KR101509391B1 - 모로우붉은실 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 피부손상 억제 및 피부치료용 조성물 - Google Patents
모로우붉은실 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 피부손상 억제 및 피부치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 모로우붉은실(Polysiphonia morrowii Harvey) 추출물을 유효 성분으로 포함하는 자외선에 의한 피부손상 억제 및 피부치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 모로우붉은실 추출물은 자외선 조사에 따라 발생하는 세포 내 자유라디칼 소거활성을 통한 항산화 효과가 뛰어날 뿐만 아니라, 자외선 자체를 직접적으로 흡수하는 작용 및 자외선에 의해 유도된 세포자연사(apoptosis)를 억제할 수 있는 효과가 우수하므로, 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 약제학적 조성물은 피부 세포를 자외선으로부터 효과적으로 보호할 수 있어 피부보호 및 피부치료에 유용하게 사용될 수 있다. 특히 이러한 모로우붉은실 추출물은 천연물질로서, 식용 가능한 물질에 해당하므로, 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 장기적 사용에도 안전한 이점을 가진다.
Description
본 발명은 자외선에 의한 피부손상을 억제 및 피부를 보호해 줄 수 있는 치료용 약제학적 조성물 및 자외선 흡수용 조성물에 관한 것이다.
일반적으로 태양광에 포함된 자외선은 피부에 직접적으로 과도하게 조사되는 경우, 홍반 형성이나 피부 세포 내의 멜라닌색소 생성을 촉진시켜 기미나 잡티 발생의 원인이 되기도 하며, 표피에 분비되는 피지와 반응하여 과산화지질을 생성함으로써 피부트러블을 발생시키기도 하고, 심할 경우 피부암 발생의 원인이 되기도 한다. 자외선은 파장에 따라 UV-A (320~400 nm), UV-B (280~320 nm), UV-C (200~280 nm)로 구분되며, 이 중 지표에 도달하여 인체에 영향을 주는 자외선은 UV-A 및 UV-B로 알려져 있다.
자외선 노출은 피부 내에서 자유라디칼(free radical) 형성과 활성산소종(reactive oxygen species; ROS)의 발생을 증가시키고, DNA, 세포막 및 단백질 등 세포성분들에 대한 산화적 스트레스를 유발시켜 피부노화를 일으키는 것으로 알려져 있다.
상기와 같은 자외선에 의한 피부손상 방지를 목적으로 사용되고 있는 자외선차단제는 크게 화학적 자외선차단제와 물리적 자외선차단제로 분류되고 있다.
자외선의 화학적 흡수를 메커니즘으로 하는 화학적 차단제는 신남산계, 살리실산계, 벤조페논계 등의 유기차단제가 잘 알려져 있으며, 자외선의 물리적 산란 및 차폐를 메커니즘으로 하는 물리적 차단제는 이산화티탄, 산화아연과 같은 무기차단제가 잘 알려져 있다. 화학적 차단제의 경우, 자외선차단 효과가 뛰어난 장점을 갖고 있으나 적용되는 파장범위가 좁고, 화장료에 적용함에 있어 끈적이고 번들거리는 사용감과 분자형태로 피부에 흡수되므로 피부자극을 유발하는 단점을 가지고 있다. 물리적 차단제의 경우, 피부자극은 화학적 차단제에 비해 상대적으로 낮지만 무거운 사용감과 백화현상 및 광독성을 유발하는 단점을 갖고 있다.
상기한 화학적 차단제와 물리적 차단제의 단점을 보완하고자 자외선차단제에 대한 다양한 연구가 진행되어 왔으며, 특히 피부안전성에 장점을 갖는 천연 자외선차단 성분에 대한 연구가 활발히 진행되어 왔다. 이와 관련하여 개발된 기술로서, 대한민국특허 제10-0526637호, 제10-0858630호, 제10-0114124호 및 제10-0162282호 등에서는 도화, 녹두, 커피, 팬지, 대황 등에서 추출한 천연성분을 함유한 자외선차단용 화장료조성물이 개발된 바 있다.
상기한 기술들은 피부안전성이 우수한 천연 자외선차단 성분들을 포함하고 있지만, 직접적인 자외선차단 효과가 낮아 천연추출물 단일 성분이 아니라 기존의 합성 유기 자외선차단 성분과 천연추출물을 혼합하여 사용해야 하는 단점을 갖고 있다.
또한 상기와 관련하여 개발된 기술로서, 미국특허 제5552135호에서는 오트, 옥수수, 밀, 쌀 등의 곡물류에서 페룰산(ferulic acid)과 에틸페룰레이트(ethylferulate)를 함유하는 자외선차단 천연성분을 개발하였으나, 단일 성분이 아니라 유기 자외선차단 성분과 혼합하여 사용했을 때 자외선차단 효과가 증가되는 기술을 제시하였다.
한편, 모로우붉은실(Polysiphonia morrowii Harvey)은 해수에 서식하는 홍조류로 비단풀목 빨간검둥이과(Rhodomelaceae)에 속하며, 우리나라에서는 제주도와 전국 연안에 분포하고, 유럽, 남아메리카, 중국, 일본 등 아시아에 분포하고 있는 것으로 보고되어 있다. 현재까지, 모로우붉은실로부터 몇 종의 브로모페놀 화합물이 분리가 보고되었고, 생리활성으로는 α-글루코시다아제 저해활성[Fisheries Science (1999), 65(2), 300-303]과 어병세균에 대한 항균활성[J. Fish Pathol., 18 (2): 147-156 (2005)], 어병바이러스에 대한 항바이러스 활성과 관련 국내특허[Food Sci. Biotechnol. 17(5): 1074-1078 (2008); 대한민국 특허 제 10-0838621] 및 항산화활성[Food Sci. Biotechnol. 18(1): 124-129 (2009)]이 보고되어 있다. 그러나 아직까지 상기 모로우붉은실 추출물의 자외선 흡수효과에 관해서는 보고된 바 없다.
이에 본 발명자들은 해양 생물을 이용한 기능성 약제학적 소재를 연구하던 중, 모로우붉은실 추출물이 자외선 조사로 인해 발생하는 세포 내 자유라디칼 소거활성에 따른 항산화효과 뿐만 아니라, 이러한 자외선 자체를 흡수하는 효과 및 자외선 조사에 의해 유발되는 세포자연사(apoptosis) 억제를 통한 세포보호 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 자외선 흡수 효과, 세포 내 자유라디칼 소거 효과 및 자외선 조사에 의해 유발되는 세포자연사(apoptosis) 억제 효과를 가지는 모로우붉은실 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 피부손상 억제 및 피부치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 모로우붉은실 추출물을 유효성분으로 포함하는자외선 흡수용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 모로우붉은실 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 피부손상 억제 및 피부 보호용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 모로우붉은실(Polysiphonia morrowii Harvey) 추출물을 유효 성분으로 포함하는 자외선에 의한 피부손상 억제 및 피부치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 모로우붉은실 추출물은 물, 유기 용매 또는 이들의 혼합 용매 추출물일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 모로우붉은실 추출물은 에탄올 추출물일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 모로우붉은실 추출물은 자외선 흡수, 자외선 조사에 의해 발생된 세포 내 자유라디칼을 소거 및 자외선에 의해 유도된 세포자연사(apoptosis)를 억제하는 기작을 통해 피부보호 효과를 가질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제로 이루어진 군으로부터 선택되는 피부 외용제 형태의 조성물일 수 있다.
또한, 본 발명은 모로우붉은실(Polysiphonia morrowii Harvey) 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선 흡수용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 모로우붉은실(Polysiphonia morrowii Harvey) 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 피부손상 억제 및 피부 보호용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화장료 조성물이 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 립스틱, 메이컵 베이스, 파운데이션, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도로 제형화될 수 있다.
본 발명의 모로우붉은실 추출물은 자외선 조사에 따라 발생하는 세포 내 자유라디칼 소거활성을 통한 항산화 효과가 뛰어날 뿐만 아니라 자외선 자체를 직접적으로 흡수하는 작용 및 자외선에 의해 유도된 세포자연사(apoptosis)를 억제할 수 있는 효과가 우수하므로, 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 약제학적 조성물은 피부세포를 자외선으로부터 효과적으로 보호할 수 있어 피부보호 및 피부치료에 유용하게 사용될 수 있다. 특히 이러한 모로우붉은실 추출물은 천연물질로서, 식용 가능한 물질에 해당하므로, 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 장기적 사용에도 안전한 이점을 가진다.
도 1은 UV 분광광도계를 이용하여 자외선영역(250~400 nm)에서 본 발명의 모로우붉은실 추출물의 흡광도를 측정한 것이다.
도 2는 본 발명의 모로우붉은실 추출물의 농도별 처리에 따른 DPPH 라디칼 소거활성, H2O2 처리된 세포 내 활성산소종 소거활성, UV-B 처리된 세포 내 활성산소종 소거활성을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다(PME: 본 발명의 모로우붉은실 추출물, NAC: N-acetyl cysteine).
도 3은 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 세포에 농도별로 처리한 후 UV-B 조사하였을 때, 세포 내에서 발생되는 활성산소종을 레이저 스캐닝 마이크로스코프 5 PASCAL 프로그램(Carl Zeiss, Jena, Germany)을 이용하여 이미지화한 사진이다.
도 4는 도 3의 이미지에 나타난 세포 내 활성산소종 발생에 따른 형광강도를 대조군과 비교하여 정량화한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 모로우붉은실 추출물 적용에 따른 과산화물음이온의 소거활성을 측정하기 위하여 ESR spectrometer를 이용하여 ESR 시그널을 측정한 그래프이다(control: 무처리군).
도 6은 본 발명의 모로우붉은실 추출물 적용에 따른 히드록실 라디칼의 소거활성을 측정하기 위하여 ESR spectrometer를 이용하여 ESR 시그널을 측정한 그래프이다(control: 무처리군).
도 7은 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 세포에 농도별로 적용한 후 MTT assay 방법을 통해 세포생존율을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 세포에 처리한 후 UV-B를 조사한 경우 MTT assay 방법을 통해 세포생존율을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 세포에 처리한 후 UV-B 조사한 경우 SOD 효소 활성을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다(control: 무처리군).
도 10은 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 세포에 처리한 후 UV-B 조사한 경우 카탈라제 효소 활성을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다(control: 무처리군).
도 11은 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 농도별로 세포에 처리한 경우 세포 내 SOD 및 카탈라제의 단백질 발현량을 웨스턴 블랏팅에 의해 측정한 결과이다.
도 12A는 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 세포에 처리한 후 UV-B 조사한 경우 apoptotic bodies의 핵의 단편을 DNA 특이적 형광염료인 Hoechst 33342로 염색한 후 형광현미경 하에서 이미지화한 사진이다(control: 무처리군).
도 12B는 도 12A의 이미지에 나타난 세포 내 apoptotic bodies를 대조군과 비교하여 정량화한 그래프이다(control: 무처리군).
도 13은 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 세포에 처리한 후 UV-B 조사한 경우 apoptotic bodies 형성에 따른 세포의 DNA 단편을 분석하여 그래프로 나타낸 것이다(control: 무처리군).
도 2는 본 발명의 모로우붉은실 추출물의 농도별 처리에 따른 DPPH 라디칼 소거활성, H2O2 처리된 세포 내 활성산소종 소거활성, UV-B 처리된 세포 내 활성산소종 소거활성을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다(PME: 본 발명의 모로우붉은실 추출물, NAC: N-acetyl cysteine).
도 3은 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 세포에 농도별로 처리한 후 UV-B 조사하였을 때, 세포 내에서 발생되는 활성산소종을 레이저 스캐닝 마이크로스코프 5 PASCAL 프로그램(Carl Zeiss, Jena, Germany)을 이용하여 이미지화한 사진이다.
도 4는 도 3의 이미지에 나타난 세포 내 활성산소종 발생에 따른 형광강도를 대조군과 비교하여 정량화한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 모로우붉은실 추출물 적용에 따른 과산화물음이온의 소거활성을 측정하기 위하여 ESR spectrometer를 이용하여 ESR 시그널을 측정한 그래프이다(control: 무처리군).
도 6은 본 발명의 모로우붉은실 추출물 적용에 따른 히드록실 라디칼의 소거활성을 측정하기 위하여 ESR spectrometer를 이용하여 ESR 시그널을 측정한 그래프이다(control: 무처리군).
도 7은 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 세포에 농도별로 적용한 후 MTT assay 방법을 통해 세포생존율을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 세포에 처리한 후 UV-B를 조사한 경우 MTT assay 방법을 통해 세포생존율을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 세포에 처리한 후 UV-B 조사한 경우 SOD 효소 활성을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다(control: 무처리군).
도 10은 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 세포에 처리한 후 UV-B 조사한 경우 카탈라제 효소 활성을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다(control: 무처리군).
도 11은 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 농도별로 세포에 처리한 경우 세포 내 SOD 및 카탈라제의 단백질 발현량을 웨스턴 블랏팅에 의해 측정한 결과이다.
도 12A는 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 세포에 처리한 후 UV-B 조사한 경우 apoptotic bodies의 핵의 단편을 DNA 특이적 형광염료인 Hoechst 33342로 염색한 후 형광현미경 하에서 이미지화한 사진이다(control: 무처리군).
도 12B는 도 12A의 이미지에 나타난 세포 내 apoptotic bodies를 대조군과 비교하여 정량화한 그래프이다(control: 무처리군).
도 13은 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 세포에 처리한 후 UV-B 조사한 경우 apoptotic bodies 형성에 따른 세포의 DNA 단편을 분석하여 그래프로 나타낸 것이다(control: 무처리군).
본 발명은 모로우붉은실 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 피부손상 억제 및 피부치료(보호)용 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.
모로우붉은실은 Ceramiales(비단풀목) Rhodomelaceae(빨간검둥이과)에 속하며 우리나라 제주도를 비롯한 동-서-남해안에 분포하고 있다. 모로우붉은실 분획물은 DPPH 라디칼 소거 활성이 있음이 알려져 있으며, 아라키돈산(arachidonic acid) 및 에이코사펜타에노산(eicosapentaenoic acid)의 원료로서의 기능성 및 바이오매스에 대해 보고된 바 있다.
본 발명은 상기한 특징을 가지는 모로우붉은실 추출물이 자유라디칼 소거활성을 통한 항산화 효과뿐만 아니라 자외선을 직접적으로 흡수할 수 있으며, 자외선에 의해 유도된 DNA 손상을 억제할 수 있는 효과가 우수함을 확인함으로써, 피부보호에 효과적이라는 사실을 최초로 규명하였다.
보다 구체적으로, 하기 실시예 2에서는 본 발명의 모로우붉은실 추출물의 UV-B 흡수능 측정한 결과 UV-B 범위에 해당하는 285nm에서 높은 흡광도를 확인하였으며, 이를 통해 본 발명의 모로우붉은실 추출물이 UV-B 조사에 대응하여 피부세포를 보호할 수 있음을 유추할 수 있었다.
또한, 하기 실시예 <3-1>에서는 DPPH 라디칼 소거활성을 측정한 결과 본 발명의 모로우붉은실 추출물 100μg/ml에서 51%의 소거활성을 보이는 것을 확인할 수 있었으며, 실시예 <3-2>에서는 본 발명의 모로우붉은실 추출물 적용 후 UV-B 처리된 세포 내 활성산소종 측정한 결과 100μg/ml에서 30%의 활성산소종 소거효과를 보여 양성대조군인 NAC가 나타낸 26%보다 더욱 높은 것을 확인할 수 있었고, 실시예 <3-3>에서는 본 발명의 모로우붉은실 추출물 적용 후 UV-B 처리된 세포 내에서 과산화물음이온(superoxide anion: O2-ㆍ) 및 히드록실 라디칼(hydroxyl radical: ㆍOH) 소거활성 측정한 결과 이들이 모두 유의적으로 제거되는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 하기 실시예 5에서는 본 발명의 모로우붉은실 추출물이 항산화효소(SDO 및 catalase)에 미치는 영향을 조사하였는데, 본 발명의 추출물이 항산화효소 활성을 증가시킬 뿐만 아니라 항산화효소 단백질 발현도 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 하기 실시에 6에서는 본 발명의 모로우붉은실 추출물이 UV-B 조사에 의해 발생되는 DNA 손상 및 이로 인해 발생되는 세포자연사(apoptosis)를 효과적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
즉, 상기와 같은 특징을 갖는 본 발명의 조성물은 자외선에 의한 피부손상을 억제하고 자외선으로부터 피부를 보호하는데 유용하게 사용될 수 있어, 모로우붉은실(Polysiphonia morrowii Harvey) 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 피부손상 억제 및 피부치료용 약제학적 조성물로 사용될 수 있으며, 또한 추출물 자체가 자외선 흡수 효과를 가지고 있어, 모로우붉은실(Polysiphonia morrowii Harvey) 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선 흡수용 조성물로도 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 모로우붉은실 추출물은 당업계에 공지된 추출 및 분리하는 방법을 사용하여 천연으로부터 추출 및 분리하여 수득한 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 정의된‘추출물’은 적절한 용매를 이용하여 모로우붉은실로부터 추출한 것이며, 예를 들어, 모로우붉은실의 열수추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 모두 포함할 수 있다.
모로우붉은실로부터 추출물을 추출하기 위한 적절한 용매로는 당업계에서 허용되는 용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있다. 예를 들어, 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다. 본 발명의 모로우붉은실 추출물의 제조방법에는 제한이 없으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 조성물에 포함되는 모로우붉은실 추출물은 상기한 열수 추출 또는 용매 추출법으로 추출된 1차 추출물을, 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조할 수 있다. 또한 상기 1차 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획을 얻을 수도 있다.
따라서 본 발명에 있어서 모로우붉은실 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.
본 발명의 구체적인 일실시예에 따르면, 본 발명의 모로우붉은실 추출물 제조는 다음과 같이 실시된다.
본 발명의 모로우붉은실 추출물은 제주도에서 채집한 모로우붉은실을 음건한 다음 건조된 모로우붉은실을 80% 에탄올로 실온에서 24시간 동안 3회 추출한 뒤 여과하여 회전농축기로 감압 농축하여 에탄올 가용성 성분을 수득할 수 있다.
이러한 모로우붉은실 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 약제학적 조성물일 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 모로우붉은실 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.00001 ~ 30 중량%로 포함될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 피부 외용제 조성물일 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 자외선 흡수 효과를 가지고 있는바, 피부에 바를 수 있는 피부 외용제나 자외선 흡수용 화장료 조성물로서 자외선 차단제 등으로 활용할 수도 있다.
본 발명의 피부외용 약제학적 조성물은 자외선으로부터 피부보호 효과를 갖는 피부외용제로서 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용제 형태의 약학조성물로 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 조성물은 모로우붉은실 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 피부손상 억제 및 피부 보호용 화장료 조성물일 수 있다.
본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 조성물은 상술한 모로우붉은실 추출물뿐만 아니라, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 상술한 모로우붉은실 추출물 이외에, 모로우붉은실 추출물과 반응하여 피부보호 효과를 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용되어오던 유기 자외선 차단제를 혼합하여 사용할 수도 있다.
상기 유기 자외선 차단제로는 글리세릴파바, 드로메트리졸트리실록산, 드로메트리졸, 디갈로일트리올리에이트, 디소듐페닐디벤즈이미다졸테트라설포네이트, 디에칠헥실부타미도트리아존, 디에칠아미노하이드록시벤조일헥실벤조에이트, 디이에이-메톡시신나메이트, 로우손과 디하이드록시아세톤의 혼합물, 메칠렌비스-벤조트리아졸릴테트라메칠부틸페놀, 4-메칠벤질리덴캠퍼, 멘틸안트라닐레이트, 벤조페논-3(옥시벤존),벤조페논-4, 벤조페논-8(디옥시페벤존), 부틸메톡시디벤조일메탄, 비스에칠헥실옥시페놀메톡시페닐트리아진, 시녹세이트, 에칠디하이드록시프로필파바, 옥토크릴렌, 에칠헥실디메칠파바, 에칠헥실메톡시신나메이트, 에칠헥실살리실레이트, 에칠헥실트리아존, 이소아밀-p-메톡시신나메이트, 폴리실리콘-15(디메치코디에칠벤잘말로네이트), 테레프탈릴리덴디캠퍼설포닉애씨드 및 그 염류, 티이에이-살리실레이트 및 아미노벤조익애씨드(파바)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 각종크림, 에센스, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 구체적인 제형으로서는 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 립스틱, 메이컵 베이스, 파운데이션, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도 등의 제형을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 모로우붉은실 추출물의 함량은 조성물 총 중량에 대하여 0.00001-30중량%이며, 바람직하게는 0.5-20%이며, 보다 바람직하게는 1.0-10중량%이다. 상기 모로우붉은실 추출물의 함량이 0.00001중량% 미만이면 모로우붉은실 추출물에 의한 자외선 흡수 효과가 크게 감소되고, 30중량%를 초과하는 경우에는 피부 자극을 초래할 수 있으며, 제형상의 문제점이 발생할 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 상기 화장료 조성물은 모로우붉은실 추출물을 나노리포좀 내부에 함유시켜 안정화하여 제형화할 수도 있다. 상기 추출물을 나노리포좀 내부에 함유시키면, 추출물의 성분이 안정화되어 제형화시 침전형성, 변색, 변취 등의 문제점을 해결할 수 있으며, 성분의 용해도 및 경피흡수율을 높일 수 있어 상기 추출물로부터 기대되는 효능을 최대로 발현시킬 수 있다.
본 발명에서 나노리포좀은 통상적인 리포좀의 형태를 갖는 것으로서 평균 입자 지름이 10~500nm인 리포좀을 의미한다. 본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 나노리포좀의 평균 입자 지름은 50~300nm이다. 나노리포좀의 평균 입자 지름이 300nm를 초과하는 경우에는 본 발명에서 달성하고자 하는 기술적 효과 중 피부침투의 개선 및 제형 안정성의 개선이 매우 미약하다.
본 발명에 따라 상기 추출물을 안정화하는데 사용되는 나노리포좀은 폴리올, 유성성분, 계면활성제, 인지질, 지방산 및 물을 포함하는 혼합물에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 나노리포좀에 이용되는 폴리올은 특히 제한되지 않으며, 바람직하게는 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 메틸프로판디올, 이소프로필렌글리콜, 펜틸렌글리콜, 에리스리톨, 자일리톨, 솔비톨 및 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상이다. 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 10~80중량%, 바람직하게는 30~70중량%이다.
본 발명의 나노리포좀의 제조에 이용되는 유성(oil) 성분은 당업계에 공지된 다양한 오일이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 헥사데칸 및 파라핀 오일과 같은 하이드로카본계 오일, 에스테르계의 합성오일, 디메치콘 및 사이크로메치콘계와 같은 실리콘 오일, 해바라기유, 옥수수유, 대두유, 아보카도유, 참깨유 및 어유와 같은 동식물성 오일, 에톡시레이티드 알킬에테르계오일, 프로폭시레이티드 알킬에테르계오일, 피토스핑고신, 스핑고신 및 스핑가닌과 같은 스핑고노이드 지질, 세레브로사이드 콜레스테롤, 시토스테롤 콜레스테릴설페이트, 시토스테릴설페이트, C10-40 지방알콜 및 이의 혼합물이다. 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여1.0~30.0중량%일 수 있으며, 바람직하게는 3.0~20.0중량%이다.
본 발명의 나노리포좀의 제조에 이용되는 계면활성제는 당업계에 공지된 어떠한 것도 사용할 수 있다. 예를 들어, 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 양성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제가 사용될 수 있다. 바람직하게는 음이온성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제이다. 음이온성 계면활성제의 구체적인 예는 알킬아실글루타메이트, 알킬포스페이트, 알킬락틸레이트, 디알킬포스페이트 및 트리알킬포스페이트를 포함한다. 비이온성 계면활성제의 구체적인 예는 알콕시레이티드 알킬에테르, 알콕시레이티드 알킬에스테르, 알킬폴리글리코사이드, 폴리글리세릴에스테르 및 슈가에스테르를 포함한다. 특히 바람직한 계면활성제는 비이온성 계면활성제에 속하는 폴리솔베이트류이다. 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 0.1~10중량%일 수 있으며, 바람직하게는 0.5~5.0중량%이다.
본 발명의 나노리포좀의 제조에 이용되는 또 다른 성분인 인지질은 양쪽친화성 지질이 이용되며, 천연 인지질(예를 들어, 난황 레시틴 또는 대두 레시틴, 스핑고마이엘린) 및 합성 인지질(예를 들어, 디팔미토일포스파티딜콜린 또는 수첨 레시틴)을 포함하며, 바람직하게는 레시틴이다. 특히, 대두 또는 난황에서 추출한 천연 유래의 불포화 레시틴 또는 포화 레시틴이 바람직하다. 통상적으로 천연 유래의 레시틴은 포스파티딜콜린의 양이 23~95%, 그리고 포스파디딜에탄올아민의 양이 20% 이하이다. 본 발명의 나노리포좀의 제조에 있어서, 인지질의 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 0.5~20.0중량%이며, 바람직하게는 2.0~8.0중량%이다.
본 발명의 나노리포좀 제조에 이용되는 지방산은 고급 지방산으로서, 바람직하게는 C12-22 알킬 체인의 포화 또는 불포화 지방산으로서, 예컨대, 라우린산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아린산, 올레산 및 리놀레산을 포함한다. 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 0.05~3.0중량%일 수 있으며, 바람직하게는 0.1~1.0중량%이다.
본 발명의 나노리포좀의 제조에 이용되는 물은 일반적으로 탈이온화된 증류수이며, 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 5.0~40중량%일 수 있다.
나노리포좀의 제조는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 이루어질 수 있으나, 가장 바람직하게는 상기 성분들을 포함하는 혼합물을 고압 호모게나이저에 적용하여 제조된다. 고압 호모게나이저에 의한 나노리포좀의 제조는 소망하는 입자 크기에 따라 다양한 조건(예: 압력, 횟수 등)으로 실시할 수 있으며, 바람직하게는 600~1200bar의 압력 하에서 1~5회 고압 호모게나아저를 통과하도록 하여 나노리포좀을 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 피부보호용 화장료 조성물은 상기 모로우붉은실 추출물을 나노리포좀 충 중량 기준으로 0.1~20.0중량%, 제형 안정화를 위하여 보다 바람직하게 1.0~10.0중량%로 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 식품 조성물일 수 있는데, 이러한 식품 조성물은 유효성분인 모로우붉은실 추출물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.
또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 모로우붉은실 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명의 유효성분인 모로우붉은실 추출물은 천연물질로서 독성 및 부작용은 거의 없으므로 자외선에 의한 피부손상 억제 및 피부 보호용 피부보호를 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 자외선에 의한 피부손상 억제 및 피부 보호를 위한 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
본 발명에서 “건강기능식품”이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 “식품 첨가물 공전”에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.
예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 모로우붉은실 추출물을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.
캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분인 모로우붉은실 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 모로우붉은실 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 모로우붉은실 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.
과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 모로우붉은실 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
>
통계처리
실험결과는 평균±표준편차로 표기하였고, 그 결과들은 차이를 분석하기 위하여 Tokey's test를 이용한 variance(ANOVA)로 분석하였다. p 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.
시약
1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼, N-acetyl cysteine(NAC), 5,5-demethyl-1-pyrroline-N-oxide(DMPO), 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCF-DA), [3-(4,5-dimehtylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium] bromide(MTT) 및 Hoechst 33342 염료는 Sigma chemical company(St. Louis, Mo, USA)에서 구입하였다. Cu/Zn SOD 및 CAT 항체는 Biodesign International Company(Saco, Maine, USA)에서 구입하였다. 모든 다른 화합물 및 시약은 분석용 등급을 사용하였다.
<
실시예
1>
본 발명의
모로우붉은실
추출물 제조
모로우붉은실 시료는 제주도에서 채집하였으며, 증거표본은 제주생물종다양성연구소(Jeju Biodiversity Research Institute: JBRI)에 기탁하여 JBRI-10365를 부여받았다. 본 발명의 모로우붉은실 추출물은 제주도에서 채집한 모로우붉은실을 음건한 다음 건조된 모로우붉은실을 80% 에탄올로 실온에서 24시간 동안 3회 추출한 뒤 여과하여 회전농축기로 감압 농축하여 에탄올 가용성 성분을 수득할 수 있었다.
<
실시예
2>
본 발명의
모로우붉은실
추출물의
UV
-B
흡수능
측정
상기 실시예 1에서 제조한 본 발명의 모로우붉은실 추출물의 자외선흡수능을 평가하기 위하여 UV 분광광도계(Shimadzu, UV-1800, Japan)를 이용하여 자외선영역(250~400 nm)에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과 도 1에서 나타낸 바와 같이, UV-B 범위에 해당하는 285nm에서 피크가 나타나 본 범위에서 높은 흡광도를 확인할 수 있었다. 따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 모로우붉은실 추출물이 UV-B를 흡수하는 작용을 할 수 있어 UV-B 조사에 대응하여 세포를 보호할 수 있을 것으로 판단되었다.
<
실시예
3>
본 발명의
모로우붉은실
추출물의
자유라디칼
소거능
측정
상기 실시예 1을 통해 제조된 본 발명의 모로우붉은실 추출물의 자유라디칼 소거능을 확인하기 위하여, DPPH 라디칼 소거활성, 세포 내 활성산소종(ROS) 소거활성, 과산화물음이온 소거활성 및 히드록실 라디칼 소거활성을 측정하였다.
<3-1>
DPPH
라디칼
소거활성 측정
DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 분석은 항산화 물질의 전자공여능으로 인해 방향족 화합물 및 방향족 아민류에 의해 환원되어 자색이 탈색되는 정도를 지표로 하여 항산화 능력을 측정하는 방법이다. 이 실험에서 양성대조군으로는 항산화 효능이 잘 알려진 NAC(N-acetyl cysteine)을 사용하였다.
먼저 상기 실시예 1을 통해 제조된 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 각 농도별로 6.25, 12.5, 25, 50, 100μg/ml씩 메탄올 내 1×10-4M DPPH 용액에 첨가한 후 격렬히 혼합한 다음, 3시간 후에 DPPH 잔여 농도를 분광광도계를 이용하여 520nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과 도 2에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 모로우붉은실 추출물은 농도 의존적으로 DPPH 라디칼 소거능을 갖는다는 사실을 알 수 있었는데, 본 발명의 추출물은 6.25μg/ml에서 4%, 12.5μg/ml에서 6%, 25μg/ml에서 13%, 50μg/ml에서 26%, 100μg/ml에서 51%의 소거활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
<3-2> 세포 내
활성산소종
(
ROS
) 소거활성 측정
본 발명의 모로우붉은실 추출물이 세포 내에서 발생하는 활성산소종(ROS)을 소거하는 활성이 있는지 확인하기 위하여, 인간 케라틴 세포(HaCaT cells)에 본 발명의 추출물을 처리한 후, H2O2 처리 또는 UV-B를 조사하여 케라틴세포 내 ROS 수준을 측정하였으며, 이때 세포 내 활성산소종 측정은 DCF-DA(dichlorodihydrofluorescein diacetate) 방법을 이용하였다. DCF-DA는 세포 내 활성산소종과 반응하여 형광물질(dichlorodihydrofluorescein: DCF)을 만들어 내는 것으로 세포 내에서 발생하는 형광 측정을 통해 세포 내 활성산소종을 측정할 수 있다. 이 실험에서 양성대조군으로는 항산화 효능이 잘 알려진 NAC(N-acetyl cysteine)을 사용하였다.
① 세포 배양
인간 케라틴세포(HaCaT cells)는 5% CO2 및 37℃에서 95% 이상의 습도를 유지한 배양기에서 10% heat-inactivated fetal calf serum, 100μg/ml 스트렙토마이신 및 100unit/ml 페니실린을 포함하는 DMEM(Dulbeccos modified Eagle's medium) 배지에서 배양하였다.
②
H
2
O
2
처리된 세포 내
활성산소종
측정
상기 배양된 인간 케라틴세포(HaCaT cells)를 플레이트에 1.5×105 cells/well 밀도로 분주하고 16시간 동안 배양 한 다음, 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 농도별(6.25, 12.5, 25, 50, 100μg/ml)로 처리하였으며, 30분 후에 H2O2(1mM)를 플레이트에 첨가하고 37℃에서 30분 동안 추가로 인큐베이션하였다. 마지막으로 DCF-DA 용액 25μM을 첨가 후 10분이 경과한 다음, 2',7'-dichlorofluorescein의 형광을 PerkinElmer LS-5B 분광형광계(PerkinElmer, Waltham, MA, USA)를 이용하여 검출하였다.
그 결과 도 2에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 모로우붉은실 추출물은 농도 의존적으로 H2O2-유도된 세포 내의 ROS를 소거하는 것을 확인할 수 있었는데, 본 발명의 추출물을 6.25μg/ml로 처리한 경우, 14%의 ROS 소거활성을 보였고, 12.5μg/ml로 처리한 경우는 17%, 25μg/ml로 처리한 경우는 25%, 50μg/ml로 처리한 경우는 47%, 100μg/ml로 처리한 경우는 61%의 ROS 소거활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
③
UV
-B 처리된 세포 내에서의
활성산소종
소거 효과 측정
본 실험에서는 실제로 UV-B 조사에 따라 생성된 세포 내 활성산소종을 소거하는 효과를 보이는지 확인하기 위하여, 인간 케라틴세포(HaCaT cells)에 UV-B를 조사한 후 활성산소종 소거 효과를 조사하였다.
먼저 인간 케라틴세포(HaCaT cells)를 플레이트에 1.5×105 cells/well 밀도로 분주하고 16시간 동안 배양 한 다음, 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 농도별(6.25, 12.5, 25, 50, 100μg/ml)로 처리하였다. 1시간 후 CL-1000M UV Crosslinker(UVP, Upland, CA, USA)를 이용하여 UV-B(280-320nm; peak intensity 302nm)를 150mJ/cm2 양으로 세포에 조사하였으며, 이렇게 UV-B에 노출된 세포들은 37℃에서 24시간 동안 배양되었다. 마지막으로 DCF-DA 용액 25μM을 첨가 후 10분 이 경과한 다음, 2',7'-dichlorofluorescein의 형광을 PerkinElmer LS-5B 분광형광계(PerkinElmer, Waltham, MA, USA)를 이용하여 검출하였다.
그 결과 도 2에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 모로우붉은실 추출물은 농도 의존적으로 UVB에 의해 발생된 세포 내 ROS를 소거하는 활성을 갖는 것을 확인할 수 있었으며, 본 발명의 추출물은 6.25μg/ml에서 14%, 12.5μg/ml에서 15%, 25μg/ml에서 16%, 50μg/ml에서 24%, 100μg/ml에서 30%의 ROS 소거활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
또한 세포 내 활성산소종 발생에 따른 이미지 분석을 위하여 cover-slip loaded 6-well plate에 2×105 cells/well을 분주하고 16시간 배양한 다음, 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 농도별(25, 50, 100μg/ml)로 처리하였다. 추출물을 처리하고 1시간이 지난 후, 플레이트에 UV-B를 82시간 조사하였다. 그리고 24시간 후, DCF-DA(100μM)를 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 추가적으로 30분 동안 세포들을 배양하였다. 이러한 과정을 거친 세포들을 PBS로 세척한 후, 염색된 세포들은 공초점현미경 상의 레이저 스캐닝 마이크로스코프 5 PASCAL 프로그램(Carl Zeiss, Jena, Germany)을 이용하여 이미지화하였다.
그 결과 도 3에서 나타낸 바와 같이, ROS에 의해 생산된 DCF와 일치하는 붉은 형광강도가 나타났으며, 이러한 형광강도를 대조군과 비교하여 정량화하였을 때 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 25μg/ml 처리한 실험군에서는 41의 형광강도 값이, 50μg/ml 처리한 실험군에서는 25의 형광강도 값이, 100μg/ml를 처리한 실험군에서는 20의 형광강도 값이 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 본 발명의 모로우붉은실 추출물 처리가 UV-B 조사에 따른 ROS 시그널을 감소시키는 것으로 ROS 발생 감소를 반영하는 것이다(도 4 참조).
<3-3>
과산화물음이온
(
superoxide
anion
:
O2
-ㆍ) 소거활성 측정
xanthine/xanthine oxidase 시스템을 통해 생산된 과산화물음이온은 spin trapping agent인 DMPO(5,5 dimethyl-1-pyrroline-N-oxide)에 의해 DMPO/ㆍOOH adduct을 형성시킨 후, DMPO/ㆍOOH adduct 양을 ESR(electron spin resonance) spectrometer를 이용하여 측정하였다. 간략하게, xanthine oxidase(0.25U/mL) 20μl에 xanthine(5mM) 20μl, DMPO(1.5M) 20μl 및 모로우붉은실 추출물(100μg/mL) 20μl를 첨가하여 혼합한 후 5분 뒤에 ESR 시그널을 기록하였다. ESR spectrum의 조건은 하기 표 1에서 나타내었다.
| 매개변수 | 조건 |
| magnetic field | 336mT |
| power | 1.00mW |
| frequency | 9.4380GHz |
| modulation amplitude | 0.2mT |
| gain | 500 |
| scan time | 0.5 min |
| scan width | 10mT |
| time constant | 0.03sec |
| temperature | 25 |
그 결과 도 5에 나타낸 바와 같이, ESR spectrometer 데이터는 과산화물음이온 시그널이 xanthine/xanthine oxidase 시스템에서 2756의 값으로 증가하는 것으로 나타났으나, 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 처리한 경우 과산화물음이온 시스널이 1552 값으로 감소되었다. 이를 통해 본 발명의 추출물이 O2-ㆍ를 제거함으로서 시그널 형성이 저해되는 것을 확인할 수 있었다.
<3-4> 히드록실
라디칼
(
hydroxyl
radical
: ㆍ
OH
) 소거활성 측정
펜톤 반응(H2O2+FeSO4)으로 생성된 히드록실 라디칼은 spin trapping agent인 DMPO(5,5 dimethyl-1-pyrroline-N-oxide)에 의해 DMPO/ㆍOH adduct을 형성시킨 후, DMPO/ㆍOH adduct 양은 JES-FA ESR spectrometer(JEOL, Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였다. 0.3M의 DMPO, 10mM FeSO4, 10mM H2O2을 포함하는 pH 7.4의 인산버퍼용액에 100μg/ml 모로우붉은실 추출물을 혼합한 후 2.5분 뒤에 ESR 시그널을 기록하였다. ESR spectrum의 조건은 하기 표 2에서 나타내었다.
| 매개변수 | 조건 |
| magnetic field | 336mT |
| power | 1.00mW |
| frequency | 9.4380GHz |
| modulation amplitude | 0.2mT |
| gain | 200 |
| scan time | 0.5 min |
| scan width | 10mT |
| time constant | 0.03sec |
| temperature | 25 |
그 결과 도 6에 나타낸 바와 같이, ESR spectrometer 데이터는 히드록실 라디칼 시그널이 펜톤반응 시스템 하에 3930의 값까지 증가되었으며, 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 처리한 경우 히드록실 라디칼 시스널이 2182 값으로 감소되는 것으로 나타났다. 이를 통해 본 발명의 추출물이 ㆍOH를 제거함으로서 시그널 형성이 저해되는 것을 확인할 수 있었다.
<
실시예
4>
본 발명의
모로우붉은실
추출물이 세포에 미치는 영향
본 실험에서는 본 발명의 모로우붉은실 추출물이 세포성장에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 MTT assay를 이용하여 세포생존율을 조사하였다.
<4-1> 농도별 세포독성 측정
인간 케라틴세포(HaCaT cells)를 96 웰 플레이트에 1×105 cells/ml가 되도록 분주하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 16시간 배양한 후, 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 6.25, 12.5, 25, 50, 100μg/ml 의 농도로 각각 첨가하였다. MTT assay를 위하여 50μL의 MTT stock solution(2mg/mL)을 전체 반응볼륨이 200μL가 되도록 각각의 웰(well)에 첨가한 후 4시간 동안 세포들을 더 배양하여 MTT가 환원되도록 하였다. 플레이트는 800×g에서 5분간 원심분리한 후 상등액을 제거하고, 각각의 웰에 150μl 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide)를 첨가하여 formazan crystal을 녹인 후, scanning multi-well spectrophotometer로 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 흡광도는 MTT가 세포에 의해서 환원된 양을 나타내며, 따라서 각 웰(well)에 존재하는 세포 생존수와 비례한다.
그 결과 도 7에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 추출물은 6.25, 12.5, 25, 50, 100μg/ml의 어떤 농도에서도 세포독성이 나타나지 않았다. 이러한 결과를 바탕으로, 본 발명의 모로우붉은실 추출물은 항산화효과가 높은 100μg/ml가 최적의 양이라 판단되었으며, 하기에서는 본 발명의 모로우붉은실 추출물의 농도를 100μg/ml로 하여 실험을 실시하였다.
<4-2> 본 발명의 추출물 처리 후
UV
-B 조사 시 세포생존율 측정
본 실험에서는 UV-B 조사가 세포에 미치는 영향과 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 처리한 경우 UV-B 조사에 대응하여 세포를 보호하는 효과를 조사하였다.
인간 케라틴세포(HaCaT cells)를 96 웰 플레이트에 1×105 cells/ml가 되도록 분주하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 16시간 배양한 다음, 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 100μg/ml를 첨가하였다. 1시간 후 UV-B를 조사한 다음 37℃에서 48시간 동안 배양하였으며, MTT assay를 위하여 50μL의 MTT stock solution(2mg/mL)을 전체 반응볼륨이 200μL가 되도록 각각의 웰(well)에 첨가한 후 4시간 동안 세포들을 더 배양하여 MTT가 환원되도록 하였다. 플레이트는 800×g에서 5분간 원심분리한 후 상등액을 제거하고, 각각의 웰에 150μl 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide)를 첨가하여 formazan crystal을 녹인 후, scanning multi-well spectrophotometer로 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 흡광도는 MTT가 세포에 의해서 환원된 양을 나타내며, 따라서 각 웰(well)에 존재하는 세포 생존수와 비례한다. 대조군으로는 본 발명의 추출물 대신 PBS를 사용하였다.
그 결과 도 8에서 나타낸 바와 같이, UV-B가 조사된 실험군에서는 28%의 세포생존율을 보인 것과 비교하여 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 처리한 후 UV-B 조사한 실험군에서는 세포생존율이 79%로 두드러지게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
<
실시예
5>
본 발명의
모로우붉은실
추출물이 항산화효소에 미치는 영향
상기 실시예 3에서는 본 발명의 모로우붉은실 추출물이 자유라디칼 소거 효과를 보이는 것을 확인하였는데, 본 실험에서는 이러한 자유라디칼 소거능이 항산화 효소에 따른 영향을 받은 것인지 확인하기 위하여 본 발명의 모로우붉은실 추출물로 처리된 세포에서의 항산화효소(SDO 및 catalase) 활성 및 단백질 발현량을 조사하였다.
<5-1>
SOD
(
superoxide
dismutase
)의 활성 측정
슈퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase: SOD)는 인체 내에서 대표적인 활성산소라고 할 수 있는 과산화물음이온(superoxide anion: O2-ㆍ)을 과산화수소(H2O2)로 변화시키는 항산화효소이다.
인간 케라틴세포(HaCaT cells)를 100μg/ml 농도의 본 발명의 모로우붉은실 추출물로 24시간 동안 처리하고, 1시간 후 세포들에 UV-B를 조사한 다음 인큐베이터에서 37℃, 24시간 동안 배양하였다. SOD 활성은 colorimetric assay kit(Abcam, Cambridge, MA, USA)를 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라서 측정하였다. 이때 키트는 과산화물음이온의 감소에 따라 수용성 formazan을 생산할 수 있는 tetrazolium salt WST-1을 이용하였으며, formazan 염료 생산물은 450nm에서 검출되었다. SOD 활성은 과산화물음이온(superoxide anion: O2-ㆍ)의 억제 퍼센트로써 나타내었다.
그 결과 도 9에서 나타낸 바와 같이, UV-B 조사에 의해 세포 내 SOD 활성은 54 mU/ml로 감소하였으나, 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 처리한 실험군에서는 61 mU/ml로 효소활성이 회복되는 것을 확인할 수 있었다.
<5-2>
카탈라제
(
catalase
)의 활성 측정
카탈라제는 과산화수소를 물로 변화시키는 효소로서 지질과산화를 일차적으로 방호하며 라디칼 생성을 억제하는 항산화효소이다. 따라서 본 발명자들은 본 발명의 모로우붉은식 추출물이 라디칼 생성 억제 효소인 카탈라제의 활성을 조절하여 항산화활성을 갖는지를 다음과 같은 실험을 통해 확인하였다.
모로우붉은실 추출물을 인간 케라틴세포(HaCaT cells)에 100μg/ml 농도로 24시간 동안 처리하고, 1시간 후 상기 세포에 UV-B를 조사한 다음 인큐베이터에서 37℃, 24시간 동안 배양하였다. 카탈라제 활성은 colorimetric assay kit(Abcam, Cambridge, MA, USA)를 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라서 측정하였다. 간략하게 카탈라제는 H2O2 존재 하에 전자 공여체로써 제공하는 메탄올과 반응한다. 생산된 포름알데하이드는 발색체(chromogen)로서 4-amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4-trizole를 이용하여 측정되었으며, 540nm에서 검출되었다. 카탈라제 활성은 nmol/min/ml로써 나타내었다.
그 결과, 도 10에서 나타낸 바와 같이, UV-B 조사에 의해 세포 내 CAT 활성은 10 nmol/min/ml로 감소하였으나, 본 발명의 모로우붉은실 추출물을 처리한 실험군에서는 21 nmol/min/ml로 효소활성이 회복되는 것을 확인할 수 있었다.
<5-3> 세포 내
SOD
및
카탈라제
단백질 발현량 측정
본 발명의 모로우붉은실 추출물이 세포 내 SOD 및 카탈라제의 활성뿐만 아니라 이들의 단백질 발현에도 영향을 미치는지를 조사하기 위하여, 웨스턴 블랏팅을 통해 SOD 및 카탈라제의 단백질 발현수준을 측정하였다.
인간 케라틴세포(HaCaT cells)를 100μg/ml 농도의 모로우붉은실 추출물로 1, 6, 12, 24시간 동안 처리한 후, 수득하여 용해버퍼(120mM NaCl, 40mM Tris(pH 8) 및 0.1% NP 40을 포함) 100μl로 30분 동안 처리하였다. 이후 세포들은 13,000×g에서 15분 동안 원심분리한 다음, 세포 용출액에서 상등액을 분리한 후, 단백질 농도를 결정하였다. 이후 세포 용출액 중 일부를(40μg)를 5분 동안 가열한 후 10% SDS-폴리아크릴아마이트 젤 상에서 전기영동하고, 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 이동시켰다. 그 다음 10% skim milk를 니트로셀룰로오스 멤브레인에 전처리하고, 목적 단백질에 대한 1차 항체를 처리한 후 2차 이뮤노글로불린-G-호스라디시 퍼옥시데이스 컨쥬게이트(Pierce, Rockford, IL, USA)를 처리하였다. 단백질 밴드는 강화된 chemiluminescence western blotting detection kit(Amersham, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK)를 이용하여 검출하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 모로우붉은실 추출물을 처리한 실험군은 대조군(β-actin)과 비교하여 Cu/Zn SOD 및 카탈라제 단백질 발현량이 시간 의존적으로 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
<
실시예
6>
모로우붉은실
추출물의
UV
-B에 의한 세포자연사(
apoptosis
) 억제 효과 분석
상기 실시예 <4-2>에서는 UV-B에 의한 세포사멸이 본 발명의 모로우붉은실 추출물 처리에 의해 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 이에 본 발명자들은 UV-B에 의한 세포사멸이 직접적으로 세포자연사와도 연관되어 있는지를 조사하기 위하여, 본 발명의 모로우붉은실 추출물 처리에 따른 세포자연사(apoptosis) 억제 효과를 측정하였다.
세포자연사 억제 효과를 위해 먼저 세포들의 핵 염색을 통해 apoptotic bodies를 관찰하였다. 인간 케라틴세포(HaCaT cells)에 모로우붉은실 추출물을 100μg/ml 농도로 처리하고, 1시간 후 세포들을 UV-B에 노출시켰다. 세포들은 추가적으로 37℃에서 48시간 동안 배양시킨 후, DNA 특이적 형광염료인 Hoechst 33342(stock 10mg/ml) 1.5μl를 각각의 웰(well)에 첨가하여 37℃에서 10분간 배양시켰다. 염색된 세포들은 핵 응축의 정도를 검사하기 위해 CoolSNAP-Pro 컬러 디지털 카메라가 장착된 형광현미경 하에서 가시화시켰고 이를 정량화하였다.
그 결과 도 12에서 나타낸 바와 같이, UV-B가 조사된 실험군에서 세포자연사를 나타내는 apoptotic bodies의 핵의 단편들이 두드러지게 관찰되는 반면, 본 발명의 모로우붉은실 추출물 처리한 후 UV-B를 조사한 실험군에서는 apoptotic bodies의 핵 단편이 급격히 감소되는 것을 확인할 수 있었다.
또한 본 발명의 모로우붉은실 추출물의 세포자연사 억제 효과를 측정하기 위하여 세포들의 DNA 단편화(fragmentation)를 관찰하였다. 세포의 DNA 단편화는 제조자의 지시에 따라 Roche Diagnostic(Portland, OR, USA)로부터 구입한 키트를 사용하여 분석되는 세포질의 히스톤-관련된 DNA 단편으로써 평가되었다.
그 결과 도 13에서 나타낸 바와 같이, UV-B 조사된 세포에서는 DNA의 단편화가 높게 나타난 반면, 본 발명의 모로우붉은실 추출물 처리 후 UV-B를 조사한 실험군에서는 DNA의 단편화가 두드러지게 감소되는 것으로 나타났다.
따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 모로우붉은실 추출물이 UV-B 조사에 의한 세포자연사(apoptosis)의 억제를 핵 응축의 정도 및 DNA 단편화 실험을 통해 효과적으로 억제한다는 사실을 알 수 있었고, 궁극적으로 모로우붉은실 추출물이 UV-B 조사로부터 세포를 보호하는 효과가 우수하다는 것을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (5)
- 모로우붉은실(Polysiphonia morrowii Harvey) 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 피부괴사 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
- 제 1항에 있어서,
모로우붉은실 추출물은 물, 유기 용매 또는 이들의 혼합 용매 추출물인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
- 제 2항에 있어서,
상기 모로우붉은실 추출물은 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
- 삭제
- 제 1항에 있어서,
상기 약제학적 조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제로 이루어진 군으로부터 선택되는 피부 외용제 형태의 조성물인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
Priority Applications (1)
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| KR20140019156A KR101509391B1 (ko) | 2014-02-19 | 2014-02-19 | 모로우붉은실 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 피부손상 억제 및 피부치료용 조성물 |
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-
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| Food Sci. Biotechnol. Vol. 18, No. 1, pp. 124 ~ 129 (2009) * |
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