KR101718190B1 - 줄의관말 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선에 대한 피부세포 보호용 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 줄의관말(Carpomitra costata (Stackhouse) Batters) 추출물(CCE)을 유효성분으로 함유하는 자외선에 대한 피부세포 보호용 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 줄의관말 추출물은 HaCaT 피부세포에서의 UVB-자극된 세포내 ROS 수준을 효과적으로 감소시키고, UVB-저해 항산화제 효소인, 구리/아연 초산화물 디스무타제, 카탈라제, 및 heme oxygenase-1의 발현 및 작용을 회복시키며, 방사선 조사된 피부세포에서 세포 성분에 대한 UVB-작동 산화적 손상을 감소시키고, 미토콘드리아 막 탈분극 및 뒤따르는 세포사멸로부터 세포를 보호하는 효과를 나타냄으로써, 자외선에 의한 피부 세포 보호용 기능성 화장료 조성물 또는 약학적 조성물의 원료로 유용하게 사용할 수 있을 것이다.

Description

줄의관말 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선에 대한 피부세포 보호용 또는 치료용 조성물{Composition for protecting or curing human keratinocyte against UVB containing Extract of Carpomitra costata Stackhouse Batters as an active ingredient}

본 발명은 줄의관말 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선에 대한 피부세포 보호용 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

태양광은 자외선(UV) 방사선의 1차 근원이고, 이는 파장 범위에 따라 세 분류로 나누어진다: 자외선 A (UVA, ~320-540 nm), 자외선 B (UVB, ~280-320 nm), 및 자외선 C (UVC, ~100-320 nm) (Matsumura & Ana7nthaswamy, 2004). 아인슈타인 공식(Planck-Einstein equation)에 개시된 바와 같이, 세 종류의 UV 광선은 다른 파장-특이적 에너지 수준을 특징으로 한다(UVC > UVB > UVA)(Einstein, 1905). 그러나, 이 셋 중 UVB 광선은 사람에게 가장 해롭고 유전자 독성을 나타내는데, 왜냐하면 UVA 광선은 비교적 낮은 에너저의 방사선원이고, UVC 광선은 오존층에 의해 저지되어 사람 피부에 도달될 수 없기 때문이다(Brash, 1997).

피부는 기본적인 신진대사 과정을 통하여 우리 몸의 항상성을 저해하는 다양한 외부 요인으로부터 위해를 막아주는 일차적인 기능을 담당하고 있다. 즉, 피부는 신체 가장 바깥쪽에 위치함으로써 물리적, 화학적, 생물학적 장벽기능을 통한 보호작용, 체온조절작용, 감각작용, 분비 및 배설작용, 흡수작용, 저장작용, 재생작용 등의 다양한 역할을 수행하고 있지만, 지속적인 외부 스트레스가 가해지는 경우 가장 손상을 받기 쉽다. 이러한 외부 스트레스의 주요 원인으로는 자외선 노출, 배기가스, 황사, 환경오염물, 중금속, 온도변화, 미생물을 대표적인 예로 들 수 있다. 이들은 주로 산화적 스트레스(산화적 stress)를 통하여 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 생성함으로써, 항산화 방어체계를 붕괴시켜 세포 손상 및 사멸을 야기하게 된다. 특히, 자외선 B가 DNA 손상, 광노화 및 피부암을 일으키는 주요 요인으로 보고되었다(Fisher, G. J. New Engl. J. Med. 337 : 1419 (1997), Kang, S. et al., Arch. Dermatol. 133 : 1280 (1997)). 자외선 B는 히드록시 라디칼, 초산화물 음이온 등과 같은 활성산소종의 생성을 유도하여 산화적 스트레스 및 항산화 방어기전의 불균형을 초래하여 염증반응, 광노화 및 피부암 등의 질병을 심화시킬 수 있다.

따라서, 외부 스트레스로부터 피부 세포를 보호하고 노화를 예방하기 위해서는 활성산소로 인한 산화적 스트레스를 억제하고, 활성산소를 효율적으로 제거할 수 있는 항산화 방어 강화가 중요하며, 최근에는 인체에 무해하고 보다 강력한 항산화력을 가진 천연 물질에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다.

현재 활성산소종을 제거하는 항산화 효소인 초산화물 디스무타제(dismutase)(SOD), 카탈라제(catalase) 및 항산화제인 비타민 C, 비타민 E 등이 피부노화, 피부암 발생을 억제한다고 보고되고 있다. 또한, 미용, 식품의 소재로 사용되고 있는 성분들은 히아루론산, 포도씨 추출물, 이소플라본, 콜라겐, 세라마이드, 코엔자임 Q10, 콘드로이틴, 리코펜, 알파 리포산 등이며, 이들의 피부미용효과는 주로 항산화 기능으로부터 기인하고 있다(박장서, 식품과학과 산업, 40, 19 (2007)).

그 외, 한국공개특허 제2010-0021341호는 귀룽나무 추출물을 천연 항산화 조성물로 제안하고, 한국공개특허 제2009-70455호는 초임계 자초 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 효과를 갖는 화장료 조성물에 관한 기술을 제시하고 있으며, 한국공개특허 제2009-92898호에서는 정향, 백단향, 감송향, 침향, 귤홍, 회향, 곽향, 백복령, 백급, 백작약, 백과, 백삼, 백질려 및 백렴으로 구성되는 생약 추출물과 칠향팔백산을 함유하는 것을 특징으로 하는 항산화 효과를 갖는 화장료 조성물에 관한 기술을 제시하고 있다. 한국특허등록 제899502호에서는 석류, 무화과, 은행, 오디로 구성된 혼합물의 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 항산화 효과가 있는 화장료 조성물에 관한 기술을 제시하고 있다. 또한, 한국특허등록 제898307호에서는 금은화, 백작약, 고삼, 황금, 오배자, 녹차, 도엽, 은행잎으로부터 추출된 한방식물 추출물을 함유하여 항산화 효과를 갖는 화장료 조성물에 관한 기술을 제시하고 있다. 한국공개특허 제2011-0115499호는 미역, 모자반, 다시마, 해마, 석결명, 청각, 모려 및 해룡 중 어느 1종 이상의 해양생물의 열수 추출물을 포함하는 항산화 조성물을 제안하고 있다.

한편, 줄의관말(Carpomitra costata (Stackhouse) Batters)은 조체는 좁고 편평한 선상이며, 차상분지 또는 삼차상으로 분지하며, 높이 10-20cm, 폭 2-3mm인 갈조류로서, 조하대 깊은 곳에 생육하고, 우리나라에서는 울릉도, 독도, 제주도 문섬, 섶섬에서 분포하고 있는 것이 확인되고 있고 일본, 남아프리카, 유럽, 호주에도 분포한다. 상기 줄의관말은 항균 및 항진균 활성과 같은 중요한 생물학적 특성을 가지고 있는 것으로 보고되나(Pesando & Caram, 1984), 항산화 및/또는 항-광노화 기능에 대하여는 전혀 보고된 바가 없다.

한국공개특허 제2011-0115499호

이에 본 발명자들은 줄의관말 추출물(CCE)가 자외선 조사로 인해 발생하는 세포내 자유라디칼 소거활성에 따른 항산화효과 뿐만 아니라, 자외선 조사에 의해 유발되는 세포사멸(apoptosis) 억제를 통한 세포보호 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 줄의관말 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 피부 손상 억제 및 피부 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 줄의관말 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 피부 손상 억제 및 피부 보호용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 줄의관말(Carpomitra costata (Stackhouse) Batters) 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선에 의한 피부 손상 억제 및 피부 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출물은 알코올 추출물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 줄의관말 추출물을 25 μg/ml 내지 200 μg/ml의 농도로 함유할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제로 이루어진 군으로부터 선택되는 피부 외용제 형태의 조성물일 수 있다.

본 발명은 또한 줄의관말(Carpomitra costata (Stackhouse) Batters) 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선에 의한 피부 손상 억제 및 피부 보호용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 립스틱, 메이컵 베이스, 파운데이션, 프레스파우더, 루스파우더 및 아이섀도로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상으로 제형화될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 줄의관말 추출물을 25 μg/ml 내지 200 μg/ml의 농도로 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 줄의관말(Carpomitra costata (Stackhouse) Batters) 추출물(CCE)은 HaCaT 피부세포에서의 UVB-자극된 세포내 ROS 수준을 효과적으로 감소시키고, UVB-저해 항산화제 효소인, 구리/아연 초산화물 디스무타제, 카탈라제, 및 heme oxygenase-1의 발현 및 작용을 회복시키며, 방사선 조사된 피부세포에서 세포 성분에 대한 UVB-작동 산화적 손상을 감소시키고, 미토콘드리아 막 탈분극 및 뒤따르는 세포사멸로부터 세포를 보호하는 효과를 나타냄으로써, 자외선에 의한 피부 세포 보호용 기능성 화장료 조성물 또는 약학적 조성물의 원료로 유용하게 사용할 수 있을 것이다.

도 1a은 본 발명의 일실시예에 따른 줄의관말 추출물(이하, CCE)의 농도에 대한 세포 생존율을 MTT 분석법를 통해 분석한 그래프이다
도 1b는 본 발명의 일실시예에 따른 줄의관말 추출물의 농도에 대한 DPPH 라디칼 소거능을 나타내는 그래프이다.
도 1c는 잔틴(xanthine)과 잔틴산화효소(xanthine oxidase)가 DMPO와 반응해서 생산된 초산화물 음이온과 DMPO/.OOH 부산물을 ESR 분광법으로 분석한 그래프이다.
도 1d는 Fenton 반응(H₂O₂+FeSO₄)에 의해 생성된 하이드록시 라디칼을 DMPO와 반응시키고, 생성물인 DMPO/OH 부산물을 ESR 분광법으로 분석한 그래프이다.
도 1e는 본 발명의 일실시예에 따른 줄의관말 추출물을 농도별로 처리했을 때의 UVB 조사에 노출된 세포들의 세포내 ROS 함량을 나타낸 그래프이다.
도 1f는 본 발명의 일실시예에 따른 줄의관말 추출물을 농도별로 처리했을 때의 UVB 조사에 노출된 세포들을 공초점 이미지로 나타낸 것이다.
도 1g는 본 발명의 일실시예에 따른 줄의관말 추출물을 농도별로 처리했을 때의 UVB 조사에 노출된 세포들의 세포내 ROS 함량을 유동 세포분석법으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2a는 본 발명의 일실시예에 따른 줄의관말 추출물 처리에 대한 항산화제 효소인 Nrf2의 발현을 나타내는 웨스턴 블로팅 결과이다.
도 2b는 본 발명의 일실시예에 따른 줄의관말 추출물 처리에 대한 항산화제 효소들(Cu/Zn SOD, CAT, 및 HO-1)의 발현을 나타내는 웨스턴 블로팅 결과이다.
도 2c는 본 발명의 일실시예에 따른 줄의관말 추출물 처리에 대한 항산화제 효소인 Cu/Zn SOD 활성을 나타내는 그래프이다.
도 2d는 본 발명의 일실시예에 따른 줄의관말 추출물 처리에 대한 항산화제 효소인 CAT 활성을 나타내는 그래프이다.
도 2e는 본 발명의 일실시예에 따른 줄의관말 추출물 처리에 대한 항산화제 효소인 HO-1 활성을 나타내는 그래프이다.
도 3a는 comet 분석법를 수행하여 세포 내 DNA 손상의 비율과 이미지를 나타낸 도면이다. 여기서 *는 대조군과 현저하게 다르다는 것을 의미하고(p<0.05), #는 UVB를 조사한 세포와 현저하게 다르다는 것을 의미한다(p<0.05).
도 3b는 본 발명의 일실시예에 따른 줄의관말 추출물을 처리했을 때 카르보닐 형성의 양을 측정하여 단백질 산화를 분석한 결과이다. 여기서 *는 대조군과 현저하게 다르다는 것을 의미하고(p<0.05), #는 UVB를 조사한 세포와 현저하게 다르다는 것을 의미한다(p<0.05).
도 3c는 본 발명의 일실시예에 따른 줄의관말 추출물을 처리했을 때 8-이소프로스탄의 수치를 측정해 지질 과산화를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4a는 Hoechst 33342 염료로 염색한 세포에서 형광현미경을 통해 세포사멸 소체(apoptotic body, 화살표)를 관찰하고 정량화한 결과를 나타낸 도면이다. 여기서 *는 대조군과 현저하게 다르다는 것을 의미하고(p<0.05), #는 UVB를 조사한 세포와 현저하게 다르다는 것을 의미한다(p<0.05).
도 4b는 본 발명의 일실시예에 따른 줄의관말 추출물을 처리했을 때 JC-1로 염색 후 유동 세포분석법에 의해 분석된 Δψm 의 분포를 나타내는 그래프이다.
도 4c는 본 발명의 일실시예에 따른 줄의관말 추출물을 처리했을 때의 세포사멸 관련 단백질(Bax, Bcl-2, 쪼개진 카스파제(caspase)-9, 쪼개진 카스파제-3)의 발현을 나타내는 웨스턴 블로팅 결과이다.
도 4d는 본 발명의 일실시예에 따른 줄의관말 추출물을 처리했을 때의 세포사멸 관련 단백질(JNK 및 인산화-JNK)의 발현을 나타내는 웨스턴 블로팅 결과이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 하기의 정의를 가지며 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미에 부합된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

용어 "약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 자외선에 노출된 인간 HaCaT 피부세포(keratinocyte)가 세포사멸 과정을 거치는데, 줄의관말(Carpomitra costata (Stackhouse) Batters)의 추출물을 세포에 처리하게 되면 자외선에 의해 유발된 세포사멸이 억제되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

UVB는 활성산소종을 생성하여 산화적 스트레스를 유발함으로써 다양한 피부 구성 세포에 손상을 유발하는 것으로 알려져 있으며, 이는 궁극적으로 광노화 과정을 가속화시킨다. 본 발명에서는 줄의관말 추출물을 이용하여 자유라디칼 소거능, UV-B 조사로 인한 세포독성 및 산화적 사멸 억제능, 세포내 항산화능을 비교실험을 통하여 본 발명의 줄의관말 추출물이 항산화 효과를 갖는 조성물로서 적절함을 확인하였다.

줄의관말(Carpomitra costata (Stackhouse) Batters)은 조체는 좁고 편평한 선상이며, 차상분지 또는 삼차상으로 분지하며, 높이 10-20cm, 폭 2-3mm인 갈조류로서, 조하대 깊은 곳에 생육하고, 우리나라에서는 울릉도, 독도, 제주도 문섬, 섶섬에서 분포하고 있는 것이 확인되고 있고 일본, 남아프리카, 유럽, 호주에도 분포한다. 상기 줄의관말은 항균 및 항진균 활성과 같은 중요한 생물학적 특성을 가지고 있는 것으로 보고되나(Pesando & Caram, 1984), 항산화 및/또는 항-광노화 기능에 대하여는 전혀 보고된 바가 없다.

본 발명의 줄의관말의 에탄올 추출물은 인간 HaCaT 피부피부세포에서 자외선 유발 세포 손상에 대한 광보호 효과를 갖는다. 또한, 노화의 원인이 되는 자유라디칼 소거능을 갖는다.

노화의 원인에 대한 자유라디칼(free radical) 이론에 따르면, 정상적인 대사과정에서 부수적으로 생성되는 여러 가지 활성산소들에 의하여 생체구성 성분(지방, 단백질, 핵산)들이 산화적 손상을 받게 되고 이러한 손상들이 축적되어 노화에 이르게 된다. 유해한 활성산소의 작용은 수년 내지 일생을 통하여 만성적으로 일어나 누적되어 세포나 조직의 기능을 저하시키고, 이것이 곧 노화 및 질병의 원인이 된다.

본 발명에서는 이러한 과산화수소 및 자외선에 의해 유도된 자유라디칼 소거능력을 특정하기 위하여 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)를 사용하였다. DPPH는 보라색을 띠며 화학적으로 안정화된 자유라디칼을 가지고 있는 수용성 물질로 전자를 받게 되면 흡광도가 감소하며, 환원력이 있는 물질과 만나 전자를 내어주면 DPPH 라디칼이 소멸되어 특유의 보라색이 옅은 노란색으로 변하는 것을 측정하게 된다. 따라서, DPPH의 감소는 자유라디칼 소거반응을 의미한다.

본 발명의 조성물은 자외선에 의한 피부손상을 억제하고 자외선으로부터 피부를 보호하는데 유용하게 사용될 수 있어, 줄의관말 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 대한 피부보호용 및 피부치료용 약제학적 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 줄의관말은 당업계에 공지된 추출 및 분리하는 방법을 사용하여 천연으로부터 추출 및 분리하여 수득한 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 정의된 "추출물"은 적절한 용매를 이용하여 줄의관말로부터 추출한 것이며, 예를 들어, 줄의관말의 열수추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 모두 포함할 수 있다.

줄의관말로부터 추출물을 추출하기 위한 적절한 용매로는 당업계에서 허용되는 용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있다. 예를 들어, 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다. 본 발명의 줄의관말 추출물의 제조방법에는 제한이 없으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있다.

예를 들면, 본 발명의 조성물에 포함되는 줄의관말 추출물은 상기한 열수 추출 또는 용매 추출법으로 추출된 1차 추출물을, 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조할 수 있다. 또한 상기 1차 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획을 얻을 수도 있다.

따라서 본 발명에 있어서 줄의관말 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.

약제학적 조성물

이러한 줄의관말 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 약제학적 조성물일 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 줄의관말 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 25 μg/ml 내지 200 μg/ml의 농도로 함유될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 피부 외용제 조성물일 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 자외선 흡수 효과를 가지고 있는바, 피부에 바를 수 있는 피부 외용제나 자외선 흡수용 화장료 조성물로서 자외선 차단제 등으로 활용할 수도 있다.

본 발명의 피부외용 약제학적 조성물은 자외선으로부터 피부보호 효과를 갖는 피부외용제로서 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용제 형태의 약학조성물로 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

화장료 조성물

또한, 본 발명의 조성물은 줄의관말 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 피부손상 억제 및 피부 보호용 화장료 조성물일 수 있다.

본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 조성물은 상술한 줄의관말 추출물뿐만 아니라, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 상술한 줄의관말 추출물 이외에, 줄의관말 추출물과 반응하여 피부보호 효과를 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용되어오던 유기 자외선 차단제를 혼합하여 사용할 수도 있다.

상기 유기 자외선 차단제로는 글리세릴파바, 드로메트리졸트리실록산, 드로메트리졸, 디갈로일트리올리에이트, 디소듐페닐디벤즈이미다졸테트라설포네이트, 디에칠헥실부타미도트리아존, 디에칠아미노하이드록시벤조일헥실벤조에이트, 디이에이-메톡시신나메이트, 로우손과 디하이드록시아세톤의 혼합물, 메칠렌비스-벤조트리아졸릴테트라메칠부틸페놀, 4-메칠벤질리덴캠퍼, 멘틸안트라닐레이트, 벤조페논-3(옥시벤존),벤조페논-4, 벤조페논-8(디옥시페벤존), 부틸메톡시디벤조일메탄, 비스에칠헥실옥시페놀메톡시페닐트리아진, 시녹세이트, 에칠디하이드록시프로필파바, 옥토크릴렌, 에칠헥실디메칠파바, 에칠헥실메톡시신나메이트, 에칠헥실살리실레이트, 에칠헥실트리아존, 이소아밀-p-메톡시신나메이트, 폴리실리콘-15(디메치코디에칠벤잘말로네이트), 테레프탈릴리덴디캠퍼설포닉애씨드 및 그 염류, 티이에이-살리실레이트 및 아미노벤조익애씨드(파바)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 각종크림, 에센스, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 구체적인 제형으로서는 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 립스틱, 메이컵 베이스, 파운데이션, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도 등의 제형을 포함한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 줄의관말 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 25 μg/ml 내지 200 μg/ml의 농도로 함유될 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 상기 화장료 조성물은 줄의관말 추출물을 나노리포좀 내부에 함유시켜 안정화하여 제형화할 수도 있다. 상기 추출물을 나노리포좀 내부에 함유시키면, 추출물의 성분이 안정화되어 제형화시 침전형성, 변색, 변취 등의 문제점을 해결할 수 있으며, 성분의 용해도 및 경피흡수율을 높일 수 있어 상기 추출물로부터 기대되는 효능을 최대로 발현시킬 수 있다.

본 발명에서 나노리포좀은 통상적인 리포좀의 형태를 갖는 것으로서 평균 입자 지름이 10~500nm인 리포좀을 의미한다. 본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 나노리포좀의 평균 입자 지름은 50~300nm이다. 나노리포좀의 평균 입자 지름이 300nm를 초과하는 경우에는 본 발명에서 달성하고자 하는 기술적 효과 중 피부침투의 개선 및 제형 안정성의 개선이 매우 미약하다. 본 발명에 따라 상기 추출물을 안정화하는데 사용되는 나노리포좀은 폴리올, 유성성분, 계면활성제, 인지질, 지방산 및 물을 포함하는 혼합물에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 나노리포좀에 이용되는 폴리올은 특히 제한되지 않으며, 바람직하게는 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 메틸프로판디올, 이소프로필렌글리콜, 펜틸렌글리콜, 에리스리톨, 자일리톨, 솔비톨 및 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상이다. 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 10~80중량%, 바람직하게는 30~70중량%이다.

본 발명의 나노리포좀의 제조에 이용되는 유성(oil) 성분은 당업계에 공지된 다양한 오일이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 헥사데칸 및 파라핀 오일과 같은 하이드로카본계 오일, 에스테르계의 합성오일, 디메치콘 및 사이크로메치콘계와 같은 실리콘 오일, 해바라기유, 옥수수유, 대두유, 아보카도유, 참깨유 및 어유와 같은 동식물성 오일, 에톡시레이티드 알킬에테르계오일, 프로폭시레이티드 알킬에테르계오일, 피토스핑고신, 스핑고신 및 스핑가닌과 같은 스핑고노이드 지질, 세레브로사이드 콜레스테롤, 시토스테롤 콜레스테릴설페이트, 시토스테릴설페이트, C10-40지방알콜 및 이의 혼합물이다. 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 1.0~30.0중량%일 수 있으며, 바람직하게는 3.0~20.0중량%이다.

본 발명의 나노리포좀의 제조에 이용되는 계면활성제는 당업계에 공지된 어떠한 것도 사용할 수 있다. 예를 들어, 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 양성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제가 사용될 수 있다. 바람직하게는 음이온성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제이다. 음이온성 계면활성제의 구체적인 예는 알킬아실글루타메이트, 알킬포스페이트, 알킬락틸레이트, 디알킬포스페이트 및 트리알킬포스페이트를 포함한다. 비이온성 계면활성제의 구체적인 예는 알콕시레이티드 알킬에테르, 알콕시레이티드 알킬에스테르, 알킬폴리글리코사이드, 폴리글리세릴에스테르 및 슈가에스테르를 포함한다. 특히 바람직한 계면활성제는 비이온성 계면활성제에 속하는 폴리솔베이트류이다. 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 0.1~10중량%일 수 있으며, 바람직하게는 0.5~5.0중량%이다.

본 발명의 나노리포좀의 제조에 이용되는 또 다른 성분인 인지질은 양쪽친화성 지질이 이용되며, 천연 인지질(예를 들어, 난황 레시틴 또는 대두 레시틴, 스핑고마이엘린) 및 합성 인지질(예를 들어, 디팔미토일포스파티딜콜린 또는 수첨 레시틴)을 포함하며, 바람직하게는 레시틴이다. 특히, 대두 또는 난황에서 추출한 천연 유래의 불포화 레시틴 또는 포화 레시틴이 바람직하다. 통상적으로 천연 유래의 레시틴은 포스파티딜콜린의 양이 23~95%, 그리고 포스파디딜에탄올아민의 양이 20% 이하이다. 본 발명의 나노리포좀의 제조에 있어서, 인지질의 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 0.5~20.0중량%이며, 바람직하게는 2.0~8.0중량%이다.

본 발명의 나노리포좀 제조에 이용되는 지방산은 고급 지방산으로서, 바람직하게는 C12-22알킬 체인의 포화 또는 불포화 지방산으로서, 예컨대, 라우린산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아린산, 올레산 및 리놀레산을 포함한다. 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 0.05~3.0중량%일 수 있으며, 바람직하게는 0.1~1.0중량%이다.

본 발명의 나노리포좀의 제조에 이용되는 물은 일반적으로 탈이온화된 증류수이며, 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 5.0~40중량%일 수 있다.

나노리포좀의 제조는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 이루어질 수 있으나, 가장 바람직하게는 상기 성분들을 포함하는 혼합물을 고압 호모게나이저에 적용하여 제조된다. 고압 호모게나이저에 의한 나노리포좀의 제조는 소망하는 입자 크기에 따라 다양한 조건(예: 압력, 횟수 등)으로 실시할 수 있으며, 바람직하게는 600~1200bar의 압력 하에서 1~5회 고압 호모게나아저를 통과하도록 하여 나노리포좀을 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 피부보호용 화장료 조성물은 상기 줄의관말 추출물을 나노리포좀 충 중량 기준으로 0.1~20.0중량%, 제형 안정화를 위하여 보다 바람직하게 1.0~10.0중량%로 함유할 수 있다.

식품 조성물

본 발명의 조성물은 또한 식품 조성물일 수 있는데, 이러한 식품 조성물은 유효성분인 줄의관말 추출물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.

또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 줄의관말 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

본 발명의 유효성분인 줄의관말 추출물은 천연물질로서 독성 및 부작용은 거의 없으므로 자외선에 의한 피부손상 억제 및 피부 보호용 피부보호를 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 자외선에 의한 피부손상 억제 및 피부 보호를 위한 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.

본 발명에서 "건강기능식품"이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 "식품 첨가물 공전"에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.

예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 줄의관말 추출물을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.

캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분인 줄의관말 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 줄의관말 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.

환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 줄의관말 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.

과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 줄의관말 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.

상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 추가적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

통계처리

실험결과는 평균±표준편차로 표기하였고, 그 결과들은 차이를 분석하기 위하여 Tokey's test를 이용한 variance(ANOVA)로 분석하였다. p 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.

시약

N-아세틸 시스테인(N-acetyl cysteine; NAC), 5,5-디메틸-1-피롤리딘-N-옥사이드(5,5-dimethyl-1-pyrroline-N-oxide; DMPO), 2'-7'-디클로로디히드로플루오레세인 디아세테이트(2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate; DCF-DA), 1,1-디페닐-2-피크릴히드라질(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl; DPPH), (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨) 브로마이드((3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium) bromide; MTT), 및 Hoechst 33342 염료는 Sigma chemical company(St. Louis, Mo, USA)에서 구입하였다. 5,5',6,6'-테트라클로로-1,1',3,3'-테트라에틸-벤즈이미다졸릴카보시아닌 요오다이드(5,5',6,6'-Tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethyl-benzimidazolylcarbocyanine iodide; JC-1)는 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였다. HO-1 항체는 Stressgen Corporation (Victoria, Canada)에서 구입하였다. 카스파제(Caspases)-3 및 -9, Cu/Zn SOD, JNK, 그리고 phospho-JNK 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)에서 구입하였다. Nrf2, Bax, Bcl-2, 카탈라제(catalase) 및 β-액틴 항체는 Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Dallas, TX, USA)에서 구입하였다. 모든 다른 화합물 및 시약은 분석용 등급을 사용하였다.

< 실시예 1>

줄의관말 추출물(CCE)의 제조

줄의관말 시료는 제주도에서 채집하였으며, 증거표본은 제주생물종다양성연구소(Jeju Biodiversity Research Institute: JBRI)의 식물표본실에 기탁하였다. 상기 줄의관말 시료를 실온에서 공기 건조시킨 다음, 건조된 줄의관말을 80% 에탄올로 24시간 동안 추출한 뒤, 용매를 진공하에서 증발시켜 추출물을 수득하였다.

< 실험예 1>

줄의관말 추출물의 세포 생존력 분석

<1-1> 세포 배양

인간 피부세포(HaCaT) 세포주를 아모레퍼시픽 회사(용인, 대한민국)에서 공급받아, 5% CO₂및 37℃에서 95% 이상의 습도를 유지한 배양기에 두었다. 세포를 10% 소태아 혈청(56℃에서 45분 동안 가열하여 불활성화시킴), 스트렙토마이신(100 μg/mL) 및 페니실린(100 unit/mL)이 함유된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에서 배양시켰다.

<1-2> 세포 생존력 분석

본 발명에 따른 줄의관말 추출물의 세포 생존력에 대한 효과를, MTT의 노란색 테트라졸륨 염이 살아있는 세포 내에서 보라색 포르마잔으로 환원되는 것을 기초로 하는 표준 비색 MTT 분석법을 사용함으로써 평가하였다. 세포들을 1×10⁵ 세포수/mL의 밀도로 96-웰 플레이트에 씨딩하였고, 16 시간 동안 배양시켰으며, 본 발명의 줄의관말 추출물(CCE)을 25, 50, 100, 또는 200 μg/mL의 농도로 처리하였다. 추가적으로 24 시간 동안 더 배양시킨 후, MTT 저장 용액(50 μL, 2 mg/mL)을 각 웰에 전체 반응 부피가 250 μL가 되도록 첨가하였다. 4 시간 후, 상청액을 흡입하여 버리고, 디메틸 설폭사이드(DMSO, 150 μL)를 각 웰에 첨가하여 포르마잔 결정을 용해시켰다. Carmichael et al. 1987에 개시된 바와 같이, 용액의 흡광도를 스캐닝 멀티-웰 분광 광도계(scanning multi-well spectrophotometer)로 540 nm에서 측정하였다.

그 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이 본 발명에 따른 줄의관말 추출물(CCE)은 25-200 μg/mL의 농도에서 HaCaT 세포에 대하여 세포독성이 없음을 나타내었다.

< 실험예 2>

1,1-디페닐-2-피크릴히드라질(DPPH) 라디칼의 검출

본 발명의 줄의관말 추출물(CCE)(25, 50, 100, 또는 200 μg/mL) 또는 N-아세틸 시스테인(NAC, 1 mM)을 메탄올에 용해된 DPPH 용액(0.1 mM, 190 μL)에 첨가하였다. CCE/DPPH 및 NAC/DPPH 혼합물을 격렬하게 섞어 실온에서 3 시간 동안 반응시켰다. 3 시간 후, 남은 DPPH 양을 분광광도계를 사용하여 520 nm에서 측정하였다. CCE 및 NAC의 DPPH 라디컬 소거능(%)을 하기 식에 따라 각각 계산하였다: (대조군의 흡광도 - 각 농도에서의 CCE 또는 NAC의 흡광도) / 대조군의 흡광도 × 100.

그 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이, CCE는 25 μg/mL에서 7%의 라디칼을 소거하였고, 50 μg/mL에서 11%, 100 μg/mL에서 14%, 및 200 μg/mL에서 20%를 소거하는 등, DPPH 라디칼을 농도-의존 방식으로 소거하였다. 특히, 100 및 200 μg/mL에서 CCE의 작용은 대조군(0 μg/mL CCE, 0% 소거 효능; 데이터는 미도시)과 비교할 때 유의적이었다. 이들 결과는 잘 알려진 ROS 소거제(scavenger)인, NAC (1 mM)에 대한 64% 소거 효능과 비교할 수 있다.

< 실험예 3>

초산화물 음이온의 검출

잔틴/잔틴산화효소 반응 시스템(xanthine/xanthine oxidase reaction system)을 사용하여 초산화물(superoxide) 음이온에 대한 본 발명에 따른 CCE 소거능을 무-세포 시스템에서 조사하였다.

상기 잔틴/잔틴산화효소 반응 시스템은 나이트론 회전 덫(nitrone spin trap)인 DMPO와 반응하여 초산화물 음이온을 생성하여, 반응 생성물로서 DMPO/OOH 부산물을 형성한다. 이후, 상기 DMPO/OOH 부산물을 JES-FA electron spin resonance (ESR) spectrometer (JEOL, Tokyo, Japan)로 검출하였다(Ueno et al., 1984; Kohno et al., 1994). 간단하게, 20 μL의 잔틴산화효소(0.25 U/mL)를 각각의 20 μL의 잔틴(10 mM), DMPO (3 M) 및 CCE (200 μg/mL)와 혼합한 후, 2.5분 후에 ESR 신호전달을 기록했다. ESR 스펙트로미터 파라미터는 하기와 같이 세팅하였다: 자기장 = 336.8 mT, 전력 = 1.00 mW, 진동수 = 9.4380 GHz, 변조 진폭 = 0.2 mT, 이득(gain) = 500, 스캔 타임(scan time) = 0.5 분, 스캔 너비 = 10 mT, 시간 상수 = 0.03초, 온도 = 25 ℃.

그 결과, 도 1c에 나타낸 바와 같이, 잔틴/잔틴 산화효소 시스템에서의 초산화물의 신호는 대조군 시료(PBS)에서의 2263에서부터 3665까지 명확히 증가하였으나, 잔틴/잔틴 산화효소 시스템에서의 본 발명에 따른 CCE의 첨가는 초산화물 음이온 신호를 2887까지 현저히 감소시켰다.

< 실험예 4>

하이드록시 라디칼의 검출

Fenton 반응 시스템(H₂O₂ + 황산제일철(FeSO₄))을 사용하여, 나이트론 회전 덫(nitrone spin trap)으로서 DMPO와 반응시킴으로써 하이드록시 라디칼에 대한 CCE 소거능도 세포 없는 시스템에서 측정하였다.

결과물인 DMPO와 OH 부산물의 ESR 분석을 Li et al., 2003, 2004에 기재된 바와 같이 수행하였다. 인산염 완충액(pH 7.4)을 0.3 M DMPO, 10 mM H₂O₂, 10 mM FeSO4, 및 200 μg/mL CCE의 각 20 μL와 반응시키고 2.5분 후 ESR 스펙트럼을 기록하였다. ESR 스펙트로미터 파라미터는 하기와 같이 세팅하였다: 자기장 = 336.8 mT, 전력 = 1.00 mW, 진동수 = 9.4380 GHz, 변조 진폭 = 0.2 mT, 이득(gain) = 200, 스캔 타임(scan time) = 0.5 분, 스캔 너비 = 10 mT, 시간 상수 = 0.03초, 및 온도 = 25 ℃.

그 결과, 도 1d에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 CCE 처리는 Fenton 반응에서의 하이드록시 라디칼의 발생도 마찬가지로 약화시켰다.

< 실험예 5>

세포 내 활성산소종(ROS) 검출

UVB에 의해 발생되는 세포 내 활성산소종(ROS) 수준 및 본 발명에 따른 CCE의 보호 작용을 DCF-DA(dichlorodihydrofluorescein diacetate) 방법을 이용하여 평가하였다(Rosenkranz et al., 1992). 세포들을 96-웰 플레이트에 1.0×10⁵ 세포수/mL의 밀도로 씨딩하고 37 ℃에서 16 시간 동안 배양하였다. 다음으로, 상기 세포들을 25 내지 200 μg/mL의 범위의 농도의 CCE로 처리하였다. 37 ℃에서 1 시간 동안 배양시킨 후, 세포들을 UVB 방사선에 노출시키고 (30 mJ/cm²), 상기 플레이트를 다시 37 ℃에서 24 시간 동안 배양시켰다. 이후 DCF-DA 용액(25 μM)을 각 웰에 첨가하고 세포들을 어두운 곳에서 10분 동안 두었다. ROS에 의해 발생되는 2',7'-디클로로플루오레세인(DCF) 생성물의 형광을 PerkinElmer LS-5B 분광형광계를 이용하여 검출하였다(PerkinElmer, Waltham, MA, USA).

발생된 세포 내 ROS의 영상 분석을 위해, 세포들을 4-웰 챔버 슬라이드 상에 2×10⁵ 세포수/mL의 밀도로 씨딩하였다. 16 시간 후, 세포들을 CCE(200 μg/mL)에 노출시켰다. 1 시간 후, 세포들을 UVB 방사선(30 mJ/cm²)에 노출시키고 다시 6 시간 동안 배양시켰다. 이후 DCF-DA (100 μM)를 각 웰에 첨가하고, 세포들을 37 ℃에서 부가적인 30분 동안 배양하였다. 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척한 후, DCF-염색된 세포를 봉입제(mounting medium)로 챔버 슬라이드 상에 봉입하였다(Dako, Carpinteria, CA, USA). 공초점 현미경 및 Laser Scanning Microscope 5 PASCAL 소프트웨어를 사용하여 영상을 얻었다(Carl Zeiss, Jena, Germany).

그 결과, 형광 분광법 데이터(도 1e) 및 공초점 현미경 이미지(도 1f)는 200 μg/mL에서 CCE가 UVB-처리된 피부세포에서의 세포내 ROS 수준을 상당히 약화시킴을 나타내었다.

또한, CCE의 ROS-소거 퍼텐셜을 유동 세포분석법(flow cytometry)을 통해 측정하였다. 세포들을 6-웰 플레이트에 1.0×10⁵ 세포수의 밀도로 씨딩하였다. 씨딩 16 시간 후, 세포들을 200 μg/mL CCE로 처리하고, 1 시간 동안 UVB에 노출시킨 후, 37 ℃에서 부가적인 18 시간 동안 배양시켰다. DCF-DA (100 μM)를 각 웰에 첨가하고 세포들과 함께 30분 동안 배양시킨 후, FACSCalibur 유동 세포분석법 장치를 사용하여 DCF 형광을 검출하였다(Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA).

도 1g에 나타낸 바와 같이, 일관성 있는 결과들이 또한 유동 세포분석법에서도 관찰되었다.

따라서, 본 발명에 따른 CCE 처리는 자유 라디칼 함량 및 세포내 ROS 발생의 감소를 통해, UVB 노출 후에 발생되는 산화적 스트레스를 완화시키는 능력을 가짐을 알 수 있다.

< 실험예 6>

항산화제 효소들의 웨스턴 블로팅

세포들은 Cu/Zn SOD, CAT, 및 HO-1을 포함하는, 수많은 항산화제 효소들을 활성화시킴으로써 유독한, 산화적 자극에 대항하는 보호 메카니즘을 개시하고 있다(Surh, 2003).

따라서, 우리는 다음으로 항산화제 효소의 주요 전사 인자인, Nrf2(핵인자 (erythroid-derived 2)-like 2), Cu/Zn SOD, CAT, 및 HO-1의 발현 수준을 관찰하였다.

<6-1> 웨스턴 블로팅

세포들을 거두어, PBS로 두번 세척하고, 100 μL의 용해 완충액(120 mM NaCl, 40 mM Tris (pH 8), 0.1% NP 40) 내에서 30 분 동안 차가운 상태로 용해시키고, 13000 ×g에서 15 분 동안 원심분리하였다. 결과물의 상청액을 수집하여, 단백질 농도를 측정하였다. 적정량의 용해물(40 μg의 단백질)을 5 분 동안 끓여 10% 소디움 도네실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 내에서 전기영동시켰다. 용해된 단백질을 니트로셀룰로오스 막쪽으로 이동시킨 후, 적절한 1차 항체와 함께 배양시켰다. 다음으로 막들을 2차 면역 글로불린 항체 G-서양고추냉이 과산화효소 결합체와 함께 배양시켰다(Pierce, Rockford, IL, USA). 향상된 화학 발광 웨스턴 블로팅 검출 키트(Amersham, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK)을 사용하여 단백질 띠를 검출하였고, 이후 반응된 니트로셀룰로오스 막들은 X-선 필름에 노출시켰다.

<6-2> Cu/Zn SOD 활성

세포들을 CCE(200 μg/mL)로 처리하고, 이후 UVB 방사선(30 mJ/cm²)에 1 시간 동안 노출시킨 다음 12 시간 동안 배양하였다. 0.1 mM EDTA 및 0.4 mM 에피네프린을 함유하는 50 mM 인산염 완충액(pH 10)에 세포 용해물(50 μg)을 첨가하였다. 에피네프린은 pH 10에서 급속히 자가-산화하여 아드레노크롬인, 분홍색 생성물을 생성하는데, 이는 UV/가시광 분광 광도계를 사용하여 480 nm에서 동적 모드(kinetic mode)로 검출할 수 있다. 한편으로는, Cu/Zn SOD는 에피네프린의 자가-산화를 저해하여, 효소 활성을 측정하도록 제공한다(Misra & Fridovich, 1972). SOD 저해율을 480 nm에서 모니터링하였고, SOD 활성은 유닛(units)/mg 단백질로서 표현되었다. 한 유닛의 효소 활성은 에피네프린 자가-산화의 50% 저해를 위해 필요한 효소의 양으로서 정의되었다.

<6-3> CAT 활성

세포들을 CCE(200 μg/mL)로 처리하고, 이후 UVB 방사선(30 mJ/cm²)에 1 시간 동안 노출시킨 다음 12 시간 동안 배양하였다. Cayman Chemical(Ann Arbor, MI, USA)에서 구입한 카탈라제 분석 키트를 사용하여 카탈라제 활성을 측정하였다.

<6-4> HO-1 활성

HO-1 활성을 종래 개시된 바에 따라 측정하였다(Kutty & Maines, 1982). CCE 전처리 되거나 되지 않은 UVB-처리 세포들을 50 mM 칼륨 인산염 완충액 (pH 7.4)을 함유하는 0.5 mL 매우 차가운 0.25 M 자당 용액에 균질혼합시켰다. 균질혼합물을 200 ×g에서 10 분 동안 원심분리하였다. 상청액을 처음에는 9000 ×g에서 20 분 동안 원심분리하고, 추가로 15,000 ×g에서 60 분 동안 원심분리하였다. 이후 펠렛을 50 mM 칼륨 인산염 완충액(pH 7.4)에 재분산시키고, 단백질 양을 측정하였다. 반응 혼합물(200 μL, 0.2 mM 헤민 기질(hemin substrate), 500 μg/mL 세포 용해물, 빌리베르딘 환원효소(biliverdin reductase)의 원료로서 0.5 mg/mL 마우스 간 시토졸, 0.2 mM MgCl₂, 2 mM 글루코오스-6-인산염, 1 U/mL 글루코오스-6-인산염 탈수소효소, 1 mM NADPH, 및 50 mM 칼륨 인산염 완충액(pH 7.4)에 따름)을 37 ℃에서 1 시간 동안 배양시켰다. 클로로포름(0.5 mL)을 가하여 반응을 종료시키고, 클로로포름 층을 제거하고 분광광도법 분석을 수행하였다. 464 대 530 nm에서의 흡광도의 차이를 기초로 빌리루빈(Bilirubin)의 형성을 계산하였다.

그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 CCE는 UVB-처리된 HACaT 세포에서의 Nrf2의 발현을 증가시켰고, 도 2b에 나타낸 바와 같이, 항산화제 효소(Cu/Zn SOD, CAT, 및 HO-1)의 수준 또한 현저하게 상향 조절시킴을 알 수 있었다. 게다가, 도 2c-e에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 CCE는 Cu/Zn SOD, CAT, 및 HO-1의 활성 또한 증가시켰다.

이들 결과로부터 본 발명에 따른 줄의관말 추출물은 세포 항산화 방어 시스템을 강화시킴으로써 세포내 ROS를 효과적으로 해독시킬 수 있음을 알 수 있다.

< 실험예 7>

단일 세포 겔 전기 영동 (유전자 혜성 분석법(comet assay))

본 발명에 따른 CCE가 UVB 방사선조사에 의해 유발된 산화적 세포 손상을 억제할 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 우리는 먼저 알칼리 혜성 분석법을 사용하여 배양된 피부세포에서의 UVB-유도 DNA 손상을 평가하였다.

단일 세포 겔 전기 영동 분석법으로서도 불리는 유전자 혜성 분석법은 검출 DNA 사슬 파괴에 대한 믿을만하고 안정한 기술이다(Rajagopalan et al., 2003; Singh et al., 2000; Collins, 2009).

세포 펠렛들을 39 ℃에서 0.5% 저 용융 온도 아가로스(LMA, 75 μL)에 분산시키고, 1% 보통 용융 온도 아가로스(200 μL)로 미리 코팅된 현미경 슬라이드로 이동시켰다. 아가로스의 응고 후, 상기 슬라이드를 또다른 층의 0.5% LMA(75 μL)로 덮고 이후 4℃에서 용해 용액(2.5 M NaCl, 100 mM Na-EDTA, 10 mM Tris, 1% Triton X-100, 및 10% DMSO, pH 10)에 1 시간 동안 함침시켰다. 다음으로 300 mM NaOH 및 10 mM Na-EDTA (pH 13)를 함유하는 겔 전기영동 장치에 상기 슬라이드를 40 분 동안 놓고 DNA 풀림 및 알칼리-불안정 손상의 발현이 일어나도록 했다. 4 ℃에서 전기장(300 mA, 25 V)을 20 분 동안 적용하여 음전하로 하전된 DNA가 양극(anode)쪽으로 끌리도록 하였다. 상기 슬라이드를 4 ℃에서 중성화 완충액(0.4 M Tris, pH 7.5)으로 5분 동안 세 번 세척하고, 브롬화 에티듐으로 염색하고, Komet 5.5 영상 분석기가 구비된 형광 현미경(Kinetic Imaging Ltd., Nottingham, UK) 하에서 관찰하였다. 슬라이드 당 50 개의 세포들의 혜성 꼬리에서의 총 세포 형광의 백분율을 기록하였다.

그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, 세포의 UVB 방사선 노출 후에 혜성 꼬리 형성은 명확히 증가하여, 핵에서 떨어진 부서진 DNA 단편들이 나타났다. 그러나, CCE-전처리된/UVB-처리된 세포는 DNA 가닥 절단의 백분율이, 43에서 28%로 뚜렷하게 감소됨을 나타냈다.

< 실험예 8>

단백질 카르보닐 형성

UVB-조사된 HaCaT 세포에서의 단백질 산화 정도는 단백질 아미노산 곁사슬에서의 카르보닐 기의 형성으로 증명되었다(Pirinccioglu et al., 2010).

구체적으로, 세포들을 CCE(200 μg/mL)로 처리하고, 이후 UVB 방사선(30 mJ/cm²)에 1 시간 동안 노출시킨 다음 12 시간 동안 배양하였다. OxiselectTM 단백질 카르보닐 효소결합면역흡착측정법(ELISA) 키트(Cell Biolabs, San Diego, CA, USA)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 단백질 카르보닐 형성 정도를 측정하였다.

그 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이, UVB 노출은 처리되지 않은 대조군 세포에 비해 단백질 카르보닐화 정도를 증가시켰으나, 본 발명에 따른 CCE로의 전처리는 UVB 광의 작용을 상당히 저해하는 것으로 나타났다.

< 실험예 9>

지질 과산화 분석법

배양 배지 내로 분비된, 산화된 지질의 대사적 부산물인 8-이소프로스탄의 수준을 측정함으로써, UVB-조사된 HaCaT 피부세포에서의 지질 과산화의 정도를 조사하였다.

산화된 세포들의 조건부 배지에 추척된 지질 과산화의 지시약인 8-이소프로스탄의 비색 검출의 기초로 지질 과산화를 평가하였다(Beauchamp et al., 2002). 시판되는 8-이소프로스탄 ELISA 키트(Cayman Chemical)를 이용하여 제조자의 지시에 따라 HaCaT 피부세포에 의한 8-이소프로스탄의 분비를 평가하였다.

그 결과, 도 3c에 나타낸 바와 같이, UVB 방사선으로 처리된 HaCaT 세포는 처리되지 않은 대조군 세포보다 매우 높은 수준의 8-이소프로스탄을 분비하였으나, 본 발명에 따른 CCE의 전처리는 8-이소프로스탄 축적을 상당히 감소시킴을 나타냈다.

이들 결과로부터 본 발명에 따른 줄의관말 추출물은 HaCaT 피부세포의 주요 거대분자 성분에 대한 UVB-유발 산화적 손상을 감소시킬 수 있다.

< 실험예 10>

UVB 조사로 유발된 세포사멸에 대한 효과

UVB-유발된 세포사멸에 대한 CCE의 세포보호 효과를 조사하기 위하여, UVB 노출 후에 HaCaT 세포에서의 세포사멸성 소체(apoptotic bodies)의 형성을 저지하고, 미토콘드리아 막 퍼텐셜의 변화, Δψm를 억제하는 CCE 전처리의 능력을 평가하였다.

<10-1> Hoechst 33342로의 핵 염색

Hoechst 33342는 세포사멸(apoptosis)로 진행하는 세포 내 DNA 손상을 분석하기 위해 사용되는 DNA-특이적 형광 염료이다. 세포들을 CCE (200 μg/mL)로 처리한 다음 1 시간 후에 UVB 방사선(30 mJ/cm²)에 노출시켰다. 37 ℃에서 부가적으로 12 시간 배양시킨 후, 세포들을 37 ℃에서 10 분 동안 Hoechst 33342(1.5 μL, 10 mg/mL 저장 용액)와 함께 배양시켰다. 염색된 세포들이 이후 CoolSNAP-Pro 컬러 디지털 카메라가 구비된 형광 현미경 하에서 가시화 되었다. 핵 수축 양이 세포사멸의 측정치로서 정량화되었다.

<10-2> 미토콘드리아 막 퍼텐셜(Δψm)의 검출

Δψm의 감소는 초기 상태 세포사멸의 진단제이고, 세포사멸 유도(pro-apoptotic) 단백질의 상향 조절 및 항-세포사멸 단백질의 하향 조절을 특징으로 한다. 따라서, 우리는 UVB-처리된 HaCaT 세포에서의 관련된 마커의 발현 수준에 대한 CCE의 영향을 조사하였다.

세포들을 6-웰 플레이트에 1 × 10⁵ 세포들/mL의 밀도로 씨딩하였다. 씨딩 16 시간 후, 세포들을 CCE(200 μg/mL)로 1 시간 동안 처리하고, UVB에 노출시킨 후, 37 ℃에서 부가적인 18 시간 동안 배양시켰다. Δψm을 미토콘드리아에 들어가서 막 퍼텐셜이 증가함에 따라 녹색에서 적색으로 바뀌는 지질친화적인 양이온성 형광 염료인, JC-1을 사용하여 분석하였다. 2.5 μM의 JC-1 첨가 및 37 ℃에서 30 분 동안 배양 후, 이전에 개시된 바와 같이 유동 세포분석법에 따라 Δψm을 분석하였다(Cossarizza et al., 1993).

그 결과, 처리되지 않은 대조군 세포는 Hoechst 33342로 염색된 온전한 핵들로 나타났으나, UVB-처리된 세포에서는 상당한 세포사멸성 소체 형성이 나타났다(UVB: 세포사멸 지수 = 9). 그러나, CCE 전처리는 핵 단편화의 정도를 효과적으로 감소시켰다(CCE + UVB: 세포사멸 지수 = 7) (도 4a). 동시에, CCE는 UVB 광에 의해 촉진되는 미토콘드리아 막의 탈분극화를 억제하였다(UVB: 형광 강도(FI) = 255; CCE + UVB: FI = 155) (도 4b).

UVB 조사는 세포사멸을 촉진시키는 단백질인, Bax, 쪼개진 카스파제(caspase)-9, 및 쪼개진 카스파제-3의 세포내 함량을 증가시켰으나, CCE 전처리는 이들 증가를 크게 저해하였다. 한편, CCE 전처리는 항-세포사멸 단백질, Bcl-2의 UVB-촉진된 하향 조절을 억제했다(도 4c).

c-Jun N-말단 단백질 키나제(JNK)는 적응할 수 있는 세포 스트레스 반응 및 세포사멸을 포함하는, 많은 중요한 세포의 현상을 조절한다(Jing & Anning, 2005). 같은 방식으로, JNK 경로의 활성화는 UVB 노출에 의해 유도되는 세포사멸과 관련된다(Bivik & Ollinger, 2008).

또한, UVB 조사는 HaCaT 피부세포 내에서 인산화를 통해 JNK의 활성화를 자극시켰다. 그러나, CCE 전처리는 UVB 광의 작용을 다시 중지시켰다(도 4d).

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 CCE가 세포사멸을 효과적으로 억제한다는 사실을 알 수 있었고, CCE는 자유라디칼 소거능이 있고, 지질 과산화 및 단백질 카르보닐 형성을 저해하며 DNA 손상을 보호하여 궁극적으로 CCE가 자외선으로부터 세포를 보호하는 효과가 우수하다는 것을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (7)

1. 50 μg/ml 내지 200 μg/ml의 농도의 줄의관말(Carpomitra costata (Stackhouse) Batters) 추출물을 유효성분으로 함유하며, HaCaT 피부세포에서의 UVB-자극된 세포내 ROS 수준을 효과적으로 감소시키고, UVB-저해 항산화제 효소인, 구리/아연 초산화물 디스무타제, 카탈라제, 및 heme oxygenase-1의 발현 및 작용을 회복시키며, 방사선 조사된 피부세포에서 세포 성분에 대한 UVB-작동 산화적 손상을 감소시키고, 미토콘드리아 막 탈분극 및 뒤따르는 세포사멸로부터 세포를 보호하는 효과를 갖는 자외선에 의한 피부 손상 억제용 약제학적 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 추출물은 알코올 추출물인 것을 특징으로 하는 자외선에 의한 피부 손상 억제용 약제학적 조성물.
3. 삭제
4. 제1항에 있어서,
   상기 약제학적 조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제로 이루어진 군으로부터 선택되는 피부 외용제 형태의 조성물인 것을 특징으로 하는 자외선에 의한 피부 손상 억제용 약제학적 조성물.
5. 50 μg/ml 내지 200 μg/ml의 농도의 줄의관말(Carpomitra costata (Stackhouse) Batters) 추출물을 유효성분으로 함유하며, HaCaT 피부세포에서의 UVB-자극된 세포내 ROS 수준을 효과적으로 감소시키고, UVB-저해 항산화제 효소인, 구리/아연 초산화물 디스무타제, 카탈라제, 및 heme oxygenase-1의 발현 및 작용을 회복시키며, 방사선 조사된 피부세포에서 세포 성분에 대한 UVB-작동 산화적 손상을 감소시키고, 미토콘드리아 막 탈분극 및 뒤따르는 세포사멸로부터 세포를 보호하는 효과를 갖는 자외선에 의한 피부 손상 억제 및 피부 보호용 화장료 조성물.
6. 제5항에 있어서,
   상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 립스틱, 메이컵 베이스, 파운데이션, 프레스파우더, 루스파우더 및 아이섀도로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상으로 제형화됨을 특징으로 하는 자외선에 의한 피부손상 억제 및 피부보호용 화장료 조성물.
7. 삭제

Images