KR101745338B1

KR101745338B1 - 톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101745338B1
Application number: KR1020140178341A
Authority: KR
Inventors: 김형락; 정은지; 권위경
Original assignee: 대한민국(관리부서:국립수산과학원)
Priority date: 2014-12-11
Filing date: 2014-12-11
Publication date: 2017-07-04
Also published as: KR20160071074A

Abstract

본 발명은 톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 톱니모자반 추출물 및 상기 추출물로부터 분리된 화합물은 세포에 독성을 유발시키지 않아 안정성이 있으며, 염증 관련 인자들의 유전자 및 단백질 발현을 억제할 수 있고, 항염 활성 인자를 활성화 시킬 수 있어 염증을 예방, 개선 및 치료할 수 있는 의약품 및 기능성식품의 소재로 활용할 수 있는 효과가 있다.

Description

톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing and treating inflammatory diseases comprising Sagassum serratifolium extract}

본 발명은 톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

염증반응은 박테리아, 곰팡이, 바이러스 또는 다양한 종류의 알레르기 유발물질 등과 같은 외부감염원을 포함한 외부에서 들어온 해로운 물질이나 유기체 등에 노출되거나 여러 요인에 의하여 세포나 조직이 손상을 입거나 파괴되었을 때 그 손상을 최소화하고 손상된 부위를 원상으로 회복시키기 위하여 국소적으로 일어나는 면역반응을 의미한다.

상기 염증을 유발하는 여러 요인으로 외상, 화상, 동상, 방사능 등에 의한 물리적 요인, 산(acid)과 같은 화학물질에 의한 화학적 요인 및 항체반응에 의한 면역학적 요인들이 있으며, 그 외에 혈관이나 호르몬 불균형에 의해 발생되기도 한다.

염증반응은 생체를 보호하고 조직 손상으로 생성된 산물들을 제거하는데 유용한 방어 메카니즘으로, 국소혈관과 체액에 존재하는 각종 염증 매기인자 및 면역세포가 관련되어 효소 활성화, 염증매개물질 분비, 체액침윤, 세포 이동, 조직 파괴, 홍반, 부종, 발열 또는 통증 등의 나타난다. 또한, 상기와 같은 증상에 의해 기능장애가 유발되기도 한다.

염증은 정상적인 경우에는 생체 내에서 염증반응을 통하여 외부감염원을 제거하거나 발병 요인을 중화 또는 제거하고, 상한 조직을 재생시켜서 정상적인 구조와 기능을 회복시키는 작용을 한다. 하지만, 항원이 계속 제거되지 않거나 특정한 내부 물질이 원인이 되어 염증의 정도가 일정 수준 이상이 되거나 만성화되면, 과민성질환이나 만성염증과 같은 질병 상태로 진행되는 경우 문제가 된다. 임상질환 가운데 거의 모든 질환에서 염증반응을 관찰할 수 있을 뿐만 아니라, 암발생 과정(carcinogenesis)에서도 염증 반응과 관련된 효소들이 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한, 수혈, 약물투여 또는 장기이식 등의 치료과정에서도 장애요인이 된다.

생체에 있어서 염증반응은 다양한 생화학적인 현상이 관여하고 있으며, 특히, 면역세포에 의해 생산되는 염증반응과 관련된 다양한 효소에 의해 반응이 개시되거나 조절된다.

구체적으로, 상기 면역세포들은 히스타민(histamine), 일산화질소(nitric oxide, NO) 또는 프로스타글라딘 E2(prostaglandin E2, PGE2) 등의 도움으로 혈관을 통해 손상된 부위로 이동하여 염증반응을 개시한다. 상기 손상된 부위로 이동한 면역세포는 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1β(interleukin-1β) 또는 IL-

6(interleukin-6)와 같은 사이토카인(cytokine)이나 MIP-1, IL-8 또는 MCP-1등과 같은 케모카인(chemokine)을 분비하여 직접적인 외부침입물질을 파괴하거나 다른 면역세포들을 모아 염증반응을 개시한다.

상기 염증반응을 일으키는 interferon-γ, lipoteichoic acid, lipopolysaccharide(LPS) 등의 염증유발 물질이나 다양한 염증 유도 사이토카인에 노출될 경우, iNOS(inducible Nitric Oxide synthase)와 COX-2(cyclooxygenase-2)가 발현되어, NO와 PGE2가 과량 생성된다. 이들 여러 염증 개시인자들(iNOS, COX-2, TNF-α, IL-6 등)은 활성화된 NF-κB에 의해 전사가 촉진되며, 이로 인해 NO가 필요이상으로 생성되면 쇼크에 의한 혈관확장, 염증반응에 의해 유발되는 조직손상, mutagenesis, 신경조직의 손상 등을 일으킨다.

특히, 산화질소(Nitric oxide; NO)는 NO 합성효소 (NOS)에 의하여 L-arginine과 분자상의 산소로써 만들어진다. 포유동물에는 세가지 형태의 NOS가 존재한다; 즉, neuronal NOS (nNOS), endothelial NOS (eNOS) 및 inducible NOS (iNOS). nNOS와 eNOS는 센경세포와 내피세포에서 구성적으로 발현된다. 그러나, iNOS는 유도성으로 LPS나 전구성 염증 cytokine의 노출에 의하여 거식세포나 단구세포에서 만들어진다 (Vane et al., 1994). iNOS에 생성된 NO는 염증이나 면역반응을 일으켜 세포로 침입한 병원체의 증식억제제나 세포독성물질로 작용한다. 그러나 iNOS의 과발현에 의하여 생성된 과잉의 NO는 병리적인 상태를 야기시키는 것으로 알려져 있다 (Kim et al., 2005; Pan et al., 2011). 세포내에서 과잉의 NO에 의한 유해한 효과는 자체로써 염증매개인자로 작용할 뿐만 아니라 superoxide와 반응하여 peroxynitrite를 생성한다. peroxynitrite는 단백질, 지방, DNA와 같은 세포내 분자의 산화적 손상을 야기시킬뿐만 아니라 정상적인 유전자 조절을 변형시키기도 한다. 따라서 다량의 NO는 여러 가지 염증성 질환과 관련된 병리적인 상태와 밀접한 관련이 있다 (MacMicking et al., 1997; Maeda and Akaike, 1998).

또한, Nuclear factor kappa B (NF-κB)는 세포의 성장은 물론 면역과 급성염증반응에 주요한 역할을 한다(Li and Verma, 2002; Makarov, 2001). NF-κB 활성화는 iNOS와 여러 가지 전구염증성 유전자들의 발현을 촉진한다(Kim et al., 2005; Makarov, 2001). NF-κB의 활성화 경로는 LPS에 의해 inhibitor of kB (IκB)-α kinase의 인산화 다음으로 IκB-α가 인산화되어 ubiquitine에 의해 인산화된 IκB-α가 분해됨으로써 유리상태의 NF-kB가 핵으로 이동하게 되어 염증관련유전자들의 발현을 조절한다 (Chen et al., 1995). 또 다른 NF-kB의 활성화는 mitogen-activated protein kinases (MAPKs) (Guha and Mackman, 2001)나 phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/protein kinase B (Akt) 경로 (Sheu et al., 2005)를 통하여 일어난다. MAPKs에는 extracellular signal-regulated kinase (ERK), c-Jun NH₂-terminal kinase(JNK) 및 p38 MAPK이 있으며, 이들은 NF-κB 활성화를 통한 염증 유전자들의 전사조절과 관련이 있다 (Bhat et al., 1998; Kao et al., 2005; Shin et al., 2010). PI3K 또한 NF-kB 활성화를 통한 염증성 사이토카인의 생성에 관여하고 있다 (Cremer et al., 2011; Sheu et al., 2005). PI3K 활성화는 phosphatidylinositide를 인산화시켜 Akt 단백질을 활성화 시킨다. 활성화된 PI3K/Akt은 거식세포의 활성화에 주요한 역할을 한다 (MacMicking et al., 1997; Sheu et al., 2005). 따라서, 항염증제를 개발하기 위하여 NK-kB나 NF-kB를 활성화시키는 MAPKs과 Akt의 활성화를 억제시키는 물질을 찾기 위한 많은 연구가 진행되고 있다.

한편 이러한 염증 질환을 치료하기 위한 치료제 및 치료 방법으로는 대표적으로 iNOS에 의해 발생되는 산화질소의 생성을 차단하는 방법 및 치료제들이 개발되고 있는데, 특히 이러한 종래 기술로는 대한민국등록특허 제1070324 호에 “마크로락틴 에이 및 그 유도체를 유효성분으로 함유하는 항염제 조성물”에 대한 내용이 개시되어 있으며, 대한민국공개특허 제2009-0015766 호에는 “8 - 토실아미노퀴놀린을 함유하는 염증성 질병, 면역질환 또는 종양의 예방 또는 치료용 조성물”에 대한 내용이 개시되어 있고, 대한민국등록특허 제0846437호에는 “테오페더린 유도체를 함유하는 약제학적 조성물, 건강식품 조성물 및 유발형 산화질소합성효소 활성 억제제 조성물”에 대한 내용이 개시되어 있다.

그러나 종래 개발된 염증질환 치료제들은 대부분이 합성 화합물로서 체내에서 예상치 못한 부작용이 일어나는 등 다양한 문제점이 일어나고 있어, 체내에 대해 안정성이 인정된 천연물로부터 새로운 염증 질환 치료제의 개발이 필요한 실정이다.

대한민국공개특허 제2010-0032134호

따라서 본 발명의 목적은 톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증질환의 예방 또는 개선용 기능성 건강식품을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 사가하이드로퀴노익산(Sargahydroquinoic acid)을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 사가하이드로퀴노익산(Sargahydroquinoic acid)을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 또는 개선용 기능성 건강식품을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 톱니모자반 추출물은 물 또는 유기용매를 이용하여 수득한 추출물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유기용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 아세톤, 에테르, 벤젠, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 헥산 및 시클로헥산으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출물에는 사카크로멘올, 사가퀴노익산 또는 사가하이드로퀴노익산 화합물을 함유하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 염증질환은 염증성 장 질환, 복막염, 골수염, 봉소염, 췌장염, 외상 유발 쇼크, 기관지 천식, 알러지성 비염, 낭포성 섬유증, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 급성 세기관지염, 만성 세기관지염, 골관절염, 통풍, 척추관절병증, 강직성 척추염, 라이터 증후군, 건선성 관절병증, 장질환 척추염, 연소자성 관절병증, 연소자성 강직성 척추염, 반응성 관절병증, 감염성 관절염, 후-감염성 관절염, 임균성 관절염, 결핵성 관절염, 바이러스성 관절염, 진균성 관절염, 매독성 관절염, 라임 병, '혈관염 증후군'과 관련된 관절염, 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 루게닉 육아종증, 류마티스성 다발성근육통, 관절 세포 동맥염, 칼슘 결정 침착 관절병증, 가성 통풍, 비-관절 류마티즘, 점액낭염, 건초염, 상과염(테니스 엘보), 신경병증성 관절 질환(neuropathic joint disease), 출혈성 관절증(hemarthrosic), 헤노흐-쉔라인 자반병, 비후성 골관절병증, 다중심성 세망조직구종, 척추측만증(scoliosis), 혈색소증, 혈색소병증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, 가족성 지중해열, 베하트병, 전신성 홍반성 루푸스, 재귀열, 다발성 경화증, 패혈증, 패혈성 쇼크, 급성 호흡곤란 증후군, 다발성 장기부전, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 급성 폐손상(acute lung injury), 기관지 폐 형성장애(broncho- pulmonary dysplasia) 및 염증성 피부질환으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증질환의 예방 또는 개선용 기능성 건강식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 사가하이드로퀴노익산(Sargahydroquinoic acid)을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 사가하이드로퀴노익산(Sargahydroquinoic acid)은 톱니모자반으로부터 분리 및 정제된 것일 수 있다.

나아가 본 발명은 사가하이드로퀴노익산(Sargahydroquinoic acid)을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 또는 개선용 기능성 건강식품을 제공한다.

본 발명은 톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 치매의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 톱니모자반 추출물 및 상기 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물로서 이들 조성물은 세포에 독성을 유발시키지 않아 안정성이 있으며, 염증 관련 인자들의 유전자 및 단백질 발현을 억제할 수 있고, 치매의 원인으로 알려진 베타 아밀로이드의 생성을 억제하는 효과가 우수하여, 치매를 예방, 개선 및 치료할 수 있는 의약품 및 기능성식품의 소재로 활용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 톱니모자반의 주정추출물(EtOH), n-헥산 가용분획물(Hxn), 에틸아세테이트 가용 분획물(EtOAC)을 농도별로 처리한 후, 세포에 미치는 세포 독성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 톱니모자반의 주정추출물(EtOH), n-헥산 가용분획물(Hxn), 에틸아세테이트 가용 분획물(EtOAC)을 농도별로 처리한 후, 산화질소의 생성 억제정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 톱니모자반의 주정추출물(EtOH), n-헥산 가용분획물(Hxn), 에틸아세테이트 가용 분획물(EtOAC)을 농도별로 처리한 후, 프로그라스탄딘 E₂ (PGE₂)의 생성 억제정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 톱니모자반의 주정추출물(EtOH), n-헥산 가용분획물(Hxn), 에틸아세테이트 가용 분획물(EtOAC)을 농도별로 처리한 후, 종양괴사인자인 (TNF-α) 생성 억제정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 톱니모자반의 주정추출물(EtOH), n-헥산 가용분획물(Hxn), 에틸아세테이트 가용 분획물(EtOAC)을 농도별로 처리한 후, IL-1beta 생성 억제정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 톱니모자반의 주정추출물(EtOH), n-헥산 가용분획물(Hxn), 에틸아세테이트 가용 분획물(EtOAC)을 농도별로 처리한 후, 인터루킨 6 (IL-6) 생성 억제정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 톱니모자반의 주정추출물(EtOH), n-헥산 가용분획물(Hxn), 에틸아세테이트 가용 분획물(EtOAC)의 LPS에 의한 iNOS 및 COX-2 발현에 미치는 영향을 웨스턴 블럿을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 톱니모자반의 주정추출물(EtOH), n-헥산 가용분획물(Hxn), 에틸아세테이트 가용 분획물(EtOAC)의 LPS에 의한 iNOS 및 COX-2 발현에 미치는 영향을 mRNA 수준에서 확인하기 위해 PCR 수행 결과를 나타낸 것이다.
도 9 는 톱니모자반의 주정추출물(EtOH), n-헥산 가용분획물(Hxn), 에틸아세테이트 가용 분획물(EtOAC)이 처리된 세포의 세포질(cytosol) 및 핵(nucleus) 추출물을 대상으로 IkB-α의 인산화 및 NF-κB의 핵 내로의 이동 억제 정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 톱니모자반의 주정추출물(EtOH), n-헥산 가용분획물(Hxn), 에틸아세테이트 가용 분획물(EtOAC)의 LPS에 의한 MAPKs 및 Akt활성화에 미치는 영향을 웨스턴 블럿을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 톱니모자반의 주정추출물(EtOH), n-헥산 가용분획물(Hxn), 에틸아세테이트 가용 분획물(EtOAC)의 HO-1 단백질 발현에 미치는 영향을 웨스턴 블럿을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 톱니모자반의 주정추출물(EtOH), n-헥산 가용분획물(Hxn), 에틸아세테이트 가용 분획물(EtOAC)의 HO-1 유전자 발현에 미치는 영향을 mRNA 수준에서 확인하기 위해 PCR 수행 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 톱니모자반의 주정추출물(EtOH), n-헥산 가용분획물(Hxn), 에틸아세테이트 가용 분획물(EtOAC)이 처리된 세포의 세포질(cytosol) 및 핵(nucleus) 추출물을 대상으로 Nrf2 단백질의 발현에 미치는 영향을 웨스턴블럿을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 톱니모자만 추출물로부터 Sargahydroquinoic acid(SHQ), Sargaquinoic acid (SQA)및 Sargachromenol(SCM)화합물을 분리 및 동정한 컬럼크로마토그래피를 나타낸 것이다.
도 15은 사가하이드로퀴노익산을 대상으로 LPS에 의해 유도되는 산화질소 생성 억제 정도를 분석한 결과와 세포독성에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 톱니모자반 추출물이 항염 활성이 우수함을 규명한 톱니모자반 추출물의 신규 용도에 관한 것이다.

본 발명에서는 새로운 염증질환 치료제의 소재로서 톱니모자반 추출물에 주목하였는데, 톱니모자반은 조간대에서 점심대에 걸쳐 생육하는 식물로서 1∼4m인 다년생 대형 갈조류이다. 뿌리는 지름 4∼5cm로 원뿔상이고, 고무와도 같으며 나이테가 있고, 줄기는 원주상으로 짧고 다수의 중심가지로 나뉘며 편압되어 있다. 또한 줄기의 양 가장자리가 얇고, 세로로 중륵처럼 한쪽으로 융기하며, 가장자리에서 짧은 가지를 내고 있으며 줄기잎은 기부로 향하여 있고, 가장자리에 2중으로 된 톱니가 있으며, 기포는 둥근 모양에 가까우며 그 꼭대기에 관엽(冠葉) 또는 가시 모양의 돌기가 있다. 특히 우리나라의 남해안과 제주에 생육하는 것으로 알려져 있으며, 지질강하, 혈압강하, 방사성 동위원소 배출작용에 대한 기능을 가지고 있는 것으로 알려져 있을 뿐, 아직까지 염증과 관련된 작용에 대해서는 알려진 바가 없다.

본 발명자들은 톱니모자반 추출물이 항염 활성이 있다는 것을 본 발명의 일실시예를 통해 확인하였는데, 일실시예에 의하면, 염증 유발 인자인 LPS로 대식세포를 자극시켜 염증 반응을 유발시킨 후, 본 발명의 톱니모자반 추출물을 처리하여 염증 반응의 억제 정도를 분석한 결과, 본 발명의 톱니모자반 추출물이 산화질소의 생성을 억제하는 것으로 나타났고, 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 생성을 유의적으로 억제하는 것으로 나타났으며, 나아가 프로스타글란딘 E2의 생성도 억제하는 것으로 나타났다. 특히 프로스타글란딘 E2의 생성은 톱니모자반의 에틸아세테이트 분획물에서 우수하게 억제하는 효과가 있음을 알 수 있었다.

또한, 이러한 염증 반응 억제 정도는 톱니모자반 추출물의 처리 농도에 비례하는 것으로 나타났다. 따라서 본 발명자들은 본 발명의 톱니모자반 추출물이 항염 활성을 갖는 다는 사실을 알 수 있었으며, 다른 모자반 추출물에 비해 톱니모자반 추출물이 더 월등하게 항염 활성을 나타내고 있었다. 따라서 본 발명자들은 다른 모자반에 비해 톱니모자반 추출물이 항염제로 더 유용한 소재임을 알 수 있었다.

나아가 본 발명자들은 본 발명의 톱니모자반 추출물이 inducible NOS (iNOS) 및 COX2의 발현을 억제하는 효과가 있음을 단백질 수준과 mRNA 수준에서 확인하였는데, 특이하게도 inducible NOS (iNOS)는 유전자 및 단백질 수준에서 발현을 모두 억제할 수 있는 것으로 나타난 반면, COX2에 대해서는 유전자 및 단백질 발현에는 영향을 주지 못하였고, COX2의 단백질 활성을 억제할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

또한, 본 발명자들은 다른 일실시예를 통해 본 발명의 톱니모자반 추출물이 NF-κB의 활성을 억제하고 MAPKs와 Akt와 같은 세포내 신호 전달의 활성을 억제할 수 있음을 확인할 수 있었다.

앞서 종래 기술에서도 기술한 바와 같이, Nuclear factor kappa B (NF-κB)는 세포의 성장은 물론 면역과 급성염증반응에 주요한 역할을 하는데, NF-κB 활성화는 iNOS와 여러 가지 전구염증성 유전자들의 발현을 조절하며, NF-κB의 활성화 경로는 LPS에 의해 inhibitor of kB (IκB)-α kinase가 인산화되고 인산화된 IκB-α가 분해되어 유리상태의 NF-kB가 핵으로 이동하게 되어 염증관련유전자들의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 발명의 추출물은 이러한 NF-kB의 활성화를 억제할 수 있어 이로 인한 염증관련 유전자의 발현을 억제하여 궁극적으로 항염 활성을 유도할 수 있음을 알 수 있었다.

또한, mitogen-activated protein kinases (MAPKs)나 phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/protein kinase B (Akt) 경로를 통해서도 NF-kB의 활성이 유도되는데 따라서 이들 신호전달을 차단할 수 있게 되면 이로 인한 염증반응을 억제할 수 있는 효과를 얻게 된다. 이러한 점에서 본원발명에서 제공하는 톱니모자반 추출물은 NK-kB나 NF-kB를 활성화시키는 MAPKs과 Akt의 활성화를 억제시킬 수 있는 바, 염증을 유도하는 초기 단계를 차단하여 보다 원천적으로 염증질환을 예방 및 치료할 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 톱니모자반 추출물은 헴 옥시게나제-1(heme oxygenase-1; HO-1)의 활성을 증진시키는 효과가 있음을 확인하였는데 HO-1은 제독화 효소로 heme 기를 Fe³⁺, CO, biliverdin으로 분해함으로써 항산화, 항염증, 항비만, 항암 등 다양한 생리활성을 조절하는 것으로 알려져 있다.

뿐만 아니라, 본 발명에 따른 톱니모자반 추출물은 HO-1와 같은 항산화 효소의 발현을 조절하는 Nrf-2의 활성도 촉진시키는 역할을 한다는 것을 확인할 수 있었다.

따라서 톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 염증 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명에서 "염증 질환"이란 염증유발인자 등 유해한 자극으로 인해 인체 면역체계를 과도하게 항진시켜 대식세포와 같은 면역세포에서 분비되는 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1(interleukin-1), IL-6, 프로스타글란딘(prostagladin), 루코트리엔(luecotriene) 또는 산화질소(nitric oxide, NO)와 같은 염증유발물질(염증성 사이토카인)에 의해 유발되는 질환을 말한다.

본 발명에서 "치료"란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 치료란 용어는 "치료하는"이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에 있어서 염증질환의 "치료" 또는 "치료요법"은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:

(1) 염증질환의 발달을 저지시킴,

(2) 염증질환의 확산을 예방함,

(3) 염증질환을 경감시킴,

(4) 염증질환의 재발을 예방함 및

(5) 염증질환의 증상을 완화함(palliating)

본 발명에 따른 톱니모자반 추출물은 당업계에 공지된 추출 및 분리하는 방법을 사용하여 천연으로부터 추출 및 분리하여 수득한 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 정의된‘추출물’은 적절한 용매를 이용하여 톱니모자반으로부터 추출한 것이며, 예를 들어, 톱니모자반 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 모두 포함할 수 있다.

상기 톱니모자반으로부터 추출물을 추출하기 위한 적절한 용매로는 이에 제한되지 않으나, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 예를 들어, 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다. 바람직하게는 에탄올(주정), n-헥산 및 에틸아세테이트 용매를 사용할 수 있다.

추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다. 본 발명의 톱니모자반 추출물의 제조방법에는 제한이 없으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있다.

예를 들면, 본 발명의 조성물에 포함되는 톱니모자반 추출물은 상기한 열수 추출 또는 용매 추출법으로 추출된 1차 추출물을, 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조할 수 있다. 또한 상기 1차 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획을 얻을 수도 있다.

따라서 본 발명에 있어서 톱니모자반 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.

상기 톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 약제학적 조성물이나 식품 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 톱니모자반 추출물은 조성물에 10 내지 100μg/ml의 농도로 포함될 수 있으며, 또한 본 발명의 톱니모자반 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 ~ 95중량%로 포함될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물이 치료효과를 나타낼 수 있는 염증 질환으로는, 관절염, 류머티즘성 관절염, 류마티스성 다발성 근육통, 동맥경화증, 염증성 내장 질병, 궤양성 대장염, 골다공증, 크론(Crohn) 병, 뇌척수염, 수막염, 췌장염, 복막염, 골수염, 뇌염, 뇌막염, 비염, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 골관절염, 통풍, 척추관절염, 강직성 척추염, 건선성 관절염, 맥관염, 임파구 맥락수막염, 사구체신염, 포도막염, 회장염, 간 염증, 신장 염증, 천식, 통증, 패혈성 쇼크, 국소 빈혈, 궤양, 다중경화증, 경화증, 출혈성쇼크, 아나필락틱 쇼크, 화상, 감염, 박테리아성 감염, 비루스성 감염, 진균성 감염 및 기생성감염, 건선, 아토피성피부염, 레이슈마니아증, 주혈흡충증, 혈액투석증, 발작, 심폐 혈관이식, 국소 빈혈, 재환류 질환, 혈색소증, 혈색소병증, 당뇨병, 알츠하이머(Alzheimer) 병, 파킨슨(Parkinson) 병, 타가이식거부증 및 자가면역질환 등을 들 수 있되, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 또한 식품 조성물일 수 있는데, 특히 본 발명에 따른 톱니모자반 추출물은 세포에 독성을 유도하지 않음을 일실시예를 통해 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명의 식품 조성물은 유효성분인 톱니모자반 추출물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.

또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 톱니모자반 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

본 발명의 유효성분인 톱니모자반 추출물은 천연물질로서 화학약품과 같은 부작용은 거의 없으므로 염증 질환의 예방 또는 치료를 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 건강기능식품은 염증 질환 개선을 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.

본 발명에서 “건강기능식품”이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 “식품 첨가물 공전”에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.

예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 톱니모자반 추출물을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.

캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분인 톱니모자반 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 톱니모자반 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.

환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 톱니모자반 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.

과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 톱니모자반 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.

본 발명의 톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 건강기능식품은 하기 실시예에서도 확인한 바와 같이 산화질소(nitric oxide: NO) 생성 억제, 염증성 사이토카인 생성 억제, 프로스타글란딘 E2의 생성 억제 효과를 가지기 때문에 염증 질환의 개선 및 치료에 효과적이다.

상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.

또한 본 발명은 포유동물에게 톱니모자반 추출물을 투여하는 것을 포함하는 염증 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.

여기에서 사용된 용어 "치료상 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 치료방법에 있어서, 성인의 경우, 본 발명의 톱니모자반 추출물을 1일 1회 내지 수회 투여시, 0.01㎎/kg~250㎎/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 치료방법에서 본 발명의 톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

나아가 본 발명은 사가하이드로퀴노익산(Sargahydroquinoic acid)을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

상기 사가하이드로퀴노익산(Sargahydroquinoic acid) 화합물은 톱니모자반으로부터 분리 및 정제한 것일 수 있고 또는 합성한 화합물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면 톱니모자반 추출물로부터 분리된 화합물인 사카크로멘올, 사가퀴노익산 또는 사가하이드로퀴노익산 화합물에 대해 항염 활성을 분석한 결과 이들 화합물 모두 항염 활성을 나타내는 것으로 확인되었다.

따라서 본 발명은 톱니모자반 추출물 뿐만 아니라 사카크로멘올, 사가퀴노익산 또는 사가하이드로퀴노익산 화합물을 유효성분으로 하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 사카크로멘올, 사가퀴노익산 또는 사가하이드로퀴노익산 화합물은 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.

본 발명에 따른 사카크로멘올, 사가퀴노익산 또는 사가하이드로퀴노익산 화합물은 천연으로부터 분리되거나 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조할 수 있는데, 바람직하게는 톱니모자반 추출물로부터 분리 및 정제된 것일 수 있다. 상기 추출물로부터 이들 화합물의 분리 및 정제는 실리카겔(silica gel)이나 활성 알루미나(alumina)등의 각종 합성수지를 충진한 컬럼 크로마토그라피(column chromatography) 및 고속액체크로마토그라피(HPLC) 등을 단독으로 혹은 병행하여 사용할 수 있다. 그러나 유효성분의 추출 및 분리정제 방법은 반드시 상기한 방법에 한정되는 것은 아니다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1>

톱니모자반의 주정추출물, n - 헥산 가용분획물 , 에틸아세테이트 가용 분획물의 제조

본 발명에서 사용한 톱니모자반은 부산시 기장군에서 채집하여 사용하였고, 아래와 같은 방법을 통해 톱니모자반의 주정추출물, n-헥산 가용분획물, 에틸아세테이트 가용 분획물을 수득하였다. 먼저 주정추출물의 제조를 위해 톱니모자반을 음지 또는 양지에서 자연건조 후 마쇄하여 얻은 분말 2 kg과 주정(95% 에탄올)을 각각 8 L씩 넣고 70℃에서 3시간 동안 3회 반복하여 환류냉각기가 장착된 추출기로 추출한 후 여지 (와트만사, 미국) 또는 마이크로필터로 감압 여과하고, 여과된 추출물을 진공회전농축기로 40℃에서 용매를 제거한 다음 추출된 잔사로서 톱니모자반조추출물 (200 ± 25 g)을 수득하였으며, 이 중 일부를 취하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

톱니모자반조추출물을 H₂O:ethanol (9:1, v/v)의 혼합용매로 녹인 후, 분액깔때기에 부어, 동량의 n-hexane를 넣어 분액깔때기를 흔든 다음 평형화시켰다. 이후 위층의 n-hexane 가용부를 모아 무수 황산나트륨 (sodium sulfate, anhydrous)으로 처리한 다음 여과하여 농축하였다. 이와 같은 방법으로 5회 더 반복하여 180 g 의 n-hexane 분획물을 얻었다. 동일한 방법으로 H₂O층에 EtOAc를 가하여 상층의 EtOAc 가용부를 모아 EtOAc 분획물 (5 ± 2 g)을 얻었다.

< 실험예 1>

톱니모자반의 주정추출물, n - 헥산 가용분획물 , 에틸아세테이트 가용 분획물의 세포독성 효과

상기 실시예 1에서 얻은 톱니모자반의 주정추출물, n-헥산 가용분획물, 에틸아세테이트 가용 분획물로 대식세포인 RAW 264.7 세포에 농도별로 처리하고 세포독성을 측정하였다. 구체적으로 RAW 264.7 세포 (5 × 10⁴ cells/well)를 DMEM 배지에 톱니모자반 주정추출물 및 n-헥산 가용 분획물, 에틸아세테이트 가용 분획물을 각각 처리하여 1시간 배양한 후 LPS (1 ug/ml)을 처리하여 24시간 배양하였다. 96 well plate에 배지 100㎕와 MTS 용액 5㎕를 넣고 1시간 정도 반응시킨 후 microplate reader를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정치는 3회 반복 실험의 평균값으로 하였다.

그 결과, 도 1에 나타나듯이, RAW 264.7 세포에 대한 톱니모자반의 주정추출물, n-헥산 가용 분획물의 세포 독성은 5 μg/ml까지 나타나지 않았고, 에틸아세테이트 가용 분획물의 세포 독성은 15 μg/ml의 농도까지 나타나지 않았다. 따라서 본 발명에서 제조한 상기 추출물 및 분획물들은 대체적으로 세포에 독성을 유발시키지 않아 안정하다는 것을 알 수 있었다.

< 실험예 2>

톱니모자반의 주정추출물, n - 헥산 가용분획물 , 에틸아세테이트 가용 분획물의 NO 생성 억제효과

RAW 264.7 세포 (1.0 × 10⁵ cells/well)를 DMEM 배지를 이용하여 96 well plate에 접종하고, 톱니모자반 주정추출물, n-헥산 가용 분획물 및 에틸아세테이트 가용 분획물을 각각 농도별로 처리하고 1시간 뒤 LPS (1 μg/ml)를 함유한 새로운 배지를 처리하여 24시간 배양하였다. 생성된 NO의 양을 Griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 아질산의 형태로 측정하였다. 세포배양 상등액 100 ㎕와 Griess시약 (1% sulfanilamide, 0.1% naphtyl-ethylenediamine in 5% phosphoric acid) 100 ㎕를 혼합하여 96 well plates에서 10분 동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준농도 곡선은 sodium nitrite (NaNO₂)를 serial dilution (연속 희석)하여 얻었다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 톱니모자반 주정추출물, n-헥산 가용 분획물, 에틸아세테이트 가용 분획물은 RAW 264.7 세포에서 LPS로 유도된 NO의 생성을 농도 의존적으로 감소시킴을 확인할 수 있었다.

< 실험예 3>

톱니모자반의 주정추출물, n - 헥산 가용분획물 , 에틸아세테이트 가용 분획물의 PGE ₂ 생성 억제효과

RAW 264.7 세포 (10 × 10⁵ cells/well)를 DMEM 배지를 이용하여 6 well plate에 접종하고, 톱니모자반 주정추출물, n-헥산 가용 분획물 및 에틸아세테이트 가용 분획물을 농도별로 처리하고 1시간 뒤 LPS (1 μg/ml)를 함유한 새로운 배지를 처리하여 24시간 배양하였다. 생성된 PGE₂의 양을 ELISA kit를 이용하여 측정하였고, 그 결과는 도 3에 나타내었다.

분석 결과, 도 3에서 볼 수 있듯이, 톱니모자반 주정추출물 및 n-헥산 가용 분획물은 RAW 264.7 세포에서 LPS로 유도된 PGE₂의 생성에 영향을 미치지 않았으나, 에틸아세테이트 가용 분획물은 PGE₂의 생성을 농도의존적으로 감소시킴을 확인할 수 있었다.

< 실험예 4>

톱니모자반의 주정추출물, n - 헥산 가용분획물 , 에틸아세테이트 가용 분획물의 전구염증성 사이토카인의 생성 억제효과

앞서 실험예에서 확인한 바와 같이, 톱니모자반 주정추출물, n-헥산 가용 분획물 및 에틸아세테이트 가용 분획물은 염증매개인자인 NO의 생성을 농도 의존적으로 저해한 것으로 나타났다. 따라서 전구염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 생성도 억제하는 효과가 있는지 다음과 같은 실험을 통해 확인하였다. 세포에 톱니모자반 주정추출물 및 n-헥산 가용 분획물, 에틸아세테이트 가용 분획물을 1시간 처리한 후 1 μg/ml의 LPS가 함유된 배지를 처리하였다. 24시간 후 세포 배양액을 원심분리하여 상층액에 분비된 전구염증성 사이토카인인 세포배양액 내의 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 농도 측정은 BD Biosciences (San Jose, USA)사의 ELISA kit를 사용하였다.

그 결과, 도 4 내지 도 6에 나타낸 바와 같이, 톱니모자반 주정추출물, n-헥산 가용 분획물 및 에틸아세테이트 가용 분획물은 RAW 264.7 세포에서 LPS로 유도된 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 생성을 농도의존적으로 감소시킴을 확인할 수 있었다.

< 실험예 5>

톱니모자반의 주정추출물, n - 헥산 가용분획물 , 에틸아세테이트 가용 분획물의 iNOS 와 COX -2의 단백질 생성 억제효과

NO와 PGEs는 nitric oxide synthase (NOS)와 cyclooxygenase (COX)에 의해 각각 _L-arginine 및 인지질로부터 합성된다. 병리적인 조건 하에서 NO와 PGE₂의 과도한 증가는 염증 과정을 자극하고 다른 염증 매개체와 함께 상승효과를 나타낸다. 이러한 상태 하에서 과도한 NO와 PGE₂는 inducible NOS (iNOS)와 COX-2에 의해 합성된다. 또한, iNOS와 COX-2는 염증성 사이토카인과 박테리아성 endotoxin에 노출되었을 때 강하게 발현된다. 따라서 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 iNOS와 COX-2의 단백질 발현에 대한 톱니모자반 주정추출물 및 n-헥산 가용 분획물, 에틸아세테이트 가용 분획물의 효과를 Western blot을 통하여 관찰하였는데, 즉 앞서 실험에 사용한 각 세포군을 대상으로 세포 용해물을 수득한 후, iNOS와 COX-2에 대한 항체를 사용하여 웨스턴 블럿을 수행하였다.

분석 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 톱니모자반 주정추출물 및 n-헥산 가용 분획물, 에틸아세테이트 가용 분획물은 LPS에 의한 iNOS 단백질의 발현을 농도의존적으로 감소시켰으나, COX-2의 단백질 발현에는 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다. 또한, 톱니모자반 에틸아세테이트 가용 분획물은 PGE₂의 생성을 유의적으로 억제하나 COX-2의 단백질 발현은 감소시키지 못하고 있는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 톱니모자반 에틸아세테이트 가용 분획물이 COX-2의 단백질 발현 과정에 미치는 영향은 적지만 COX-2 단백질의 활성에 영향을 미친다는 것을 알 수 있었고, 즉, 톱니모자반 에틸아세테이트 가용 분획물은 COX-2 단백질의 발현이 아닌 활성을 억제함을 통해 항염 활성을 유도할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

< 실험예 6>

톱니모자반의 주정추출물, n - 헥산 가용분획물 , 에틸아세테이트 가용 분획물의 iNOS 와 COX -2 mRNA 발현 억제효과

앞선 실험예에서 톱니모자반 주정추출물 및 n-헥산 가용 분획물, 에틸아세테이트 가용 분획물이 LPS에 의한 iNOS의 단백질 발현을 억제하는 것으로 확인되어 본 발명자들은 이들의 mRNA 발현에도 톱니모자반 주정추출물 및 n-헥산 가용 분획물, 에틸아세테이트 가용 분획물이 상기 유전자의 발현을 억제하는지 확인하기 위해 RT-PCR (reverse-transcriptase PCR)을 수행하였다.

그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, iNOS 유전자의 mRNA 발현 수준은 톱니모자반 주정추출물, n-헥산 가용 분획물 및 에틸아세테이트 가용 분획물이 억제하는 것으로 나타난 반면, COX-2 는 mRNA 발현억제에 크게 영항을 미치지 못하는 것으로 나타났다.

따라서 본 발명자들은 실험예 5 및 6의 결과를 통해 톱니모자반 주정추출물 및 n-헥산 가용 분획물, 에틸아세테이트 가용 분획물이 iNOS에 대해서는 mRNA 발현 및 단백질 발현을 저해함을 통해 항염 활성을 유도하는 것으로 나타났고, 반면 COX-2에 대해서는 유전자 또는 단백질 발현이 아닌 COX-2 단백질의 활성 억제를 통해 항염 활성을 유도할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

< 실험예 7>

톱니모자반의 주정추출물, n - 헥산 가용분획물 , 에틸아세테이트 가용 분획물의 NF -κB 활성 억제효과

LPS에 의한 iNOS와 COX-2 및 전구염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 등은 전사인자인 NF-κB에 의하여 조절된다. NF-κB는 일반적인 상태에서는 inhibitory κB-α (IκB-α)와 함께 결합하여 세포질에 불활성화 상태로 존재한다. 하지만 LPS와 같은 외부자극에 의해 자극을 받으면 IκB-α가 인산화되어 ubiquitin에 의해 분해되며 유리형의 NF-κB (p65)는 핵으로 이동하여 cytokine, cytokine receptor, cell adhesion molecule, growth factor 등의 발현에 관여하는 유전자의 promoter나 enhancer의 κB site에 결합함으로써 전사를 유도한다.

따라서 본 발명자들은 본 발명의 톱니모자반 주정추출물, n-헥산 가용 분획물 및 에틸아세테이트 가용 분획물이 NF-κB가 핵으로 이동하는 것에 대한 영향을 주는지 확인하기 위해, LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 톱니모자반 주정추출물 및 n-헥산 가용 분획물, 에틸아세테이트 가용 분획물을 처리하고, 세포 용해물을 수득한 후, IκB-α의 인산화와 NF-κB의 핵 이동을 웨스턴블럿을 통해 확인하였다.

분석결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 세포질에서 LPS에 의한 IκB-a의 인산화와 NF-κB의 감소는 톱니모자반 주정추출물 및 n-헥산 가용 분획물, 에틸아세테이트 가용 분획물 처리에 의하여 농도의존적으로 억제되는 것으로 나타났고, 핵에서 LPS에 의해 증가하는 NF-κB는 톱니모자반 주정추출물 및 n-헥산 가용 분획물, 에틸아세테이트 가용 분획물 처리에 의해 다시 감소하는 것으로 나타났다.

또한, ERK와 JNK의 downstream targets은 AP-1을 포함하고 있는데, JNK의 활성화는 c-jun protein의 N-terminus(S63과 S73)을 인산화시키고 이는 AP-1의 활성을 증가시킨다. 이러한 결과는 도 9에 나타나 있듯이, c-jun의 인산화는 톱니모자반 주정추출물 및 n-헥산 가용 분획물, 에틸아세테이트 가용 분획물에 의해서 농도의존적으로 감소되는 것으로 나타났다.

따라서 본 실험을 통해 본 발명자들은 톱니모자반 주정추출물, n-헥산 가용 분획물, 에틸아세테이트 가용 분획물이 LSP에 의한 IκB-α의 인산화 및 분해를 억제하고 NF-κB의 유리화를 감소시킴으로써 NF-κB가 핵으로 이동하여 염증성사이토카인 등 염증인자의 전사인자로 작용하는 것을 차단하고, c-jun의 인산화를 억제함으로써 AP-1의 활성화를 억제시킬 수 있다는 것을 알 수 있었다.

< 실험예 7>

톱니모자반의 주정추출물, n - 헥산 가용분획물 , 에틸아세테이트 가용 분획물의 MAPKs과 Akt 활성화 억제효과

다양한 외부자극에 의한 NF-κB 전사인자의 활성화를 통해 iNOS나 COX-2 또는 전구염증성 사이토카인의 발현을 유도하는 과정을 조절하는 분자신호 전달기전은 주요 MAPK superfamily에 속하는 세 가지 효소들, 즉 extracellular-regulated protein kinase (ERK), c-Jun NH2-protein kinase (JNK), p38 MAPK와 PI3K/Akt들을 들 수 있다. 이에 세포내 단백질의 인산화에 관한 본 발명의 톱니모자반 주정추출물, n-헥산 가용 분획물 및 에틸아세테이트 가용 분획물의 효과를 확인하기 위해 웨스턴 블럿을 수행하였다.

그 결과, 도 10에 나타나 있듯이, LPS에 의해 유도된 대식세포의 염증 반응에서 톱니모자반 주정추출물은 Akt, JNK, p38 MAPK의 억제를 보였으며, n-헥산 가용 분획물은, Akt, ERK, p38 MAPK을 억제하는 것으로 나타났고, 에틸아세테이트 가용 분획물은 Akt, JNK, p38 MAPK을 억제하는 것으로 나타났다. 따라서 이러한 결과를 통해 톱니모자반 주정 추출물, n-헥산 가용 분획물 및 에틸아세테이트 가용 분획물은 세포내 다양한 신호 단백질 경로를 차단함으로써 염증 반응을 저해한다는 것을 알 수 있었다.

< 실험예 8>

톱니모자반의 주정추출물, n - 헥산 가용분획물 , 에틸아세테이트 가용 분획물의 heme oxygenase ( HO -1)의 단백질 발현 효과

HO-1은 제독화 효소로 heme 기를 Fe³ ⁺, CO, biliverdin으로 분해함으로써 항산화, 항염증, 항비만, 항암 등 다양한 생리활성을 조절하는 것으로 보고되고 있다. 따라서 본 실험에서는 톱니모자반 주정추출물 및 n-헥산 가용 분획물, 에틸아세테이트 가용 분획물이 HO-1의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 확인하고자 하였다. 이를 위해 RAW 264.7 대식세포에 톱니모자반 주정추출물, n-헥산 가용 분획물 및 에틸아세테이트 가용 분획물을 1시간 처리한 뒤, LPS를 16시간 처리한 다음, 세포 용해물을 수득하고 HO-1에 대한 항체를 이용하여 웨스턴블럿을 수행하였다.

그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 톱니모자반 주정추출물, n-헥산 가용 분획물 및 에틸아세테이트 가용 분획물은 처리 농도 의존적으로 HO-1의 발현을 유도하는 것으로 나타났다.

< 실험예 9>

톱니모자반의 주정추출물, n - 헥산 가용분획물 , 에틸아세테이트 가용 분획물의 HO -1의 mRNA 발현 효과

앞선 실험예를 통해 본 발명의 추출물 및 분획물이 LPS에 의한 HO-1 단백질의 발현을 증가시킨다는 것을 확인하였고, 나아가 HO-1의 mRNA 수준에서도 유전자 발현을 증가시키는지 확인하기 위해 상기 실험에서 사용한 시료를 대상으로 HO-1유전자에 대한 특이적 프라이머를 사용하여 RT-PCR (reverse-transcriptase PCR)을 수행하였다.

그 결과, 상기 실험예 8의 결과와 유사하게 톱니모자반 주정추출물 및 n-헥산 가용 분획물, 에틸아세테이트 가용 분획물 처리 시 HO-1의 mRNA 수준이 증가하는 것으로 나타났다(도 12 참조). 따라서 톱니모자반 주정추출물, n-헥산 가용 분획물 및 에틸아세테이트 가용 분획물은 HO-1의 발현을 전사단계에서 증진 조절한다는 것을 알 수 있었다.

< 실험예 10>

톱니모자반의 주정추출물, n - 헥산 가용분획물 , 에틸아세테이트 가용 분획물의 Nrf2 전사인자의 translocation 효과

Nrf-2는 HO-1 등의 항산화 효소의 발현을 조절하는 전사인자로 잘 알려져 있다. 이에 앞선 실험결과, 톱니모자반 주정추출물 및 n-헥산 가용 분획물, 에틸아세테이트 가용 분획물은 HO-1 발현을 전사단계에서 향상 조절하였기 때문에 HO-1의 전사를 조절하는 Nrf-2의 활성화에도 영향을 미치는지 다음과 같은 실험을 통해 확인하였다. 먼저 RAW 264.7 대식세포에 톱니모자반 주정추출물, n-헥산 가용 분획물 및 에틸아세테이트 가용 분획물을 1 시간 처리한 후 LPS를 30 분간 처리하였다. 그 후 핵과 세포질을 분리한 다음, Nrf-2에 대한 항체를 이용하여 웨스턴블럿을 수행하였다.

그 결과, 도 13에 나타나 있듯이, 본 발명의 톱니모자반 주정추출물, n-헥산 가용 분획물 및 에틸아세테이트 가용 분획물은 세포질의 Nrf-2 발현을 감소시키고 핵의 Nrf-2 발현은 증가시키는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 톱니모자반 주정추출물, n-헥산 가용 분획물 및 에틸아세테이트 가용 분획물이 Nrf-2의 핵으로의 이동을 증가시킨다는 것을 의미하며, 따라서 톱니모자반 주정추출물 및 n-헥산 가용 분획물, 에틸아세테이트 가용 분획물이 Nrf-2 전사인자의 활성화를 통하여 HO-1의 발현을 조절한다는 것을 알 수 있었다.

< 실험예 11>

톱니모자반 추출물로부터 항염증 활성을 갖는 화합물들의 분리

상기 본 발명의 방법으로 수득한 톱니모자반 주정추출물을 대상으로 다음과 같은 방법에 따라 사가하이드로퀴노익산, 사가크로멘올 및 사가퀴노익산의 화합물을 분리하였고 분리한 화합물들에 대한 컬럼크로마토그램은 도 14에 나타내었다.

<11-1> Sargahydroquinoic acid 의 분리

톱니모자반 주정추출물을 100 g을 물:에탄올 (9:1, v/v)의 혼합용매 1 리터에 녹인 후 분액깔때기에 넣고 동량의 n-hexane을 넣어 평형화시킨 후 위층의 n-hexane 가용부를 모아 무수황산나트륨으로 탈수한 다음 농축하여 n-hexane 분획물을 분리하였다. 분리된 n-hexane 분획물 12.2g을 120 mL methanol에 녹여 membrane filter로 여과 후 200 uL을 주입하여 Phenomenex C18(2) (15μm, 21.2 mm × 250 mm) 칼럼이 장착된 HPLC로 4개의 획분으로 분리하였다. 크로마토그래피의 이동상으로는 메탄올 (A)과 물 (B)의 혼합용매를 사용하였으며 유속은 7 mL로 설정하였다. 크로마토그래피 조건은 처음 A/B(90/10) ∼ A/B(94/6) 농도로 33분간, A/B(94/6) ∼ A/B(100/0) 농도로 2 분간, A/B(100/0)로 10 분간 씻어준 후에 A/B(90:10) 농도로 10분간 칼럼을 평형화하였다. 크로마토그래피는 Autosampler로 자동으로 시료를 주입하는 방식으로 50회 실시하여 대량의 1번 분획물의 1차 획분을 얻었다. 대량으로 얻은 1차 획분의 순도를 높이기 위하여 동일한 기기와 칼럼을 사용하였다. 크로마토그래피 조건은 처음 A/B(85/15) ∼ A/B(87/13) 농도로 26분간, A/B(87/13) ∼ A/B(100/0) 농도로 2 분간, A/B(100/0)로 6 분간 씻어준 후에 A/B(87:13) 농도로 10분간 칼럼을 평형화하였다. 크로마토그래피는 Autosampler로 자동으로 시료를 주입하는 방식으로 실시하여 보다 순도가 높은 1번 분획물의 2차 획분을 얻었다.

이후 1번 분획물의 2차 획분 중 1번을 동일한 조건으로 재크로마토그래피하여 정제하였으며 (523 mg), 분석용칼럼 (Phenomenex C18(2), 3 μm, 3 mm × 150 mm)으로 분석한 결과 단일물질로 판명되었으며, 이를 1H-NMR 및 13C-NMR로 분석한 결과 아래와 같은 결과를 얻었고 sargahydroquinoic acid로 판명되었다.

1H-NMR (CD3OD, 400 MHz); 3.25 (2H, d, J=7.4 Hz, H-1), 5.29 (1H, dt, J=7.3 & 1.4 Hz, H-2), 2.08 (2H, m, H-4), 2.12 (2H, m, H-5), 5.14 (1H, t, J=7.0 Hz, H-6), 2.08 (2H, m, H-8), 2.50 (2H, dt, J=7.0 & 7.0, H-9), 5.83 (1H, t, J=7.3 Hz, H-10), 2.21 (2H, t, J=7.7 Hz, H-12), 2.12 (2H, m, H-13), 5.07 (1H, tt, J=7.3 & 1.4 Hz, H-14), 1.65 (3H, s, CH3-16), 1.56 (3H, s, CH3-17), 1.59 (3H, s, CH3-19), 1.70 (3H, s, H-20), 6.38 (2H, brs, H-3’ & H-5’), 2.14 (3H, s, Aromatic-CH3).

13C-NMR (CD3OD, 100 MHz); 29.6 (C-1), 124.1 (C-2), 136.8 (C-3), 40.9 (C-4), 27.6 (C-5), 125.96 (C-6), 135.5 (C-7), 40.3 (C-8), 28.9 (C-9), 142.7 (C-10), 132.9 (C-11), 36.0 (C-12), 29.0 (C-13), 124.8 (C-14), 133.3 (C-15), 25.9 (C-16), 17.8 (C-17), 171.7 (C-18), 15.96 (C-19), 16.2 (C-20), 146.5 (C-1’), 131.3 (C-2’), 114.5 (C-3’), 151.4 (C-4’), 115.7 (C-5’), 127.5 (C-6’), 16.9 (Aromatic-CH3)

<11-2> Sargachromenol 의 분리

상기 <<11-1>에서 수득한 분획물 중 2번 분획물을 1번 분획물과 동일한 HPLC 장치와 칼럼을 사용하여 재크로마토그래피하였다. 크로마토그래피 조건은 처음 A/B(91.5/8.5) ∼ A/B(92.2/7.8) 농도로 26분간, A/B(92.2/7.8) ∼ A/B(100/0) 농도로 2 분간, A/B(100/0)로 6 분간 씻어준 후에 A/B(91.5:8.5) 농도로 10분간 칼럼을 평형화하였다. 크로마토그래피는 Autosampler로 자동으로 시료를 주입하는 방식으로 50회 실시하여 대량의 2번 분획물의 2차 획분을 얻었다. 2번 분획물은 3개의 피크를 나타내었으며, 이중 2번 피크 (Frc2-2)를 다시 정제하여 크로마토그램을 얻었으며(126 mg), 분리물을 1H-NMR 및 13C-NMR로 분석한 결과 sargachromenol로 판명되었다.

1H-NMR (CD3OD, 400 MHz); 5.60 (1H, d, J=9.9 Hz, H-3), 6.29 (1H, d, J=9.9 Hz, H-4), 6.27 (1H, d, J=2.5 Hz, H-5), 6.42 (1H, d, J=2.5 Hz, H-7), 1.65 (2H, m, H-1’), 2.10 (2H, m, H-2’), 5.14 (1H, t, J=6.9 Hz, H-3’), 2.05 (2H, t, J=7.5 Hz, H-5’), 2.50 (2H, dt, J=7.0 & 7.52 Hz, H-6’), 5.82 (1H, t, J=7.0 Hz, H-7’), 2.21 (2H, t, J=6.9 Hz, H-9’), 2.10 (2H, m, H-10’), 5.08 (1H, t, J=6.9 Hz, H-11’), 1.66 (3H, s, H-13’), 1.56 (6H, brs, H-14’ & H-16’), 1.32 (3H, s, H-17’), 2.11 (3H, s, Aromatic-CH3)

13C-NMR (CD3OD, 100 MHz); 78.8 (C-2), 131.5 (C-3), 124.3 (C-4), 122.6 (C-4a), 111.3 (C-5), 151.3 (C-6), 118.0 (C-7), 126.6 (C-8), 145.3 (C-8a), 41.9 (C-1’), 23.7 (C-2’), 124.8 (C-3’), 135.5 (C-4’), 40.27 (C-5’), 29.0 (C-6’), 142.5 (C-7’), 132.9 (C-8’), 36.0 (C-9’), 28.9 (C-10’), 124.2 (C-11’), 133.5 (C-12’), 25.9 (C-13’), 17.8 (C-14’), 171.7 (C-15’), 15.7 (C-16’), 26.3 (C-17), 15.8 (C-18’)

<11-3> Sargaquinoic acid 의 분리

상기 <<11-1>에서 수득한 분획물 중 3번 분획물을 1번 분획물과 동일한 HPLC 장치와 칼럼을 사용하여 재크로마토그래피하였다. 크로마토그래피 조건은 처음 A/B(93.4/6.6) ∼ A/B(93.8/6.2) 농도로 20분간, A/B(93.8/6.2) ∼ A/B(100/0) 농도로 2 분간, A/B(100/0)로 6 분간 씻어준 후에 A/B(93.8/6.2) 농도로 10분간 칼럼을 평형화하였다. 크로마토그래피는 Autosampler로 자동으로 시료를 주입하는 방식으로 50회 실시하여 대량의 3번 분획물의 2차 획분을 얻었다. 3번 분획물은 4개의 피크를 나타내었으며, 이중 4번 피크 (Frc3-4)를 다시 정제하여 크로마토그램을 얻었고(171 mg), 분리물을 1H-NMR 및 13C-NMR로 분석한 결과 sargaquinoic acid로 판명되었다.

1H-NMR (CD3OD, 400 MHz); 3.12 (2H, d, J=6.9 Hz, H-1), 5.17 (1H, t, J=7.4 Hz, H-2), 2.08 (2H, m, H-4), 2.09 (2H, m, H-5), 5.10 (1H, m, H-6), 2.09 (2H, m, H-8), 2.59 (2H, dt, J=7.2 & 7.2, H-9), 5.84 (1H, t, J=7.3 Hz, H-10), 2.19 (2H, t, J=7.2 Hz, H-12), 2.12 (2H, m, H-13), 5.06 (1H, tt, J=7.3 & 1.4 Hz, H-14), 1.65 (3H, s, CH3-16), 1.58 (3H, s, CH3-17), 1.60 (3H, s, CH3-19), 1.62 (3H, s, H-20), 6.42 (1H, m, H-3’), 6.56 (1H, quin, J=1.4 Hz, H-5’), 2.12 (3H, d, J=1.5 Hz, Aromatic-CH3)

13C-NMR (CD3OD, 100 MHz); 28.5 (C-1), 120.1 (C-2), 140.4 (C-3), 40.7 (C-4), 27.3 (C-5), 125.7 (C-6), 135.8 (C-7), 40.3 (C-8), 29.0 (C-9), 142.6 (C-10), 132.9 (C-11), 36.1 (C-12), 28.9 (C-13), 124.8 (C-14), 133.4 (C-15), 25.9 (C-16), 17.8 (C-17), 171.6 (C-18), 15.97 (C-19), 16.0 (C-20), 189.4 (C-1’), 150.0 (C-2’), 133.0 (C-3’), 188.9 (C-4’), 133.96 (C-5’), 147.6 (C-6’), 16.1 (Aromatic-CH3)

< 실험예 12>

사가하이드로퀴노익산에 대한 NO 생성량 및 세포 독성 시험분석

본 발명자들은 상기 실험예에서 분리 및 정제한 화합물들 중, 사가하이드로퀴노익산 화합물이 항염활성이 있는지와 세포 독성 정도를 분석하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다, 먼저, 사가하이드로퀴노익산 화합물을 BV-2 세포에 2시간 전처리 후, LPS (0.1 mg/mL)를 24시간 처리하였다. 이후 NO의 농도는 세포를 배양한 배지 (100 mL)와 Griess 시약 (0.1% naphtylethylene diamine dihydrochloride + 1% sulfanilamide + 5% phosphoric acid)을 동일한 비율로 반응시켜 microplate reader로 540 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 또한, 세포 독성 확인을 위해, BV-2 세포들을 96-well plate 에 5x10⁴cells/well로 분주하고 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 농도별로 희석된 DMEM 배지로 교체하여 2시간 배양하였고, LPS가 함유한 DMEM 배지에 다시 24시간 배양한 다음, MTS 시험 키트를 사용하여 세포 생존율을 확인하였다. MTS 용액은 FBS-free DMEM에 5%(v/v)농도로 섞어 100 ml씩 처리하였다. 1시간 후에 microplate reader를 사용하여 490 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.

분석 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이, 사가하이드로퀴노익산 화합물을 처리한 군에서는 NO의 생성량이 화합물 처리 농도 의존적으로 감소하는 것으로 나타났고, 화합물의 처리에 의한 세포 독성은 유발되지 않는 것으로 나타나 본 발명의 화합물은 항염 활성을 가지면서 세포에 대해 안정성을 나타냄을 알 수 있었다.

< 실험예 13>

다양한 모자반 추출물을 대상으로 한 항염활성 분석

나아가 본 발명자들은 본 발명의 톱니모자반 추출물의 항염 활성이 다른 종류의 모자반에 비해 우수한 효과를 가지는지 분석하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 즉, 애기외톨개모자반, 큰열매모자반, 엔도모자반, 큰잎모자반, 톱니모자반을 대상으로 주정 추출물을 수득하고, 이들 추출물에 대해 앞서 실험예에서 사용한 염증성 사이토카인 억제 효능 실험을 수행하였다. 이때 모자반 추출물 이외에 상기 수득한 3가지 화합물에 대해서도 동일한 항염 활성 분석을 수행하였다.

분석 결과, 하기 표에 기재된 바와 같이, 다른 종류의 모자반에 비해 톱니모자반 추출물이 월등히 항염 활성이 우수한 것으로 나타났다.

모자반종류	수율(%)	항염증활성 (EC₅₀, ug/mL)
애기외톨개모자반	6.6 ±1.0	126 ±6.4
큰열매모자반	14. 3 ±1.9	229 ±12.5
엔도모자반	9.0 ±1.4	125±8.7
큰잎모자반	18.1 ±2.2	210 ±7.8
톱니모자반	10.5 ±1.5	2.2 ±0.12
Sargahydroquinoic acid	2 ±0.4	0.5 ±0.03
Sargachromenol	0.5 ±0.1	2.4 ±0.15
Sargaquinoic acid	0.8 ±0.2	1.0 ±0.06

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
상기 추출물에는 사카크로멘올, 사가퀴노익산 또는 사가하이드로퀴노익산 화합물을 함유하며,
상기 톱니모자반 추출물은 톱니모자반의 주정 추출물, 톱니모자반 주정 추출물의 n-헥산 분획물 또는 톱니모자반 주정 추출물의 에틸아세테이트 분획물인 것을 특징으로 하는 염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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[청구항 5은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.]

제1항에 있어서,
상기 염증질환은 염증성 장 질환, 복막염, 골수염, 봉소염, 췌장염, 외상 유발 쇼크, 기관지 천식, 알러지성 비염, 낭포성 섬유증, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 급성 세기관지염, 만성 세기관지염, 골관절염, 통풍, 척추관절병증, 강직성 척추염, 라이터 증후군, 건선성 관절병증, 장질환 척추염, 연소자성 관절병증, 연소자성 강직성 척추염, 반응성 관절병증, 감염성 관절염, 후-감염성 관절염, 임균성 관절염, 결핵성 관절염, 바이러스성 관절염, 진균성 관절염, 매독성 관절염, 라임 병, '혈관염 증후군'과 관련된 관절염, 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 루게닉 육아종증, 류마티스성 다발성근육통, 관절 세포 동맥염, 칼슘 결정 침착 관절병증, 가성 통풍, 비-관절 류마티즘, 점액낭염, 건초염, 상과염(테니스 엘보), 신경병증성 관절 질환(neuropathic joint disease), 출혈성 관절증(hemarthrosic), 헤노흐-쉔라인 자반병, 비후성 골관절병증, 다중심성 세망조직구종, 척추측만증(scoliosis), 혈색소증, 혈색소병증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, 가족성 지중해열, 베하트병, 전신성 홍반성 루푸스, 재귀열, 다발성 경화증, 패혈증, 패혈성 쇼크, 급성 호흡곤란 증후군, 다발성 장기부전, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 급성 폐손상(acute lung injury), 기관지 폐 형성장애(broncho- pulmonary dysplasia) 및 염증성 피부질환으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증질환의 예방 또는 개선용 기능성 건강식품으로서, 상기 추출물에는 사카크로멘올, 사가퀴노익산 또는 사가하이드로퀴노익산 화합물을 함유하며,
상기 톱니모자반 추출물은 톱니모자반의 주정 추출물, 톱니모자반 주정 추출물의 n-헥산 분획물 또는 톱니모자반 주정 추출물의 에틸아세테이트 분획물인 것을 특징으로 하는 염증질환의 예방 또는 개선용 기능성 건강식품.
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[청구항 10은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.]

제6항에 있어서,
상기 염증질환은 염증성 장 질환, 복막염, 골수염, 봉소염, 췌장염, 외상 유발 쇼크, 기관지 천식, 알러지성 비염, 낭포성 섬유증, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 급성 세기관지염, 만성 세기관지염, 골관절염, 통풍, 척추관절병증, 강직성 척추염, 라이터 증후군, 건선성 관절병증, 장질환 척추염, 연소자성 관절병증, 연소자성 강직성 척추염, 반응성 관절병증, 감염성 관절염, 후-감염성 관절염, 임균성 관절염, 결핵성 관절염, 바이러스성 관절염, 진균성 관절염, 매독성 관절염, 라임 병, '혈관염 증후군'과 관련된 관절염, 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 루게닉 육아종증, 류마티스성 다발성근육통, 관절 세포 동맥염, 칼슘 결정 침착 관절병증, 가성 통풍, 비-관절 류마티즘, 점액낭염, 건초염, 상과염(테니스 엘보), 신경병증성 관절 질환(neuropathic joint disease), 출혈성 관절증(hemarthrosic), 헤노흐-쉔라인 자반병, 비후성 골관절병증, 다중심성 세망조직구종, 척추측만증(scoliosis), 혈색소증, 혈색소병증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, 가족성 지중해열, 베하트병, 전신성 홍반성 루푸스, 재귀열, 다발성 경화증, 패혈증, 패혈성 쇼크, 급성 호흡곤란 증후군, 다발성 장기부전, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 급성 폐손상(acute lung injury), 기관지 폐 형성장애(broncho- pulmonary dysplasia) 및 염증성 피부질환으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 기능성 건강식품.
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