KR101819462B1 - 톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 톱니모자반 추출물 및 상기 추출물로부터 분리된 화합물은 세포에 독성을 유발시키지 않아 안정성이 있으며, 염증 관련 인자들의 유전자 및 단백질 발현을 억제할 수 있고, 항염 활성 인자를 활성화 시킬 수 있으며, ICAM-1과 VCAM-1과 같은 인자들의 억제를 통해 단핵구의 내피세포와의 접합을 억제하여 혈관 손상을 예방, 개선 및 치료할 수 있는 의약품 및 기능성식품의 소재로 활용할 수 있는 효과가 있다.

Description

톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing and treating cardiovascular diseases comprising Sagassum serratifolium extract}

본 발명은 톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

최근 식생활의 서구화와 고령인구의 증가로 인하여 성인질환, 특히 심혈관질환 (cardiovascular disease) 및 뇌혈관질환 (cerebrovascular disease) 등의 혈관질환이 급속히 증가하고 있는 추세이다. 죽상동맥경화증은 일반적인 심혈관, 뇌혈관질환으로 전 세계적으로 남성과 여성 모두에게서 사망의 원인이 되는 심근경색, 뇌졸중으로 이끈다(Funatsu et al., Jpn. J. Ophthalmol. 45, p577-584, 2001). 죽상동맥경화증의 원인 중의 하나인 혈관염증은 혈관에 염증이 발생하여 혈관내경이 좁아지고 조직의 허혈 및 괴사를 초래하는 질환으로 크기, 위치 및 형태에 관계없이 모든 혈관을 침범하여 다양한 증상을 나타낸다고 보고되어 있다 (Tay et al., Transplantation, 78(7), 987-994, 2004).

또한, 혈관은 내피세포와 평활근세포로 대부분 이루어져 있는데, 염증 초기단계에서는 순환하고 있는 단핵구와 같은 염증성세포가 내피세포에 의해서 혈관벽 내로 이동하고, 단핵구가 대식세포로 분화되게 된다. 이러한 이동을 촉진하기 위해서는 내피세포 표면에 단핵구가 부착되어 조직 속으로 이동할 수 있도록 intracellular adhesion molecule (ICAM-1)이나 vascular cell adhesion molecule (VCAM-1)과 같은 세포부착분자를 발현하게 된다(Betera et al., Rev. Neuropsiquiatr. 37, 177-195).

TNF-α (Tumor mecrosis factor-α)는 전신염증과 면역반응에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 염증매개 사이토카인으로, 죽상동맥경화의 손상에서 일반적으로 나타나 내피세포에 이러한 부착분자들의 발현을 이끄는 신호를 일으키게 된다 (Modur et al., J. Biol. Chem. 271, 13094-13102, 1996).

TNF-α에 의한 세포부착분자의 발현은 전사인자인 nuclear factor-κB (NF-κB)의 전사활성 조절에 의해서 일어나게 되며, gelatinase라 불리는 matrix metalloproteinase (MMP)-2와 MMP-9의 발현도 조절한다고 보고되어져왔다 (Chandrasekar et al., J. Biol. Chem. 281, 15099-15109, 2006: de Winther et al., Arterioscler Throm Vasc Biol, 25, 904-914, 2005). 세포외 기질은 세포사이기질과 기저막으로 구성되는데 MMP는 병리학적 조건에서 이 세포외기질을 분해시켜 matrix remodeling을 초래하여 면역세포의 이동, 혈관외 유출, 침윤에 중요한 역할을 하게 된다. (Cuzner and Opdenakker, J. Neuroimmunol. 94, 1-14, 1999). 특히 MMP-2와 9의 활성은 죽상동맥경화, 뇌졸중, 심부전, 허혈성 심장질환, 동맥류과 같은 심혈관 질환을 일으키는 것으로 알려져 있다. (Weiwei et al., J. Endocrinol. 214, 145-153, 2012). Monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1)은 단핵세포, 평활근, 내피세포와 같은 여러 세포에서 cytokine, 산화적 스트레스, 성장인자와 같은 자극에 의하여 생성되다. MCP-1의 과도한 생산은 당뇨합병증, 치주질환, 유방암, 류마티스성 관절염, 동맥경화, 아테롬성 동맥경화와 같은 병리적인 상태에서 관찰된다 (Pe & Niu, Circ Res., 110, 174-189, 2012; Koyanagi et al., Circulation. 102, 2243-2248, 2000).

Heme oxygenase 1 (HO-1)은 HSP32라고도 부르며, 유독한 Heme을 철 이온, 일산화탄소, 그리고 biliverdin으로 분해하는 항산화효소이다 (Morse and Choi, Am. J. Respair. Cell. Mol. Biol. 27, 8-16, 2002). Biliverdin은 biliverdin reductase에 의하여 강력한 항산화 활성을 지닌 bilirubin으로 전환된다. HO-1의 유도는 전사활성인자인 nuclear transcription factor-E2-related factor 2 (Nrf-2)에 의해서 조절된다. 현재까지 HO-1와 그 생성물들이 redox-sensitive NF-κB 활성 경로에 중요한 역할을 하는 세포내 reactive oxygen species (ROS) 축적을 억제하므로써 강력하게 노화와 염증반응의 억제는 물론 백혈구, 특히 단핵구의 부착을 억제하여 내피세포의 활성을 조절하는 역할이 보고되고 있다 (Ishikawa et al., J. Clin. Invest. 100, 12091216, 1997). 이러한 이유 때문에 체내에서 HO-1의 발현을 향상시키는 물질은 산화적스트레스의 억제는 물론 혈관내피세포에서의 염증을 억제함으로써 심혈관질환에 도움이 되는 것으로 알려져 있다.

한편, 점점 높아져 가는 심혈관 질환의 발병률과 사망률로 인해 의학적으로 많은 관심과 연구가 진행되고 있는데, 보다 근본적인 치료와 함께 부작용을 유발하지 않는 치료제가 부재하여 이러한 치료제의 개발이 시급한 실정이다.

대한민국공개특허 제2008-0044734호

따라서 본 발명의 목적은 톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환의 예방 또는 개선용 기능성 건강식품을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 사카크로멘올, 사가퀴노익산 또는 사가하이드로퀴노익산을 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 사카크로멘올, 사가퀴노익산 또는 사가하이드로퀴노익산을 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환의 예방 또는 개선용 기능성 건강식품을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 톱니모자반 추출물은 물 또는 유기용매를 이용하여 수득한 추출물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유기용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 아세톤, 에테르, 벤젠, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 헥산 및 시클로헥산으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출물에는 사카크로멘올, 사가퀴노익산 또는 사가하이드로퀴노익산 화합물을 함유하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 심혈관질환은 고혈압, 뇌졸중, 협심증, 심부전, 심근경색, 죽상동맥경화 및 허혈성 심장질환으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환의 예방 또는 개선용 기능성 건강식품을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 톱니모자반 추출물은 물 또는 유기용매를 이용하여 수득한 추출물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유기용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 아세톤, 에테르, 벤젠, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 헥산 및 시클로헥산으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출물에는 사카크로멘올, 사가퀴노익산 또는 사가하이드로퀴노익산 화합물을 함유할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 상기 심혈관질환은 고혈압, 뇌졸중, 협심증, 심부전, 심근경색, 죽상동맥경화 및 허혈성 심장질환으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.

또한, 본 발명은 사카크로멘올, 사가퀴노익산 또는 사가하이드로퀴노익산 화합물을 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화합물은 톱니모자반으로부터 분리 및 정제된 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 사카크로멘올, 사가퀴노익산 또는 사가하이드로퀴노익산 화합물을 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환의 예방 또는 개선용 기능성 건강식품을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화합물은 톱니모자반으로부터 분리 및 정제된 것일 수 있다.

본 발명은 톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 톱니모자반 추출물 및 상기 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물로서 이들 조성물은 세포에 독성을 유발시키지 않아 안정성이 있으며, 세포부착분자들의 유전자 및 단백질 발현을 억제할 수 있고, 심혈관 질환의 원인으로 알려진 혈관염증을 억제하는 효과가 우수하여, 심혈관 질환을 예방, 개선 및 치료할 수 있는 의약품 및 기능성식품의 소재로 활용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 톱니모자반의 주정추출물(EtOH), n-헥산 가용분획물(Hxn), 에틸아세테이트 가용 분획물(EtOAC)을 농도별로 처리한 후, 세포에 미치는 세포 독성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 톱니모자반의 주정추출물(EtOH), n-헥산 가용분획물(Hxn), 에틸아세테이트 가용 분획물(EtOAC)을 HUVEC 세포에 농도별로 처리한 후, ICAM-1 및 VCAM-1 단백질의 발현정도를 웨스턴 블럿을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 톱니모자반의 주정추출물(EtOH), n-헥산 가용분획물(Hxn), 에틸아세테이트 가용 분획물(EtOAC)을 HUVEC 세포에 농도별로 처리한 후, ICAM-1 및 VCAM-1 단백질의 발현정도를 ELISA 분석을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 톱니모자반의 주정추출물(EtOH), n-헥산 가용분획물(Hxn), 에틸아세테이트 가용 분획물(EtOAC)을 HUVEC 세포에 농도별로 처리한 후, ICAM-1 및 VCAM-1 의 mRNA 발현정도를 PCR 분석을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 톱니모자반의 주정추출물(EtOH) 및 n-헥산 가용분획물(Hxn)의 HO-1 단백질 발현에 미치는 영향을 웨스턴 블럿을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 톱니모자반의 주정추출물(EtOH) 및 n-헥산 가용분획물(Hxn)을 농도별로 처리한 후, TNF-α 자극에 의한 ROS 생성량을 DCFH-DA을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 톱니모자반의 주정추출물(EtOH), n-헥산 가용분획물(Hxn) 및 에틸아세테이트 가용분획물(EtOAC)을 농도별로 처리한 후, TNF-α 자극에 의한 IKK-beta 및 IkB-α의 인산화 정도를 웨스턴 블럿을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 톱니모자반의 주정추출물(EtOH), n-헥산 가용분획물(Hxn), 에틸아세테이트 가용 분획물(EtOAC)이 처리된 세포의 핵(nucleus) 추출물을 대상으로 jun 및 NF-κB의 핵 내로의 이동 억제 정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 톱니모자반의 n-헥산 가용분획물(Hxn)이 NF-κB가 핵으로 이동하는 것에 미치는 영향을 분석하기 위해 공초점 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 10은 TNF-α에 의한 단핵구 부착 증가에 대한 톱니모자반 주정추출물의 효과를 형광현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 11은 톱니모자반의 주정추출물(EtOH)이 MMP-9의 단밸질 발현 억제 정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 톱니모자반 추출물에서 정제 및 분리한 sargachromenol 및 sargaquinoic acid 화합물의 세포 독성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 톱니모자반 추출물에서 정제 및 분리한 sargachromenol 및 sargaquinoic acid 화합물을 HUVEC 세포에 농도별로 처리한 후, ICAM-1 및 VCAM-1 단백질의 발현정도를 웨스턴 블럿을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 톱니모자반 추출물에서 정제 및 분리한 sargachromenol 및 sargaquinoic acid 화합물을 HUVEC 세포에 농도별로 처리한 후, ICAM-1 및 VCAM-1 단백질의 발현정도를 ELISA 분석을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 톱니모자반 추출물에서 정제 및 분리한 sargachromenol 및 sargaquinoic acid 화합물을 HUVEC 세포에 농도별로 처리한 후, ICAM-1 및 VCAM-1 의 mRNA 발현정도를 PCR 분석을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 톱니모자반 추출물에서 정제 및 분리한 sargachromenol 및 sargaquinoic acid 화합물의 HO-1 단백질 발현에 미치는 영향을 웨스턴 블럿을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 톱니모자반 추출물에서 정제 및 분리한 sargachromenol 및 sargaquinoic acid 화합물을 농도별로 처리한 후, TNF-α 자극에 의한 ROS 생성량을 DCFH-DA을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 톱니모자반 추출물에서 정제 및 분리한 sargaquinoic acid 화합물의 TNF-α 자극에 의한 염증성 사이토카인인 IL-8와 MCP-1의 mRNA 발현양을 RT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 sargachromenol 및 sargaquinoic acid 화합물이 처리된 세포의 세포질(cytosol) 추출물을 대상으로 IKK-beta, IkB-a 및 NF-κB의 발현 및 인산화 정도를 웨스턴 블럿을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 톱니모자반 추출물에서 정제 및 분리한 sargachromenol 및 sargaquinoic acid 화합물의 핵에서의 TNF-α에 의한 NF-κB 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 21은 sargachromenol 및 sargaquinoic acid 화합물이 NF-κB가 핵으로 이동하는 것에 미치는 영향을 분석하기 위해 공초점 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 22는 sargaquinoic acid 화합물에 처리된 세포의 세포질(cytosol) 및 핵(nucleus) 추출물을 대상으로 Nrf2 단백질의 발현에 미치는 영향을 웨스턴블럿을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 23은 sargaquinoic acid 화합물에 처리된 세포 내에서 sargaquinoic acid 화합물에 의한 Nrf-2 핵이동 현상을 공초점 현미경을 통해 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 24는 sargaquinoic acid에 의한 루시퍼라제 활성 촉진(Nrf-2 전사인자의 활성화) 활성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 25는 sargachromenol 및 sargaquinoic acid 화합물에 의한 THP-1 부착 감소 효과를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 26은 sargachromenol 및 sargaquinoic acid 화합물의 TNF-α에 의한 MMP-9 단백질 발현 억제 정도를 웨스턴 블럿을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 톱니모자반 추출물이 심혈관 질환을 예방 또는 치료할 수 있음을 규명한 점에 특징이 있다.

본 발명에서는 새로운 심혈관 치료제의 소재로서 톱니모자반 추출물에 주목하였는데, 톱니모자반은 조간대에서 점심대에 걸쳐 생육하는 식물로서 1∼4m인 다년생 대형 갈조류이다. 뿌리는 지름 4∼5cm로 원뿔상이고, 고무와도 같으며 나이테가 있고, 줄기는 원주상으로 짧고 다수의 중심가지로 나뉘며 편압되어 있다. 또한 줄기의 양 가장자리가 얇고, 세로로 중륵처럼 한쪽으로 융기하며, 가장자리에서 짧은 가지를 내고 있으며 줄기잎은 기부로 향하여 있고, 가장자리에 2중으로 된 톱니가 있으며, 기포는 둥근 모양에 가까우며 그 꼭대기에 관엽(冠葉) 또는 가시 모양의 돌기가 있다. 특히 우리나라의 남해안과 제주에 생육하는 것으로 알려져 있으며, 지질강하, 혈압강하, 방사성 동위원소 배출작용에 대한 기능을 가지고 있는 것으로 알려져 있을 뿐, 아직까지 심혈관 질환과의 관련성에 대해서는 알려진 바가 없다.

본 발명자들은 톱니모자반 추출물이 심혈관 질환을 치료할 수 있음을 다양한 실험을 통해 확인할 수 있었는데, 특히 혈관은 내피세포와 평활근세포로 대부분 이루어져 있고, 염증 초기단계에서는 순환하고 있는 단핵구와 같은 염증성세포가 내피세포에 의해서 혈관벽 내로 이동하여 단핵구가 대식세포로 분화되며, 이를 위해 내피세포 표면에 단핵구가 부착되어 조직 속으로 이동할 수 있도록 ICAM-1이나 VCAM-1과 같은 세포부착분자를 발현하게 된다. 또한, TNF-α(Tumor mecrosis factor-α)는 전신염증과 면역반응에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 염증매개 사이토카인으로, 죽상동맥경화을 포함하는 심혈관 질환의 손상에서 이러한 부착분자들의 발현을 유도하게끔 한다.

따라서 본 발명에 따른 톱니모자반 추출물, 바람직하게는 톱니모자반의 주정추출물(EtOH), n-헥산 가용분획물(Hxn), 에틸아세테이트 가용 분획물(EtOAC)은 ICAM-1이나 VCAM-1의 발현 및 활성을 효과적으로 억제할 수 있고, TNF-α에 의한 염증성 사이토카인 및 ROS와 같은 병인인자의 생성을 억제할 수 있었다.

또한, Nuclear factor kappa B (NF-κB)는 세포의 성장은 물론 면역과 급성염증반응에 주요한 역할을 하는데, NF-κB 활성화는 여러 가지 전구염증성 유전자들의 발현을 조절하며, NF-κB의 활성화 경로는 TNF-α에 의해 inhibitor of kB (IκB)-α kinase가 인산화되고 인산화된 IκB-α가 분해되어 유리상태의 NF-kB가 핵으로 이동하게 되어 염증관련유전자들의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 발명의 추출물은 이러한 NF-kB의 활성화를 억제할 수 있어 이로 인한 염증관련 유전자의 발현을 억제하여 궁극적으로 항염 활성 및 심혈관 발병 기전의 억제를 유도할 수 있음을 알 수 있었다.

나아가, 본 발명에 따른 톱니모자반 추출물은 헴 옥시게나제-1(heme oxygenase-1; HO-1)의 활성을 증진시키는 효과가 있음을 확인하였는데 HO-1은 항산화와 제독화 효소로 heme 기를 Fe³⁺, CO, biliverdin으로 분해함으로써 항산화, 항염증, 항비만, 항암 등 다양한 생리활성을 조절하는 것으로 알려져 있다. 뿐만 아니라, HO-1는 redox-sensitive Nf-κB 활성 경로에 중요한 역할을 하는 세포내 reactive oxygen species (ROS) 축적을 억제하여 강력하게 노화와 염증반응의 억제는 물론 백혈구, 특히 단핵구의 부착을 억제하여 내피세포의 활성을 조절하는 역할이 보고되고 있다. 이러한 점에서 본원의 추출물들은 HO-1의 발현과 활성을 촉진시킬 수 있으며, HO-1와 같은 단백질의 발현을 조절하는 Nrf-2의 활성도 촉진시키는 역할을 한다는 것을 확인할 수 있었다.

따라서 톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 심혈관 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명에서 "심혈관 질환"이란 고혈압, 뇌졸중, 협심증, 심부전, 심근경색, 죽상동맥경화 및 허혈성 심장질환을 포함할 수 있으며, 본 발명에서 "치료"란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 치료란 용어는 "치료하는"이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에 있어서 심혈관질환의 "치료" 또는 "치료요법"은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:

(1) 심혈관질환의 발달을 저지시킴,

(2) 심혈관질환의 확산을 예방함,

(3) 심혈관질환을 경감시킴,

(4) 심혈관질환의 재발을 예방함 및

(5) 심혈관질환의 증상을 완화함(palliating)

본 발명에 따른 톱니모자반 추출물은 당업계에 공지된 추출 및 분리하는 방법을 사용하여 천연으로부터 추출 및 분리하여 수득한 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 정의된‘추출물’은 적절한 용매를 이용하여 톱니모자반으로부터 추출한 것이며, 예를 들어, 톱니모자반 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 모두 포함할 수 있다.

상기 톱니모자반으로부터 추출물을 추출하기 위한 적절한 용매로는 이에 제한되지 않으나, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 예를 들어, 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다. 바람직하게는 에탄올(주정), n-헥산 및 에틸아세테이트 용매를 사용할 수 있다.

추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다. 본 발명의 톱니모자반 추출물의 제조방법에는 제한이 없으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있다.

예를 들면, 본 발명의 조성물에 포함되는 톱니모자반 추출물은 상기한 열수 추출 또는 용매 추출법으로 추출된 1차 추출물을, 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조할 수 있다. 또한 상기 1차 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획을 얻을 수도 있다.

따라서 본 발명에 있어서 톱니모자반 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.

상기 톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 약제학적 조성물이나 식품 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 톱니모자반 추출물은 조성물에 10 내지 100μg/ml의 농도로 포함될 수 있으며, 또한 본 발명의 톱니모자반 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 ~ 95중량%로 포함될 수 있다.

본 발명의 조성물은 또한 식품 조성물일 수 있는데, 특히 본 발명에 따른 톱니모자반 추출물은 세포에 독성을 유도하지 않음을 일실시예를 통해 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명의 식품 조성물은 유효성분인 톱니모자반 추출물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.

또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 톱니모자반 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

본 발명의 유효성분인 톱니모자반 추출물은 천연물질로서 화학약품과 같은 부작용은 거의 없으므로 염증 질환의 예방 또는 치료를 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 건강기능식품은 염증 질환 개선을 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.

본 발명에서 “건강기능식품”이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 “식품 첨가물 공전”에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.

예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 톱니모자반 추출물을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.

캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분인 톱니모자반 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 톱니모자반 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.

환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 톱니모자반 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.

과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 톱니모자반 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.

상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.

또한 본 발명은 포유동물에게 톱니모자반 추출물을 투여하는 것을 포함하는 심혈관 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.

여기에서 사용된 용어 "치료상 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 치료방법에 있어서, 성인의 경우, 본 발명의 톱니모자반 추출물을 1일 1회 내지 수회 투여시, 0.01㎎/kg~250㎎/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 치료방법에서 본 발명의 톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

또한 본 발명은 톱니모자반 추출물 뿐만 아니라 톱니모자반 추출물로부터 분리 및 정제한 사카크로멘올, 사가퀴노익산 또는 사가하이드로퀴노익산 화합물을 유효성분으로 하는 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 사카크로멘올, 사가퀴노익산 또는 사가하이드로퀴노익산 화합물은 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.

본 발명에 따른 사카크로멘올, 사가퀴노익산 또는 사가하이드로퀴노익산 화합물은 천연으로부터 분리되거나 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조할 수 있는데, 바람직하게는 톱니모자반 추출물로부터 분리 및 정제된 것일 수 있다. 상기 추출물로부터 이들 화합물의 분리 및 정제는 실리카겔(silica gel)이나 활성 알루미나(alumina)등의 각종 합성수지를 충진한 컬럼 크로마토그라피(column chromatography) 및 고속액체크로마토그라피(HPLC) 등을 단독으로 혹은 병행하여 사용할 수 있다. 그러나 유효성분의 추출 및 분리정제 방법은 반드시 상기한 방법에 한정되는 것은 아니다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1>

톱니모자반의 주정추출물, n - 헥산 가용분획물 , 에틸아세테이트 가용 분획물의 제조

본 발명에서 사용한 톱니모자반은 부산시 기장군에서 채집하여 사용하였고, 아래와 같은 방법을 통해 톱니모자반의 주정추출물, n-헥산 가용분획물, 에틸아세테이트 가용 분획물을 수득하였다. 먼저 주정추출물의 제조를 위해 톱니모자반을 음지 또는 양지에서 자연건조 후 마쇄하여 얻은 분말 2 kg과 주정(95% 에탄올)을 각각 8 L씩 넣고 70℃에서 3시간 동안 3회 반복하여 환류냉각기가 장착된 추출기로 추출한 후 여지 (와트만사, 미국) 또는 마이크로필터로 감압 여과하고, 여과된 추출물을 진공회전농축기로 40℃에서 용매를 제거한 다음 추출된 잔사로서 톱니모자반조추출물 (200 ± 25 g)을 수득하였으며, 이 중 일부를 취하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

톱니모자반조추출물을 H₂O:ethanol (9:1, v/v)의 혼합용매로 녹인 후, 분액깔때기에 부어, 동량의 n-hexane를 넣어 분액깔때기를 흔든 다음 평형화시켰다. 이후 위층의 n-hexane 가용부를 모아 무수 황산나트륨 (sodium sulfate, anhydrous)으로 처리한 다음 여과하여 농축하였다. 이와 같은 방법으로 5회 더 반복하여 180 g 의 n-hexane 분획물을 얻었다. 동일한 방법으로 H₂O층에 EtOAc를 가하여 상층의 EtOAc 가용부를 모아 EtOAc 분획물 (5 ± 2 g)을 얻었다.

< 실험예 1>

톱니모자반의 주정추출물, n - 헥산 및 에틸아세테이트 가용분획물의 세포독성 효과분석

상기 실시예 1에서 수득한 톱니모자반의 추출물 중에서 주정추출물 및 n-헥산 가용분획물로 혈관 내피세포인 HUVEC에 처리하여 세포독성을 측정하였다. HUVEC (5 × 10³ cells/well)를 EGM-2 (endotherial cell growth media-2) 배지에서 배양 후, 톱니모자반 주정추출물, n-헥산 및 에틸아세테이트 가용분획물을 처리하고 1시간 배양한 후 TNF-α (10 ng/ml)을 처리하여 24시간 배양하였다. 96 well plate에 배지 100㎕와 MTS 용액 5㎕를 넣고 1시간 정도 반응시킨 후 microplate reader를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정치는 3회 반복 실험의 평균값으로 하여 분석하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, HUVEC 세포에 대한 톱니모자반의 주정추출물 및 n-헥산 가용분획물의 세포 독성은 10 μg/ml의 농도까지 나타나지 않았으며, 에틸아세테이트 가용분획물의 세포 독성은 4 μg/ml의 농도까지 나타나지 않았다. 따라서 본 발명의 추출물들은 세포에 특별한 독성을 유발하지 않는 안정한 것임을 알 수 있었다.

<실험예 2>

톱니모자반 주정추출물, n - 헥산 및 에틸아세테이트 가용분획물의 ICAM -1과 VCAM-1의 단백질 생성 억제효과

TNF-α는 전신염증과 면역반응에 중요한 역할을 하는 잘 알려진 염증매개 사이토카인으로, 내피세포의 부착인자(CAMs)인 intracellular adhesion molecule-1 (ICAM-1)와 vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1)의 발현을 증가시킨다. 이러한 세포부착분자는 단핵구의 부착을 중개하여 손상된 내피세포에 다량의 단핵구와 림프구가 조직 내로 침투해 들어가도록 하여 여러 혈관염증을 진행시킨다.

이에 본 발명자들은 HUVCE 세포에 톱니모자반 주정추출물, n-헥산 및 에틸아세테이트 가용분획물을 1시간 처리한 후 10 ng/ml의 TNF-α가 함유된 배지를 처리하여 6시간 후 세포내 단백질을 웨스턴블럿을 통해 확인하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, HUVCE에서 ICAM-1과 VCAM-1의 단백질발현에 대한 톱니모자반 추출물의 효과는 톱니모자반 주정추출물, n-헥산 및 에틸아세테이트 가용분획물 모두 TNF-α에 의한 ICAM-1과 VCAM-1 단백질의 발현을 농도 의존적으로 감소시키는 것을 알 수 있었다.

또한 TNF-α로 유도된 HUVEC 세포표면의 ICAM-1과 VCAM-1의 발현에 대한 톱니모자반 주정추출물, n-헥산 및 에틸아세테이트 가용분획물의 효과를 cell based ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)를 통해서 분석하였는데, 그 결과, 세포표면의 ICAM-1과 VCAM-1의 발현양 역시 톱니모자반 주정추출물, n-헥산 및 에틸아세테이트 가용분획물의 농도 의존적으로 감소함을 확인하였다(도 3 참조).

< 실험예 3>

톱니모자반 n - 헥산 가용분획물의 ICAM -1, VCAM -1 및 IL -8의 mRNA 발현 억제효과

톱니모자반 추출물의 ICAM-1과 VCAM-1의 억제 효과가 mRNA 발현 수준에서 억제하는 것인지 확인하기 위해 RT-PCR (reverse-transcriptase PCR)을 수행하였다.

분석 결과, 실험예 2의 결과와 같이 이들 유전자를 mRNA 발현 수준에서도 톱니모자반 주정추출물이 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다(도 4 참조).

또한, 혈관내피세포에 TNF-α를 처리하면 여러 기전을 통하여 interleukin-8 (IL-8), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) 등 염증 관련 cytokine이 발현되며 이는 염증 반응에 대한 판단 지표가 된다. 이에 본 발명자들은 톱니모자반 n-헥산 가용분획물을 세포에 대해 1시간 동안 전처리 후 TNF-α를 처리하고 6 시간 배양 후 IL-8의 mRNA 발현 양을 RT-PCR로 분석하였다.

그 결과, TNF-α에 의해 다량 발현된 IL-8은 톱니모자반 n-헥산 가용분획물에 의하여 농도 의존적으로 억제되는 것이 확인되었다(도 4 참조). 이러한 결과는 톱니모자반 n-헥산 가용분획물이 TNF-α에 의해 발생되는 염증반응을 억제하여 염증 매개인자인 염증성 cytokine의 발생을 효과적으로 억제시킨다는 것을 의미하고 있다.

<실험예 4>

톱니모자반 주정추출물 및 n - 헥산 가용분획물의 HO -1의 단백질 및 mRNA 발현 유도효과

Heme oxygenase-1(HO-1)은 제독화 효소로 heme 기를 Fe^{3 +}, CO, biliverdin으로 분해함으로써 항산화, 항염증, 항비만, 항암 등 다양한 생리활성을 조절하는 것으로 보고되고 있다. 톱니모자반 주정추출물 및 n-헥산 가용분획물의 항염증 기전이 HO-1을 통해서 일어나는지를 확인하기 위하여 HUVEC에 톱니모자반 주정추출물 또는 n-헥산 가용분획물을 1시간 동안 전처리 후 TNF-α를 처리하여 6 시간 배양 또는 톱니모자반 주정추출물 또는 n-헥산 가용분획물만을 6시간동안 배양한 다음 세포내 단백질을 추출하여 Western blotting으로 HO-1 단백질의 발현 변화를 분석하였다. 또한 HO-1의 TNF-α 존재하의 유도가 전사단계에서 일어나는지를 확인하기 위하여 세포내 RNA를 분리하여 RT-PCR로 HO-1 유전자의 발현정도를 분석하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 톱니모자반 주정추출물 및 n-헥산 가용분획물은 TNF-α 존재 하에서 HO-1 단백질과 mRNA 발현을 유도하는 것으로 확인되었고, TNF-α 비존재하에서도 HO-1 단백질 발현을 증가시키는 것으로 나타났다. 따라서 톱니모자반 주정추출물 및 n-헥산 가용분획물은 HO-1의 발현 활성으로 인해 항산화와 항염증 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

< 실험예 5>

톱니모자반 주정추출물 및 n - 헥산 가용분획물의 ROS 생성 억제 효과

혈관내피세포에서 TNF-α에 의해 세포가 자극되면 여러 기전을 통하여 활성 산소종인 Reactive oxygen species (ROS)가 생성되는 것으로 알려져 있으며, 이러한 ROS는 혈관에 산화적 스트레스를 주는 주요한 인자로 알려져 있다.

이에 본 발명자들은 상기 실험예에서 사용한 동일 세포를 대상으로 톱니모자반 주정추출물 및 n-헥산 가용분획물을 1시간 처리한 후 TNF-α에 의한 ROS 생성량을 DCFH-DA로 분석하였다.

그 결과, 톱니모자반 주정추출물 및 n-헥산 가용분획물 처리 시, TNF-α에 의한 ROS 생성을 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있었다(도 6 참조).

<실험예 6>

톱니모자반 주정추출물, n - 헥산 및 에틸아세테이트 가용분획물의 NF -κB 전사인자 핵이동 억제 효과

ICAM-1과 VCAM-1의 전사는 NF-κB를 포함한 다양한 전사 인자들에 의해 조절되는 것으로 알려져 있다. NF-κB는 일반적인 상태에서는 inhibitory of κB-α (IκB-α)와 함께 결합하여 세포질에 불활성화 상태로 존재한다. 하지만 세포외 자극이나 내적인 자극에 의해 여러 기전을 통하여 IκB-α가 인산화되어 ubiquitin에 의해 분해되며 유리형의 NF-κB (p65)는 핵으로 이동하여 cytokine, cytokine receptor, cell adhesion molecule, growth factor 등의 발현에 관여하는 유전자의 promoter나 enhancer의 κB site에 결합함으로써 전사를 유도한다.

따라서 TNF-α로 유도된 HUVEC 세포에서 본 발명의 톱니모자반 주정추출물, n-헥산 및 에틸아세테이트 가용분획물에 의한 IκB-α의 인산화와 NF-κB의 핵이동 억제효과를 웨스턴 블럿을 통해 확인하였다. 즉 이를 위해 톱니모자반 주정추출물, n-헥산 및 에틸아세테이트 가용분획물을 HUVEC 세포에 1 시간 동안 처리한 후 TNF-α로 30분간 자극한 후 세포를 수거하여 세포질 단백질과 핵 단백질을 분리하였다. 분리된 각각의 단백질을 웨스턴 블럿을 수행하여 세포질에서 pIKKβ와 톱니모자반 주정추출물, n-헥산 및 에틸아세테이트 가용분획물 처리에 의한 IκB-α 발현 정도를 분석하였다.

그 결과, TNF-α만을 세포에 처리한 경우 세포질에서 IKKβ가 인산화됨으로써 NF-κB를 억제하는 하위인자인 IκB-α가 인산화되어 분해됨으로써 감소하였다. 그러나 이러한 영향은 톱니모자반 주정추출물, n-헥산 및 에틸아세테이트 가용분획물을 처리함으로써 억제되었고(도 7 참조), 핵에서 TNF-α에 의해 증가하는 NF-κB는 톱니모자반 주정추출물, n-헥산 및 에틸아세테이트 가용분획물 처리에 의하여 다시 감소하는 것으로 나타났다(도 8 참조). 또한, 이러한 결과는 톱니모자반 주정추출물, n-헥산 및 에틸아세테이트 가용분획물이 TNF-α에 의한 IκB-α의 인산화 및 분해를 억제하여 NF-κB의 유리화를 감소시킴으로써 NF-κB가 핵으로 이동하여 전사인자로써 작용하는 것을 차단한다는 것을 의미한다.

더불어, 톱니모자반 n-헥산 가용분획물이 NF-κB가 핵으로 이동하는 것에 대한 영향을 확인하기 위하여 HUVEC에 톱니모자반 n-헥산 가용분획물을 1시간 처리한 후 다시 TNF-α (10 ng/ml)을 처리하여 배양한 후, immunostain하여 confocal 현미경으로 관찰하였다. 그 결과, 톱니모자반 n-헥산 가용분획물이 TNF-α에 의한 NF-kB의 핵이동 현상을 현저히 억제시키는 것으로 나타났다 (도 9)

<실험예 7>

톱니모자반 주정추출물, n - 헥산 및 에틸아세테이트 가용분획물의 c- jun 전사인자 인산화 억제 효과

ICAM-1과 VCAM-1은 또한 activator protein-1(AP-1)에 의해서도 전사 조절되는데, 이 AP-1의 활성은 c-jun의 인산화에 의한 핵으로의 이동에 의해서 조절된다. 이에 본 발명자들은 톱니모자반 주정추출물, n-헥산 및 에틸아세테이트 가용분획물을 세포에 처리하고, c-Jun의 인산화 정도를 웨스턴 블럿을 통해 확인하였다.

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, TNF-α에 의해 활성화된 전사인자 c-Jun의 인산화가 톱니모자반 주정추출물, n-헥산 및 에틸아세테이트 가용분획물에 의해 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다.

< 실험예 8>

TNF -α에 의한 단핵구 부착 증가에 대한 톱니모자반 주정추출물 효과

단핵구의 내피세포로의 부착은 혈관염증을 가중시켜 혈전을 증가시킨다. 이러한 부착은 ICAM-1과 VCAM-1과 같은 부착분자들에 의해서 매개되는데, 톱니모자반 추출물이 이러한 부착분자들의 발현을 감소시켜 단핵구인 THP-1 세포가 HUVEC으로의 부착을 억제할 수 있는지를 분석하였다. 이를 위해 HUVEC에 1시간 동안 톱니모자반 주정추출물을 전 처리한 후 TNF-α로 6시간 유도하고, BCECF-AM (2',7'-Bis-(2-Carboxyethyl)-5-(and-6)- Carboxyfluorescein, Acetoxymethyl Ester)로 label된 THP-1을 HUVEC과 함께 1시간 동안 동시배양 시킨 후 비접착성 THP-1은 PBS로 세척하고, 접착성 THP-1은 형광현미경으로 관찰하였다. 또한 값으로 나타내기 위해 세포를 용해시키고 형광강도를 형광광도계(spectrofluometer)를 통해 분석하였다.

그 결과, 처리된 톱니모자반 주정추출물의 농도 의존적으로 THP-1 부착이 감소하는 것으로 나타났다(도 10 참조). 이는 톱니모자반 주정추출물이 도 2 및 3에 나타난 바와 같이, ICAM-1과 VCAM-1과 같은 부착인자들을 억제함으로써 단핵구의 내피세포와의 접합을 억제시켰으며, 단핵구가 혈관내피로 이동하는 것을 억제하여 혈관염증을 억제할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

< 실험예 9>

톱니모자반 주정추출물에 의한 MMP -9의 단백질 발현 억제효과

NF-κB의 전사활성은 전염증성 세포부착분자 뿐만 아니라 gelatinase라 불리는 matrix metalloproteinase (MMP)-9 발현도 조절한다고 알려져 있다. MMP-9은 단핵구를 포함한 면역세포의 이동, 혈관외 유출, 침윤에 중요한 역할을 한다. 세포에 톱니모자반 주정추출물을 1시간 처리한 후 10 ng/ml의 TNF-α가 함유된 배지를 처리하여 24시간 후 세포내 단백질을 웨스턴 블럿을 통해 관찰하였다.

그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 톱니모자반 주정추출물은 TNF-α에 의한 MMP-9 단백질의 발현을 억제하는 것으로 확인되었고, 따라서 톱니모자반 주정추출물은 단핵구와 같은 세포들의 이동 및 침윤을 억제할 수 있어, 심혈관 질환을 예방 또는 치료할 수 있음을 알 수 있었다.

< 실시예 2>

톱니모자반 추출물로부터 심혈관 질환 치료효과를 갖는 화합물들의 분리

상기 본 발명의 방법으로 수득한 톱니모자반 주정추출물을 대상으로 다음과 같은 방법에 따라 사가하이드로퀴노익산, 사가크로멘올 및 사가퀴노익산의 화합물을 분리하였다.

<2-1> Sargahydroquinoic acid 의 분리

톱니모자반 주정추출물을 100 g을 물:에탄올 (9:1, v/v)의 혼합용매 1 리터에 녹인 후 분액깔때기에 넣고 동량의 n-hexane을 넣어 평형화시킨 후 위층의 n-hexane 가용부를 모아 무수황산나트륨으로 탈수한 다음 농축하여 n-hexane 분획물을 분리하였다. 분리된 n-hexane 분획물 12.2g을 120 mL methanol에 녹여 membrane filter로 여과 후 200 uL을 주입하여 Phenomenex C18(2) (15μm, 21.2 mm × 250 mm) 칼럼이 장착된 HPLC로 4개의 획분으로 분리하였다. 크로마토그래피의 이동상으로는 메탄올 (A)과 물 (B)의 혼합용매를 사용하였으며 유속은 7 mL로 설정하였다. 크로마토그래피 조건은 처음 A/B(90/10) ∼ A/B(94/6) 농도로 33분간, A/B(94/6) ∼ A/B(100/0) 농도로 2 분간, A/B(100/0)로 10 분간 씻어준 후에 A/B(90:10) 농도로 10분간 칼럼을 평형화하였다. 크로마토그래피는 Autosampler로 자동으로 시료를 주입하는 방식으로 50회 실시하여 대량의 1번 분획물의 1차 획분을 얻었다. 대량으로 얻은 1차 획분의 순도를 높이기 위하여 동일한 기기와 칼럼을 사용하였다. 크로마토그래피 조건은 처음 A/B(85/15) ∼ A/B(87/13) 농도로 26분간, A/B(87/13) ∼ A/B(100/0) 농도로 2 분간, A/B(100/0)로 6 분간 씻어준 후에 A/B(87:13) 농도로 10분간 칼럼을 평형화하였다. 크로마토그래피는 Autosampler로 자동으로 시료를 주입하는 방식으로 실시하여 보다 순도가 높은 1번 분획물의 2차 획분을 얻었다.

이후 1번 분획물의 2차 획분 중 1번을 동일한 조건으로 재크로마토그래피하여 정제하였으며 (523 mg), 분석용칼럼 (Phenomenex C18(2), 3 μm, 3 mm × 150 mm)으로 분석한 결과 단일물질로 판명되었으며, 이를 1H-NMR 및 13C-NMR로 분석한 결과 아래와 같은 결과를 얻었고 sargahydroquinoic acid로 판명되었다.

1H-NMR (CD3OD, 400 MHz); 3.25 (2H, d, J=7.4 Hz, H-1), 5.29 (1H, dt, J=7.3 & 1.4 Hz, H-2), 2.08 (2H, m, H-4), 2.12 (2H, m, H-5), 5.14 (1H, t, J=7.0 Hz, H-6), 2.08 (2H, m, H-8), 2.50 (2H, dt, J=7.0 & 7.0, H-9), 5.83 (1H, t, J=7.3 Hz, H-10), 2.21 (2H, t, J=7.7 Hz, H-12), 2.12 (2H, m, H-13), 5.07 (1H, tt, J=7.3 & 1.4 Hz, H-14), 1.65 (3H, s, CH3-16), 1.56 (3H, s, CH3-17), 1.59 (3H, s, CH3-19), 1.70 (3H, s, H-20), 6.38 (2H, brs, H-3’ & H-5’), 2.14 (3H, s, Aromatic-CH3).

13C-NMR (CD3OD, 100 MHz); 29.6 (C-1), 124.1 (C-2), 136.8 (C-3), 40.9 (C-4), 27.6 (C-5), 125.96 (C-6), 135.5 (C-7), 40.3 (C-8), 28.9 (C-9), 142.7 (C-10), 132.9 (C-11), 36.0 (C-12), 29.0 (C-13), 124.8 (C-14), 133.3 (C-15), 25.9 (C-16), 17.8 (C-17), 171.7 (C-18), 15.96 (C-19), 16.2 (C-20), 146.5 (C-1’), 131.3 (C-2’), 114.5 (C-3’), 151.4 (C-4’), 115.7 (C-5’), 127.5 (C-6’), 16.9 (Aromatic-CH3)

<2-2> Sargachromenol 의 분리

상기 <2-1>에서 수득한 분획물 중 2번 분획물을 1번 분획물과 동일한 HPLC 장치와 칼럼을 사용하여 재크로마토그래피하였다. 크로마토그래피 조건은 처음 A/B(91.5/8.5) ∼ A/B(92.2/7.8) 농도로 26분간, A/B(92.2/7.8) ∼ A/B(100/0) 농도로 2 분간, A/B(100/0)로 6 분간 씻어준 후에 A/B(91.5:8.5) 농도로 10분간 칼럼을 평형화하였다. 크로마토그래피는 Autosampler로 자동으로 시료를 주입하는 방식으로 50회 실시하여 대량의 2번 분획물의 2차 획분을 얻었다. 2번 분획물은 3개의 피크를 나타내었으며, 이중 2번 피크 (Frc2-2)를 다시 정제하여 크로마토그램을 얻었으며(126 mg), 분리물을 1H-NMR 및 13C-NMR로 분석한 결과 sargachromenol로 판명되었다.

1H-NMR (CD3OD, 400 MHz); 5.60 (1H, d, J=9.9 Hz, H-3), 6.29 (1H, d, J=9.9 Hz, H-4), 6.27 (1H, d, J=2.5 Hz, H-5), 6.42 (1H, d, J=2.5 Hz, H-7), 1.65 (2H, m, H-1’), 2.10 (2H, m, H-2’), 5.14 (1H, t, J=6.9 Hz, H-3’), 2.05 (2H, t, J=7.5 Hz, H-5’), 2.50 (2H, dt, J=7.0 & 7.52 Hz, H-6’), 5.82 (1H, t, J=7.0 Hz, H-7’), 2.21 (2H, t, J=6.9 Hz, H-9’), 2.10 (2H, m, H-10’), 5.08 (1H, t, J=6.9 Hz, H-11’), 1.66 (3H, s, H-13’), 1.56 (6H, brs, H-14’ & H-16’), 1.32 (3H, s, H-17’), 2.11 (3H, s, Aromatic-CH3)

13C-NMR (CD3OD, 100 MHz); 78.8 (C-2), 131.5 (C-3), 124.3 (C-4), 122.6 (C-4a), 111.3 (C-5), 151.3 (C-6), 118.0 (C-7), 126.6 (C-8), 145.3 (C-8a), 41.9 (C-1’), 23.7 (C-2’), 124.8 (C-3’), 135.5 (C-4’), 40.27 (C-5’), 29.0 (C-6’), 142.5 (C-7’), 132.9 (C-8’), 36.0 (C-9’), 28.9 (C-10’), 124.2 (C-11’), 133.5 (C-12’), 25.9 (C-13’), 17.8 (C-14’), 171.7 (C-15’), 15.7 (C-16’), 26.3 (C-17), 15.8 (C-18’)

<2-3> Sargaquinoic acid 의 분리

상기 <2-1>에서 수득한 분획물 중 3번 분획물을 1번 분획물과 동일한 HPLC 장치와 칼럼을 사용하여 재크로마토그래피하였다. 크로마토그래피 조건은 처음 A/B(93.4/6.6) ∼ A/B(93.8/6.2) 농도로 20분간, A/B(93.8/6.2) ∼ A/B(100/0) 농도로 2 분간, A/B(100/0)로 6 분간 씻어준 후에 A/B(93.8/6.2) 농도로 10분간 칼럼을 평형화하였다. 크로마토그래피는 Autosampler로 자동으로 시료를 주입하는 방식으로 50회 실시하여 대량의 3번 분획물의 2차 획분을 얻었다. 3번 분획물은 4개의 피크를 나타내었으며, 이중 4번 피크 (Frc3-4)를 다시 정제하여 크로마토그램을 얻었고(171 mg), 분리물을 1H-NMR 및 13C-NMR로 분석한 결과 sargaquinoic acid로 판명되었다.

1H-NMR (CD3OD, 400 MHz); 3.12 (2H, d, J=6.9 Hz, H-1), 5.17 (1H, t, J=7.4 Hz, H-2), 2.08 (2H, m, H-4), 2.09 (2H, m, H-5), 5.10 (1H, m, H-6), 2.09 (2H, m, H-8), 2.59 (2H, dt, J=7.2 & 7.2, H-9), 5.84 (1H, t, J=7.3 Hz, H-10), 2.19 (2H, t, J=7.2 Hz, H-12), 2.12 (2H, m, H-13), 5.06 (1H, tt, J=7.3 & 1.4 Hz, H-14), 1.65 (3H, s, CH3-16), 1.58 (3H, s, CH3-17), 1.60 (3H, s, CH3-19), 1.62 (3H, s, H-20), 6.42 (1H, m, H-3’), 6.56 (1H, quin, J=1.4 Hz, H-5’), 2.12 (3H, d, J=1.5 Hz, Aromatic-CH3)

13C-NMR (CD3OD, 100 MHz); 28.5 (C-1), 120.1 (C-2), 140.4 (C-3), 40.7 (C-4), 27.3 (C-5), 125.7 (C-6), 135.8 (C-7), 40.3 (C-8), 29.0 (C-9), 142.6 (C-10), 132.9 (C-11), 36.1 (C-12), 28.9 (C-13), 124.8 (C-14), 133.4 (C-15), 25.9 (C-16), 17.8 (C-17), 171.6 (C-18), 15.97 (C-19), 16.0 (C-20), 189.4 (C-1’), 150.0 (C-2’), 133.0 (C-3’), 188.9 (C-4’), 133.96 (C-5’), 147.6 (C-6’), 16.1 (Aromatic-CH3)

< 실험예 10>

sargachromenol 및 sargaquinoic acid 의 세포독성 효과

실시예 2에서 수득한 sargachromenol과 sargaquinoic acid 화합물을 혈관 내피세포인 HUVEC에 처리하고 세포에 독성을 미치는지의 여부를 분석하였다. 이를 위해 HUVEC (5 × 10³ cells/well)를 EGM-2(endotherial cell growth media-2) 배지에서 배양한 후, sargachromenol과 sargaquinoic acid을 처리하고 1시간 배양한 후 TNF-α (10 ng/ml)을 처리하여 24시간 배양하였다. 96 well plate에 배지 100㎕와 MTS 용액 5㎕를 넣고 1시간 정도 반응시킨 후 microplate reader를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정치는 3회 반복 실험의 평균값으로 하여 분석하였다.

그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, HUVEC에 대한 sargachromenol의 세포 독성은 60 μM의 농도까지 나타나지 않았으며, sargaquinoic acid의 세포 독성은 30 μM의 농도까지 나타나지 않았다. 따라서 톱니모자반의 추출물들과 같이 이들 화합물들 역시 세포에 특별히 독성을 유발하지 않는 안전한 화합물들임을 알 수 있었다.

< 실험예 11>

sargachromenol 과 sargaquinoic acid 의 ICAM -1과 VCAM -1의 단백질 생성 억제효과

TNF-α는 전신염증과 면역반응에 중요한 역할을 하는 잘 알려진 염증매개 사이토카인으로, 내피세포의 부착인자(CAMs)인 intracellular adhesion molecule-1 (ICAM-1)와 vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1)의 발현을 증가시킨다. 이러한 세포부착분자는 단핵구의 부착을 중개하여 손상된 내피세포에 다량의 단핵구와 림프구가 조직 내로 침투해 들어가도록 하여 여러 혈관염증을 진행시킨다.

이에 본 발명자들은 HUVCE 세포에 sargachromenol과 sargaquinoic acid를 1시간 처리한 후 10 ng/ml의 TNF-α가 함유된 배지를 처리하여 6시간 후 세포내 단백질을 Western blot을 통하여 관찰하였다.

그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, sargachromenol과 sargaquinoic acid는 TNF-α에 의한 ICAM-1과 VCAM-1 단백질의 발현을 농도 의존적으로 감소시키는 것으로 나타났고, 또한 TNF-α로 유도된 HUVEC 세포표면의 ICAM-1과 VCAM-1의 발현에 대한 sargachromenol과 sargaquinoic acid의 효과를 cell based ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)를 통해서 분석하였는데, 그 결과, 세포표면의 ICAM-1과 VCAM-1의 발현양 역시 sargachromenol과 sargaquinoic acid의 농도 의존적으로 감소하는 것으로 나타났다(도 14 참조).

< 실험예 12>

sargachromenol 과 sargaquinoic acid 의 ICAM -1과 VCAM -1의 mRNA 발현 억제효과

앞서 실험을 통해 sargachromenol과 sargaquinoic acid가 TNF-α에 의한 ICAM-1과 VCAM-1의 단백질 발현을 억제하는 것으로 확인되었기 때문에 이들의 mRNA 발현에 대한 sargachromenol과 sargaquinoic acid의 효과를 확인하기 위하여 RT-PCR (reverse-transcriptase PCR)을 통해 분석하였다.

그 결과, 이들 화합물들 모두 ICAM-1과 VCAM-1를 mRNA 발현 수준에서도 억제하는 것으로 나타났다(도 15 참조).

< 실험예 13>

sargachromenol 과 sargaquinoic acid 의 항산화효소인 HO -1의 단백질 및 mRNA 발현 유도효과

Heme oxygenase 1 (HO-1)은 HSP32라고도 부르며, 유독한 Heme을 철 이온, 일산화탄소, 그리고 biliverdin을 거쳐 bilirubin으로 분해하는 항산화효소이다. 현재까지 HO-1와 그 생성물들이 redox-sensitive Nf-κB 활성 경로에 중요한 역할을 하는 세포내 reactive oxygen species (ROS) 축적을 억제하므로써 강력하게 백혈구, 특히 단핵구의 부착을 억제하여 내피세포의 활성을 조절하는 역할이 알려져있다. sargachromenol과 sargaquinoic acid의 항염증 기전이 HO-1을 통해서 일어나는지를 확인하기 위하여 HUVEC에 sargachromenol과 sargaquinoic acid를 1시간 동안 전처리 후 TNF-α를 처리하여 6 시간 배양 또는 sargachromenol과 sargaquinoic acid만을 6시간동안 배양한 다음 세포내 단백질을 추출하여 웨스턴블럿으로 HO-1 단백질의 발현 변화를 분석하였다. 또한 HO-1의 TNF-α 존재하의 유도가 전사단계에서 일어나는지를 확인하기 위하여 세포내 RNA를 분리하여 RT-PCR로 HO-1 유전자의 발현정도를 분석하였다.

그 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이, sargachromenol과 sargaquinoic acid는 TNF-α 존재 하에서 HO-1 단백질과 mRNA 발현을 유도하는 것으로 확인되었고, TNF-α 비존재하에서도 HO-1 단백질 발현을 증가시키는 것으로 나타났다. 따라서 sargachromenol과 sargaquinoic acid은 HO-1의 발현을 유도하여 항산화와 항염증 효과를 나타내고 혈관내피세포의 염증을 억제하여 궁극적으로 심혈관 질환을 예방 및 치료할 수 있음을 알 수 있었다.

< 실험예 14>

sargachromenol 과 sargaquinoic acid 의 ROS 생성 억제 효과

혈관내피세포에서 TNF-α에 의해 염증 반응이 일어나면 여러 기전을 통하여 활성 산소종인 Reactive oxygen species (ROS)가 생성된다. 이러한 ROS는 혈관에 산화적 스트레스를 주는 주요한 인자이다. sargachromenol과 sargaquinoic acid를 1시간 전처리하고 TNF-α자극하여 DCFH-DA로 ROS 생성량을 분석하였다.

그 결과, sargachromenol과 sargaquinoic acid의 처리로 인해 ROS 생성이 효과적으로 억제되는 것으로 나타났다(도 17 참조).

< 실험예 15>

TNF -α에 의한 전구염증성 사이토카인의 생성에 대한 sargaquinoic acid 의 영향

혈관내피세포에서 TNF-α에 의해 염증 반응이 일어나면 여러 기전을 통하여 interleukin-8 (IL-8), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) 등 염증 관련 cytokine이 발현되며 이는 염증 반응에 대한 판단 지표가 된다. sargaquinoic acid를 1시간 동안 전처리 후 TNF-α를 처리하여 6 시간 배양 후 IL-8와 MCP-1의 mRNA 발현양을 RT-PCR로 분석하였다.

그 결과, TNF-α에 의해 다량 발현된 IL-8 및 MCP-1는 sargaquinoic acid에 의하여 농도 의존적으로 억제되는 것이 확인되었다(도 18 참조). 이러한 결과는 sargaquinoic acid가 TNF-α에 의해 발생되는 염증반응을 억제하여 염증 매개인자인 염증성 cytokine의 발생을 효과적으로 억제시킨다는 것을 의미한다.

< 실험예 16>

sargachromenol 과 sargaquinoic acid 의 NF -κB 전사인자 핵이동 억제 효과

ICAM-1과 VCAM-1의 전사는 NF-κB를 포함한 다양한 전사 인자들에 의해 조절되는 것으로 알려져 있다. NF-κB는 일반적인 상태에서는 inhibitory of κB-α (IκB-α)와 함께 결합하여 세포질에 불활성화 상태로 존재한다. 하지만 세포외 자극이나 내적인 자극에 의해 여러 기전을 통하여 IκB-α가 인산화되어 ubiquitin에 의해 분해되며 유리형의 NF-κB (p65)는 핵으로 이동하여 cytokine, cytokine receptor, cell adhesion molecule, growth factor 등의 발현에 관여하는 유전자의 promoter나 enhancer의 κB site에 결합함으로써 전사를 유도한다. 따라서 TNF-α로 유도된 HUVEC에서 sargachromenol과 sargaquinoic acid에 의한 IκB-α의 인산화와 NF-κB의 핵이동 억제효과를 Western blot으로 관찰하였다. sargachromenol과 sargaquinoic acid를 HUVEC에 1 시간 동안 처리한 후 TNF-α로 30분간 자극한 후 세포를 수거하여 세포질 단백질과 핵 단백질을 분리하였다. 분리된 각각의 단백질을 Western blotting으로 분석하여 세포질에서 pIKKβ와 IκB-α 발현 정도를 분석하였다.

그 결과, TNF-α만을 세포에 처리할 경우 세포질에서 IKKβ가 인산화됨으로써 NF-κB를 억제하는 하위인자인 IκB-α가 인산화되어 분해되었다. 그러나 이러한 영향은 sargachromenol과 sargaquinoic acid를 처리하므로써 억제되었고 (도 19), 핵에서 TNF-α에 의해 증가하는 NF-κB는 sargachromenol과 sargaquinoic acid 처리에 의하여 다시 감소하고 있음을 확인하였다(도 20). 이러한 결과는 sargachromenol과 sargaquinoic acid가 TNF-α에 의한 IκB-α의 인산화 및 분해를 억제하여 NF-κB의 유리화를 감소시킴으로써 NF-κB가 핵으로 이동하여 전사인자로써 작용하는 것을 차단한다는 것을 의미한다.

또한, sargachromenol과 sargaquinoic acid가 NF-κB가 핵으로 이동하는 것에 대한 영향을 확인하기 위하여 HUVEC에 sargachromenol과 sargaquinoic acid을 1시간 처리한 후 다시 TNF-α (10 ng/ml)을 처리하여 배양한 후, immunostain하여 confocal 현미경으로 관찰하였다. 그 결과 sargachromenol과 sargaquinoic acid가 TNF-α 에 의한 NF-kB의 핵이동 현상을 현저히 억제시키는 것으로 나타났다 (도 21 참조)

< 실험예 17>

sargaquinoic acid 의 Nrf -2 전사인자 핵이동 유도 효과

Nrf-2는 HO-1 등의 제독화 효소의 발현을 조절하는 전사인자로 잘 알려져 있다. 본 연구결과 sargaquinoic acid가 HO-1의 발현을 전사단계에서 조절하였기 때문에 HO-1의 전사를 조절하는 Nrf-2의 활성화를 분석하여 그 기전을 확인하고자 하였다. HUVEC에 sargaquinoic acid 30 μM을 1, 3, 6 시간 처리하였다. 그 후 핵과 세포질을 분리하여 각각의 단백질을 Western blot을 통하여 분석하였다. 실험결과 sargaquinoic acid은 세포질의 Nrf-2 발현을 감소시키고 핵의 Nrf-2 발현을 증가시키는 것으로 나타났다 (도 22). 또한, sargaquinoic acid가 Nrf-2가 핵으로 이동하는 것에 영향을 주는지 확인하기 위하여 HUVEC에 sargaquinoic acid 30 μM을 6시간 처리하여 배양한 후, immunostain하여 confocal 현미경으로 관찰하였다. 그 결과 sargaquinoic acid가 Nrf-2 핵이동 현상을 유도 시키는 것으로 나타났다 (도 23). 또한 sargaquinoic acid에 의한 Nrf-2의 전사활성을 확증하기 위하여 HUVEC을 Nrf-2 promoter/luciferase DNA (2 μg)를 40 ng control pRL-TK DNA와 같이 40 시간 동안 형질전환시킨 후 각기 다른 농도의 sargaquinoic acid로 6시간 동안 자극시켰다. 그 후 세포를 수거한 후 luciferase kit로 luciferase 활성을 분석하였다. 그 결과 농도 의존적으로 sargaquinoic acid에 의하여 luciferase 활성이 증가함을 알 수 있었다 (도 24).

이러한 결과는 sargaquinoic acid가 Nrf-2의 핵이동을 증가시킨다는 것을 의미하며, 따라서 sargaquinoic acid가 Nrf-2 전사인자의 활성화를 통하여 HO-1의 발현을 조절하는 것으로 나타났다.

< 실험예 18>

TNF -α에 의한 단핵구 부착 증가에 대한 sargachromenol 과 sargaquinoic acid의 효과

단핵구의 내피세포로의 부착은 혈관염증을 가중시킨다. 이러한 부착은 ICAM-1과 VCAM-1과 같은 부착분자들에 의해서 매개되는데, sargachromenol과 sargaquinoic acid가 이러한 부착분자들의 발현을 감소시키므로 sargachromenol과 sargaquinoic acid가 단핵구인 THP-1 세포가 HUVEC으로의 부착을 억제할 수 있는지를 분석하였다. 이를 확인하기 위하여 HUVEC에 1시간 동안 sargachromenol과 sargaquinoic acid을 전 처리한 후 TNF-α로 6시간 유도하고, BCECF-AM (2',7'-Bis-(2-Carboxyethyl)-5-(and-6)- Carboxyfluorescein, Acetoxymethyl Ester)로 label된 THP-1을 HUVEC과 함께 1시간 동안 동시배양 시킨 후 비접착성 THP-1은 PBS로 washing하고, 접착성 THP-1은 형광현미경으로 관찰한다. 또한 값으로 나타내기 위해 cell을 lysis하여 형광강도를 spectrofluometer 분석하였다.

그 결과 sargachromenol과 sargaquinoic acid 농도 의존적으로 THP-1 부착이 감소함을 나타내었다(도 25). 이는 sargachromenol과 sargaquinoic acid가 도 13, 14, 및 15에 나타난 바와 같이 ICAM-1과 VCAM-1과 같은 부착인자들을 억제함으로써 단핵구의 내피세포와의 접합을 억제시켰으며, 단핵구가 혈관내피로 이동하는 것을 억제하여 혈관염증을 억제할 수 있음을 나타낸다.

< 실험예 19>

sargachromenol 과 sargaquinoic acid 에 의한 MMP -9의 단백질 발현 억제효과

NF-κB의 전사활성은 전염증성 세포부착분자 뿐만 아니라 gelatinase라 불리는 matrix metalloproteinase (MMP)-9 발현도 조절한다고 알려져 있다. MMP-9은 단핵구를 포함한 면역세포의 이동, 혈관외 유출, 침윤에 중요한 역할을 한다. 세포에 sargachromenol과 sargaquinoic acid를 1시간 처리한 후 10 ng/ml의 TNF-α가 함유된 배지를 처리하여 24시간 후 세포내 단백질을 Western blot을 통하여 관찰하였다.

그 결과, 도 26에서 HUVCE에서 MMP-9의 단백질발현에 대한 sargachromenol과 sargaquinoic acid의 효과를 나타내었는데, sargachromenol과 sargaquinoic acid는 TNF-α에 의한 MMP-9 단백질의 발현을 억제하는 것으로 확인되었다. 따라서 sargachromenol과 sargaquinoic acid는 단핵구와 같은 세포들의 이동, 침윤을 억제할 수 있음을 나타낸다.

< 실험예 20>

다양한 모자반 추출물을 대상으로 한 심혈관 질환 치료 효능 분석

나아가 본 발명자들은 본 발명의 톱니모자반 추출물의 심혈관 질환 치료효능을 비교분석하기 위해 다른 종류의 모자반들을 대상으로 다음과 같은 실험을 수행하였다. 즉, 애기외톨개모자반, 큰열매모자반, 엔도모자반, 큰잎모자반, 톱니모자반을 대상으로 주정 추출물을 수득하고, 이들 추출물에 대해 앞서 실험예 11에서 사용한 실험 중, ICAM-1과 VCAM-1의 단백질 발현 억제 효능을 분석하였다.

분석 결과, 하기 표에 기재된 바와 같이, 다른 종류의 모자반에 비해 톱니모자반 추출물이 월등히 ICAM-1과 VCAM-1의 단백질 생성억제 정도가 우수하여 심혈관 치료 효능이 더 우수한 것을 알 수 있었다.

모자반종류	ICAM-1(발현정도)	VCAM-1(발현정도)
애기외톨개모자반	6.6±1.0	126±6.4
큰열매모자반	14.3±1.9	229 ±12.5
엔도모자반	9.0±1.4	125 ±8.7
큰잎모자반	18.1±2.2	210±7.8
톱니모자반	10.5 ±1.5	2.2±0.12
Sargahydroquinoic acid	2±0.4	0.5 ±0.03
Sargachromenol	0.5±0.1	2.4±0.15
Sargaquinoic acid	0.8±0.2	1.0±0.06

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (14)

1. 톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
   상기 심혈관질환은 고혈압, 뇌졸중, 협심증, 심부전, 심근경색, 죽상동맥경화 및 허혈성 심장질환으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 톱니모자반 추출물은 물 또는 유기용매를 이용하여 수득한 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제2항에 있어서,
   상기 유기용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 아세톤, 에테르, 벤젠, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 헥산 및 시클로헥산으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 추출물에는 사카크로멘올, 사가퀴노익산 또는 사가하이드로퀴노익산 화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 삭제
6. 톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환의 예방 또는 개선용 기능성 건강식품으로서,
   상기 심혈관질환은 고혈압, 뇌졸중, 협심증, 심부전, 심근경색, 죽상동맥경화 및 허혈성 심장질환으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 기능성 건강식품.
   
7. 제6항에 있어서,
   상기 톱니모자반 추출물은 물 또는 유기용매를 이용하여 수득한 추출물인 것을 특징으로 하는 기능성 건강식품.
8. 제7항에 있어서,
   상기 유기용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 아세톤, 에테르, 벤젠, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 헥산 및 시클로헥산으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 기능성 건강식품.
9. 제8항에 있어서,
   사카크로멘올, 사가퀴노익산 또는 사가하이드로퀴노익산 화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 기능성 건강식품.
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