KR101621147B1

KR101621147B1 - 석창포 및 원지를 포함하는 인지기능 개선용 조성물 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR101621147B1
Application number: KR1020140082294A
Authority: KR
Inventors: 김종철
Original assignee: 에스앤에프 주식회사
Priority date: 2014-07-02
Filing date: 2014-07-02
Publication date: 2016-05-13
Also published as: KR20160004024A

Abstract

본 발명은 석창포 및 원지를 포함하는 인지기능 개선용 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 석창포 및 원지를 포함하는 인지기능 개선용 조성물은 1 : 10 내지 10 : 1 중량비로 혼합되고, 활성산소종의 제거, DNA 손상에 대한 항산화, ACE(Angiotensin Converting Enzyme) 효소 저해활성, AChE(acetylcholine esterase) 저해 활성, NO(Nitric oxide) 생성 억제활성, 산화질소 생성 효소 NOS-2 발현 증가활성 및 PC12세포에서 NF-κB 전사활성 증가효과를 나타내는 것일 수 있다.
상기 석창포 및 원지를 포함하는 인지기능 개선 조성물에 의하는 경우 세포독성이 낮아 부작용이 적고, 활성산소종의 제거, DNA 손상에 대한 항산화, ACE(Angiotensin Converting Enzyme) 효소 저해활성, AChE(acetylcholine esterase) 저해 활성, NO(Nitric oxide) 생성 억제활성, 산화질소 생성 효소 NOS-2 발현 증가활성 및 PC12세포에서 NF-κB 전사활성 증가효과가 매우 우수하여 인지능력 개선에 대한 효과가 뛰어나 다양한 건강기능성 식품 등의 제품으로 활용될 수 있다.

Description

석창포 및 원지를 포함하는 인지기능 개선용 조성물 및 그 제조방법{Polygala tenuifolia and Acorus Gramineus Extracts For Cognitive Function Activity Effect And Manufacturing Method of thereof}

본 발명은 석창포 및 원지를 포함하는 인지기능 개선용 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 활성산소제거, 지질과산화에 대한 항산화 활성, DNA 손상에 대한 항산화 효과, 세포증식 효과, ACE(Angiotensin Converting Enzyme) 효소 저해활성 등에 대한 효과가 높아 인지기능에 대한 개선효과를 가질 수 있는 석창포 및 원지를 포함하는 인지기능 개선용 조성물 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.

사람의 뇌는 학습, 기억, 운동 등을 총괄하는 중요한 부위로서 신경세포들이 서로 연결되어 거대한 신경망이 형성되는데, 이 신경망이 학습과 기억을 포함하는 신경계적 기반이 된다.

하지만 다양한 원인에 의해 유해 활성산소종(Reactive Oxygen Species)이 과다하게 생성되어 체내에 축적되면, 세포에 산화적 손상을 주어 세포퇴화와 세포괴사 등을 유도한다. 정상적인 경우 체내 제거기전인 superoxide dismutase(SOD), catalase, carotenoid 및 glutathione 등에 의해 제거되지만, 체내에 남아있는 ROS는 뇌 신경세포의 퇴화와 사멸을 유도하여 올바른 신경망 형성에 부정적으로 영향을 학습능력과 기억력을 저하시키며, 심할 경우 파키슨씨병, 알츠하이머와 같은 퇴행성 뇌질환을 유발시킨다.

또한 뇌의 학습, 기억과 같은 인지능력은 acetylcholine(ACh)과 같은 신경전달물질에 의해 나타난다. 신경세포 말단에서 분비되는 ACh는 학습과 같은 외부자극을 시냅스의 수용체를 통해 정상적으로 신호를 전달한 뒤 acetycholinesterase(AChE)에 의해 acetate와 choline으로 분해되어 다시 부분 재흡수된다. 이러한 과정을 cholinergic system이라 하며 알츠하이머 환자들의 대부분은 이 과정에서 심각한 문제가 일어난다고 알려져 있다. ACh의 감소는 뇌의 인지능력을 손상시켜 정상적으로 작동하지 못하게 한다.

따라서 AChE inhibitor는 알츠하이머 환자들의 치료제로써 많이 사용되고 있다. 또한 고혈압 역시 뇌졸중과 동맥경화의 원인이 되는 뇌 혈관질환으로서 Angiotensin II에 의해 유도된다. Angiotensin II는 renine에 의해 분해된 angiotensine이 angiotensin I converting enzyme(ACE)에 의해 전환된 고혈압 유발 효소이다. 이러한 angiotensin II는 동맥혈관을 수축시키고 혈관을 확장시키는 효소인 bradykinin을 분해함으로써 혈압을 상승시킨다. 뿐만 아니라 스트레스 역시 고혈압의 원인이 된다.

만병의 근원이라고 할 수 있는 ROS 역시 스트레스에 의해 생성이 촉진된다. 뿐만 아니라 angiotensin II는 고혈압의 주된 원인인 스트레스에도 영향을 미친다는 연구결과가 있다. Nrf2의 항산화 target 유전자의 발현을 억제시킴으로써 ROS의 수준을 증가시키고 NF-κB signaling을 통해 superoxide dismutase (SOD)를 감소시켜 산화스트레스를 유도한다.

석창포는 천남성과(Araceae)에 속하는 다년생 초본으로 한국, 중국, 일본 등지에서 자생하고 있으며, 한국에서는 중부와 남부지방에서 자생한다. 석창포는 산골짜기에서 자라며 뿌리줄기는 옆으로 길게 자라고 지상에 있는 줄기와 더불어 독특한 향기가 나는 식물이다. 석창포는 연못가나 도랑가에서 자라는 일반 창포보다 잎이 보다 좁고 길이가 짧으며 뿌리가 가는 특징이 있다. 또한 석창포의 다른 이름으로 수검초, 요구, 창본, 창양, 창초, 창포, 구절창포 등이 있다.

원지는 무환자나무목 원지과의 여러해살이 풀로 한국의 중부, 이북과 중국의 북부지역에서 자생한다. 꽃잎은 윗부분이 벌어지고 밑부분이 붙어 있으며 끝이 솔처럼 잘게 갈라진다. 열매는 삭과(?果)로서 납작하고 2개로 갈라지며 종자에는 털이 빽빽이 난다. 한방에서는 뿌리를 원지라고 하며 거담제, 강장제, 강정제로 쓴다.

본 발명은 석창포 및 원지를 활용하여 조성물의 기억, 학습과 같은 뇌 기능 개선에 대한 효과를 조사하기 위하여 유해 활성산소종 소거능력과 인지능력 관련 효소인 AChE(acetylcholine esterase)와 고혈압 유발 효소인 ACE(Angiotensin Converting Enzyme)의 활성효과와 뇌의 혈액순환과 관련된 효소들의 활성효과를 실험하고, 이에 따라 활성산소제거, 지질과산화에 대한 항산화 활성, DNA 손상에 대한 항산화 효과, ACE 효소 저해활성 등의 효과를 확인 크게 높일 수 있는 방법을 제시하고 석창포 및 원지를 포함한 추출물이 포함된 건강기능 개선의 식품 내지 약품으로 활용될 수 있도록 한다.

특허문헌 1은 석창포(Acorus gramineus Solander)를 비극성 용매로 초임계 추출하여 얻어지는 석창포 친유성 추출물을 포함하는 피부노화방지 조성물에 대한 발명을 개시하는 있으나, 본원발명에서 제시하는 효과상 특징에 대한 인식이 없고, 상기 효과의 인식에 따른 구성의 한정에 대한 개시가 없다.

KR 10-2003-0029563 A

본 발명의 목적은 세포독성이 낮아 부작용이 적고 인지능력 개선효과가 뛰어난 석창포 및 원지를 포함하는 인지기능 개선용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 석창포 및 원지를 포함하는 인지기능 개선용 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 석창포 및 원지를 포함하는 인지기능 개선용 조성물은 1 : 10 내지 10 : 1 중량비로 혼합되고, 활성산소종의 제거, DNA 손상에 대한 항산화, ACE(Angiotensin Converting Enzyme) 효소 저해활성, AChE(acetylcholine esterase) 저해 활성, NO(Nitric oxide) 생성 억제활성, 산화질소 생성 효소 NOS-2 발현 증가활성 및 PC12세포에서 NF-κB 전사활성 증가효과를 나타내는 것일 수 있다.

상기 석창포 추출물 또는 원지 추출물은 물, 탄소수 1 내지 5의 알코올, 헥산, 메틸렌클로라이드 및 그 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나를 추출용매로 하여 추출된 것일 수 있다.

상기 석창포 또는 원지 추출물은 상기 석창포 또는 원지에 바실러스 리체니포르미스(Bacillus lichenifomis) 또는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 중 1종 이상의 미생물을 접종하여 발효한 뒤 추출된 것일 수 있다.

상기 바실러스 리체니포르미스는 건조된 석창포 또는 원지의 질량 대비 0.0001 내지 0.05%(w/v)로 접종된 것일 수 있다.

상기 석창포 추출물 또는 원지 추출물은 분쇄된 석창포 또는 원지를 1기압 상태에서 녹는점이 30℃ 이하인 용매와 함께 불활성 기체를 사용하여 20 내지 35 기압으로 가압한 뒤 상기 1기압 상태에서 녹는점이 30℃ 이하인 용매 및 불활성 기체를 배출하여 제조된 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따른 석창포 및 원지를 포함하는 인지기능 개선용 조성물의 제조방법은 건조된 석창포를 일정한 크기로 절단하여 1기압 상태에서 녹는점이 30℃ 이하인 용매와 혼합하여 용매혼합물을 제조하는 용매혼합단계; 상기 혼매혼합물을 반응기에 넣고 30 내지 35℃의 온도를 유지하면서 불활성 기체를 주입하여 반응기 내 압력이 20 내지 35 기압이 되도록 하는 반응단계; 상기 반응단계 이후 상기 반응기에서 불활성 기체와 함께 상기 1기압 상태에서 녹는점이 30℃ 이하인 용매를 배출하여 입자화 된 석창포 추출물을 제조하는 배출단계; 및 상기 입자화된 석창포 추출물을 원지 추출물에 혼합하여 혼합 추출물을 제조하는 혼합단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 원지 추출물은 물, 탄소수 1 내지 5의 알코올, 헥산, 메틸렌클로라이드 및 그 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나를 추출용매로 하여 추출된 것일 수 있다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 석창포 및 원지를 포함하는 인지기능 개선용 조성물은 1 : 10 내지 10 : 1 중량비로 혼합되고, 활성산소종의 제거, DNA 손상에 대한 항산화, ACE(Angiotensin Converting Enzyme) 효소 저해활성, AChE(acetylcholine esterase) 저해 활성, NO(Nitric oxide) 생성 억제활성, 산화질소 생성 효소 NOS-2 발현 증가활성 및 PC12세포에서 NF-κB 전사활성 증가효과를 나타내는 것일 수 있다.

뇌의 기능을 저하시키는 다양한 요인들 중 활성산소 종은 뇌 세포 괴사, DNA 파괴, 조직의 변형 및 파괴와 같은 산화적 손상을 야기 시켜 지각 능력, 학습 능력, 기억력 등과 같은 인지능력을 관장하는 신경망형성을 파괴한다. 자외선이나 다양한 스트레스적 요인에 의해 체내에서 제거되지 못하고 남아있는 활성산소에 의해 뇌의 신경 세포들이 손상되면 뇌 기능을 저하시킬 뿐만 아니라 심하면 대사질병과 염증, 암 그리고 알츠하이머, 파키슨씨병 등과 같은 심각한 퇴행성 뇌 질환을 유발한다.

상기 인지기능 개선효과를 가지는 석창포 및 원지 추출물은 이러한 체내에 잔류할 수 있는 유해 활성산소종(Reactive Oxygen Species, 이하 ROS라 한다)의 제거에 탁월한 효과를 가질 수 있다.

체내 많은 성분들 중 철은 대사활동에 필수적인 요소이지만 Fe^2＋는 체내의 과산화 수소와 반응하는 Fenton reaction에 의해 hydroxyl radical을 형성하여 체내에 유해한 산화 효과를 나타낸다. 상기 석창포 및 원지 추출물은 하기의 시험예를 통해 알 수 있는 와 같이 DPPH radical 소거에는 효과가 없지만 hydroxyl radical 제거 능력이 탁월한 것으로 보아 hydroxyl radical의 형성을 억제함으로써 항산화 방어기작을 나타내는 것을 알 수 있다.

나아가 상기 석창포 및 원지 추출물은 DNA 산화의 억제에 대한 우수한 활성을 나타내고 있다.

또한, 하기의 시험예를 기초로 볼 때, 상기 석창포 및 원지 추출물을 포함하는 조성물에 의하는 경우 ACE의 활성 억제에 매우 우수한 효과를 가지며, AChE의 활성 억제효과도 가진다. 따라서, 상기 석창포 추출물의 ACE의 활성 및 AChE의 활성에 대한 억제로 뇌의 비정상적 기능을 막아 뇌의 기능이상에 관한 질병의 예방효과를 나타낼 수 있다.

한편, 외부로부터 오는 학습, 인지 등의 자극은 뇌의 해마에서 단기 기억과 장기 기억으로 입력된다. 이러한 뇌의 기능은 중추 신경전달물질들이 시냅스의 수용체에서 반응을 일으켜 전달되는 것으로 dopamine, acetylcholin (ACh)등이 대표적인 신경전달물질들이다. 해마에서 생성된 ACh는 분해효소인 AChE에 의해 가수분해 되어 acetate기와 choline으로 분해되는데 이러한 ACh의 감소는 심각한 기억 손실을 유발하며 또한 퇴행성 뇌 질환인 알츠하이머와 매우 밀접한 관계가 있다고 알려져 있다.

상기 석창포 및 원지를 포함하는 인지기능 개선용 조성물은 석창포 추출물 및 원지 추출물이 1 : 10 내지 10 : 1 중량비로 혼합되는 것일 수 있다.

상기 범위에 의하는 경우 활성산소종의 제거, DNA 손상에 대한 항산화, ACE(Angiotensin Converting Enzyme) 효소 저해활성, AChE(acetylcholine esterase) 저해 활성, NO(Nitric oxide) 생성 억제활성, 산화질소 생성 효소 NOS-2 발현 증가활성 및 PC12세포에서 NF-κB 전사활성 증가효과를 나타냄으로써 보다 효과적으로 두뇌 인지기능을 증진시킬 수 있는데, 더 바람직하게는 상기 석창포 추출물 및 원지 추출물이 5 : 1 내지 8 : 1 중량비로 포함된 것일 수 있다. 상기 범위에 의하는 경우 두뇌 인지기능 개선효과가 더 높아질 수 있다.

상기 석창포 추출물은 조성물 총량에 대하여 15 중량% 미만으로 포함되는 것일 수 있고, 상기 원지 추출물은 조성물 총량에 대하여 12 중량% 미만으로 포함되는 것일 수 있다. 상기 범위에 의하는 경우 세포독성이 없어 상기 조성물 사용에 따른 부작용 발생을 억제할 수 있다. 더 바람직하게는 상기 석창포 추출물은 조성물 총량에 대하여 6 중량% 미만으로 포함되는 것일 수 있고, 상기 원지 추출물은 조성물 총량에 대하여 8 중량% 미만으로 포함되는 것일 수 있다. 상기 범위에 의하는 경우 세포독성이 거의 없으므로 대상군에 차이에 따른 부작용 발생을 억제할 수 있는 장점이 있다.

탄소수 1 내지 5개의 알코올은 70 내지 100 중량% 농도의 에탄올일 수 있다. 상기 에탄올을 사용하는 경우 석창포 또는 원지에 포함된 인지능력 개선을 위한 유효성분이 효과적으로 추출될 수 있고, 상기 에탄올 농도가 70 중량% 미만인 경우 상기 추출물의 두뇌 인지능력의 개선 효과가 저하될 수 있다.

상기 미생물 접종에 의하는 경우 상기 미생물의 발효에 의하여 두뇌 인지능력 개선을 위한 유효성분의 활성이 증대하여 hydroxyl radical의 소거능과 DNA 산화를 억제하는 효과가 크게 높아진다. 특히 상기 미생물 접종은 석창포 또는 원지에 접종하여 발효시키는 경우 그 효과가 매우 우수하다.

0.01%(w/v) 미만으로 접종시키는 경우 발효과정이 진행되지 않거나 발효기간이 너무 길어지는 문제가 있고, 0.05%(w/v)을 초과하여 접종시키는 경우 과발효로 hydroxyl radical의 소거능을 가지는 유효성분의 활성 저하되므로 인지능력 개선을 위한 효과가 오히려 저하되고 세포독성이 높아지는 문제가 발생할 수 있다.

바람직하게는 상기 미생물 접종은 바실러스 리체니포르미스(Bacillus lichenifomis)을 사용한 것으로 건조된 석창포 또는 원지의 질량 대비 0.01 내지 0.03%(w/v)로 접종시킨 것일 수 있다.

상기 미생물은 바실러스 리체니포르미스(Bacillus lichenifomis)를 단독으로 사용한 경우 상기 추출물의 세포독성을 낮출 뿐만 아니라 hydroxyl radical의 소거능과 DNA 산화를 억제하는 효과가 가장 우수하여 두뇌 인지능력 개선에 효과가 뛰어날 수 있다.

상기 발효는 1일 내지 7일 동안 이루어지는 것이 바람직하다. 상기 발효가 1일 미만으로 이루어지는 경우 미생물 활성에 따른 인지능력 개선 효과를 나타낼 수 있는 유효성분의 증가 효과가 미미하고, 7일 이상 발효가 진행되는 경우 상기 유효물질의 함량이 오히려 감소하는 문제가 있다.

더 바람직하게는 상기 석창포 또는 원지를 건조한 후에 증숙시키는 것일 수 있다. 증숙된 석창포 또는 원지를 사용하거나 증숙된 석창포 또는 원지를 상기 미생물을 사용하여 발효시키는 경우 상기 석창포 및 원지 추출물에 포함된 hydroxyl radical의 소거능과 DNA 산화를 억제를 위한 유효물질이 크게 증가하여 인지능력 개선을 높이는 효과가 우수할 수 있다.

본 명세서에서 전반에 걸쳐 사용된 "불활성 기체"는 이산화탄소 기체 또는 질소 기체와 같이, 반응성이 없거나 매우 낮은 것이고 초임계유체(supercritical fluid)가 될 수 있는 기체로 정의하며, '초임계유체' 또는 '초임계유체가스'를 포함하는 것으로 본다.

또한 본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 "1 기압 상태에서 녹는점이 30℃ 이하인 용매"는 기압(1atm), 30℃ 이하의 온도에서 고체상을 유지하고, 녹는점이 40 내지 150℃, 바람직하게는 40 내지 90℃로 비교적 낮으며, 상기 불활성 기체에 대한 용해도가 큰 화합물을 의미하는 것으로 정의한다. 한편, 탄소수 10 내지 22의 포화 지방산 및 그 에스테르 화합물 및 그 알코올 화합물, 탄소수 10 내지 22의 포화지방산기를 갖는 모노- 또는 디-글리세라이드 화합물, 탄소수 16 이상의 탄화수소, 탄소수 10 내지 22의 트리글리세라이드 화합물의 지방산 환원 화합물, 탄소수 6 내지 22의 선형 또는 분지형 디올 화합물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것이 사용될 수 있다.

상기 1기압 상태에서 녹는점이 30℃ 이하인 용매 및 불활성 기체를 사용하여 추출한 석창포 추출물 또는 원지 추출물은 인지능력 개선을 위한 유효성분에 대한 효과적인 추출이 가능할 뿐만 아니라 체내 흡수율이 높아 상대적으로 적은 양의 사용으로 인지능력 개선에 높은 효과를 나타낼 수 있으므로 상기 유효성분의 활성을 증진시키면서도 상기 조성물의 사용에 따른 부작용의 문제를 발생시키지 않을 수 있는다는 장점을 가진다.

바람직하게는 상기 석창포는 미생물 접종에 의해 발효된 것을 일정한 크기로 분쇄하여 사용하는 것일 수 있고, 더 바람직하게는 상기 석창포는 증숙된 석창포를 미생물 접종을 발효하여 증숙한 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따른 석창포 및 원지를 포함하는 인지기능 개선용 조성물의 제조방법은 건조된 석창포를 일정한 크기로 절단하여 1기압 상태에서 녹는점이 30℃ 이하인 용매와 혼합하여 용매혼합물을 제조하는 용매혼합단계; 상기 혼매혼합물을 반응기에 넣고 30 내지 35℃의 온도를 유지하면서 불활성 기체를 주입하여 반응기 내 압력이 20 내지 35 기압이 되도록 하는 반응단계; 상기 반응단계 이후 상기 반응기에서 불활성 기체와 함께 상기 용매를 배출하여 입자화 된 석창포 추출물을 제조하는 배출단계; 및 상기 입자화된 석창포 추출물을 원지 추출물에 혼합하여 혼합 추출물을 제조하는 혼합단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 제조방법에 의하는 경우 석창포가 수 마이크로미터 또는 그 이하의 수백 나노미터 크기의 작은 입자로 분산된 형태로 얻어질 수 있고, 상기 입자의 재성장 내지 재결정화가 낮아 체내 흡수율이 높아 상대적으로 작은 용량으로 인지능력 개선효과를 낼 수 있다는 장점이 있다.

상기 배출단계에서 얻어진 고형물은 10℃ 이하의 온도에서 급속냉각하고, 상기 원지 추출물에 혼합하여 상기 석창포 추출물이 0.0001 내지 15 중량%, 상기 원지 추출물이 0.00003 내지 3 중량%가 되도록 농도를 조정하는 것일 수 있다.

상기 급속냉각에 의하는 경우 유효성분의 손실이 없고 비교적 표면적인 넓고 용해도가 높은 나노사이즈의 입자형성이 가능하므로 조성물에 대한 분산성이 높을 뿐 아니라, 체내에 흡수율이 보다 높아지는 장점을 가진다.

본 발명에 따른 석창포 및 원지를 포함하는 인지기능 개선용 조성물은 세포독성이 낮아 부작용이 적고, 활성산소종의 제거, DNA 손상에 대한 항산화, ACE(Angiotensin Converting Enzyme) 효소 저해활성, AChE(acetylcholine esterase) 저해 활성, NO(Nitric oxide) 생성 억제활성, 산화질소 생성 효소 NOS-2 발현 증가활성 및 PC12세포에서 NF-κB 전사활성 증가효과가 매우 우수하여 인지능력 개선에 대한 효과가 뛰어나다.

따라서 상기 석창포 및 원지를 포함하는 인지기능 개선용 조성물을 포함하는 건강기능 식품 또는 건강보조재 등을 널리 활용될 수 있는 장점을 가진다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

[제조예: 실시예 및 비교예의 제조]

동일하게 세척 및 건조된 석창포 및 원지를 사용하여 하기의 실시예 및 비교예를 제조하였다.

실시예 1 및 비교예 1 및 2에서 사용한 석창포 추출물과 원지 추출물은 석창포와 원지를 각각 에탄올로 추출하여 혼합하였고, 혼합비율은 하기의 표1에 나타낸 바와 같다.

실시예 2 및 3에서 사용한 석창포 추출물과 원지 추출물은 각각 석창포와 원지를 증숙기에 넣어 60℃에서 40분간 1차 증숙하고, 다시 90℃ 이하에서 2시간 동안 2차 증숙하였다. 상기 증숙된 석창포와 원지를 열풍건조한 뒤 각각의 석창포 및 원지의 중량 대비 0.015%(w/v)로 바실러스 리체니포르미스(Bacillus lichenifomis)를 접종시켜 15 내지 37℃를 유지하면서 3일간 발효하였다. 이후 상기 발효된 각각의 석창포와 원지를 0.15 내지 0.2mm로 분쇄하고 상기 분쇄된 각각의 석창포 및 원지와 60부피%의 에탄올 수용액을 1 : 3 내지 3 : 1의 부피비로 혼합하여 추출하였다.(상기 추출과정은 20 내지 30℃를 유지하면서 20 내지 25시간 동안 침전물을 침전시킨 뒤 여과하고, 상기 여과로 모아진 여과액을 rotary vacuum evaporator (Buchi Rotavapor R-144, Switzerland) 농축한 다음 190℃ 3시간 동안 hydrodistillation을 통해 분리하였다) 상기 석창포 추출물과 원지 추출물의 혼합비율은 하기의 표 1에 나타낸 바와 같다.

실시예 4에서 사용한 석창포 추출물은 분쇄한 석창포를 반응기에 투입하고, 30 내지 35℃의 온도를 유지하면서 상기 반응기에 라우르산(lauric acid) 및 이산화탄소를 주입하여 20 내지 35 기압까지 가압한 뒤 5시간 뒤에 상기 이산화탄소를 흘려보내면서 라우르산을 제거하여 얻어진 분말을 사용하였고, 상기 석창포 추출물을 에탄올을 사용하여 추출한 원지 추출물과 혼합하고 이를 물에 분산하여 제조하였다.

	실시예1	실시예2	실시예3	실시예4	비교예1	비교예2
석창포 추출물	100	100	100	100	100	0
원지 추출물	16	10	16	16	0	100

(단위: 중량부)

하기의 실험예에서는 상기 표1에 따른 실시예 및 비교예를 물에 희석하여 상기 실시예 및 비교예의 농도를 10w%로 조정하여 사용하였다.

[실험예: 실시예, 비교예 및 대조군에 대한 활성시험]

1. DPPH radical 분석

1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical을 이용하여 실시예 및 비교예에 따른 radical 소거능력을 측정하였다.( Imai J, Ide N, Nagae S, Moriguchi T, Matsuura H, Itakura Y. Antioxidant and radical scavanging effects of aged garlic extract and its constituents. Planta Medica-J Med Plant Res 60, 417-420, 1994.) 상기 실시예 및 비교예를 DPPH 용액을 가하여 10초 동안 잘 혼합한 다음, 실온에서 20분 동안 반응시킨 후 525 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH radical 함량은 시료 첨가군과 대조군의 흡광도 비를 %값으로 환산하여 나타내었다.

생체에서 산화적 스트레스와 관련되어 있는 DPPH, superoxide anion과 같은 활성산소종에 대하여 상시 실시예 및 비교예 따른 소거능력 및 환원력에 대하여 조사하였다. DPPH radical 소거법은 DPPH radical이 항산화 물질로 인해 환원되면, 자색이 탈색되는 정도를 지표로 하여 지질과산화의 초기 억제 정도를 예측할 수 있다. 상기 비교예 및 실시예의 항산화 효과를 알아보기 위해 DPPH를 이용하여 항산화 작용을 측정하여 하기의 표 2에 나타내었다(실시예 및 비교예를 처리하지 않은 군(blank)을 기준(100%)으로 DPPH radical(%)로 나타내었다.). 하기의 표 2를 참조하면, DPPH에 대하여 실시예의 소거효과가 나타났다.

	실시예 1	실시예2	실시예3	실시예4	비교예1	비교예2
DPPH radical(%)	62	55	52	39	77	80

2. 환원력 분석

Oyaizu의 방법(Oyaizu M. Studies on products of the browning reaction. Antioxidative activities of browning reaction products prepared from glucosamine. Japa J Nutrition [Eiyogaku Zasshi] 44, 307-315, 1986.)에 따라 측정하였다. 시료 1 ml에 pH 6.6의 200 mM 인산 완충액 및 1%의 potassium ferricyanide를 각각 1 ml씩 차례로 가하여 교반한 후 50℃의 수욕상에서 20분 동안 반응시켰다. 여기에 10% TCA (trichloroacetic acid)용액을 1 ml 가하여 13,500× g에서 15분 동안 원심분리하여 상등액 1 ml에 증류수 및 ferric chloride 각 1 ml을 혼합한 후 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 실시예 및 비교예의 환원력은 대조군의 값을 기준으로 흡광도 비를 %값으로 환산하여 하기의 표 3에 나타내었다.

	실시예 1	실시예2	실시예3	실시예4	비교예1	비교예2
reducing power(%)	228	233	392	502	191	170

3. Superoxide anion radical 소거효과 측정

Superoxide anion 라디칼 소거능은 Fridovich(Fridovich I. Superoxide anion radical (O·^-2), superoxide dismutases, and related matters. J Biol Chem 272, 18515, 1997.)의 방법에 의해 정하였다. 실시예 및 비교예 0.1 ml와 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.5) 0.6 ml에 0.4 mM xanthine과 0.24mM nitro bluetetrazolium (NBT)를 녹인 기질액 1 ml를 첨가하고 xanthineoxidase (0.049 U/ml) 1 ml를 가하여 37℃에 서 20분간 반응시킨 후 1 N-HCl을 1 ml를 가하여 반응을 종료시킨 다음, 반응액 중에 생성된 superoxide anion radical의 양을 560 nm에서 흡광도를 측정하여 무처리군(100%)을 기준으로 비교하여 하기의 표 4에 나타내었다.

	실시예 1	실시예2	실시예3	실시예4	비교예1	비교예2
Superoxide anion(%)	88	77	75	47	99	97

4. In vitro 지질과산화에 대한 항산화 활성

상기 실시예 및 비교예를 linolenic acid emulsion과 혼합한 후에 0.8 mM H₂O₂ 및 0.8 mM FeSO₄를 혼합한 용액을 5시간 동안 반응시킨 후 0.4% TBA를 첨가하고 95℃에서 2시간 반응시킨 다음 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 그 다음 15：1 비율의 n-butanol : pyridine 용액을 500 μl을 첨가하고 1,000 × g에서 10분 동안 원심분리한 후 상등액을 532nm에서 흡광도를 측정하여 지질과산화 정도는 시료 첨가 전후의 흡광도 비를 %값으로 환산하여 하기의 표 5에 나타내었다.

	실시예 1	실시예2	실시예3	실시예4	비교예1	비교예2
lipid peroxidation(%)	88	79	75	66	88	99

5. Hydroxyl radical에 의한 DNA 손상 분석

Genomic DNA는 약간 변형된 표준 과정에 따라 PC12 세포로부터 추출하였다(Sambrook J, Russell DW. Molecular cloning: a laboratory manual. New York, CSHL Press, 2001.). Fenton 반응에 의하여 발생된 hydroxyl radical에 노출된 DNA 산화는 기존에 실험된 방법에 따라 수행되었다(Milne L, Nicotera P, Orrenius S, Burkitt M. Effects of glutathione and chelating agents on copper-mediated DNA oxidation: pro-oxidant and antioxidant properties of glutathione. Arch Bi℃hem Biophys 304, 102-109, 1993.). 먼저 100 μl의 DNA 용액에 실시예 및 비교예, 200 μM FeSO₄, 1 mM H₂O₂ 및 50 μg/ml genomic DNA를 첨가하였다. 반응 혼합물을 30분 동안 상온에서 반응시킨 후 10 mM EDTA를 첨가하여 반응을 종결시켰다. 1 μg의 DNA를 포함하는 20 μl의 반응혼합물을 1% agarose gel에서 100 V로 30분 동안 전기영동하였다. Gel은 1 mg/ml ethidium bromide로 염색하여 물로 세척하여 UV로 LAS3000 image analyzer (Fujifilm Life Science, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였고, 무처리군을 기준으로 그 결과를 %화 하여 하기의 표 6에 나타내었고, 그 % 수치가 낮을수록 우수한 것이다. 하기의 표 6을 참조하면, 실시예에 의하는 경우 hydroxyl radical에 의한 DNA의 손상을 감소시킬 수 있다는 것을 알 수 있고 특히 실시예 2 내지 4애 의하는 경우 그 효과가 상당히 우수하다는 것을 알 수 있다.

	실시예 1	실시예2	실시예3	실시예4	비교예1	비교예2
DNA oxidation(%)	77	64	55	72	88	79

6. ACE (Angiotensin I Converting Enzyme) 활성 측정

ACE 활성은 0.3 M NaCl을 포함한 0.1 M sodium borate buffer (pH 8.3)에 토끼 rabbit lung acetone powder을 1 g/10ml (w/v)의 농도로 4℃에서 2시간 동안 추출한 후, 원심분리(4℃, 4,000 rpm, 40분)하여 ACE 조효소액을 얻었다. 실시예 및 비교예에 각각 0.1 M 붕산나트륨 완충액(pH 8.3) 100 μl와 ACE 조효소액 50 μl를 가한 다음, 37℃에서 5분 동안 예비반응을 시킨 후, 0.3 M NaCl이 포함된 0.1 M 붕산나트륨 완충액(pH 8.3) 5 ml에 HHL (hippuryl-histidyl-leucine) 25 mg을 첨가하여 만든 기질 50 μl를 가하여 37℃에서 30분간 반응을 시켰다. 이에 1 N HCl을 250 μl를 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 아세트산 에틸(ethyl acetate) 1.5 ml를 가해 15초 동안 교반한 다음, 원심분리(3,000 rpm, 5 min, 4℃)하여 상등액 1 ml을 얻었다. 이 상등액을 완전히 건조시켜 증류수 3 ml를 넣어 교반 한 후 분광광도계로 228 nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성대조군으로는 증류수 50 μl를 사용하였으며, 양성대조군으로는 captopril 0.1%를 사용하여 실시예와 그 활성을 비교하였다. ACE 효소활성은 무처리군을 기준(100%)으로 시료 첨가 전후의 흡광도 비를 %값으로 환산하여 하기의 표 7에 나타내었다.

	실시예 1	실시예2	실시예3	실시예4	비교예1	비교예2
ACE inhibition(%)	176	181	188	222	155	167

7. AChE (Acetylcholine esterase) 활성측정

PC12 세포로부터 분리한 AchE (25 mU/ml) 50 μl를 반응효소로, 0.1 M의 인산나트륨 완충액(pH 8.0)에 녹인 1mM의 아세틸콜린 요오드화물을 기질로 하였고, 발색 시약은 39.6 mg의 5,5'-dithiobis-2-nitrobenzoic acid 및 15 mg의 탄산수소나트륨을 0.1 M 인산나트륨 완충액(pH 7.0) 10 ml에 용해하여 제조하였다. 효소반응은 다음과 같이 전개하였다. 2 ml의 0.1 M 인산나트륨 완충액(pH 8.0)에 20 μl의 실시예 및 비교예, 200 μl의 10 mM DTNB 용액 및 100 μl의 효소 (0.03 U)를 가하고 37℃에서 10분간 전 유지시킨 다음, 기질 200 μl를 가해 3분간 반응시킨 후, 분광광도계로 412 nm에서 흡광도 값을 측정하였다. AChE의 활성은 무처리군을 기준(100%)으로 실시예 및 비교예의 첨가 전후의 흡광도 비를 %값으로 환산하였다. 전후의 흡광도 비를 %값으로 환산하여 하기의 표8에 나타내었다. 하기의 표 8을 참조하면 실시예에 따른 조성물을 사용한 경우 AchE 활성 억제 효과가 관찰되었으며 실시예 4가 가장 우수한 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.

	실시예 1	실시예2	실시예3	실시예4	비교예1	비교예2
AChE activity(%)	77	72	71	64	88	78

8. PC12세포에서 NF-κB 전사활성에 대한 시험

PC12 cells를 6-well plate에 분주하고 37℃에서 배양하였다. 세포가 약 70 내지 80%의 증식했을 때, 혈청이 함유되지 않은 DMEM 배지로 세척하고 5시간 동안 혈청 및 항생물질 없이 DMEM로 배양하였다. 이어 세포를 lipofectamine 시약(Invitrogen, USA)으로 well 당 DNA 총량을 조절한 NF-κB promoter가 삽입된 pGL3 reporter vector(NF-?B-Luc) 1 μg 및 pcDNA 3.1를 300 ng 함유 DNA 혼합물로 transfection 시켰다. 72 시간 배양한 후, 세포를 용리시키고, luminometer (Tecan Austria GmbH, Austria)를 이용하여 luciferase 활성을 측정하였다. Well 당 transfection된 세포수의 차이를 보정하기 위하여, 기질로서 o-nitrophenylbeta-galactopyranoside를 사용하여 β-galactosidase 활성을 모니터링 하였다. 데이터를 "평균±표준편차(n=3)"로 나타내었다. NF-κB promoter-luciferase construct를 PC12 cells에 transfection시킨 후에 실시예 및 비교예를 처리한 후 NF-κB promoter-luciferase construct를 이용하여 NF-κB의 전사 활성이 실시예 및 비교예에 의해 영향을 받는지 여부를 조사하여 실시예 1을 기준으로 지수(%)화 하여 하기의 표 9에 나타내었다. 상기 지수가 높을수록 NF-κB의 전사 활성이 우수한 것이다.

	실시예 1	실시예2	실시예3	실시예4	비교예1	비교예2
Relative luciferase activity(%)	100	250	273	304	100	98

상기 실험을 기초로 본 발명에 따른 실시예의 경우 석창포 또는 원지의 단독추출물에 비하여 활성산소종의 제거, DNA 손상에 대한 항산화, ACE(Angiotensin Converting Enzyme) 효소 저해활성, AChE(acetylcholine esterase) 저해 활성, NO(Nitric oxide) 생성 억제활성, 산화질소 생성 효소 NOS-2 발현 증가활성 및 PC12세포에서 NF-κB 전사활성 증가효과를 가진다는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 상기 실시예를 기초로 두뇌 인지능력 개선을 위한 다양한 제품 군에 활용될 수 있다.

특히, 실시예 2 내지 4에 있어 이러한 효과가 더 뛰어나기 때문에 그 활용도가 더 높다고 본다.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims

건조된 석창포를 일정한 크기로 절단하여 1기압 상태에서 녹는점이 30℃ 이하인 용매와 혼합하여 용매혼합물을 제조하는 용매혼합단계;
상기 혼매혼합물을 반응기에 넣고 30 내지 35℃의 온도를 유지하면서 불활성 기체를 주입하여 반응기 내 압력이 20 내지 35 기압이 되도록 하는 반응단계;
상기 반응단계 이후 상기 반응기에서 상기 불활성 기체와 함께 상기 용매를 배출하여 입자화 된 석창포 추출물을 제조하는 배출단계; 및
상기 입자화된 석창포 추출물을 원지 추출물에 혼합하여 혼합 추출물을 제조하는 혼합단계를 포함하는 것인
석창포 및 원지를 포함하는 인지기능 개선용 조성물의 제조방법.
제 1항에 있어서,
석창포 추출물 및 원지 추출물은
1 : 10 내지 10 : 1 중량비로 혼합된 것인
석창포 및 원지를 포함하는 인지기능 개선용 조성물의 제조방법.
삭제
삭제
삭제
삭제
제 1항에 있어서,
상기 원지 추출물은 물, 탄소수 1 내지 5의 알코올, 헥산, 메틸렌클로라이드 및 그 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나를 추출용매로 하여 추출된 것인
석창포 및 원지를 포함하는 인지기능 개선용 조성물의 제조방법.