KR101500076B1

KR101500076B1 - 석창포 및 바이칼레인을 포함하는 인지기능 개선 조성물 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR101500076B1
Application number: KR1020130056774A
Authority: KR
Inventors: 김문무; 정경태; 박혜정; 김준영; 고건희
Original assignee: 동의대학교 산학협력단
Priority date: 2013-05-20
Filing date: 2013-05-20
Publication date: 2015-03-18
Also published as: KR20140136602A

Abstract

본 발명은 석창포 및 바이칼레인을 포함하는 인지기능 개선 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 석창포 및 바이칼레인을 포함하는 인지기능 개선 조성물은 건조된 석창포(Acorus gramineus) 및 물을 1 : 12 내지 1 : 8의 중량비로 혼합하여 70 내지 90℃ 습열추출하고, 상기 습열추출물을 동결건조시킨 석창포 추출물 및 바이칼레인(Baicalein)을 포함하고, 활성산소종의 제거, DNA 손상에 대한 항산화, ACE(Angiotensin Converting Enzyme) 효소 저해활성, AChE(acetylcholine esterase) 저해 활성, NO(Nitric oxide) 생성 억제활성, 산화질소 생성 효소 NOS-2 발현 증가활성 및 PC12세포에서 NF-κB 전사활성 증가효과를 동시에 나타내는 것일 수 있다.

Description

석창포 및 바이칼레인을 포함하는 인지기능 개선 조성물 및 그 제조방법{Bacalein and Acorus Gramineus Extracts For Cognitive Function Activity Effect And Manufacturing Method of thereof}

본 발명은 석창포 및 바이칼레인을 포함하는 인지기능 개선 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 바이칼레인과 석창포(Acorus gramineus Solander)의 열수추출물의 활성산소제거, 지질과산화에 대한 항산화 활성, DNA 손상에 대한 항산화 효과, 세포증식 효과, ACE(Angiotensin Converting Enzyme) 효소 저해활성 등의 효과를 확인하고, 동시에 상기 효과를 동시에 나타낼 수 있는 농도 범위의 석창포 및 바이칼레인을 포함하는 인지기능 개선 조성물 및 그 제조방법을 제공한다.

사람의 뇌는 학습, 기억, 운동 등을 총괄하는 중요한 부위로서 신경세포들이 서로 연결되어 거대한 신경망이 형성되는데, 이 신경망이 학습과 기억을 포함하는 신경계적 기반이 된다.

하지만 다양한 원인에 의해 유해 활성산소종(Reactive Oxygen Species)이 과다하게 생성되어 체내에 축적되면, 세포에 산화적 손상을 주어 세포퇴화와 세포괴사 등을 유도한다. 정상적인 경우 체내 제거기전인 superoxide dismutase(SOD), catalase, carotenoid 및 glutathione 등에 의해 제거되지만, 체내에 남아있는 ROS는 뇌 신경세포의 퇴화와 사멸을 유도하여 올바른 신경망 형성에 부정적으로 영향을 학습능력과 기억력을 저하시키며, 심할 경우 파키슨씨병, 알츠하이머와 같은 퇴행성 뇌질환을 유발시킨다.

또한 뇌의 학습, 기억과 같은 인지능력은 acetylcholine(ACh)과 같은 신경전달물질에 의해 나타난다. 신경세포 말단에서 분비되는 ACh는 학습과 같은 외부자극을 시냅스의 수용체를 통해 정상적으로 신호를 전달한 뒤 acetycholinesterase (AChE)에 의해 acetate와 choline으로 분해되어 다시 부분 재흡수된다. 이러한 과정을 cholinergic system이라 하며 알츠하이머 환자들의 대부분은 이 과정에서 심각한 문제가 일어난다고 알려져 있다. ACh의 감소는 뇌의 인지능력을 손상시켜 정상적으로 작동하지 못하게 한다.

따라서 AChE inhibitor는 알츠하이머 환자들의 치료제로써 많이 사용되고 있다. 또한 고혈압 역시 뇌졸중과 동맥경화의 원인이 되는 뇌 혈관질환으로서 Angiotensin II에 의해 유도된다. Angiotensin II는 renine에 의해 분해된 angiotensine이 angiotensin I converting enzyme(ACE)에 의해 전환된 고혈압 유발 효소이다. 이러한 angiotensin II는 동맥혈관을 수축시키고 혈관을 확장시키는 효소인 bradykinin을 분해함으로써 혈압을 상승시킨다. 뿐만 아니라 스트레스 역시 고혈압의 원인이 된다.

만병의 근원이라고 할 수 있는 ROS 역시 스트레스에 의해 생성이 촉진된다. 뿐만 아니라 angiotensin II는 고혈압의 주된 원인인 스트레스에도 영향을 미친다는 연구결과가 있다. Nrf2의 항산화 target 유전자의 발현을 억제시킴으로써 ROS의 수준을 증가시키고 NF-κB signaling을 통해 superoxide dismutase (SOD)를 감소시켜 산화스트레스를 유도한다.

바이칼레인은 황금의 주성분으로 항염증 및 항산화 효능을 가지고 천연 방부효과가 탁월하고, 항알레르기성 작용을 하여 알레르기성 천식을 완화하며, 염증성 피부에 효과적이다. 특히 활성산소 및 항산화 효과가 우수하여 피부노화를 지연시키고 피부진정 및 항염, 항균 작용이 있고, 뇌질환 등의 신경계 질환에도 효능이 있다고 알려져 있다.

석창포는 천남성과(Araceae)에 속하는 다년생 초본으로 한국, 중국, 일본 등지에서 자생하고 있으며, 한국에서는 중부와 남부지방에서 자생한다. 석창포는 산골짜기에서 자라며 뿌리줄기는 옆으로 길게 자라고 지상에 있는 줄기와 더불어 독특한 향기가 나는 식물이다. 석창포는 연못가나 도랑가에서 자라는 일반 창포보다 잎이 보다 좁고 길이가 짧으며 뿌리가 가는 특징이 있다. 또한 석창포의 다른 이름으로 수검초, 요구, 창본, 창양, 창초, 창포, 구절창포 등이 있다.

본 발명은 바이칼레인 및 석창포 추출물을 포함하는 조성물의 기억, 학습과 같은 뇌 기능 개선에 대한 효과를 조사하기 위하여 유해 활성산소종 소거능력과 인지능력 관련 효소인 AChE(acetylcholine esterase)와 고혈압 유발 효소인 ACE(Angiotensin Converting Enzyme)의 활성효과와 뇌의 혈액순환과 관련된 효소들의 활성효과를 실험하고, 이에 따라 활성산소제거, 지질과산화에 대한 항산화 활성, DNA 손상에 대한 항산화 효과, 세포증식 효과, ACE 효소 저해활성 등의 효과를 확인 및 이와 동시에 상기 효과를 동시에 나타낼 수 있는 농도의 범위를 제시함으로써, 상기 농도 범위의 바이칼레인 및 석창포 추출물이 포함된 건강기능 개선의 식품 내지 약품으로 활용될 수 있도록 한다.

특허문헌 1은 석창포 (Acorus gramineus Solander)를 비극성 용매로 초임계 추출하여 얻어지는 석창포 친유성 추출물을 포함하는 피부노화방지 조성물에 대한 발명을 개시하는 있으나, 본원발명에서 제시하는 효과상 특징에 대한 인식이 없고, 상기 효과의 인식에 따른 구성의 한정에 대한 개시가 없다.

KR 10-2003-0029563 A

본 발명의 목적은 활성산소종의 소거능력, 인지능력 관련 효소인 AChE(acetylcholine esterase)와 고혈압 유발 효소인 ACE(Angiotensin Converting Enzyme)에 대한 억제활성을 가지는 바이칼레인 및 석창포를 포함하는 조성물을 제공한다. 또한, 상기 효과가 동시에 나타날 수 있는 인지기능 개선효과를 가지는 바이칼레인 및 석창포를 포함하는 조성물과 상기 조성물에 포함되는 바이칼레인 및 석창포 추출물의 농도범위를 제공한다.

본 발명의 다른 목적은 상기 바이칼레인 및 석창포 추출물을 포함하는 조성물의 제조방법을 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 석창포 및 바이칼레인을 포함하는 인지기능 개선 조성물은 건조된 석창포(Acorus gramineus) 및 물을 1 : 12 내지 1 : 8의 중량비로 혼합하여 70 내지 90℃ 습열추출하고, 상기 습열추출물을 동결건조시킨 석창포 추출물 및 바이칼레인(Baicalein)을 포함하고, 활성산소종의 제거, DNA 손상에 대한 항산화, ACE(Angiotensin Converting Enzyme) 효소 저해활성, AChE(acetylcholine esterase) 저해 활성, NO(Nitric oxide) 생성 억제활성, 산화질소 생성 효소 NOS-2 발현 증가활성 및 PC12세포에서 NF-κB 전사활성 증가효과를 동시에 나타내는 것일 수 있다.

상기 석창포 및 바이칼레인을 포함하는 인지기능 개선 조성물은 상기 바이칼레인이 0.0001내지 0.01 중량%과 석창포 추출물이 0.05 내지 0.1 중량%로 포함되는 것일 수 있다.

상기 석창포 및 바이칼레인을 포함하는 인지기능 개선 조성물은 상기 석창포 추출물이 상기 습열추출이 4 내지 5 시간 동안 습열추출되고, 상기 습열추출이 1 내지 5회 반복되고, 동결건조된 것일 수 있다.

상기 석창포 및 바이칼레인을 포함하는 인지기능 개선 조성물은 상기 석창포 및 바이칼레인을 포함하는 인지기능 개선 조성물을 포함하는 뇌기능 개선용 식품 조성물로 제공될 수 있다.

상기 석창포 및 바이칼레인을 포함하는 인지기능 개선 조성물은 석창포 및 바이칼레인을 포함하는 인지기능 개선 조성물을 포함하는 뇌질환 예방 및 개선을 위한 약학 조성물로 제공될 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따른 석창포 및 바이칼레인을 포함하는 인지기능 개선 조성물의 제조방법은 석창포를 건조하는 건조단계, 상기 건조단계를 거친 석창포를 물과 1 : 8 내지 1 : 12의 중량비로 혼합하고, 70 내지 90℃에서 1 내지 5 시간 동안 습열추출하는 습열추출단계, 상기 습열추출단계를 1 내지 5회 반복하는 반복추출단계, 상기 반복추출단계를 거친 석창포 추출물을 여과하고, 여과된 여액을 동결건조시켜 분말화 된 석창포 추출물을 제조하는 분말화 단계 및 바이칼레인을 첨가하여 혼합하는 혼합물 제조단계를 포함하는 것이고, 상기 분말화 단계를 거친 석창포 추출물은 활성산소종의 제거, DNA 손상에 대한 항산화, ACE(Angiotensin Converting Enzyme) 효소 저해활성, AChE(acetylcholine esterase) 저해 활성, NO(Nitric oxide) 생성 억제활성, 산화질소 생성 효소 NOS-2 발현 증가활성 및 PC12세포에서 NF-κB 전사활성 증가효과를 동시에 나타내는 것일 수 있다.

상기 석창포 및 바이칼레인을 포함하는 인지기능 개선 조성물의 제조방법은 동결건조 단계 이후에, 상기 석창포 추출물을 0.05 내지 0.1 중량%로 희석시키는 농도 조정단계를 더 포함하는 것일 수 있다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 석창포 및 바이칼레인을 포함하는 인지기능 개선 조성물은 건조된 석창포(Acorus gramineus) 및 물을 1 : 12 내지 1 : 8의 중량비로 혼합하여 70 내지 90℃ 습열추출하고, 상기 습열추출물을 동결건조시킨 석창포 추출물 및 바이칼레인(Baicalein)을 포함하고, 활성산소종의 제거, DNA 손상에 대한 항산화, ACE(Angiotensin Converting Enzyme) 효소 저해활성, AChE(acetylcholine esterase) 저해 활성, NO(Nitric oxide) 생성 억제활성, 산화질소 생성 효소 NOS-2 발현 증가활성 및 PC12세포에서 NF-κB 전사활성 증가효과를 동시에 나타내는 것일 수 있다.

뇌의 기능을 저하시키는 다양한 요인들 중 활성산소 종은 뇌 세포 괴사, DNA 파괴, 조직의 변형 및 파괴와 같은 산화적 손상을 야기 시켜 지각 능력, 학습 능력, 기억력 등과 같은 인지능력을 관장하는 신경망형성을 파괴한다. 자외선이나 다양한 스트레스적 요인에 의해 체내에서 제거되지 못하고 남아있는 활성산소에 의해 뇌의 신경 세포들이 손상되면 뇌 기능을 저하시킬 뿐만 아니라 심하면 대사질병과 염증, 암 그리고 알츠하이머, 파키슨씨병 등과 같은 심각한 퇴행성 뇌 질환을 유발한다.

상기 인지기능 개선효과를 가지는 바이칼레인과 석창포 추출물은 이러한 체내에 잔류할 수 있는 유해 활성산소종(Reactive Oxygen Species, 이하 ROS라 한다)의 제거에 탁월한 효과를 가질 수 있다.

체내 많은 성분들 중 철은 대사활동에 필수적인 요소이지만 Fe^2＋는 체내의 과산화 수소와 반응하는 Fenton reaction에 의해 hydroxyl radical을 형성하여 체내에 유해한 산화 효과를 나타낸다. 상기 바이칼레인과 석창포 추출물은 하기의 시험예를 통해 알 수 있는 와 같이 DPPH radical 소거에는 효과가 없지만 hydroxyl radical 제거 능력이 탁월한 것으로 보아 hydroxyl radical의 형성을 억제함으로써 항산화 방어기작을 나타내는 것을 알 수 있다.

나아가 상기 바이칼레인과 석창포 추출물은 DNA 산화에 대한 우수한 보호활성을 나타내고 있다.

Nfr2는 NF-E2-related factor2로 NADPH;quinine oxidoreductase-1 그리고 γ-glutamate cysteine ligase(GCL)과 같은 항산화 유전자의 전사인자를 말하는데, 상기 바이칼레인과 석창포 추출물은 Nrf2의 발현 억제에도 효과적이다.

또한, 하기의 시험예를 기초로 볼 때, 상기 바이칼레인 및 석창포 추출물을 포함하는 조성물에 의하는 경우 ACE의 활성 억제에 매우 우수한 효과를 가지며, AChE의 활성 억제효과도 가진다. 따라서, 상기 석창포 추출물의 ACE의 활성 및 AChE의 활성에 대한 억제로 뇌의 비정상적 기능을 막아 뇌의 기능이상에 관한 질병의 예방효과를 나타낼 수 있다.

한편, 외부로부터 오는 학습, 인지 등의 자극은 뇌의 해마에서 단기 기억과 장기 기억으로 입력된다. 이러한 뇌의 기능은 중추 신경전달물질들이 시냅스의 수용체에서 반응을 일으켜 전달되는 것으로 dopamine, acetylcholin (ACh)등이 대표적인 신경전달물질들이다. 해마에서 생성된 ACh는 분해효소인 AChE에 의해 가수분해 되어 acetate기와 choline으로 분해되는데 이러한 ACh의 감소는 심각한 기억 손실을 유발하며 또한 퇴행성 뇌 질환인 알츠하이머와 매우 밀접한 관계가 있다고 알려져 있다.

상기 석창포 및 바이칼레인을 포함하는 인지기능 개선 조성물은 상기 바이칼레인을 0001 내지 0.01 중량%과 석창포 추출물이 0.05 내지 0.1 중량%로 포함되는 것일 수 있다.

상기 바이칼레인은 0.01 중량% 이하의 농도에서, 석창포 추출물은 0.1 중량% 이하의 농도에서 세포독성이 없으므로 안전하게 사용할 수 있다. 또한, 상기 석창포 추출물은 0.05 중량% 이상의 농도에서는 Nrf-2의 발현이 억제될 수 있다. 나아가 상기 바이칼레인 및 석창포 추출물이 상기 범위로 포함되는 경우 상기 석창포 및 바이칼레인을 포함하는 인지기능 개선 조성물은 활성산소종의 제거, DNA 손상에 대한 항산화, ACE(Angiotensin Converting Enzyme) 효소 저해활성, AChE(acetylcholine esterase) 저해 활성, NO(Nitric oxide) 생성 억제활성, 산화질소 생성 효소 NOS-2 발현 증가활성 및 PC12세포에서 NF-κB 전사활성 증가효과를 동시에 나타냄으로써 보다 효과적으로 두뇌 인지기능을 증진시킬 수 있다.

상기 습열 추출과정에 있어, 상기 건조된 석창포와 물이 1 : 12 내지 1 : 8의 중량비로 혼합된 경우 석창포의 유효성분의 추출에 가장 효과적이며, 추출온도가 90℃를 초과하는 경우 석창포 추출물의 활성이 저하되고, 70℃ 미만으로 추출하는 경우 본 발명에서 목적하는 유효성분의 추출이 미미하여 상기 활성산소종 제거, 항산화 등의 효과가 동시에 나타나지 않는 문제가 있다.

상기 석창포 추출물은 동결건조에 의해는 경우 유효성분이 유지되어 상기 효과를 효과적으로 나타낼 수 있다.

상기 석창포 및 바이칼레인을 포함하는 인지기능 개선 조성물은 상기 석창포 추출물이 상기 습열추출이 4 내지 5 시간 동안 습열추출되고, 상기 습열추출이 1 내지 5회 반복되고, 여과과정을 거쳐 동결건조된 것일 수 있다.

상기 습열추출 온도 70 내지 90℃에 의하는 경우 4 내지 5시간 동안 추출과정에 의하는 경우 유효성분이 파괴되지 않고 효과적으로 추출될 수 있으며, 이를 위해 90℃를 초과하지 않는 범위에서 반복추출하는 것이 보다 효과적일 수 있다.

상기 식품조성물은 활성산소종의 제거, DNA 손상에 대한 항산화, ACE(Angiotensin Converting Enzyme) 효소 저해활성, AChE(acetylcholine esterase) 저해 활성, NO(Nitric oxide) 생성 억제활성, 산화질소 생성 효소 NOS-2 발현 증가활성 및 PC12세포에서 NF-κB 전사활성 증가효과를 동시에 나타낼 수 있으며, 상기 식품조성물은 상기 바이칼레인이 0.0001 내지 0.01 중량%과 석창포 추출물은 0.05 내지 0.1 중량%로 포함하는 것일 수 있다.

상기 약학조성물의 경우 복용방법에 따라 상기 바이칼레인과 석창포 추출물의 농도범위를 기초로 그 함량을 조절할 수 있고, 필요에 따라 다양한 제형으로 제조되는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 석창포 및 바이칼레인을 포함하는 인지기능 개선 조성물에 의하는 경우 활성산소종의 제거, DNA 손상에 대한 항산화, ACE(Angiotensin Converting Enzyme) 효소 저해활성, AChE(acetylcholine esterase) 저해 활성, NO(Nitric oxide) 생성 억제활성, 산화질소 생성 효소 NOS-2 발현 증가활성 및 PC12세포에서 NF-κB 전사활성 증가효과를 동시에 나타낼 수 있다. 따라서 본 발명에 의하는 경우 두뇌 인지기능 개선효과를 높일 수 있다는 장점이 있다.

도 1은 DPPH에 대한 바이칼레인과 석창포 추출물의 소거효과에 관한 것이다.
도 2는 potassium ferrycyanide reduction법에 의한 바이칼레인과 석창포 추출물의 환원력 시험 결과에 관한 것이다.
도 3은 활성산소의 소거활성 시험결과에 관한 것이다.
도 4는 바이칼레인과 석창포 추출물의 지질과산화 억제효과 시험결과에 관한 것이다.
도 5는 손상된 DNA에 대한 바이칼레인과 석창포 추출물의 항산화 효과 시험결과에 관한 것이다.
도 6은 바이칼레인과 석창포 추출물의 세포증식에 대한 영향을 시험한 결과에 관한 것이다.
도 7은 바이칼레인과 석창포 추출물의 ACE(Angiotensin Converting Enzyme) 효소 저해활성의 시험결과에 관한 것이다.
도 8은 바이칼레인과 석창포 추출물의 인지능력 관련 효소인 AChE(acetylcholine esterase)의 활성억제 시험결과에 관한 것이다.
도 9는 바이칼레인과 석창포 추출물의 NO 생성 억제 효과에 관한 것이다.
도 10은 바이칼레인과 석창포 추출물의 NOS-2와 Nrf-2 단백질 발현에 대한 시험결과에 관한 것이다.
도 11은 바이칼레인과 석창포 추출물의 NF-κB 전사활성에 대한 효과시험 결과에 관한 것이다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

[제조예: 실시예의 제조]

실험에 사용된 바이칼레인은 시그마사에서 구입하였고 석창포는 (재)산청한방약초연구소에서 제공받았다. 석창포 열수추출물을 하기와 같은 방법으로 추출하여 얻을 수 있다. 먼저, 석창포를 흐르는 물에 깨끗이 세척한 다음 자연 건조한다. 세척ㆍ건조된 상기 석창포를 각각 증류수와 1：10의 중량비로 혼합하여 진탕기로 80℃에서 4시간 동안 습열 추출을 4회 반복한다. 상기 추출물을 여과한 후, 여과된 여액을 동결건조하여 분말 형태의 석창포 열수추출물(Acorus gramineus hot water extracts, 이하, ‘AGW’라 한다)을 얻는다. 하기의 표 1과 같이 분말형태의 바이칼레인과 AGW의 혼합하여 혼합물(이하, ‘바이칼레인과 AGW 혼합물’이라 한다)을 제조하였고, 실시예 1 내지 5에 포함된 바이칼레인과 AGW의 함량을 하기의 표 1에 나타내었다.

구분	실시예1	실시예2	실시예3	실시예4	실시예5	비교예
바이칼레인	0.0001	0.0005	0.001	0.005	0.01	0
AGW의 혼합물	0.00625	0.0125	0.025	0.05	0.1	0

(단위: 중량%)

한편 세포배양을 위한 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), Trypsin-EDTA, penicillin/streptomycin/amphotericin (각각 10,000 U/ml, 10,000 μg/m 및 2,500 μg/ml), fetal bovine serum (FBS)시약은 Gibco BRL, Life Technologies (Paisley, Scotland)로부터 구입하였다. PC12 cell line은 ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)로부터 구입하였다. MTT reagent, gelatin, agarose와 기타시약은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다.

[실험예 : 실시예, 비교예 및 대조군에 대한 활성시험]

1. 시험방법

(1) DPPH radical assay

1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical을 이용하여 바이칼레인과 AGW의 혼합물의 radical 소거능력을 측정하였다.( Imai J, Ide N, Nagae S, Moriguchi T, Matsuura H, Itakura Y. Antioxidant and radical scavanging effects of aged garlic extract and its constituents. Planta Medica-J Med Plant Res 60, 417-420, 1994.) 시험농도의 바이칼레인과 AGW의 혼합물을 DPPH 용액을 가하여 10초 동안 잘 혼합한 다음, 실온에서 20분 동안 반응시킨 후 525 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH radical 함량은 시료 첨가군과 대조군의 흡광도 비를 %값으로 환산하여 나타내었다.

(2) 환원력 assay

Oyaizu의 방법(Oyaizu M. Studies on products of the browning reaction. Antioxidative activities of browning reaction products prepared from glucosamine. Japa J Nutrition [Eiyogaku Zasshi] 44, 307-315, 1986.)에 따라 측정하였다. 시료 1 ml에 pH 6.6의 200 mM 인산 완충액 및 1%의 potassium ferricyanide를 각각 1 ml씩 차례로 가하여 교반한 후 50℃의 수욕상에서 20분 동안 반응시켰다. 여기에 10% TCA (trichloroacetic acid)용액을 1 ml 가하여 13,500× g에서 15분 동안 원심분리하여 상등액 1 ml에 증류수 및 ferric chloride 각 1 ml을 혼합한 후 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 환원력은 시료첨가군과 대조군의 흡광도 비를 %값으로 환산하였다.

(4) Superoxide anion radical 소거효과 측정

Superoxide anion 라디칼 소거능은 Fridovich(Fridovich I. Superoxide anion radical (O·^- ₂), superoxide dismutases, and related matters. J Biol Chem 272, 18515, 1997.)의 방법에 의해 정하였다. 각 시료 용액 0.1 ml과 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.5) 0.6 ml에 0.4 mM xanthine과 0.24mM nitro bluetetrazolium (NBT)를 녹인 기질액 1 ml를 첨가하고 xanthineoxidase (0.049 U/ml) 1 ml를 가하여 37℃에 서 20분간 반응시킨 후 1 N-HCl을 1 ml를 가하여 반응을 종료시킨 다음, 반응액 중에 생성된 superoxide anion radical의 양을 560 nm에서 흡광도를 측정하였다.

(5) In vitro 지질과산화에 대한 항산화 활성

상기 실시예 및 비교예를 linolenic acid emulsion과 혼합한 후에 0.8 mM H₂O₂ 및 0.8 mM FeSO₄를 혼합한 용액을 5시간 동안 반응시킨 후 0.4% TBA를 첨가하고 95℃에서 2시간 반응시킨 다음 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 그 다음 15：1 비율의 n-butanol : pyridine 용액을 500 μl을 첨가하고 1,000 × g에서 10분 동안 원심분리한 후 상등액을 532nm에서 흡광도를 측정하여 지질과산화 정도는 시료 첨가 전후의 흡광도 비를 %값으로 환산하여 나타내었다. 양성 대조군으로는 0.1% vitamin E를 사용하였다.

(6) Hydroxyl radical에 의한 DNA 손상 분석

Genomic DNA는 약간 변형된 표준 과정에 따라 PC12 세포로부터 추출하였다(Sambrook J, Russell DW. Molecular cloning: a laboratory manual. New York, CSHL Press, 2001.). Fenton 반응에 의하여 발생된 hydroxyl radical에 노출된 DNA 산화는 기존에 실험된 방법에 따라 수행되었다(Milne L, Nicotera P, Orrenius S, Burkitt M. Effects of glutathione and chelating agents on copper-mediated DNA oxidation: pro-oxidant and antioxidant properties of glutathione. Arch Bi℃hem Biophys 304, 102-109, 1993.). 먼저 100 μl의 DNA 용액에 실시예 및 비교예, 200 μM FeSO4, 1 mM H2O2 및 50 μg/ml genomic DNA를 첨가하였다. 반응 혼합물을 30분 동안 상온에서 반응시킨 후 10 mM EDTA를 첨가하여 반응을 종결시켰다. 1 μg의 DNA를 포함하는 20 μl의 반응혼합물을 1% agarose gel에서 100 V로 30분 동안 전기영동하였다. Gel은 1 mg/ml ethidium bromide로 염색하여 물로 세척하여 UV로 LAS3000 image analyzer (Fujifilm Life Science, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다.

(7) 세포배양

PC12 세포는 5% CO₂및 37℃에서 95% 이상의 습도를 유지한 배양기에서 10% fetal bovine serum, 2 mM glutamine and 100 μg/μl penicillin-streptomycin을 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였다.

(8) MTT assay

Hansen 등(Hansen MB, Nielsen SE, Berg K. Re-examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill. J Immunol Meth 119, 203-210, 1989.)의 방법에 따라 PC12세포에 대한 실시예의 세포독성을 MTT (3-(4,5-dimethyl-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 이용하여 측정하였다.

(9) ACE (Angiotensin I Converting Enzyme) 활성 측정

ACE 활성은 0.3 M NaCl을 포함한 0.1 M sodium borate buffer (pH 8.3)에 토끼 rabbit lung acetone powder을 1 g/10ml (w/v)의 농도로 4℃에서 2시간 동안 추출한 후, 원심분리(4℃, 4,000 rpm, 40분)하여 ACE 조효소액을 얻었다.

실시예 및 양성대조군 (0.1%의 Captopril)에 각각 0.1 M 붕산나트륨 완충액(pH 8.3) 100 μl와 ACE 조효소액 50 μl를 가한 다음, 37℃에서 5분 동안 예비반응을 시킨 후, 0.3 M NaCl이 포함된 0.1 M 붕산나트륨 완충액(pH 8.3) 5 ml에 HHL (hippuryl-histidyl-leucine) 25 mg을 첨가하여 만든 기질 50 μl를 가하여 37℃에서 30분간 반응을 시켰다. 이에 1 N HCl을 250 μl를 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 아세트산 에틸(ethyl acetate) 1.5 ml를 가해 15초 동안 교반한 다음, 원심분리(3,000 rpm, 5 min, 4℃)하여 상등액 1 ml을 얻었다. 이 상등액을 완전히 건조시켜 증류수 3 ml를 넣어 교반 한 후 분광광도계로 228 nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성대조군으로는 증류수 50 μl를 사용하였으며, 양성대조군으로는 captopril 0.1%를 사용하여 실시예와 그 활성을 비교하였다. ACE 효소활성은 시료 첨가 전후의 흡광도 비를 %값으로 환산하였다.

(10) AChE (Acetylcholine esterase) 활성측정

PC12 세포로부터 분리한 AchE (25 mU/ml) 50 μl를 반응효소로, 0.1 M의 인산나트륨 완충액(pH 8.0)에 녹인 1mM의 아세틸콜린 요오드화물을 기질로 하였고, 발색 시약은 39.6 mg의 5,5'-dithiobis-2-nitrobenzoic acid 및 15 mg의 탄산수소나트륨을 0.1 M 인산나트륨 완충액(pH 7.0) 10 ml에 용해하여 제조하였다. 효소반응은 다음과 같이 전개하였다. 2 ml의 0.1 M 인산나트륨 완충액(pH 8.0)에 20 μl의 바이칼레인과 AGW의 혼합물, 200 μl의 10 mM DTNB 용액 및 100 μl의 효소 (0.03 U)를 가하고 37℃에서 10분간 전 유지시킨 다음, 기질 200 μl를 가해 3분간 반응시킨 후, 분광광도계로 412 nm에서 흡광도 값을 측정하였다. AChE의 활성은 시료 첨가 전후의 흡광도 비를 %값으로 환산하였다. 전후의 흡광도 비를 %값으로 환산하였다.

(11) Western blot analysis

PC12 세포에 용출 완충용액(50mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.4% Nonidet P-40, 120 mM NaCl, 1.5 mM MgCl₂, 2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 80 μg/ml leupeptin, 3 mM NaF and 1 mM DTT)을 첨가하여 4℃에서 30분 동안 처리하였다. 10 μg의 세포용출액을 10% Tris-HCl gel에서 전기영동 후 단백질을 전기적으로 nitrocellulose membrane으로 전이시켰다. 그 다음 10% skim milk를 nitrocellulose membrane에 전 처리하고 목적 단백질에 대한 1차 항체(anti-Nrf2, anti-NOS, anti-beta-actin)를 처리한 다음 2차 항체를 처리 후, chemiluminescent ECL kit (Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 목적 단백질을 검출하였다. Western blot의 band는 LAS3000 image analyzer (Fujifilm Life Science, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다.

(12) Nitrite 양의 측정

PC12 세포로부터 생성된 NO의 양은 Griess 시약을 이용하여 세포 배양액 중에 존재하는 NO₂ ^-의 형태로서 측정하였다. PC12 세포를 DMEM 배지를 이용하여 1×105 cell/well로 조절한 후 24 well plate에 접종하고 37℃, 5% CO₂의 습윤배양기에서 배양하였다. 세포에 실시예를 전처리하고 24시간 배양하였다. 세포배양 상등액과 동량의 Griess 시약을 혼합하여 96 well plate에서 10분 동안 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하고 그 비를 %값으로 환산하였다.

(13) Transfection and reporter gene assay

PC12 cells를 6-well plate에 분주하고 37℃에서 배양하였다. 세포가 약 70∼80%의 증식했을 때, 혈청이 함유되지 않은 DMEM 배지로 세척하고 5시간 동안 혈청 및 항생물질 없이 DMEM로 배양하였다. 이어 세포를 lipofectamine 시약(Invitrogen, USA)으로 well 당 DNA 총량을 조절한 NF-κB promoter가 삽입된 pGL3 reporter vector(NF-?B-Luc) 1 μg 및 pcDNA 3.1를 300 ng 함유 DNA 혼합물로 transfection 시켰다. 72 시간 배양한 후, 세포를 용리시키고, luminometer (Tecan Austria GmbH, Austria)를 이용하여 luciferase 활성을 측정하였다. Well 당 transfection된 세포수의 차이를 보정하기 위하여, 기질로서 o-nitrophenylbeta-galactopyranoside를 사용하여 β-galactosidase 활성을 모니터링 하였다. 데이터를 "평균±표준편차(n=3)"로 나타내었다. 얻어진 Student’s t-test를 이용한 대조군과 비교하여 통계적으로 분석하였다.

(14) 통계처리

각 실험은 3회 이상 반복실험을 통하여 그 결과를 얻어 각각의 시료농도에 대해 평균±표준편차로 나타내었다. 각 시료농도군에 대한 유의차 검정은 대조군과 비교하여 Student’s t-test한 후 p＜0.05 값을 통계적으로 유의성있는 결과로 간주하였다.

2. 시험결과

(1) Cell free systems에서 DPPH, superoxide anion, lipid peroxidation에 대한 바이칼레인과 AGW의 혼합물의 항산화 효능 및 환원력

생체에서 산화적 스트레스와 관련되어 있는 DPPH, superoxide anion과 같은 활성산소종에 대한 바이칼레인과 AGW의 혼합물의 소거능력 및 환원력에 대하여 조사하였다. DPPH radical 소거법은 DPPH radical이 항산화 물질로 인해 환원되면, 자색이 탈색되는 정도를 지표로 하여 지질과산화의 초기 억제 정도를 예측 할 수 있다. 바이칼레인과 AGW의 혼합물의 항산화 효과를 알아보기 위해 DPPH를 이용하여 항산화 작용을 측정한 결과 도 1에서 보는 바와 같이, DPPH에 대하여 실시예의 소거효과는 농도에 비례하여 증가하는 것으로 나타났다. 양성 대조군은 vitamin C는 0.1%를 사용하였는데 50%의 소거효과를 나타내었다. 실시예의 환원력 측정에는 potassium ferrycyanide reduction법을 사용하여 바이칼레인과 AGW의 혼합물의 금속이온을 환원시키는 환원력을 조사하기 위하여 흡광도를 측정한 결과, vitamin C는 10 μg/ml의 농도에서 비교에와 비교시 427%의 환원력을 나타냈으며, 바이칼레인과 AGW의 혼합물은 실시예 1 내지 5의 경우 각각의 환원력은 150%, 200%, 270%, 350%, 420%로 나타나 그 효과가 우수한 것으로 나타났다(도 2). 다음으로 superoxide anion의 소거활성을 측정하기 위하여 xanthine에 xanthine oxidase를 처리하여 생성된 ?O₂ ^-가 공존하는 NBT를 환원시키는 발색반응을 이용하였다. 생성된 ?O₂ ^-의 제거능을 가진 물질로 인하여 그 발색은 저해된다. 양성 대조군으로 사용된 체내 활성 산소종 제거 기전인 SOD는 68%의 소거효과를 나타냈고 바이칼레인과 AGW의 혼합물의 실시예는 농도에 비례하여 증가하였다(도 3). 마지막으로 지질과산화 억제효과를 알아본 도 4에서는 양성 대조군으로 알려진 Vitamine E가 0.1%에서 27%의 지질과산화 억제효과를 보여주었으며, 바이칼레인과 AGW의 혼합물의 실시예 3,4,5 에서 비교에와 비교시 유의적인 억제효과를 확인할 수 있었다.

(2) 바이칼레인과 AGW의 혼합물의 Hydroxyl radical에 의한 DNA 손상에 대한 항산화 효과

Fenton reaction에 의해 생성되는 Hydroxyl radical에 genomic DNA가 노출되면 분해가 일어난다. 바이칼레인과 AGW의 혼합물의 DNA 손상에 대한 항산화 효과를 조사하기 위하여 PC12 cells로부터 genomic DNA를 분리하여 fenton reaction에 의하여 생성된 hydroxyl radical에 노출시켰다. 도 5에서 보는 바와 같이, fenton reaction 군과 비교시 0.025%의 바이칼레인과 AGW의 혼합물의 농도에서 DNA 분해가 억제되어, 바이칼레인과 AGW의 혼합물의 실시예들은 hydroxyl radical에 의한 DNA의 손상을 유의성 있게 감소시킴을 확인할 수 있었다.

(3) 바이칼레인과 AGW의 혼합물의 세포 증식 효과

본 실험에서는 바이칼레인과 AGW의 혼합물의 PC12 cells의 성장에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 세포 독성 유무를 조사하였다. MTT assay를 이용하여 바이칼레인과 AGW의 혼합물의 세포독성 효과를 조사하였으며, 도 6에서 보는 바와 같이 바이칼레인과 AGW의 혼합물의 실시예들은 비교에와 비교시 PC12 cells에 어떠한 독성효과도 나타내지 않는 것으로 판정되었다.

(4) 바이칼레인과 AGW의 혼합물의 ACE 저해 활성 효과

ACE는 renin에 의하여 생성된 angiotensin I으로부터 C- 말단 dipeptide (His-Leu)를 가수분해 시킴으로써 강력한 혈관 수축작용을 나타내는 angiotensin II를 생성시킨다.

이러한 바이칼레인과 AGW의 혼합물의 ACE 활성 저해 능력을 조사하였다. 양성대조군으로는 현재 시판되고 있는 항고혈압제인 captopril(1 mg/ml)가 사용되었으며, 도 7에서 보는 것과 같이 대조군에 비하여 126%의 소거효과를 나타냈다. 또한 바이칼레인과 AGW의 혼합물은 실시예3,4,5 에서 비교에와 비교시 유의적인 소거효과를 나타내었다.

(5) 바이칼레인과 AGW의 혼합물의 AChE 저해 활성 효과

Acetylcholine의 분해하여 체내의 신경전달이 원활하지 않게 하는 효소인 AChE의 활성을 알아본 결과 도 8에서 보는 바와 같이 바이칼레인과 AGW의 혼합물을 농도 별로 처리하였을 때 AchE 활성 억제 효과가 실시예2부터 농도에 비례하여 증가되는 것으로 나타났다.

(6) Nitric oxide (NO) 생성억제 효과

LPS (Lipopolysaccharide)에 의해 PC12 세포로부터 생성되는 NO에 대한 석창포 열수추출물의 억제효과를 세포 배양액으로부터 Griess assay 방법에 의해 측정하였다.

실시예 1 내지 5에 대한 NO의 생성억제 효과를 측정하였다. 0.1%의 농도로 처리한 세포군에서 NO의 생성 함량은 공시험군(Blank)와 비교했을 때 약 31% 증가되었다. 바이칼레인과 AGW의 혼합물을 처리한 세포군과 비교에와 비교시 실시예3,4,5 에서 NO 생성이 유의적으로 증가되는 것으로 나타났다(도 9).

(7) PC12 cells에서 NOS-2 및 Nrf2 단백질의 발현에 대한 바이칼레인과 AGW의 혼합물의 효과

바이칼레인과 AGW의 혼합물이 혈관확장에 중요한 역할을 하는 산화질소 생성효소인 NOS-2와 고혈압과 관련된 중요한 전사인자인 Nrf-2 단백질 발현을 어떻게 조절하는지 조사하였다.

도 10에서 보는 바와 같이, 바이칼레인과 AGW의 혼합물은 실시예2,3,4,5 에서 NOS-2의 발현을 증가시키는 것으로 나타났다. 반대로 실시예4,5 에서는 Nrf-2의 발현이 억제되는 것으로 나타났다.

(8) PC12세포에서 NF-κB 전사활성에 대한 바이칼레인과 AGW의 혼합물의 효능 연구

NF-κB promoter-luciferase construct를 PC12 cells에 transfection시킨 후에 바이칼레인과 AGW의 혼합물을 처리한 후 NF-κB promoter-luciferase construct를 이용하여 NF-κB의 전사 활성이 바이칼레인과 AGW의 혼합물에 의해 영향을 받는지 여부를 조사하였다. 도 11에서 보는 바와 같이 실시예3,4,5 에서 NF-κB의 전사활성이 증가하는 것으로 나타났다. 이상의 결과는 바이칼레인과 AGW의 혼합물이 NF-κB를 유전자 수준에서 활성화 시킨다는 것을 나타내고 있다.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims

건조된 석창포(Acorus gramineus) 및 물을 1 : 12 내지 1 : 8의 중량비로 혼합하여 70 내지 90℃ 습열추출하고, 상기 습열추출물을 동결건조시킨 석창포 추출물 및
바이칼레인(Baicalein)을 포함하고,
활성산소종의 제거, DNA 손상에 대한 항산화, ACE(Angiotensin Converting Enzyme) 효소 저해활성, AChE(acetylcholine esterase) 저해 활성, NO(Nitric oxide) 생성 억제활성, 산화질소 생성 효소 NOS-2 발현 증가활성 및 PC12세포에서 NF-κB 전사활성 증가효과를 동시에 나타내는 것인
석창포 및 바이칼레인을 포함하는 인지기능 개선 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 바이칼레인이 0.0001내지 0.01 중량%과 석창포 추출물이 0.05 내지 0.1 중량%로 포함되는 것인
석창포 및 바이칼레인을 포함하는 인지기능 개선 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 석창포 추출물은 상기 습열추출이 4 내지 5 시간 동안 습열추출되고,
상기 습열추출이 1 내지 5회 반복되고, 동결건조된 것인
석창포 및 바이칼레인을 포함하는 인지기능 개선 조성물.
제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 석창포 및 바이칼레인을 포함하는 인지기능 개선 조성물을 포함하는
뇌기능 개선용 식품 조성물.
제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
석창포 및 바이칼레인을 포함하는 인지기능 개선 조성물을 유효성분으로 포함하는
알츠하이머 예방 및 개선을 위한 약학 조성물.
석창포를 건조하는 건조단계,
상기 건조단계를 거친 석창포를 물과 1 : 8 내지 1 : 12의 중량비로 혼합하고, 70 내지 90℃에서 1 내지 5 시간 동안 습열추출하는 습열추출단계,
상기 습열추출단계를 1 내지 5회 반복하는 반복추출단계,
상기 반복추출단계를 거친 석창포 추출물을 여과하고, 여과된 여액을 동결건조시켜 분말화 된 석창포 추출물을 제조하는 분말화 단계 및
바이칼레인을 첨가하여 혼합하는 혼합물 제조단계
를 포함하는 것이고,
상기 분말화 단계를 거친 석창포 추출물은 활성산소종의 제거, DNA 손상에 대한 항산화, ACE(Angiotensin Converting Enzyme) 효소 저해활성, AChE(acetylcholine esterase) 저해 활성, NO(Nitric oxide) 생성 억제활성, 산화질소 생성 효소 NOS-2 발현 증가활성 및 PC12세포에서 NF-κB 전사활성 증가효과를 동시에 나타내는 것인
석창포 및 바이칼레인을 포함하는 인지기능 개선 조성물의 제조방법.
제 6항에 있어서,
동결건조 단계 이후에,
상기 석창포 추출물을 0.05 내지 0.1 중량%로 희석시키는 농도 조정단계
를 더 포함하는 것인
석창포 및 바이칼레인을 포함하는 인지기능 개선 조성물의 제조방법.