한 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물에 가용한 추출물을 포함한다.

이하, 본 발명의 화합물은 당업계에 통상적인 추출방법으로 수득가능한데, 이하에 상기 화합물을 수득하는 방법을 상세히 설명한다.

예를 들어, 건조한 팥꽃나무 시료 중량의 약 1 내지 100배(v/w), 바람직하게는 약 5 내지 20배(v/w)의 물, C₁ 내지 C₄의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물, 메탄올 또는 이들의 혼합용매, 보다 바람직하게는 물 및 메탄올 혼합용매를 가한 30 내지 110℃, 바람직하게는 50 내지 100℃에서 1시간 내지 5시간, 바람직하게는 1시간 내지 3시간동안 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각추출, 가열추출 등의 추출방법, 바람직하게는 열수추출법을 수행하여 수출물을 수득하는 제 1단계; 상기 추출물을 물 또는 물 및 메탄올 혼합용매에 녹여 현탁시킨 후, 상기 용액을 핵산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올, 물 순으로 용액-용액 분배법 (partition)을 이용하여 분획을 수행하여 에틸아세테이트 분획물을 얻는 제 2단계; 상기 단계에서 얻어진 에틸아세테이트 분획물을 메탄올 용매를 사용한 세파덱스(sepadex LH-20) 컬럼을 이용하여 6개 분획으로 나누고 그 중 4번째 분획을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silicagel C.C., 클로로포름:메탄올=16:1)로 9개의 분획물을 얻는 제 3단계; 이 분획물 중 4번째 분획물을 메탄올 재결정 과정을 거쳐서 결정을 수득하는 제 4단계의 제조공정을 통하여 본 발명의 아피게닌 화합물을 수득할 수 있다.

본 발명은 상기의 제조방법으로 얻어진 팥꽃나무에서 분리한 아피게닌을 유효성분으로 함유하는 치주염증 질환의 예방 및 치료용 약학조성물 및 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 팥꽃나무에서 분리한 아피게닌을 유효성분으로 함유하는 항치주염의 예방 및 치료용 조성물은 치주 인대 (PDL) 세포에서 니코틴과 리포폴리싸카라이드 혼합물로 유발한 염증 촉진 반응에 뛰어난 항염 효과를 나타내므로, 치주 질환의 예방 및 치료를 위한 약학 조성물 또는 건강기능식품으로 유용하게 이용할 수 있다.

본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.1 내지 50% 중량으로 포함한다.

그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 화합물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 팥꽃나무에서 분리한 아피게닌에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물은 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 팥꽃나무에서 분리한 아피게닌을 유효성분으로 함유하는 치주염증 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 치주염증 질환의 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 화합물 자체는 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

본 발명의 상기 화합물은 치주염증 질환의 예방 및 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 화합물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

도 1은 팥꽃나무에서 아피게닌 분리 방법을 나타낸 도이고,
도 2는 아피게닌의 구조 (A)와 세포독성 (B) 을 알아보기 위한 세포생존율을 나타낸 도이며,
도 3는 iNOS와 COX-2, NO와 PGE₂발현 억제 효과(Hemin은 HO-1 발현유도제를 나타냄)를 나타낸 도이며,
도 4는 염증 유발 싸이토카인 (TNF-α,IL-1β,IL-6,IL-12) 생성 억제 효과(Hemin은 HO-1 발현유도제를 나타냄)를 나타낸 도이고,
도 5은 아피게닌에 의한 미토겐 활성 단백질 키나아제 (MAPKs, mitogen activated protein kinase) 활성 경로를 억제함을 나타낸 도이고,
도 6은 HO-1 발현 억제와 HO 활성 억제 효과(CHX는 cycloheximide를 나타냄)를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 팥꽃나무에서 아피게닌의 분리

팥꽃나무 (2008년 12월 익산시 신용동 대학한약국에서 구입) 2kg을 세척, 건조 및 세절하여 기계식 가열기 (TOPS, MS-E107)에 넣고, 여기에 메탄올 5L을 가한 다음, 60℃에서 2시간 동안 가열 추출하여 추출물을 여과, 농축 및 동결건조하여 팥꽃나무 메탄올 추출물 49.3kg을 얻었다.

상기 추출물을 60% 메탄올 5L에 녹여 현탁시킨 후, 상기 용액을 핵산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올, 물 순으로 용액-용액 분배법(partition)을 이용하여, 에틸아세테이트 분획물 5.0g을 얻었다.

상기에서 얻어진 에틸아세테이트 분획물을 메탄올 용매를 사용한 세파덱스(sepadex LH-20) 컬럼을 이용하여 6개 분획으로 나누고 그 중 4번째 분획을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silicagel C.C., 클로로포름:메탄올=16:1)로 9개의 분획물을 얻었다. 이 분획물 중 4번째 분획물을 메탄올 재결정 과정을 거쳐서 하기 물성치(Bang MH et al, Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry 48, pp.418-420, 2005)를 갖는 아피게닌 114mg(이하, “ap1”이라 함)을 수득하여, 하기 실험예의 시료로 사용하였다.(도 1참조)

m.p: 343-344 ℃

IR (KBr, cm.1) : 3600, 1655, 1600, 1436, 900, 820

EI/MS m/z(70 eV): 270 [M]+, 269, 242, 153, 121

실험예 1. 사람의 치주 인대(PDL) 세포 배양 및 세포독성 측정

상기 실시예에서 얻은 아피게닌의 세포주에 대한 세포 독성 측정을 위한 세포 생존율을 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 하였다(Mosmann T, Journal of immunological methods 65, pp.55-63, 1983). PDL 세포는 선행 연구(Pi SH et al, Journal of Periodontal Research 42, pp.103114, 2007)에서 사용된 사람의 치주 인대 세포 (원광대학교 치과대학병원 환자로부터 분리(Pi SH et al, Journal of Periodontal Research 42, pp.103114, 2007)) 를 사용 하였다.

사람의 치주 인대(PDL) 세포(2 × 10⁵ cells/well)를 10% heat-inactivated FBS, penicillin G (100 IU/ml)(Gibco, 15240062)와 streptomycin (100 μg/ml)(Gibco, 15240062)을 함유한 DMEM 배지에 분주하고 5% CO₂ 배양기(Sanyo, MCO175) 내에서 37 °C에서 24시간 배양한 다음, 아피게닌을 농도 별로 처리하고 24시간 동안 5 % CO₂ 배양기 내에서 배양하였으며, 세포생존율은 MTT 법을 활용하여 측정하였다. 또한, 모든 실험치는 대조군에 대한 세포 생존율을 평균치로 표시하였으며, 각각 3회 반복 실험치를 이용하여 계산하였다.

세포독성을 측정하기 위하여 PDL 세포에 10, 20, 30, 40, 50 μM의 아피게닌을 24시간 처리하였고 세포생존율을 측정한 결과, 아피게닌의 양의 증가와 상관없이 세포 생존율은 높게 유지되었다(도 2).

실험예 2. NO 생성 측정 방법 및 측정 결과

상기 실시예에서 얻은 아피게닌의 전염증인자 들인 iNOS, COX-2 발현, NO, 및 PGE₂ 생성에 대한 활성을 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험하였다(Pi SH et al, Journal of Periodontal Research Electronic publicationin ahead, 2009).

아피게닌을 10, 20, 40μM 농도로 4시간 전처리를 한 후 니코틴과 리포폴리싸카라이드 혼합물을 함께 24시간 처리 하여서 실험을 하였다. 실험예 1에서 배양된 PDL 세포 배양한 배지의 상등액을 대상으로 측정한다. 그리스(Griess) 시약 A (5% phosphoric acid (Sigma, P6560) + 1% sulfanilamide (sigma, S9251))와 시약B (0.1% N-naphthylethylenediamine (Sigma, N5889))를 1:1로 섞어서 사용한다. 혼합된 그리스 시약과 세포 배양 배지 상등액을 1:1로 섞어서 570nm에서 NO 의 흡광도를 측정한다.

상기 실험을 실시한 결과, 아피게닌의 전처리 농도가 증가 할수록 니코틴과 리포폴리싸카라이드 혼합물로 유발되어 증가하던 iNOS, COX-2 발현과 NO, PGE₂ 생성이 억제 되는 것을 확인하였다. HO-1 발현 유도제인 Hemin과 아피게닌 40μM을 함께 전처리한 경우에는 억제 되었던 iNOS, COX-2 발현과 NO, PGE₂ 생성이 증가되는 것을 확인하였다(도 3).

실험예 3. PGE ₂ , 싸이토카인(TNF-α,IL-1β,IL-6,IL-12) 생성 측정 방법 및 측정 결과

상기 실시예에서 얻은 아피게닌의 염증유발 사이토카인들인 PGE₂, 싸이토카인(TNF-α,IL-1β,IL-6,IL-12)에 대한 효과를 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험하였다(Jeong GS et al, International Immunopharmacology 9, pp.241246, 2009).

아피게닌을 40μM 농도로 4시간 전처리를 한 후 니코틴과 리포폴리싸카라이드 혼합물을 함께 24시간 처리 하여서 실험을 하였다. 실험예 1에서 배양된 배양된 PDL 세포 배양한 배지의 상등액을 가지고 PGE_2,싸이토카인(TNF-α,IL-1β,IL-6,IL-12)의 생성을 측정하기 위해 필요한 각각의 ELISA 키트(KIT)(R&D systems, DTA00C, DLB50, D6050, D1200)를 가지고 니코틴과 리포폴리싸카라이드 혼합물과 아피게닌을 처리하지 않은 세포와 처리한 세포간의 비교를 흡광도(540nm)로 측정한다.

아피게닌을 40μM 농도로 4시간 전처리를 한 후 니코틴과 리포폴리싸카라이드 혼합물을 함께 24시간 처리 하여서 실험을 진행한 결과, 아피게닌을 전처리한 경우에 니코틴과 리포폴리싸카라이드 혼합물로 유발되어 증가하던 TNF-α,IL-1β,IL-6,IL-12 생성이 억제 되는 것을 확인하였다. HO-1 발현 유도제인 Hemin과 아피게닌 40μM을 함께 전 처리 한 경우에는 억제 되었던 TNF-α,IL-1β,IL-6, 및 IL-12 생성이 증가되는 것을 확인하였다(도 4).

실험예 4. Western Blot Analysis

상기 실시예에서 얻은 아피게닌의 Heme oxygenase-1 발현 측정, iNOS 발현 측정, COX-2 발현 측정, 미토겐 활성 단백질 키나아제 (MAPKs, mitogen activated protein kinase)의 종류인 p-PI3K, p-ERK, p-JNK, p-PKC 발현에 대한 효과를 확인하기 위하여 문헌에 개시된 western blot analysis 법을 이용하여 하기와 같이 실험하였다(Li B et al, European Journal of Pharmacology 614, pp.58-65, 2009).

니코틴과 리포폴리싸카라이드 혼합물만을 30, 60, 90분 처리한 경우와 아피게닌을 40μM 농도로 4시간 전처리를 한 후에 니코틴과 리포폴리싸카라이드 혼합물을 함께 30, 60, 90분 처리한 경우를 비교한 결과, 니코틴과 리포폴리싸카라이드 혼합물만을 처리 하였을 때는 p-ERK를 제외한 p-PI3K, p-JNK, p-PKC의 발현증가를 확인하였고, 아피게닌과 함께 처리 하였을 때는 p-PI3K, p-JNK, p-PKC의 발현이 감소한다는 것을 확인하였다(도 5).

실험예 5. Heme oxygenase activity

상기 실시예에서 얻은 아피게닌의 헴 옥시게나제 활성(Heme oxygenase activity)를 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험하였다(Pi SH et al, Journal of Periodontal Research Electronic publicationin ahead, 2009 ; Jeong GS et al, International Immunopharmacology 9, pp.241246, 2009 ; Li B et al, European Journal of Pharmacology 614, pp.58-65, 2009).

HO 효소 활성은 HO의 발현으로 인해 증가된 빌리루빈의 양을 측정함으로써 효소 활성을 측정한다. 세포로부터 얻어진 microsome에 nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (Sigma, CS1100)와 랫트의 간의 cytosol에서 얻어진 biliverdin reductase (Sigma, CS1100)를 포함하는 반응 혼합물를 첨가하고 기질로서 hemin (porphyrin products, H651-9)을 처리한 뒤 37°C에서 1시간 동안 암실에서 반응 한 뒤에 클로로포름으로 반응을 종결하고 464와 530nm에서 빌리루빈의 흡광도를 기기(Bio-Rad, model 680) 측정한다.

니코틴과 리포폴리싸카라이드 혼합물만을 처리 하였을 때, 증가하던 HO-1 발현과 HO 활성이 아피게닌을 10, 20, 40μM 농도에 따라 처리 하였을 때에 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다. 또한 처리시간에 따른 HO-1 발현과 HO 활성을 알아보고자 6, 12, 18 시간에서의 실험 결과, 6, 12, 18 시간에 따라 니코틴과 리포폴리싸카라이드 혼합물만을 처리 하였을 때 증가하던 HO-1 발현과 HO 활성이 아피게닌을 함께 처리 하였을 경우에 감소됨을 확인할 수 있었다. 싸이클로헥시미드 (cycloheximide (Fluka,18079))를 이용한 실험에서는 아피게닌과 함께 처리 하였을 때 별다른 영향을 주지 않는 것을 확인하였다(도 6).

하기에 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

ap1 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진 하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

ap1 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

ap1 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

ap1 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO₄,12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

ap1 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬 향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진 하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

ap1 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

ap1 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims

팥꽃나무에서 분리한 아피게닌을 유효성분으로 함유하는 치주염증 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 치주염증 질환은 치주염 또는 치은염인 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.1 내지 50% 중량으로 포함하는 약학 조성물.
아피게닌을 유효성분으로 함유하는 치주염증 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품.
제 4항에 있어서, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 건강기능식품.