KR20180116052A - 유산균 발효 여주 추출물을 포함하는 항산화 및 항당뇨 조성물 - Google Patents
유산균 발효 여주 추출물을 포함하는 항산화 및 항당뇨 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 균주를 이용하여 발효시킨 여주(Momordica charantia L.) 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항당뇨 조성물 및 이의 제조방법에 관한 기술 내용을 제공하고자 한다.
본 발명에 따른 조성물은 김치 유산균으로 여주 추출물을 발효하여 제조한 여주 발효 추출물을 유효성분으로 포함함에 따라, 자유 라디칼 소거활성이 높아 항산화 효능을 나타내고, 당뇨현상에서 당화반응 유도체로 인해 발생하는 DNA와 단백질의 손상을 억제하고 당분해효소인 알파 글루코시다제의 활성을 효과적으로 억제하여 항당뇨 효능이 우수하다.
본 발명에 따른 조성물은 김치 유산균으로 여주 추출물을 발효하여 제조한 여주 발효 추출물을 유효성분으로 포함함에 따라, 자유 라디칼 소거활성이 높아 항산화 효능을 나타내고, 당뇨현상에서 당화반응 유도체로 인해 발생하는 DNA와 단백질의 손상을 억제하고 당분해효소인 알파 글루코시다제의 활성을 효과적으로 억제하여 항당뇨 효능이 우수하다.
Description
본 발명은 김치 유산균의 일종인 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)로 발효한 여주 발효 추출물을 포함하는 항산화 및 항당뇨 조성물과 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.
고도의 경제성장, 환경오염, 서구화식 식생활 패턴 등의 다양한 요인으로 인해 당뇨, 치매, 암 등과 같은 성인병 질환을 앓고 있는 환자가 증가함에 따라, 식물 등과 같이 안전성이 보장된 천연물로부터 수득한 소재를 이용하여 건강을 증진시킬 수 있는 용도의 다양한 식품을 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.
여주(bitter melon)는 박과의 덩굴식물로 녹색이 짙고 혹 같은 돌기가 총총하게 많을수록 쓴맛이 강하고 유효성분도 많이 함유하고 있는 것으로 알려져 있으며, 항당뇨 활성, 항암 활성 등의 효능이 있는 것으로 알려져 관심이 증가하고 있고, 이와 같은 여주를 활용한 다양한 식품 개발이 활발히 이루어지고 있다.
일례로, 종래문헌 1인 한국공개특허 제10-2013-0009600호에는 분쇄한 여주를 열수 추출한 여주 열수 추출물을 유효성분으로 포함하는 항노화 활성 등과 같이 건강을 향상시키는 건강식품 조성물에 관한 기술 내용이 개시된 바 있다.
또 다른 예로, 종래문헌 2인 한국공개특허 제10-2012-0042398에는 감압, 여과 및 농축 과정을 거쳐 각종 유기용매에 용해되어 농축된 형태의 여주 추출물을 제조하고, 이를 유효성분으로 포함하는 항암 조성물 및 암 질환 예방 또는 개선용 기능성 건강식품에 관한 기술 내용이 개시된 바 있다.
하지만, 종래에는 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)와 같은 김치 유산균으로 여주 추출물을 발효시켜, 항산화 활성, 항당뇨 효과 등이 여주 추출물에 비해 현저히 향상된 효과를 갖는 여주 발효 추출물을 제조하고, 이를 유효성분으로 함유하여 항산화 및 항당뇨 기능을 갖는 식품을 제조할 수 있는 방법에 관한 기술내용은 개시된 바 없어, 이에 대한 연구가 필요하다.
본 발명의 발명자들은 김치 유산균의 일종인 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 균주를 이용하여 여주 추출물을 발효시켜 제조한 여주 발효 추출물이 항산화 활성이 높고, 항당뇨 효과가 뛰어나다는 사실을 다양한 분석 방법을 통해 확인하였다.
따라서, 본 발명은 김치 유산균으로 발효시킨 여주 발효 추출물을 포함하는 항산화 및 항당뇨 조성물에 관한 기술 내용을 제공하고자 한다.
상기한 바와 같은 기술적 과제를 달성하기 위해서 본 발명은, 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 균주를 이용하여 발효시킨 여주(Momordica charantia L.) 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항당뇨 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 여주 추출물에 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 균주를 접종하여 발효시키는 단계를 포함하는 항산화 및 항당뇨 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물은 김치 유산균으로 여주 추출물을 발효하여 제조한 여주 발효 추출물을 유효성분으로 포함함에 따라, 자유 라디칼 소거활성이 높아 우수한 항산화 효능을 나타내고, 당뇨현상에서 당화반응 유도체로 인해 발생하는 DNA와 단백질의 손상을 억제하고 당분해효소인 알파 글루코시다제의 활성을 효과적으로 억제하여 항당뇨 효능이 우수하다.
도 1은 여주 추출물의 DPPH 라디칼 소거활성을 분석한 결과이다.
도 2는 실시예에 따른 방법으로 제조한 여주 발효물의 DPPH 라디칼 소거활성을 분석한 결과이다.
도 3은 여주 추출물의 ABTS 라디칼 소거활성을 분석한 결과이다.
도 4는 실시예에 따른 방법으로 제조한 여주 발효물의 ABTS 라디칼 소거활성을 분석한 결과이다.
도 5는 여주 추출물의 DNA의 산화적 손상에 대한 보호효과를 분석한 결과이다.
도 6은 실시예에 따른 방법으로 제조한 여주 발효물의 DNA의 산화적 손상에 대한 보호효과를 분석한 결과이다.
도 7은 여주 추출물의 HSA 단백질의 AAPH의 산화적 손상에 대한 보호효과를 분석한 결과이다.
도 8은 실시예에 따른 방법으로 제조한 여주 발효물의 HSA 단백질의 AAPH의 산화적 손상에 대한 보호효과를 분석한 결과이다.
도 9는 여주 추출물이 메틸글리옥살에 의한 Cu,Zn-SOD의 산화적 손상에 미치는 영향을 분석한 결과이다.
도 10은 실시예에 따른 방법으로 제조한 여주 발효물이 메틸글리옥살에 의한 Cu,Zn-SOD의 산화적 손상에 미치는 영향을 분석한 결과이다.
도 11은 (a) 여주 추출물 및 (b) 실시예에 따른 방법으로 제조한 여주 발효물의 α-글루코시다아제 억제활성을 분석한 결과이다.
도 2는 실시예에 따른 방법으로 제조한 여주 발효물의 DPPH 라디칼 소거활성을 분석한 결과이다.
도 3은 여주 추출물의 ABTS 라디칼 소거활성을 분석한 결과이다.
도 4는 실시예에 따른 방법으로 제조한 여주 발효물의 ABTS 라디칼 소거활성을 분석한 결과이다.
도 5는 여주 추출물의 DNA의 산화적 손상에 대한 보호효과를 분석한 결과이다.
도 6은 실시예에 따른 방법으로 제조한 여주 발효물의 DNA의 산화적 손상에 대한 보호효과를 분석한 결과이다.
도 7은 여주 추출물의 HSA 단백질의 AAPH의 산화적 손상에 대한 보호효과를 분석한 결과이다.
도 8은 실시예에 따른 방법으로 제조한 여주 발효물의 HSA 단백질의 AAPH의 산화적 손상에 대한 보호효과를 분석한 결과이다.
도 9는 여주 추출물이 메틸글리옥살에 의한 Cu,Zn-SOD의 산화적 손상에 미치는 영향을 분석한 결과이다.
도 10은 실시예에 따른 방법으로 제조한 여주 발효물이 메틸글리옥살에 의한 Cu,Zn-SOD의 산화적 손상에 미치는 영향을 분석한 결과이다.
도 11은 (a) 여주 추출물 및 (b) 실시예에 따른 방법으로 제조한 여주 발효물의 α-글루코시다아제 억제활성을 분석한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하도록 한다.
본 발명은, 류코노스톡 메센테로이데스 균주를 이용하여 발효시킨 여주 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항당뇨 조성물을 제공한다.
상기 여주(Momordica charantia L.)는 통상적으로 시판되고 있는 다양한 품종의 여주를 제한받지 않고 사용할 수 있으며, 바람직하게는, 한국 재래종 또는 일본 품종을 사용할 수 있다.
상기 여주 추출물은 여주를 열수 추출하거나, 에탄올 추출하거나, 유기용매를 이용해 추출하는 방법 등과 같이 통상적인 다양한 추출물의 제조방법으로 제조한 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는, 여주 분쇄물을 물과 혼합하여 가열하는 열수 추출방법을 통해 수득한 여주 추출물을 사용할 수 있다. 또한, 제조한 여주 추출물을 감압, 농축 및 여과 등의 공정을 통해 처리하여 수득한 여주 발효 추출물을 사용할 수 있다.
상기 여주 발효 추출물은 여주 추출물에 김치 유산균의 일종인 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 균주를 접종한 후, 특정 조건에서 발효시켜 제조한 것으로, 이와 같은 여주 발효 추출물은 여주 추출물에 비해 항당뇨 효과 및 항산화 활성이 더욱 향상되어 우수한 특성을 나타내며, 특히, DPPH 라디칼, ABTS 라디칼 등과 같은 자유 라디칼에 대한 소거활성이 우수하여 DNA와 단백질의 산화적 손상에 대해 우수한 보호 작용을 하고, 당화반응 유도체로 DNA와 단백질을 손상시켰을 때 손상을 억제하고, 당분해효소인 알파 글루코시다아제의 활성을 효과적으로 억제할 수 있어 우수한 항당뇨 효과를 나타낸다.
상기 여주 발효 추출물은 추출물의 원료가 되는 여주가 식품 등급으로 사용할 수 있는 천연식물이므로, 독성 및 부작용도 없어 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 항산화 및 항당뇨 효과가 우수하여 이를 포함하는 조성물은 약학적 용도 또는 식품학적 용도 등으로 사용할 수 있다.
그러므로, 본 발명에 따른 여주 추출물은 항산화 활성 및 항당뇨 효과가 있는 식품, 예컨대, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 등과 같은 형태의 식품 제조에 활용이 가능하며, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 기능성 식품 또는 음료의 제조에 용이하게 활용할 수 있으며, 본원발명에 따른 여주 발효 추출물을 포함하는 조성물은, 기능성 식품, 기능성 음료, 기능성 비타민 복합제 등의 제조에 활용이 가능하며, 과자, 캔디 등과 같은 다양한 식품 가공식품, 조미식품, 소스류, 유가공품, 발효식품, 절임식품 등의 제조에 손쉽게 활용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 조성물은 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제, 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 건강 기능성 식품 제조에 활용될 수 있다.
본 발명에 따른 항산화 및 항당뇨 조성물은 식품의 총중량을 기준으로 중량의 0.001 중량% 내지 90 중량%로 혼합되어 식품제조에 활용이 될 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있으므로 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 여주 추출물에 류코노스톡 메센테로이데스 균주를 접종하여 발효시키는 단계를 포함하는 항산화 및 항당뇨 조성물의 제조방법을 제공한다.
상기 여주 추출물은 세척한 여주를 분쇄하여 여주 분쇄물을 제조하고, 제조한 여주 분쇄물에 물, 알코올, 헥산 등의 유기 용매를 혼합하여 가열, 초음파 조사 등의 통상적인 추출방법을 통해 여주 추출물을 제조할 수 있다.
상기와 같은 방법으로 제조한 여주 추출물에 류코노스톡 메센테로이데스 균주를 접종하고, 25 내지 30 ℃의 온도로 3 내지 15일 동안 배양하여 여주 추출물을 발효시킬 수 있으며, 통상적인 식품의 감압, 농축 또는 여과 등의 공정을 통해 여주 발효 추출물을 제조할 수 있으며, 이와 같은 방법으로 제조한 여주 발효 추출물은 여주 추출물에 비해 항산화 활성 및 항당뇨 효과를 나타내는 유효성분의 포함함량이 증가하여 우수한 항산화 활성 및 항당뇨 효능을 나타낼 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하도록 한다.
제시된 실시예는 본 발명의 구체적인 예시일 뿐이며, 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것은 아니다.
<실시예>
여주 원료에서 이물질을 제거하고 부패된 것을 분리선별하였으며, 선별된 여주 원료를 증류수로 깨끗이 세척하였다. 세척한 여주 원료를 분쇄하여 여주 분쇄물을 제조한 후 여주 분쇄물의 총중량 기준 1.5 배의 정제수를 가하여 골고루 혼합하고, 다양한 시간 동안 여주 조직에 물이 스며들게 하여 여주 원재료를 제조하였다. 제조한 여주 원재료를 고압 멸균기에 투입하고, 121 ℃의 온도로 1시간 멸균시켜 여주 추출물을 제조하였다.
제조한 여주 추출물에 올리고당을 10%, 20% 및 30%의 농도로 배합하여 여주 혼합물을 제조하고, 제조한 여주 혼합물에 젖산균(Leuconostoc mesenteroides)을 접종하고, 30 ℃의 온도 조건으로 5 내지 10일 동안 배양하여 여주 발효물을 제조하였으며, 여주 발효물이 pH 3.4 이하가 되었을 때, 발효를 종료하였다.
제조한 여주 발효물을 여과지 또는 여과용 천을 이용해 여과하였으며, 여과한 여주 발효물을 원심분리하여 당도가 50 brix의 여주 발효물(산도 약 1.5 ± 0.2)이 될 때까지 원심분리하여 농축시켰다.
<실험예 1> 제조한 여주 발효물의 라디칼 소거활성 분석
(1) DPPH 라디칼 소거활성 분석
DPPH 라디칼(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical)은 매우 안정한 자유 라디칼(free radical)로 517 nm의 흡수 파장을 갖는 진한 보라색 화합물이며, 항산화제에 의해 탈색되므로 항산화 활성을 쉽게 측정할 수 있다. 본 발명에서는 제조한 여주 발효물이 갖는 라디칼 소거활성을 분석하기 위해서, 생체외(in vitro) 수준에서 자유 라디칼을 유도한 뒤 여주 발효물과 여주 추출물이 라디칼 소거활성을 갖는지 여부를 관찰하였다.
이를 위해, 시험관에 DMSO 시료를 50 ㎕씩 주입하고, DPPH 용액(0.1 mM, ethanol)을 900 ㎕씩 첨가한 후, 여주 추출물과 발효물을 각각 50 ㎕씩 첨가하여 실온에서 20분 동안 반응시켰다. 반응 후 에탄올에 의해 생긴 불순물을 원심분리(10,000 ×g, 5 분)를 통해 제거한 후, 분광 광도계(spectrophotometer)를 이용해 517 nm 파장의 빛으로 흡광도를 측정하여 여주 발효물 및 추출물의 DPPH 라디칼 소거활성을 아스코르브산(ascorbic acid)과 비교하여 확인하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1(a)에 나타난 바와 같이, 여주 추출물은 라디칼 소거활성을 갖는 것으로 나타났으며, 특히, 여주 추출물을 250 ㎍/mL의 농도로 처리한 결과 60%의 라디칼 소거활성을 나타내었고, 500 ㎍/mL의 농도로 처리한 결과에서는 80%의 높은 라디칼 소거활성을 나타내는 것으로 확인되었다.
또한, 도 1(b)에 나타난 바와 같이, 500 ㎍/mL 농도의 여주 발효물로 처리한 결과 40%의 라디칼 소거활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었으며, 이와 같은 결과를 통해, 여주 발효물은 여주 추출물에 비해 라디칼 소거활성이 조금 낮은 것으로 확인되었다.
상기와 같은 결과는 여주 추출물에 포함된 라디칼 소거활성을 나타내는 물질이 젖산균 발효에 의해 다소 감소하였기 때문인 것으로 예측되었다.
(2) ABTS 라디칼 소거활성 분석
ABTS 라디칼[2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) radical] 소거활성은 일반적인 항산화 능력을 측정하기 위해 이용되며, 녹청색 라디칼이 전환되어 무색의 생성물이 생성되는 정도로 물질이 갖는 항산화 활성을 분석할 수 있다. 본 발명에서는 제조한 여주 발효물이 갖는 라디칼 소거활성을 분석하기 위해서, ABTS 라디칼 용액에 여주 발효물과 여주 추출물을 각각 공급하여 ABTS 라디칼 소거활성을 분석하였다.
먼저, ABTS(7 mM) 및 과황화칼륨(potassium persulfate, 2.5 mM)을 1:1의 중량비로 혼합한 혼합물을 제조하고, 제조한 혼합물을 12시간 동안 실온의 암실에서 녹청색의 발색단과 반응시킨 후, 50배 희석시켜 ABTS 라디칼 용액을 제조하였다.
제조한 ABTS 라디칼 용액 900 ㎕ 및 DMSO 50 ㎕를 시험관에 주입하고, 시험관에 여주 발효물 및 여주 추출물을 각각 50 ㎕씩 첨가하여 실온에서 10분 동안 반응 시킨 후, 분광광도계를 이용해 734 nm 파장의 빛에서 흡광도를 측정하는 방법을 통해서, 여주 발효물 및 여주 추출물이 갖는 ABTS 라디칼 소거활성을 분석하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 이때, 여주 추출물 및 여주 발효물을 ㎍/mL의 농도로 하여 ABTS 라디칼 소거활성을 분석하였고, 아스코르브산과 비교하여 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 여주 추출물[도 2 (a)]에 비해 여주 발효물[도 2 (b)]의 ABTS 라디칼 소거활성이 더욱 우수한 것으로 확인되었으며, 50 ㎍/mL의 저농도 여주 발효물을 혼합한 시료에서 10% 이상의 라디칼 소거활성을 갖는 것으로 확인되었고, 여주 발효물의 첨가 농도가 증가함에 따라 항산화 능력이 더욱 증가한다는 사실을 확인할 수 있었다.
상기와 같은 결과를 통해서, 여주 추출물 및 여주 발효물의 항산화 활성은 측정방법에 따라 결과가 다소 상이하지만 전반적으로 젖산균으로 발효시킨 여주 발효물의 항산화 활성이 더욱 높은 것으로 판단되었다.
<실험예 2> 제조한 여주 발효물이 생체 고분자의 산화적 손상에 미치는 영향 분석
(1) 여주 발효물의 DNA의 산화적 손상에 대한 보호효과 분석
과산화 라디칼(peroxy 라디칼)은 생체 내 고분자 물질 중 DNA와 결합하는 능력이 강해 DNA의 산화적 손상을 유발하며, 이와 같은 DNA의 산화적 손상은 DNA 부가물(adduct)들을 생성하고, 단백질 등의 다른 분자들과 가교결합(cross link)을 유도하기도 하며, 유전자 돌연변이 또는 정상적인 유전자 발현 변화 등이 발생하여 암세포화를 유도하기도 한다. 본 발명에서는 제조한 여주 발효물 및 여주 추출물이 DNA의 산화적 손상에 미치는 영향을 분석하기 위해서, 먼저, 과산화 라디칼 생성 물질인 AAPH[2,2'-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride]를 이용해 DNA 손상을 유도하고, 여주 추출물 및 여주 발효물을 각각 첨가하여 생체외(in vitro) 수준에서 어떤한 영향을 미치는 지를 아가로스 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis) 방법으로 관찰하였다.
이를 위해, DNA 시료는 pUC 19(0.1 mg/mL) 2 ㎕를 사용하였으며, 각각의 DNA 시료에 AAPH 10 mM을 첨가하여 DNA의 산화적 손상을 유도하였다. 산화적 손상은 37 ℃에서 6시간 동안 진행하였고, 아가로스 겔 전기 영동을 통해 DNA의 산화적 손상에 대한 보호작용을 확인하였으며, 그 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다. 도 3 및 도 4의 레인 2(lane 2)에는 AAPH 처리하여 DNA의 산화적 손상을 유도한 결과 DNA의 가닥 절단(strand breakage)이 발생하였고, 도 3의 레인 3 내지 6에는 여주 추출물을 첨가하고, 도 4의 레인 3 내지 6에는 여주 발효물을 첨가하여 과산화 라디칼에 의한 DNA의 손상을 억제하는지 여부를 확인하였으며, 도 3(b) 및 도 4(b)에는 여주 추출물 또는 여주 발효물을 각각 첨가한 시료의 DNA 밴드 밀도를 각각 나타내었다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 여주 추출물을 첨가한 경우에는, 20 ㎍/mL 농도까지 여주 추출물을 처리하여도 DNA 산화적 손상에 대한 보호 작용이 나타나지 않는다는 사실을 확인할 수 있었다.
반면에, 도 4에 나타난 바와 같이, 10 ㎍/mL의 농도로 여주 발효물을 처리한 경우에는, DNA의 산화적 손상에 대한 보호 작용이 나타나는 것을 확인할 수 있었으며, 특히, 20 ㎍/mL 농도의 여주 발효물을 처리한 경우 50% 이상의 DNA의 산화적 손상에 대한 보호 작용을 갖는다는 사실을 확인할 수 있었다.
따라서, 상기와 같은 결과를 통해서, 여주 추출물에 비해 여주 발효물을 처리한 경우, 동일 농도에서 효과적인 DNA의 산화적 손상에 대한 보호 작용을 갖는 다는 사실을 확인할 수 있었다.
상기와 같은 결과를 통해서, 여주 발효물의 경우, 라디칼 소거활성에 대한 결과와 마찬가지로 DNA 산화적 손상 보호 효과에 있어서도 여주 추출물에 비해 여주 발효물의 보호 효과가 더욱 뛰어나다는 사실을 확인할 수 있었으며, 여주 발효물은 매우 뛰어난 항산화 활성을 갖는 것으로 판단되었다.
한편, 메틸글리옥살(methylglyoxal, MG)은 카르보닐 스트레스 유도물질로 여러 가지 효소적, 비효소적 반응으로부터 유래한 내생적인 대사물질로서, 단백질의 아미노산과 반응하여 당화반응 유도체(advanced glycation end products, AGEs)를 가역적으로 형성시키고, 노화, 죽상경화증, 당뇨병 등의 질환을 앓는 환자에서 고농도로 관찰되는 것으로 알려져 있다. 또한, 상기 MG는 트리오스(triose) 자연 산화와 아세톤 및 아미노 아세톤의 대사 산물로서, 라이신(lysine) 잔기 및 M-아세틸-아르기닌(N-acetyl-arginine)이 있을 때 활성산소종을 생성하는 것으로 알려져 있으며, 특히, 전이금속 이온을 포함하는 단백질은 MG에 의해 산화적 손상이 쉽게 일어난다고 알려진 바 있다.
본 발명에서는 실시예에 따른 방법으로 제조한 여주 추출물 및 여주 발효물이 산화적 손상에 미치는 영향을 분석하기 위해서, MG 존재 하에 생체 고분자의 산화적 손상을 관찰하였으며, 이와 같은 반응 조건 하에서 여주 추출물 및 여주 발효물이 어떤한 영향을 미치는지를 분석하고 당뇨병 예방과의 관련성 여부를 평가하였고, 그 결과를 도 5 및 도 6에 나타내었으며, 도 5(b) 및 도 6(b)에는 여주 추출물 또는 여주 발효물을 각각 첨가한 시료의 DNA 밴드 밀도를 각각 나타내었다.
도 5 (a)에 나타난 바와 같이, 레인 2에서는 MG/Lys/Fe 반응 조건에서 DNA의 산화적 손상을 유도한 결과 DNA의 가닥 절단이 발생되었고, 여주 추출물을 첨가한 경우, 레인 3 내지 6에 나타난 바와 같이, 40 ㎍/mL 농도의 여주 추출물이 첨가된 경우에 미약하게 DNA 산화적 손상에 대한 보호 작용이 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
반면에, 도 6에 나타난 바와 같이, 10 ㎍/mL 농도의 여주 발효물로 처리한 경우, DNA의 산화적 손상에 대한 보호 작용이 나타난다는 사실을 확인할 수 있었으며, 특히, 40 ㎍/mL 농도의 여주 발효물로 처리한 시료의 경우에는, 50% 이상의 산화적 손상에 대한 보호 효과를 갖는다는 사실을 확인할 수 있었고, 여주 발효물은 MG 존재 하에서도 여주 추출물에 비해 효과적인 DNA의 산화적 손상에 대한 보호 작용을 갖는다는 사실을 확인할 수 있었다.
상기와 같은 결과를 통해서, 여주 발효물은 여주 추출물에 비해 산화적 손상으로 부터 DNA를 더욱 효과적으로 보호할 수 있을 것으로 판단되었으며, 당뇨 현상에서 나타날 수 있는 MG 존재 하에서도 DNA 손상으로부터 DNA를 더 잘 보호할 수 있을 것으로 사료되었다.
(2) HSA의 산화적 손상에 대한 보호효과 분석
1) HSA 단백질의 AAPH의 산화적 손상에 대한 여주 발효물의 보호효과 분석
과산화 라디칼은 세포내 단백질의 산화적 손상을 유도하며, 이는 단백질의 구조적 변형, 기능의 상실 등을 유발하고, 필요한 단백질들의 결핍 등으로 인해 생체 내 항상성에 문제가 생길 수 있다. 그 중에서, HSA 단백질(human serum albumin)은 혈액 내 혈장 단백질 중에서 가장 많은 50 내지 60 %를 차지하는 단백질이고, 혈장삼투압, 비특이적 결합능력이 강해 호르몬, 대사산물, 약제 등의 운반체로서 작용하는 단백질이며, 산화적 손상 및 지질 과산화물에 의한 손상으로 여러 질환이 야기될 것으로 생각되고 이러한 단백질의 산화적 손상을 억제하는 물질들은 당뇨 예방에도 도움이 될 것으로 판단되어, HSA을 모델 단백질로 사용하여 과산화 라디칼에 의한 단백질의 산화적 변성에 여주 추출물과 여주 발효물이 미치는 영향을 분석하였다.
이를 위해, 반응액에 HSA (2mg/mL) 및 50 mM AAPH를 첨가하여 혼합물을 제조하고, 혼합물에 여주 추출물 및 여주 발효물을 각각 첨가하여 37 ℃에서 6 시간 동안 반응시킨 후, SDS-page(sodium-dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 분석을 수행하여, 여주 발효물 및 여주 추출물이 갖는 산화적 손상에 대한 보호 능력을 분석하였으며, 그 결과를 도 7(a) 및 도 8(a)에 나타내었고, 도 7(b) 및 도 8(b)에는 여주 추출물 또는 여주 발효물을 각각 첨가한 시료의 DNA 밴드 밀도를 각각 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, 레인 2에는 과산화 라디칼에 의한 HSA의 산화적 손상으로 인해 단백질의 절단 현상이 나타난다는 사실을 확인할 수 있었고, 레인 3 내지 6에는 각각의 여주 추출물이 첨가되어, 과산화 라디칼에 의한 산화적 손상을 억제하여 단백질을 보호한다는 사실을 확인할 수 있었으며, 10 mg/mL농도의 여주 추출물로 처리한 시료에서는 HSA 단백질을 100% 보호하는 것으로 확인되었다.
또한, 도 8에 나타난 바와 같이, 여주 발효물로 처리한 시료의 경우에도, 40 mg/mL 농도의 여주 발효물로 처리한 시료에서는 100%의 보호효과를 갖는 다는 사실을 확인할 수 있었다.
상기와 같은 결과를 통해 여주 발효물이 과산화 라디칼에 의한 단백질의 산화적 손상에 대한 억제 기능을 나타내어 항산화 활성이 있는것으로 판단되었다.
2) 메틸글리옥살에 의한 구리,아연 과산화물 제거 효소의 산화적 손상에 미치는 영향 분석
메틸글리옥살(MG)은 카르보닐 스트레스 유도물질로서, 여러 가지 효소적, 비효소적 반응으로부터 유래한 내생적인 대사물질이며, 단백질의 아미노산과 반응하여 최종당화산물을 가역적으로 형성하고 노화, 죽상경화증, 당뇨병의 환자에서 고농도로 관찰되는 것으로 알려져 있다. 또한, MG은 트리오스 자연 산화와 아세톤 및 아미노 아세톤 대사의 산물로서, 라이신 잔기와 N-아세틸-아르기닌이 있을때 활성산소종을 생성하는 것으로 알려져 있으며, 생체 내에서 산화적 스트레스에 의한 단백질의 손상은 구체적으로 아미노산의 변형, 단백질의 가교 결합, 단백질의 절단 형태로 나타나는 것으로 알려져 있다. 특히, 단백질에 대한 산화적 손상은 단백질의 구조와 기능을 변화시켜 노화 및 많은 질병의 원인이 되고 있다.
최근에는, 당뇨병 환자의 눈에서 철분의 항상성이 손상이 되면 철분의 농도가 증가된다는 연구가 보고된 바 있으며, 철분의 상태를 나타내는 마커는 대사증후군, 포도당과 인슐린 수준으로 나타낼 수 있는 인슐린 저항성과도 상관관계가 있다고 알려진 바 있다. MG과 유사한 α-케톤알데히드(α-ketoaldehydes)는 포유류와 미생물에서 정상적인 대사물질로 발견되며, MG의 농도 증가는 당뇨와 관계가 있는 고혈당증에서 관찰되는 것으로 알려져 있다.
대부분의 생물체에서는 대사반응의 부산물로 다량의 활성산소가 생성된다. 이와 같은, 활성산소는 과산화 이온(superoxide anion, O2 -), 과산화물(hydogen peroxide, H2O2), 수산화 이온(hydroxyl 라디칼, OH-), peroxyl 라디칼(ROO·), singlet 라디칼(1O2) 등이 있으며, 이들은 단백질, 핵산, 지질 등을 파괴하여 세포의 구조적, 기능적 손상을 일으키는 것으로 알려져 있다. 생물체에서는 다양한 방법으로 활성산소를 처리하며 여기에는 과산화물 제거 효소(superoxide dismutase, SOD), 과산화수소 분해효소(catalase), 글루타티온과산화효소(glutathione peroxidase) 등이 관여하는 것으로 알려져 있다. 이 중에서 구리,아연 과산화물 제거 효소(Cu,Zn-SOD) 등은 동물의 세포질에 존재하면서 활성산소를 효과적으로 제거하는 것으로 알려져 있다. 여러 연구에 의하면 이와 같은 효소의 활성 감소는 여러 질병과 노화의 원인이 된다고 알려져 있다.
본 발명에서는 당뇨현상에서 나타나는 최종당화산물인 메틸글리옥살에 의한 영향을 분석하기 위해서, 실시예에 따른 방법으로 제조한 여주 추출물 및 여주 발효물이 MG 존재하에 Cu,Zn-SOD의 산화적 손상에 미치는 영향을 분석하였으며, 그 결과를 도 9 및 도 10에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, 레인 2는 MG에 의한 SOD의 산화적 손상으로 인해 분자량이 큰 단백질의 띠가 나타나는 올리고머화(oligomerization) 현상이 나타난다는 사실을 확인할 수 있었고, 레인 3 내지 6은 각각의 여주 추출물을 첨가하여 MG에 의한 산화적 손상이 억제되어 SOD를 보호하는 것으로 확인되었으며, 특히, 10 mg/mL 농도의 여주 추출물로 처리한 시료에서는 SOD의 90%이상을 보호하는 것으로 나타났다.
반면에, 도 10에 나타난 바와 같이, 10 mg/mL 농도의 여주 발효물로 처리한 시료에서는 SOD를 50%이상 보호하는 것으로 나타났으며, 농도가 증가해도 비슷한 보호 효과를 갖는 것으로 확인되었다. 그러나, 0.1 mg/mL 또는 1 mg/mL 등과 같은 저농도 여주 발효물로 처리한 시료의 경우에서는, 여주 발효물이 여주 추출물에 비해 SOD를 보호하는 능력이 더욱 우수한 것으로 확인되었다.
상기와 같은 결과를 통해서, 제조한 여주 발효물이 당뇨에서 관찰되는 MG에 의한 산화적 손상에 대해 억제 효과가 있으므로 당뇨병 환자들의 합병증 예방에 효과가 있을 것으로 판단되었다.
(2) 여주 발효물의 α-glucosidase 억제활성 분석
음식물로 섭취된 전분(Starch)은 아밀라아제(amylase)에 의해 올리고당(oligosaccharide)으로 분해되고, α-글루코오스 분해효소(α-glucosidase)에 의해 포도당으로 분해된다. α-glucosidase는 소장점막의 미세 융모(brush border)에 존재하는 효소로서 이당류를 단당류로 분해하는 기능을 갖는데, 이 효소의 억제제를 복용할 경우 이러한 단당류로의 분해가 지연되어 식후 혈당의 상승이 완만해지는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서는 제조한 여주 발효물이 α-glucosidase의 효소 활성을 억제하는지 여부를 분석하였으며, 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11(a)에 나타난 바와 같이, 여주 추출물은 α-glucosidase의 활성을 농도에 비례적으로 억제한다는 사실을 확인할 수 있었고, 도 11(b)에 나타난 바와 같이, 여주 발효물 또한, α-glucosidase의 활성을 농도에 비례적으로 억제하는 경향을 갖는 것으로 확인되었다. 그러나, 8 mg/mL 농도의 여주 추출물로 처리한 시료에서는 α-glucosidase의 활성을 약 30% 감소시키는 것으로 확인되었으나, 동일 농도의 여주 발효물로 처리한 시료에서는 대략 50% 감소시키는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통해, 여주 추출물에 비해 여주 발효물이 α-glucosidase의 활성을 더욱 효과적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
상기와 같은 같은 결과를 토대로, 여주 추출물과 여주 발효물은 항산화 기능과 당뇨를 예방할 수 있는 α-glucosidase의 활성 억제 효과를 나타내고 있으나, 여주 발효물이 그 효과가 더욱 높은 것을 확인할 수 있었다.
Claims (2)
- 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 균주를 이용하여 발효시킨 여주(Momordica charantia L.) 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항당뇨 조성물.
- 여주 추출물에 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 균주를 접종하여 발효시키는 단계를 포함하는 항산화 및 항당뇨 조성물의 제조방법.
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WO2023282577A1 (ko) * | 2021-07-06 | 2023-01-12 | 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 | 항당뇨, 항치매 및 항산화 기능을 강화한 프로바이오틱 여주 발효물 |
WO2023234620A1 (ko) * | 2022-06-03 | 2023-12-07 | 주식회사 메타센테라퓨틱스 | 메틸글리옥살에 대한 내성을 갖는 신규한 균주 및 이의 용도 |
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