KR102197878B1

KR102197878B1 - 혈액순환 및 고혈압에 대한 개선효과를 가지는 바자카 수액 및 뿌리 추출물을 함유하는 조성물

Info

Publication number: KR102197878B1
Application number: KR1020200077706A
Authority: KR
Inventors: 이주형
Original assignee: 이주형
Priority date: 2020-06-25
Filing date: 2020-06-25
Publication date: 2021-01-04

Abstract

본 발명은 건조된 바자카 뿌리(Acai berry)를 주정으로 12 내지 30℃에서 추출한 뿌리 추출물 및 바자카 수액을 1:1로 혼합한 혼합물을 포함하여, 지질 과산화 억제, DNA 손상에 대한 항산화, ACE(Angiotensin Converting Enzyme) 효소 저해활성, nitric oxide(NO)의 생성 억제 효과를 나타내고, NOS-1(Nitric oxide synthase-1), SOD-2(Superoxide dismutase-2) 및 SOD-3(Superoxide dismutase-3) 단백질 발현의 증가, Nrf-2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2)의 발현 증가 및 NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)전사인자의 활성의 감소 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 혈액순환 및 고혈압에 대한 개선효과를 가지는 조성물을 제공한다.

Description

혈액순환 및 고혈압에 대한 개선효과를 가지는 바자카 수액 및 뿌리 추출물을 함유하는 조성물{Composition comprising Bajakah sap and Bajakah root extracts for improving Hypertension and blood circulation}

본 발명은 혈액순환 및 고혈압에 개선효과를 가지는 바자카 수액 및 뿌리 추출물을 함유하는 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 바자카 수액 및 뿌리 추출물의 ACE(Angiotensin I Converting Enzyme) 효소와 NO(Nitric oxide) 생성에 관한 효과를 기초로 혈액순환 및 고혈압에 대한 개선 효과를 가지는 혈액순환 및 고혈압에 대한 개선효과를 가지는 바자카 수액 및 뿌리 추출물 함유하는 조성물 및 그 제조방법을 제공한다.

최근에 생명공학 기술의 발달과 더불어 다양한 천연물로부터 유래한 생리활성 물질이 질병의 예방 및 신체 건강에 도움을 줄 수 있다는 증거가 생화학시험 및 임상시험에서 누적되고 있다.

특히 식물로부터 유래한 기능성 성분이 혈액 순환장애, 고혈압, 고지혈증, 동맥경화, 뇌졸중, 중풍, 심장질환 등과 같은 여러 병리학적 질환의 신호전달에 영향을 주는 것으로 밝혀져 있다.

신체 내에서 nitric oxide(NO)는 두 가지 측면으로 작용하는데 긍정적인 측면에서는 세포 내 신호전달 및 면역계에 중요한 역할을 담당하나, 과량 생성될 경우 세포 손상 및 염증을 비롯한 뇌막염, 알츠하이머, 파킨슨병과 같은 퇴행성 질환의 원인이 되기도 한다.

혈압의 조절에 매우 중요한 역할을 하는 rennin-angiotensin system은 고혈압이 발생되는 기전인데, ACE(Angiotensin I Converting Enzyme)는 angiotensin I에서 angiotensin II를 합성하는 마지막 단계에 관여하는 효소이다. Angiotensin II는 A-II수용체와 결합하여 동맥과 소동맥을 수축시키고 부신피질을 흥분시켜 알도스테론의 유리를 촉진시켜 결과적으로 혈압의 증가를 가져온다. 따라서 ACE 저해 물질은 ACE의 활성을 억제함으로써 고혈압을 직접적으로 억제할 수 있다.

그러나 이와 관련된 종래의 기술을 보면, 이미 알려진 고혈압치료제는 주성분이 합성약물인 것이 대부분이어서 상기 합성 약물의 사용에 의한 부작용을 피하기 어렵다는 단점이 있다. 따라서 부작용 없이 혈액순환의 개선 내지 고혈압의 개선 효과를 나타내기 위해서 ACE(Angiotensin I Converting Enzyme)의 저해활성을 가진 천연 추출물에 대한 개발이 시급한 실정이다

1. 대한민국 특허공개 제10-2004-0072193호 2. 대한민국 특허공개 제10-2020-0029099호

상기 문제를 해결하고자 본 발명자는 다양한 연구 끝에 항암제로 사용되고 있는 칼리만탄에서 자라는 바자카의 수액 및 뿌리 추출물이 지질 과산화 억제, DNA 손상에 대한 항산화, ACE(Angiotensin Converting Enzyme) 효소 저해 활성, nitric oxide(NO)의 생성 억제 효과를 나타내고, NOS-1(Nitric oxide synthase-1), SOD-2(Superoxide dismutase-2) 및 SOD-3(Superoxide dismutase-3) 단백질 발현의 증가, Nrf2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2)의 발현 증가 및 NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)전사인자의 활성의 감소 효과를 나타냄으로써 혈액순환 및 고혈압에 대한 개선효과를 가질 수 있음을 밝혀내어 본 발명이 완성한 것이다.

따라서 본 발명의 목적은 혈액순환 및 고혈압에 대한 개선효과를 가지는 조성물의 제공과 이에 대한 제조방법이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은

건조된 바자카 뿌리(Acai berry)를 주정으로 12 내지 30℃에서 추출한 뿌리 추출물 및 바자카 수액을 1:1로 혼합한 혼합물을 포함하여, 지질 과산화 억제, DNA 손상에 대한 항산화, ACE(Angiotensin Converting Enzyme) 효소 저해활성, nitric oxide(NO)의 생성 억제 효과를 나타내고, NOS-1(Nitric oxide synthase-1), SOD-2(Superoxide dismutase-2) 및 SOD-3(Superoxide dismutase-3) 단백질 발현의 증가, Nrf-2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2)의 발현 증가 및 NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)전사인자의 활성의 감소 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 혈액순환 및 고혈압에 대한 개선효과를 가지는 조성물을 제공한다.

삭제

본 발명에 따른 혈액순환 및 고혈압에 대한 개선효과를 가지는 바자카 수액 및 뿌리 추출물에 의하는 경우 지질 과산화 억제, DNA 손상에 대한 항산화, ACE(Angiotensin Converting Enzyme) 효소 저해활성, nitric oxide(NO)의 생성 억제 효과를 나타내고, NOS-1(Nitric oxide synthase-1), SOD-2(Superoxide dismutase-2) 및 SOD3(Superoxide dismutase-3) 단백질 발현의 증가, Nrf-2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2)의 발현 증가 및 NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)전사인자의 활성의 감소 효과를 나타낼 수 있다.

따라서 본 발명에 의하는 경우 혈액순환 및 고혈압에 대한 개선효과를 가질 수 있다는 장점이 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 바자카 수액 및 뿌리 추출물의 항산화 효과에 관한 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 바자카 수액 및 뿌리 추출물의 항산화 효과에 관한 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 바자카 수액 및 뿌리 추출물의 DNA의 산화적 손상에 대한 억제효과에 관한 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 바자카 수액 및 뿌리 추출물의 세포독성 시험의 결과에 관한 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 바자카 수액 및 뿌리 추출물의 세포독성 시험의 결과에 관한 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 바자카 수액 및 뿌리 추출물의 Nitro oxide(NO) 생성 억제 효과에 관한 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 바자카 수액 및 뿌리 추출물의 Nitro oxide(NO) 생성 억제 효과에 관한 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 바자카 수액 및 뿌리 추출물의 ACE(Angiotensin Converting Enzyme) 효소 저해활성에 관한 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 바자카 수액 및 뿌리 추출물의 EA-HY-926 세포에서 항산화 효과 및 Nitro oxide(NO)와 관련된 단백질 발현에 관한 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 바자카 수액 및 뿌리 추출물의 EA-HY-926 세포에서 항산화 효과 및 Nitro oxide(NO)와 관련된 단백질 발현에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

생물이 호흡을 통해 얻은 산소가 에너지를 만드는 과정에서 일부는 물로 환원되지 않고 불안전한 환원이 일어나 활성산소가 된다. 특히, 자외선의 노출로 활성산소종인 유해 활성 산소종(Reactive Oxygen Species, 이하 ROS라한다)의 반응성이 많이 나타나는데, 생성된 라디칼로부터 유도된 광산화적 손상을 받게 되면 항산화 방어망이 위태롭게 되며, 상기 ROS에 의한 스트레스의 상승으로 노화 및 다양한 질병의 원인이 된다.

상기 바자카 수액 및 뿌리 추출물의 혼합물은 강력한 항산화 효과로 상기 ROS의 제거능이 뛰어난 특징을 가진다.

또한, 상기 바자카 수액 및 뿌리 추출물의 혼합물은 항산화 효과뿐만 아니라, ACE(Angiotensin Converting Enzyme) 효소 저해활성, nitric oxide(NO)의 생성 억제 효과를 나타내고, NOS-1(Nitric oxide synthase-1), SOD-2(Superoxide dismutase-2) 및 SOD-3(Superoxide dismutase-3) 단백질 발현의 증가, Nrf-2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2)의 발현 증가 및 NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)전사인자의 활성의 감소 효과를 나타내는 것을 특징으로 한다.

고혈압 역시 뇌졸중과 동맥경화의 원인이 되는 뇌혈관질환으로서 AngiotensinⅡ에 의해 유도된다. Angiotensin Ⅱ는 Renine에 의해 분해된 AngiotensineⅠ이 ACE(Angiotensin I Converting Enzyme)에 의해 전환되는 고혈압유발효소가 된다.

상기 AngiotensinⅡ은 동맥혈관을 수축시키고 혈관을 확장시키는 효소인 bradykinin을 분해함으로써 혈압을 상승시킨다.

그러나 상기 바자카 수액 및 뿌리 추출물의 혼합물에 의하는 경우 ACE(Angiotensin I Converting Enzyme)의 저해활성이 높아 angiotensin I이 angiotensin II로 합성되지 못하게 함으로써 체내의 혈압을 감소시킬 수 있다.

또한, 상기 바자카 수액 및 뿌리 추출물의 혼합물은 NOS-1(Nitric oxide synthase-1), SOD-2(Superoxide dismutase-2) 및 SOD3(Superoxide dismutase-3) 단백질 발현의 증가, Nrf-2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2)의 발현 증가 및 NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)전사인자의 활성을 감소시킨다. 따라서 혈전이 생기는 것을 억제하여 혈액 순환을 개선하고, 고혈압 발생의 예방 내지 개선효과를 가질 수 있다.

NO는 과다 생성되면, 활성산소(O2)와 결합하여, 과산화질소(ONOO)등의 또 다른 독성 유리기물질을 만들어내고, 이들은 거의 모든 체내기관에 해로운 영향을 미친다.

따라서 상기 바자카 수액 및 뿌리 추출물의 혼합물은 상기 NO에 대한 억제효과로 NO의 발현에 의한 신경세포의 손상을 방지할 수 있다. 특히. NO의 생산에 따른 동맥경화 등의 문제를 개선할 수 있다는 장점이 있다.

상기 혈액순환 및 고혈압에 대한 개선효과를 가지는 바자카 수액 및 뿌리 추출물의 혼합물은 상기 바자카 수액 및 뿌리 추출물이 0.0025 내지 0.01중량%로 포함되는 것일 수 있다.

상기 바자카 수액 및 뿌리 추출물의 혼합물이 0.0025중량% 미만으로 포함되는 경우 ACE(Angiotensin Converting Enzyme) 효소 저해 활성이 미미하고, nitric oxide(NO)의 생성 억제 효과가 크게 저하되며, NOS-1(Nitric oxide synthase-1), SOD-2(Superoxide dismutase-2) 및 SOD-3(Superoxide dismutase-3) 단백질 발현의 증가, Nrf-2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2)의 발현 증가 및 NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)전사인자의 활성의 감소 효과를 나타내기 어렵다. 또한, 0.01중량%를 초과하는 경우 세포독성의 증가로 부작용이 발생할 수 있다는 문제점이 있으므로, 0.01중량% 이하에서 사용하는 것이 안전할 수 있다.

따라서 상기 범위에 의하는 경우 상기 효과가 동시에 나타날 수 있고, 그 효과가 급격하게 우수하다는 장점을 가진다. 또한, 상기 범위에 의하는 경우 상기 효과에 따라 혈액순환의 개선 및 고혈압에 대한 개선효과를 실효적으로 나타낼 수 있고, 상기 바자카 수액 및 뿌리 추출물의 사용에 따른 부작용을 방지할 수 있다.

상기 혈액순환 및 고혈압에 대한 개선효과를 가지는 바자카 수액 및 뿌리 추출물의 혼합물에서 상기 뿌리 추출물은 상기 추출이 2 내지 5회 반복 추출된 것이고, 35 내지 65℃에서 농축된 것일 수 있다.

상기 바자카 수액 및 뿌리 추출물의 혼합물은 상대적으로 낮은 온도에서 추출하는바 2 내지 5회의 반복추출에 의하는 경우 유효성분을 최대한 많이 수득하면서 유성성분이 파괴되지 않고 온전히 유지될 수 있게 할 수 있다.

상기 농축과정에 있어 65℃를 초과하는 경우 유효성분이 파괴되는 문제가 있고, 35℃ 미만으로 농축하는 경우 감압 시 유효성분이 소실되는 문제가 있다.

상기 혈액순환 및 고혈압에 대한 개선효과를 가지는 바자카 수액 및 뿌리 추출물은 혈관 확장 효과를 가지는 것일 수 있다.

상기 바자카 수액 및 뿌리 추출물의 혼합물은 nitric oxide(NO)의 생성 억제 효과를 가지므로 혈관 확장 효과를 나타냄으로써 혈액 순환 개선에 직접적인 도움을 줄 수 있다.

상기 혈액순환 및 고혈압에 대한 개선효과를 가지는 바자카 수액 및 뿌리 추출물의 혼합물은 혈액순환 및 고혈압 개선용 식품 조성물로 제공될 수 있다.

상기 혈액순환 및 고혈압에 대한 개선효과를 가지는 바자카 수액 및 뿌리 추출물의 혼합물은 혈액순환 및 고혈압 개선을 위한 약학 조성물로 제공될 수 있다.

상기 약학 조성물의 경우 복용방법에 따라 상기 바자카 수액 및 뿌리 추출물의 혼합물 농도범위를 기초로 그 함량을 조절할 수 있고, 필요에 따라 다양한 제형으로 제조되는 것일 수 있다.

삭제

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

[ 제조예 : 실시예의 제조]

바자카 뿌리를 흐르는 물에 깨끗이 세척한 다음 자연건조 하였고, 상기 세척, 건조된 바자카 뿌리를 분쇄한 후에 주정을 1:10의 중량비로 혼합하여 24℃에서 2일 추출하였으며, 이를 3회 반복한 후에 추출액을 모아 50℃에서 감압농축하고 남아있는 여액에 바자카 수액을 1:1 중량비로 혼합한 후 동결건조하여 분말형태의 시험 대상물(이하 "BRE"라 함)을 얻었다. 상기 분말형태의 BRE를 하기의 표 1의 실시예의 농도로 희석하여 사용하였다.

한편, 세포배양을 위한 Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), Trypsin-EDTA, penicillin /streptomycin / amphotericin (각각 10,000 U/ml, 10,000 ㎍/㎖및 2,500 ㎍/㎖), fetal bovine serum (FBS) 시약은 Gibco BRL, Life Technologies (USA)로부터 구입하였다. RAW 264.7 과 EA-HY-926 cell line은 ATCC(American Type Culture Collection, USA)로부터 구입하였다. MTT reagent, gelatin, agarose와 기타 시약은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다.

	실시예 1	실시예 2	실시에 3	실시예 4	실시예 5	비교예
BRE 함량	0.000625	0.00125	0.0025	0.005	0.01	0

(단위: 중량%)

{시험방법}

[ 시험예 1: 환원력 assay]

Oyaizu(Schauss, A. G., Wu, X., Prior, R. L., Ou, B., Huang, D., Owens, J., Agarwal, A., Jensen, G. S., Hart, A. N., and Shanbrom, E. 2006. Antioxidant capacity and other bioactivities of the freeze-dried Amazonian palm, Euterpe oleraceae mart. J of Agri and Food Chem 54, 8604-8610.)의 방법에 따라 측정하였다. 시료 1ml에 pH 6.6의 200 mM 인산완충액 및 1%의 potassium ferricyanide를 각 1ml씩 차례로 가하여 교반한 후 50℃의 수욕상에서 20min 동안 반응시켰다. 여기에 10% TCA (trichloroacetic acid)용액을 1ml 가하여 13,500×g에서 15min 동안 원심분리하여 상등액 1ml에 증류수 및 ferrous chloride 각 1ml을 혼합한 후 700nm에서 흡광도를 측정하였다. 실시예 및 비교예의 환원력은 실시예와 비교예의 흡광도 비를 % 값으로 환산하였다. 양성 대조군으로는 0.001%의 vitamin C를 사용하였다.

[ 시험예 2: In vitro 지질과 산화에 대한 항산화 활성]

상기 실시예 1 내지 5를 linolenic acid emulsion과 혼합한 후에 0.8mM H₂O₂ 및 1.6mM FeSO₄를 혼합한 용액을 5hr 동안 반응 후 0.4% TBA를 첨가하고 95℃에서 2hr 반응시킨 다음 실온에서 10min 동안 반응시켰다. 그 다음 15:1 비율의 n-butanol : pyridine 용액을 500㎕ 첨가하고 1,000×g에서 10min 동안 원심분리한 후 상등액을 532nm에서 흡광도를 측정하여 지질 과산화 정도는 실시예 첨가 전후의 흡광도 비를 % 값으로 환산하여 나타내었다. 양성 대조군으로는 0.1 %의 vitamin E를 사용하였다.

[ 시험예 3: 세포배양]

RAW 264.7과 EA-HY-926 세포는 5% CO₂ 및 37℃에서 95% 이상의 습도를 유지한 배양기에서 5% fetal bovine serum, 2mM glutamine 과 100㎍/ml penicillin-streptomycin을 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였다.

[ 시험예 4: MTT assay]

Hansen (Heo, H., Choi, S., Choi, S. G., Shin, D. H., Lee, J., and Lee, C. 2008. Effects of Banana, Orange, and Apple on Oxidative Stress-Induced Neurotoxicity in PC12 Cells. J of Food Sci73, H28-H32.)의 방법에 따라 RAW 264.7 세포와 EA-HY-926 세포에 대한 실시예의 세포독성을 MTT (3-(4,5-dimethyl-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)를 이용하여 측정하였다.

[ 시험예 5: Nitrite 활성측정]

RAW 264.7 세포와 EA-HY-926 세포로부터 생성된 NO(Nitric Oxide) 라디칼의 양은 Griess 시약을 이용하여 세포 배양액 중에 존재하는 NO2-의 형태로서 측정하였다. RAW 264.7 세포와 EA-HY-926 세포를 DMEM 배지를 이용하여 1×10⁵ cell/well로 조절한 후 24 well plate에 접종하고 37℃, 5% CO₂의 습윤배양기에서 배양하였다. 세포에 실시예 1 내지 5를 전처리하고 1시간 후 1㎍/ml의 LPS를 처리하여 72시간 배양하였다. 세포배양 상등액과 동량의 Griess 시약을 혼합하여 96 well plate에서 10분 동안 반응시킨 후 540nm에서 흡광도를 측정하고 그 비를 % 값으로 환산하였다.

[ 시험예 6: ACE(Angiotensin I Converting Enzyme)저해활성측정]

ACE 활성은 0.3M NaOH을 포함한 0.1M 붕산나트륨 완충액(sodium borate buffer)(pH8.3)에 토끼 허파 조직으로부터 제조한 아세톤 분말(rabbit lung acetone powder(Sigma, USA))을 1g/10ml (w/v)의 농도로 4℃에서 2시간 동안 추출한 후, 원심분리(4℃, 4,000 rpm, 40 분)하여 ACE 조효소액을 얻었다. ACE 저해활성은 실시예 및 양성대조군 (0.1%의 captopril)에 각각 0.1M 붕산나트륨 완충액(pH 8.3) 100㎕와 ACE 조효소액 50㎕를 가한 다음, 37℃에서 5분 동안 예비 반응을 시킨 후, 0.3M NaOH이 포함된 0.1M 붕산나트륨 완충액(pH 8.3) 5ml에 hippuryl-histidyl-leucine(HHL) 25mg을 첨가하여 만든 기질 50㎕를 가하여 37℃에서 30분간 반응을 시켰다.

이에 1N HCl 250㎕를 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 아세트산에틸(ethyl acetate) 1.5ml를 가해 15초 동안 교반한 다음, 원심분리(3,000rpm, 5min, 4℃)하여 상등액 1ml을 얻었다. 이 상등액을 완전히 건조시켜 증류수 3ml를 넣어 교반한 후 분광광도계로 228nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성 대조군으로는 증류수 50㎕를 사용하였으며, 양성대조군으로는 captopril 0.1%를 사용하여 실시예와 그 활성을 비교하였다. ACE 효소활성은 시료첨가 전후의 흡광도 비를 % 값으로 환산하였다.

[ 시험예 7: DNA oxidation측정 ]

Genomic DNA는 약간 변형된 표준과정에 따라 EA-HY-926 세포로부터 추출하였다(Sambrook, J., and Russell, D.W. 2001 Molecular cloning: a laboratory manual: CSHL press.). Fenton 반응에 의하여 발생된 hydroxyl radical에 노출된 DNA 산화는 기존에 실험된 방법에 따라 수행되었다(Oyaizu, M. 1986. Studies on products of the browning reaction. Antioxidative activities of browning reaction products prepared from glucosamine. Jap J of Nut [Eiyogaku Zasshi]44, 307-315.).

먼저 100 ㎕의 DNA 용액에 실시예 1 내지 5, 200mM FeSO₄, 1mM H₂O₂ 및 50㎍/ml genomic DNA를 첨가하였다. 반응혼합물을 30분 동안 상온에서 반응시킨 후 10mM EDTA를 첨가하여 반응을 종결시켰다. 1㎍의 DNA를 포함하는 20㎕의 반응혼합물을 1% agarose gel에서 100V로 30분 동안 전기영동 하였다. Gel은 1mg/mlethidium bromide로 염색하여 물로 세척하여 UV로 LAS3000® image analyzer (Fujifilm Life Science, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다.

[ 시험예 8: Extraction of nuclear protein and Western blot analysis]

RAW 264.7 와 EA-HY-926 세포에 용출 완충 용액(50mM Tris-HCl, pH7.5, 0.4% Nonidet P-40, 120mM NaCl, 1.5mM MgCl₂, 2mM phenyl methyl sulfonyl fluoride, 3mM NaF과 1mM DTT)을 첨가하여 4℃에서 3 min 동안 처리하였다. 세포핵 단백질을 추출하기 위하여 세포에 실시예를 적절하게 처리한 후 제조업체의 지침에 따라 추출 kit(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)를 사용하여 핵단백질을 추출하였다. 10㎍의 세포 및 핵 용출액을 각각 10% Tris-HCl gel 에서 전기영동 후 단백질을 전기적으로 nitrocellulose membrane으로 전이시켰다.

그 다음 10% skim milk를 nitrocellulose membrane 에 전처리하고 목적 단백질에 대한 1차 항체 (anti-Nrf-2, anti-NF-kB, anti-NOS-1, anti-NOS-2, anti-SOD-1, anti-SOD-2, anti-SOD-3, anti-betaactin)를 처리한 다음 2차 항체를 처리 후, chemiluminescent ECL kit (Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 목적 단백질을 검출하였다. Western blot의 결과는 LAS 3000® image analyzer (Fujifilm Life Science, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다.

[통계처리]

각 실험은 3회 이상 반복실험을 통하여 그 결과를 얻어 각각의 실시예에 대해 평균 ± 표준편차로 나타내었다.

각 실시예에 대한 유의검정은 대조군과 비교하여 Students t test 한 후*P<0.05,**P<0.01, ***P<0.001 값을 통계적으로 유의성 있는 결과로 간주하였다.

2. 시험결과

(1) 실시예의 Reducing power와 Lipid peroxidation에 대한 항산화

환원력 결과인 도 1에서는 실시예에 의하는 경우 환원력이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 또한. 지질 과산화 억제효과를 알아본 도 2에서는 양성대조군으로 알려진 Vitamine E가 0.01% 에서 63%의 지질 과산화 억제효과를 보여주었으며, 실시예 3 내지 5 에서 대조군과 비교하여 유의적인 억제효과를 확인할 수 있었다.

(2) Hydroxyl radical에 의한 DNA damage에 대한 BRE의 보호 효과

EA-HY-926 세포로부터 분리한 genomic DNA를 이용하여 Fenton 반응에 의하여 발생된 hydroxyl radical에 의한 DNA의 산화적 손상에 대한 실시예의 항산화 효과를 조사하였다. 도 3에서 나타난 것과 같이 Fenton 반응에 의하여 발생된 hydroxyl radical이 실시예 3 내지 5에서 급격하게 증가하는 것이 확인되었다. 대조군(Control) 에서는 비교예에 비하여 도 3에서 DNA가 hydroxyl radical에 노출되면서 산화에 의해 DNA가 분해되는 것이 관찰되었다. 반면, 실시예 1 내지 5는 BRE가 hydroxyl radical에 의한 genomic DNA의 산화적 손상을 억제하였다.

(3) 세포성장에 대한 BRE의 효과

BRE가 세포독성에 미치는 농도를 조사하기 위하여 MTT assay를 수행하였다. RAW 264.7 와 EA-HY-926 세포에 대한 BRE의 세포독성을 측정한 도 4(PAW) 및 도 5(246.7)의 EA-HY-926 세포에서 보는 바와 같이 BRE 0.01% 이하의 농도에서 대조군과 비교하였을 때 어떠한 독성 효과도 없는 것으로 나타났다.

(4) Nitric oxide (NO) 생성에 대한 BRE의 효과

EA-HY-926 세포로부터 생성되는 NO와 LPS(Lipopolysaccharide)에 의해 RAW 264.7 세포에서 생성되는 NO에 대한 BRE의 억제효과를 세포배양액으로부터 Griess assay 방법으로 측정하였다. 실시예 1 내지 5를 세포에 처리하였다. 실시예 5를 처리한 세포군에서 NO의 생성함량은 비교예와 비교했을 때 약 40% 증가되었다. 도 6에서 나타난 것과 같이, BRE는 0.0025% 이상의 농도에서 혈관내피세포에서 농도에 따라 NO 생성을 증가시켰다. 도 7에서 보는 바와 같이 Acai berry EtOH 추출물을 처리한 group과 LPS를 처리한 세포군과 비교했을 때 실시예 3 내지 5에서 NO 생성이 급격하게 억제되는 것으로 나타났다.

(5) ACE ( Angiotensin I Converting Enzyme) 활성에 대한 BRE의 효과

혈관수축작용을 나타내는 angiotensin II를 생성하는 원인이 되는 ACE의 작용을 억제하는지 알아보기 위해 실험을 한 결과 도 8에서 보는 바와 같이 BRE의 사용으로 ACE의 활성이 억제되는 것을 알 수 있다.

또한, 양성대조군으로 사용된 항고혈압제인 captopril은 0.1% 에서 60%의 저해활성을 보였으며, BRE도 전반적으로 ACE의 활성을 억제시키며, 특히 실시예 3 내지 5는 ACE의 활성을 크게 억제시키는 것을 알 수 있다.

(6) EA - HY -926 세포에서 항산화 및 NO와 관련된 단백질의 발현에 대한 BRE의 효과

BRE의 NO 및 항산화 효과에 관여하는 단백질 발현을 조사하기 위하여 NOS-1(Nitric oxide synthase-1)와 NOS2 (Nitric oxide synthase-2), SOD-1(Superoxide dismutase-1), SOD-2(Superoxide dismutase-2), SOD3(Superoxide dismutase-3) 단백질 발현을 조사하였다. BRE이 처리된 혈관내피세포인 EA-HY-926 에서 SOD-2의 발현수준은 0.00125% 이상의 농도에서 증가하였고 SOD-3와 NOS-1의 발현수준은 0.0025% 이상의 농도에서 유의적으로 증가하지만, SOD-1과 NOS-2의 발현수준에는 시험농도에서 변화가 없었다(도 9).

핵 추출 단백질 중전사 인자인Nrf-2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2)와 NF-kB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) 단백질의 발현에 대한 결과는 도 10에서 나타내었다. 실시예로 처리된 혈관내피세포에서 SOD의 전사인자인 Nrf-2는 유의적으로 증가된 것으로 나타난 반면에, NF-kB의 발현수준에는 변화가 없었다. 특히 실시예 3 내지 5에서 Nrf-2의 증가가 두드러지게 나타났다.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims

건조된 바자카 뿌리(Acai berry)를 주정으로 12 내지 30℃에서 추출한 뿌리 추출물 및 바자카 수액을 1:1로 혼합한 혼합물을 0.0025 내지 0.01중량%로 포함하여, 지질 과산화 억제, DNA 손상에 대한 항산화, ACE(Angiotensin Converting Enzyme) 효소 저해활성, nitric oxide(NO)의 생성 억제 효과를 나타내고, NOS-1(Nitric oxide synthase-1), SOD-2(Superoxide dismutase-2) 및 SOD-3(Superoxide dismutase-3) 단백질 발현의 증가, Nrf-2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2)의 발현 증가 및 NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)전사인자의 활성의 감소 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 혈액순환 및 고혈압에 대한 개선효과를 가지는 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 바자카 뿌리 추출물은 상기 추출이 2 내지 5회 반복 추출된 것이고, 35 내지 65℃에서 농축된 것을 특징으로 하는 혈액순환 및 고혈압에 대한 개선효과를 가지는 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 혼합물이 혈관 확장 효과를 가지는 것인 혈액순환 및 고혈압에 대한 개선효과를 가지는 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 조성물이 식품 조성물인 것으로 특징으로 하는 혈액순환 및 고혈압에 대한 개선효과를 가지는 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 조성물이 약학 조성물인 것으로 특징으로 하는 혈액순환 및 고혈압에 대한 개선효과를 가지는 조성물.
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