KR100802005B1 - 진세노사이드를 이용한 멜라닌 생합성 저해제 - Google Patents

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Abstract

본 발명 진세노사이드를 이용한 멜라닌 생합성 저해제는 화학식 1과 2로 표시되는 진세노사이드 Rc, 진세노사이드 Rd와 진세노사이드 Rc, 진세노사이드 Rd의 함량을 높이도록 파핑 처리한 인삼추출물의 새로운 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 멜라닌 색소 형성 미생물인 스트렙토마이세스 비키니엔시스(Streptomyces bikiniensis)와 B16 Mouse 멜라노마 세포(melanoma cell)의 멜라닌 생합성 억제 효과를 가진 인삼의 성분인 진세노사이드 Rc, 진세노사이드 Rd의 피부미백 성분조성물 및 이 조성물의 화장료, 멜라닌 관련 질환 치료제의 용도 및 파핑(puffing, 팽화)처리로 인삼의 생리활성성분인 진세노사이드(ginsenoside)의 함량을 파핑 처리 전의 대조구 보다 진세노사이드-Rg1이 약 18%, 진세노사이드 Re가 약 14%, 진세노사이드 Rf가 약 10%, 진세노사이드 Rh1이 200%, 진세노사이드 Rb1이 약 18%, 진세노사이드 Rc가 약 21%, 진세노사이드 Rb2가 22%, 진세노사이드 Rd가 20%, 진세노사이드 Rg3가 약 130% 이상으로 미백효과를 가진 진세노사이드 Rc와 진세노사이드 Rd의 함량이 증량된 팽화(puffing) 인삼추출물의 피부미백 성분조성물 및 이 조성물의 화장료, 멜라닌 관련 질환 치료제로 사용할 수 있는 것을 특징으로 한다.
진세노사이드(ginsenoside) Rc, 진세노사이드(ginsenoside) Rd, 멜라닌, 파핑(puffing), 팽화인삼추출물

Description

진세노사이드를 이용한 멜라닌 생합성 저해제{Melanin Biosynthesis Inhibitors which using of ginsenosides}
도 1a, 1b, 1c 는 본 발명의 진세노사이드 Rc, 진세노사이드 Rd와 그 함량들을 높인 팽화(puffing) 인삼추출물의 멜라닌 생합성 저해 정도(white zone)를 스트렙토마이세스 비키니엔시스(Streptomyces bikiniensis) 균주를 사용하여 조사한 것이다.
도 2 는 본 발명의 진세노사이드 Rc, 진세노사이드 Rd와 그 함량들을 높인 팽화(puffing) 인삼추출물의 멜라닌 생합성 저해 정도를 쥐(mouse)의 B16 멜라노마 세포(melanoma cell)에 대해 조사한 것이다.
도 3 은 자외선 조사 후 본 발명의 방법에 따라 제조된 미백제를 도포한 부위(A)와 도포하지 않은 부위(B)를 사진을 찍어 비교한 것이다.
도 4 는 본 발명에 의한 진세사노이드 Rc를 유효성분으로 함유하는 화학 구조식이다.
도 5는 본 발명에 의한 진세사노이드 Rd를 유효성분으로 함유하는 화학 구조식이다.
본 발명은 진세노사이드(ginsenoside) Rc, 진세노사이드(ginsenoside) Rd와 진세노사이드(ginsenoside) Rc와 진세노사이드(ginsenoside) Rd의 함량을 높이도록 파핑(puffing) 처리에 의해 가공된 인삼추출물과 멜라닌 생합성 저해제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 진세노사이드 Rc, 진세노사이드 Rd와 일반 인삼추출물보다 파핑(puffing)처리하여 진세노사이드 Rc의 함량을 높인 팽화인삼추출물(엑기스, 분말)의 멜라닌 생합성 저해제로서 그 용도는 멜라닌 생성 억제, 피부 노화 방지, 피부 보호, 미백 기능을 가지는 화장료, 기미, 주근깨, 반점 또는 임신기 과색소 침착(hyper pigmentation)의 치료제로 사용할 수 있는 것을 특징으로 한다.
즉 본 발명은 멜라닌 색소 형성 미생물인 스트렙토마이세스 비키니엔시스 (Streptomyces bikiniensis)의 멜라닌 생합성 억제 효과와 동물세포인 쥐(mouse)의 B16 멜라노마 세포(melanoma cell)의 멜라닌 생합성 억제 효과, 자외선 조사 후 피부 미백효과를 지니는 진세노사이드 Rc, 진세노사이드 Rd 및 파핑(puffing) 처리에 의해 가공된 인삼추출물에 함유하는 멜라닌 색소 생합성 저해제로 인삼의 유효성분인 진세노사이드가 파핑 처리에 의해 증가되어 진세노사이드 Rg1이 약 18%, 진세노사이드 Re가 약 14%, 진세노사이드 Rf가 약 10%, 진세노사이드 Rh1이 200%, 진세노사이드 Rb1이 약 18%, 진세노사이드 Rc가 약 21%, 진세노사이드 Rb2가 23%, 진세노사이드 Rd가 약 20%, 진세노사이드 Rg3가 약 130% 이상으로 피부미백성분인 진세노사이드 Rc와 진세노사이드 Rd의 함량이 기존 인삼추출물보다 증량된 팽화(puffing) 인삼추출물을 함유하는 미백 추출물로 구성된 조성물에 관한 것이다.
한편으로는, 진세노사이드 Rc, 진세노사이드 Rd와 인삼을 파핑처리하여 물, 에탄올, 메탄올, 아세톤 또는 이들의 혼합용매에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용하여, 열수 또는 가열 조건하에서 수득된 추출물과 이들에 함유되어 있는 유효성분인 진세노사이드 Rc와 진세노사이드 Rd의 성분 함량이 현격하게 증가된 팽화인삼추출물의 성분조성물 및 이 조성물의 화장료, 멜라닌 관련 질환의 치료제 및 식품 첨가물로서, 상기 피부미백제들은 강력한 항산화 활성으로 인하여 멜라닌 생성 억제, 피부 노화 방지, 피부 보호, 미백 기능을 가지는 화장료, 기미, 주근깨, 반점 또는 임신기 과색소 침착(hyper pigmentation)의 치료제 및 식품의 갈변 억제제로 사용될 수 있는 용도를 지닌 것이다.
멜라닌(melanin)은 검은 색소와 단백질의 복합체 형태를 지니는 페놀류의 생체 고분자 물질로서, 사과, 감자, 바나나의 잘린 표면이 공기 중에 노출될 때 발생하는 갈변 또는 동물의 외피, 깃털, 피부, 머리, 눈 등에서 관찰된다.
그러나 멜라닌이 과잉 생산되는 경우 피부에 기미, 주근깨 등이 형성되고 피부 노화도 촉진되며, 피부암도 유발될 수 있고 또한 식품에서는 채소, 과일, 생선 등의 품질을 저하시키는 작용도 한다.
멜라닌은 주로 티로시나제의 작용에 의하여 생합성되는 것으로 보고되고 있다.
상기 티로시나제는 구리와 결합한 효소로서, 동물, 식물, 미생물 및 사람 등에 넓게 분포되어 있고, 모노하이드록시 또는 디하이드록시 페닐알라닌 (dihydroxy-phenylalanine, DOPA)등의 페놀 화합물에서 호기적 산화를 촉진시키고, 자외선에 심하게 노출된 피부에 멜라닌토스(melanintorth)를 침착시켜 피부의 노화나 손상을 유발시키는 작용을 한다.
또한 야채 또는 과실류에서도 티로시나제 등과 같은 폴리페놀 옥시다제 (polyphenol oxidase)가 식품의 갈변화 현상을 초래한다.
멜라닌의 생합성 대사는 피부암과 관련하여 최근 집중적으로 연구되고 있고, 이로부터 다양한 멜라닌 생성 저해제 등이 개발되어 의약품 산업에서 피부 질환 치료제, 화장품 산업에서 기미, 주근깨 등을 예방 및 치료하는 피부 미백제 또는 식품 산업에서 갈변 방지제 등으로 적용되고 있다.
또한 최근에는 환경문제와 관련하여 그 수요가 급격히 증가하고 있다.
이와 같이 멜라닌 생합성 저해제가 다양한 미백제 등으로 개발되어 현재 사용되고 있지만, 여러 가지 문제점도 동시에 제기되고 있다.
실제로 기미, 주근깨, 반점 및 임신기 과색소 침착과 같은 과잉 색소증 치료에 국부적으로 사용되고 있는 4-하이드록시아니솔(4-hydroxyanisole) 및 하이드로퀴논등은 강력한 멜라닌 생성 저해활성은 있으나 동시에 색소세포의 변성 또는 치사를 유발하고 세포 본래의 기능을 손상시키는 등의 부작용을 나타낸다.
특히 하이드로퀴논 계열의 화합물은 멜라닌 생합성을 저해하는 미백용 크림으로 개발되어 사용되었으나, 세포 독성으로 인한 피부 자극 또는 피부병을 유발하는 것으로 알려져 현재 일부 국가에서만 사용이 허가되고 있는 실정이다.
따라서, 미리 안정성이 입증되어 있는 천연물을 이용하여 멜라닌 색소 형성 저해물질을 선별하려는 시도들이 이루어지고 있다.
따라서 본 출원인은 세포 독성으로 인한 피부 자극 등이 없는 멜라닌 생합성 저해제를 개발하기 위하여 노력하여 오던 중, 진세노사이드 Rc와 진세노사이드 Rd가 멜라닌 생합성 저해능력이 뛰어나고 또한 이 성분들의 함량을 높인 파핑처리에 의해 가공된 인삼의 유효성분 추출물(팽화인삼추출물)이 기존 인삼추출물과 달리 저해 활성이 높을 뿐만 아니라 독성이 없는 안전한 화합물임을 알아내어 본 발명을 완성하였다.
이에 본 발명자들은 천연물로부터 멜라닌 생성을 억제하는 멜라닌 색소 생성 저해제를 개발하기 위하여 연구하던 중, 진세노사이드 Rc, 진세노사이드 Rd 및 인삼을 파핑처리하여 유효성분인 진세노사이드 Rc와 진세노사이드 Rd의 함량을 현격히 높인 팽화인삼추출물이 멜라닌 생성을 효과적으로 억제함을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명은 피부미백제로서의 진세노사이드 Rc, 진세노사이드 Rd 및 인삼을 파핑 처리하여 진세노사이드 Rc와 진세노사이드 Rd의 함량을 현저히 높인 인삼추출물의 미백효과 및 그들의 다양한 용도를 발명한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 멜라닌 생성 억제, 피부노화방지, 피부 보호 및 피부 미백 기능을 가지는 화장료, 기미, 주근깨, 반점 또는 임신기 과색소 침착(hyper pigmentation)의 치료제로서 하기 화학식 1과 2로 표시되는 진세노사이드 Rc, 진세노사이드 Rd와 피부 미백제인 진세노사이드 Rc와 진세노사이드 Rd의 함량이 증량된 팽화인삼추출물을 제공하는 것이다.
즉 상기 팽화인삼추출물은 인삼을 파핑(puffing, 팽화)처리 하여 물, 에탄올, 메탄올, 아세톤 또는 이들의 혼합용매에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용하여, 열수 또는 가열 조건하에서 수득된 추출물과 이들에 함유되어 있는 유효성분인 진세노사이드 Rc와 진세노사이드 Rd가 파핑처리에 의해 증가되어 파핑처리 전의 대조구보다 진세노사이드 Rc가 약 21%, 진세노사이드 Rd가 약 20% 증량된 추출물을 특징으로 하는 것이다.
이때 유기용매 사용 시 유기용매의 농도는 40∼99% 범위로 하고 열수 조건 또는 가열 조건에서 인삼의 유효성분인 진세노사이드 Rc와 진세노사이드 Rd 성분들의 추출 함량을 높이는 것이 바람직하다.
Figure 112006039293703-pat00001
Figure 112006039293703-pat00002
이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
도 1a, 1b, 1c 는 본 발명의 진세노사이드 Rc, 진세노사이드 Rd와 그 함량들을 높인 팽화(puffing) 인삼추출물의 멜라닌 생합성 저해 정도(white zone)를 스트렙토마이세스 비키니엔시스(Streptomyces bikiniensis) 균주를 사용하여 조사한 것이다.
A : arbutin B : 인삼추출물
C : ginsenoside Rc D : kojic acid
E : 팽화인삼추출물 F : 탄닌
G : ginsenoside Rd
본 발명은 도 1a 내지 1c와 표3을 참조하여 보면 멜라닌 생합성 저해활성을 가지는 진세노사이드 Rc와 진세노사이드 Rd 및 진세노사이드 Rc와 진세노사이드 Rd의 함량을 높이기 위해 인삼을 파핑(puffing, 팽화) 처리하여 물과 유기용매 등을 사용하여 다양한 온도에서 추출한다.
상기 추출조건은 바람직하게는 추출 용매와 온도에 따른 건조 수율과 유효성분 함량을 고려할 때 열수 추출 조건에서 40∼99% 아세톤을 사용하거나, 가열 조건에서 40∼99% 에탄올 또는 40∼99% 메탄올을 사용하여 추출물을 제조한다.
더욱 바람직하게는 열수 추출 조건에서 40∼99% 아세톤을 사용하거나, 가열 조건에서 40∼99% 에탄올 또는 40∼99% 메탄올을 사용하여 팽화인삼추출물을 제조한다.
상기 진세노사이드 Rc, 진세노사이드 Rd 및 진세노사이드 Rc와 진세노사이드 Rd의 함량을 높인 팽화인삼추출물의 멜라닌 생합성 저해 활성을 멜라닌색소를 생합성하는 미생물인 스트렙토마이세스 비키니엔시스(Streptomyces bikiniensis) 균주 등을 이용하여 멜라닌 생성 저해환(Inhibition zone, mm)의 크기를 측정한 결과, 상기 본 발명의 화합물은 알부틴(arbutin) 및 코지산(kojic acid), 파핑처리 하지 않은 인삼추출물보다 비교적 크고 깨끗한 저해 환을 생성시켰다.
도 2 는 본 발명의 진세노사이드 Rc, 진세노사이드 Rd와 그 함량들을 높인 팽화(puffing) 인삼추출물의 멜라닌 생합성 저해 정도를 쥐(mouse)의 B16 멜라노마 세포(melanoma cell)에 대해 조사한 것이다.
A : 대조군 B : 팽화인삼추출물
C : ginsenoside Rd D : ginsenoside Rc
E : 인삼추출물
또한 도 2와 표 4를 참조하여보면 상기 진세노사이드 Rc, 진세노사이드 Rd와 진세노사이드 Rc와 진세노사이드 Rd의 함량을 높인 팽화인삼추출물의 멜라닌 생성 에 대한 저해 활성도를 쥐의 B16 멜라노마 세포(melanoma cell)를 이용하여 조사한다.
이 때 동일농도에서 미백효과를 측정한 결과, 본 발명의 진세노사이드 Rc와 진세노사이드 Rd와 팽화인삼추출물은 파핑처리하지 않은 인삼추출물과는 달리 멜라닌 생성에 대한 우수한 저해 활성을 나타내었다.
도 3 은 자외선 조사 후 본 발명의 방법에 따라 제조된 미백제를 도포한 부위(A)와 도포하지 않은 부위(B)를 사진을 찍어 비교한 것이다.
또한 상기 진세노사이드 Rc, 진세노사이드 Rd와 진세노사이드 Rc, 진세노사이드 Rd의 함량을 높인 팽화인삼추출물로 제조한 화장품 시제품의 멜라닌 생성에 대한 치료효과를 40명을 대상으로 인체 피부의 팔뚝부위에 각각 4cm × 4cm의 크기로 두 부위에 UVB를 조사하여 한 곳은 제조한 시제품을 바르고, 바르지 않은 채, 색차계를 이용하여 L값을 측정하여 조사한다.
이 때 표5를 참조하여보면 시제품을 바른 부위와 바르지 않은 부위의 L값을 측정하여 현저한 효과, 유효, 무효의 3단계로 평가하였다.
실험 결과, 표 5에서 나타난 바와 같이 유효 이상의 양성 효과가 높게 나타남으로써 탁월하게 색소 침착이 억제되는 효과를 보여주었다.
따라서, 본 발명의 진세노사이드 Rc, 진세노사이드 Rd 및 진세노사이드 Rc, 진세노사이드 Rd의 함량을 높인 인삼을 파핑처리하여 유기용매로 추출한 팽화인삼추출물은 멜라닌 색소 생성 억제제로서 기미, 주근깨, 반점 또는 임신기 과색소 침착 등의 예방 및 치료에 사용될 수 있다.
또한, 진세노사이드 Rc, 진세노사이드 Rd와 진세노사이드 Rc, 진세노사이드 Rd의 함량을 높인 팽화인삼추출물은 멜라닌 생성 억제, 피부 노화 방지, 피부 보호 또는 미백 기능을 가지는 화장료로도 사용되어 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 맛사지크림, 엣센스, 팩 등에 첨가될 수 있다.
상기 진세노사이드 Rc, 진세노사이드 Rd와 진세노사이드 Rc, 진세노사이드 Rd의 함량을 높인 팽화인삼추출물은 이미 독성이 없음이 확인된 식용의 천연물이고, 진세노사이드 Rc, 진세노사이드 Rd와 상기 과정을 통하여 제조된 팽화인삼추출물이 치료용 약제로 이용되기 위해서 약제학적 분야에서 공지의 방법에 의하여 제조될 수 있으며, 그 자체 또는 약학적으로 허용되는 담체(carrier), 부형제(forming agent), 희석제(diluent) 등과 혼합하여 연고제, 분말, 과립, 정제, 캡슐제 또는 주사제 등의 제형으로 제조되어 사용될 수 있다.
또한, 이들은 비경구 또는 경구로 투여되거나 피부에 도포하여 사용될 수 있다.
또한 본 발명에 따른 유효 성분의 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성화율, 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증정도 등에 따라 적절히 선택되나, 일반적으로 성인에게 1일에 30 ~ 300 mg 정도를 사용하나 50 ~ 200 mg 정도를 사용하는 것이 바람직하다.
이렇게 제형화된 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감시하거나 관찰하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나, 일정시간 간격으로 수회 투여하거나 피부에 도포할 수 있다.
이하 실시예, 제조예 및 실험예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예, 제조예 및 실험 예들은 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 이들 내용에 의하여 한정되는 것은 아니다.
(실시예 1) 파핑처리한 인삼의 유기용매별 추출에 의한 조(crude) 사포닌 총 함량 조사
인삼을 파핑(puffing, 팽화)처리하여 얻은 분말 100g에 각각 추출용매로 물과 온도를 달리한 에탄올, 메탄올 또는 아세톤을 0.5∼3L 첨가하여 12시간 이하로 각 추출 온도에 따라 진탕 배양기(shaking incubator, 30℃) 또는 온도 조절 수조가 부착된 환류추출기 (95℃)로 추출한 다음 회전증발기(rotary evaporator)를 사용하여 50℃에서 상기 추출물을 감압 농축시키고 다시 진공 건조시켜 분말 상태의 추출물을 얻었다.
상기 추출물을 항량된 플라스크에 검체 7g을 넣어 감압농축(70~80℃)한다. 농축액을 물포화부탄올 50mL를 가하여 수욕 중에서(70~80℃) 환류냉각기를 붙여 1시간 가열 추출한다(가끔 흔들어준다).
상기 추출 후 상층은 분액여두에 여과하여 넣고 잔류물은 환류냉각 한다(3회 반복).
여지는 물포화부탄올 10mL로 세척 여액 및 세액을 합하여 분액 여두에 넣고 물 20mL로 잘 진탕시켜 수세한다.
분액여두를 잘 섞어준다(하루밤 방치).
처음 사용했던 플라스크에 물포화부탄올 추출액 전액(상층)을 넣고 수욕 중 에서 감압 농축하여 부탄올을 제거한다.
그 잔류물에 에테르 50mL를 넣고 환류냉각기를 붙여 수욕 중에서 46℃로 30분간 가열하여 탈지시킨 후 에테르를 제거한다.
105℃에서 항량이 될 때까지(3~4시간) 건조하고 데시케이터에서 30분간 방냉한 후 무게를 달아 다음 식에 따라 사포닌의 함량(홍삼성분)을 구한다.
홍삼성분(mg/g)=(A-B)/S × 1000
(A: 건조 후 플라스크 무게(g), B: 항량된 플라스크의 무게(g), S: 검체의 무게(g)
그 결과 60~80℃에서 에탄올로 추출한 후 파핑처리한 인삼의 총 조(crude)사포닌 함량이 월등히 높았다.
추출용매 및 추출온도에 따른 파핑처리한 인삼과 파핑처리하지 않은 인삼의 총 조사포닌 양
추출용매 추출 온도 (℃) 총 사포닌(mg/g)
파핑처리 인삼 인삼
물 80~95 30 15
70,80% 아세톤 60~80 40 20
70,80% 아세톤 30 20 10
70,80% 에탄올 60~80 180 70
70,80% 에탄올 30 50 24
70, 80% 메탄올 60~80 130 50
70, 80% 메탄올 30 40 18
(실시예 2) 파핑처리한 인삼추출물과 일반 인삼추출물의 진세노사이드 함량 조사
특히, 파핑처리하고 파핑처리하지 않은 인삼추출물의 70% 에탄올 추출물의 유효성분인 진세노사이드의 성분을 HPLC로 분석하였다.
팽화인삼추출물의 유효성분인 진세노사이드의 성분을 팽화하지 않은 일반 인삼추출물과 비교 분석하기 위하여 분말로 만들어 10% 메탄올, 80% 아세토니트릴 용매계를 이용한 Merke chromolith(RP-18e)컬럼의 HPLC(JASCO Japan)를 실시하여 UV 검출기를 이용하였다.
그 결과 표2를 참조하여보면 진세노사이드-Rg1이 파핑처리하지 않은 인삼추출물인 대조구 보다 약 18%, 진세노사이드 Rg1이 약 18%, 진세노사이드 Re가 약 14%, 진세노사이드 Rf가 약 10%, 진세노사이드 Rh1이 200%, 진세노사이드 Rb1이 약 18%, 진세노사이드 Rc가 약 21%, 진세노사이드 Rb2가 22%, 진세노사이드 Rd가 약 20%, 진세노사이드 Rg3가 약 130% 이상으로 함유되어 있는 것으로 나타났다.
파핑처리한 인삼추출물과 일반 인삼추출물의 진세노사이드 함량
성분명 일반인삼분말 (mg/100g) 파핑처리(팽화) 인삼분말(mg/100g)
ginsenoside Rg1 135.58 148.17
ginsenoside Re 509.98 583.64
ginsenoside Rf 238.58 265.85
ginsenoside Rh1 3.25 7.25
ginsenoside Rb1 934.39 1108.39
ginsenoside Rc 337.33 406.35
ginsenoside Rb2 121.06 148.39
ginsenoside Rd 78.37 94.04
ginsenoside Rg3 6.01 14.31
(실시예 3) Streptomyces bikiniensis NRRL B-1049에 대한 멜라닌 생합성 저해 활성 조사
본 발명의 진세노사이드 Rc, 진세노사이드 Rd와 진세노사이드 Rc, 진세노사이드 Rd의 함량을 높인 팽화인삼추출물의 멜라닌 생합성 저해 활성을 조사하기 위하여, 멜라닌 생합성 미생물인 스트렙토마이세스 비키니엔시스 B-1049 (Streptomyces bikiniensis NRRL B-1049)를 사용하였다.
구체적으로 상기 스트렙토마이세스 비키니엔시스 균주를 yeast extract 0.2%, soluble starch 1%, agar 1.5%를 함유하는 사면 배지에 접종하고, 이를 28℃에서 2주일간 배양한 다음 상기 사면 배양배지 표면에 2mL의 증류수를 가하여 기균사에 형성된 포자를 백금이로 긁어내고 포자 현탁액을 만든 다음, 이 포자 현탁액을 멸균된 시험관에 냉동 보관하였다.
또한, yeast extract 0.2%, soluble starch 1%, Tyrosine 0.05%, agar 1.5%를 함유하는 고체 배지를 만들고 멸균하여 페트리디쉬 (90mm i.d.)당 40 mL로 분주하였다.
이렇게 제작한 아가 플레이트에 각 플레이트당 0.2mL의 상기 스트렙토마이세스 비키니엔시스 포자 현탁액을 가하여 유리 하키 바 (glass hockey bar)로 균일하게 도포하였다.
다음 배지 표면을 건조시키고 이에 50μL의 시료를 적신 8mm 직경의 종이 디스크 (paper disc, Toyo Roshi Kasha Ltd., Japan)를 올려놓아 28℃ 조건에서 48시간 동안 배양함으로 멜라닌 생성 저해환 (inhibition zone, mm)이 생성되도록 하였다.
이 멜라닌 생성 저해환의 크기는 배지의 배면에서 계측하였고, 이 때 대조군으로는 일반인삼추출물, 코지산, 탄닌, 아부틴, 하이드로퀴논을 사용하였다.
그 결과, 도 1a 내지 1c와 표 3을 참조하여 보면 본 발명의 화합물에서의 저해환이 비교적 크고 깨끗하게 나타났다.
ginsenoside Rc, ginsenoside Rd와 ginsenoside Rc, ginsenoside Rd의 함량을 높이도록 파핑처리한 인삼추출물(팽화인삼추출물)과 대조군들과의 white zone(mm) 형성 정도
시료명 첨가 농도 (%) 저해환 (mm)
ginsenoside Rc 1 30
ginsenoside Rd 5 30
팽화인삼추출물 5 20
대조군 인삼추출물 5 0
아부틴 5 0
탄닌 5 0
코지산 5 0
하이드로퀴논 5 55
(실시예 4) B16 멜라노마 세포에 대한 멜라닌 생합성 저해 활성 조사
B16 F1 멜라노마 세포(strain C57BL/6J)의 멜라닌 생합성 저해도 판별을 다음과 같이 행하였다.
B16 멜라노마 세포를 1 x 105 cells/flask의 농도로 4.5 g/l of glucose, 10% (v/v) fetal bovine serum (FBS)과 1% (v/v) antibiotic-antimycotic (Gibco, Auckland, N.Z.)을 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Sigma) 배지에 현탁시켰다.
현탁세포 5mL를 25 mL T-flask에 넣고 검정시료를 농도별로 첨가한 후 5% CO2, 95% 공기조건으로 37℃에서 배양하였다.
24시간 배양 후 새로운 DMEM 배지로 대체하였다.
이어서 4일 간 배양한 후 플라스크 바닥에 흡착된 세포를 phosphate-buffered saline (PBS)로 씻은 후, 0.05% trypsin, 0.53mM EDTA 용액으로 떼어내었다.
떼어낸 세포를 1500rpm에서 10분간 원심분리 하여 튜브에 모은 후 PBS로 두 번 씻어 주었다.
세포의 수는 tryptan blue로 결정하였으며, 세포수를 측정하였으며, B16 F1 melanoma cells의 멜라닌을 추출하기 위하여 세포현탁액 1mL와 동량의 10% DMSO와 1N NaOH 혼합물을 첨가하여 흔들어 준 후, 상온에서 10분간 방치하였다.
3,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 멜라닌 함량을 ELISA Microplate Reader (PowerWaveX, Bio-Tek, USA)를 사용하여 475nm에서 결정하였다.
그 결과 도 2와 표 4를 참조하여보면 본 발명의 진세노사이드 Rc, 진세노사이드 Rd와 진세노사이드 Rc, 진세노사이드 Rd의 함량을 높인 팽화인삼추출물이 적은 농도에서 대조군으로 사용된 인삼추출물, 코지산, 아부틴보다 적은 농도에서 뛰어난 멜라닌 생합성 저해능을 보였다.
B16 멜라노마 세포(melanoma cell)에서 멜라닌 합성 저해 농도(IC50)
시료명 멜라닌
IC50(%)
ginsenoside Rc 0.0005
ginsenoside Rd 0.0008
팽화인삼추출물 0.001
대조군 인삼추출물 ND*
아부틴 0.003
코지산 0.0045
ND* : Not determined
< 제조예 1>
ginsenoside Rc를 함유한 화장료 중 유연 화장수 처방 예는 다음과 같다.
중량부
ginsenoside Rc 0.01
글리세린 3.0
부틸렌글리콜 2.0
프로필렌글리콜 2.0
카르복시비닐폴리머 0.1
에탄올 10.0
트리에탄올아민 0.1
방부제 미량
색소 미량
향료 미량
정제수 잔액
계 100.0
< 제조예 2>
ginsenoside Rc를 함유한 화장료 중 영양 화장수 처방 예는 다음과 같다.
중량부
ginsenoside Rc 0.01
밀납 4.0
폴리솔베이트 60 1.5
솔비탄세스퀴올레이트 0.5
유동파라핀 5.0
스쿠알란 5.0
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 5.0
글리세린 3.0
부틸렌글리콜 3.0
프로필렌글리콜 3.0
카르복시비닐폴리머 0.1
트리에탄올아민 0.2
방부제 미량
색소 미량
향료 미량
정제수 잔액
계 100.0
<제조예 3>
ginsenoside Rc를 함유한 화장료 중 영양크림 처방 예는 다음과 같다.
중량부
ginsenoside Rc 0.005
밀납 10.0
폴리솔베이트 60 1.5
솔비탄세스퀴올레이트 0.5
유동파라핀 10.0
스쿠알란 5.0
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 5.0
글리세린 5.0
부틸렌글리콜 3.0
프로필렌글리콜 3.0
트리에탄올아민 0.2
방부제 미량
색소 미량
향료 미량
정제수 잔액
계 100.0
<제조예 4>
ginsenoside Rc를 함유한 화장료 중 맛사지크림 처방 예는 다음과 같다.
중량부
ginsenoside Rc 0.005
밀납 10.0
폴리솔베이트 60 0.8
솔비탄세스퀴올레이트 0.5
유동파라핀 40.0
스쿠알란 5.0
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 4.0
글리세린 5.0
부틸렌글리콜 3.0
프로필렌글리콜 3.0
트리에탄올아민 0.2
방부제 미량
색소 미량
향료 미량
정제수 잔액
계 100.0
< 제조예 5>
ginsenoside Rc를 함유한 화장료 중 팩의 처방 예는 다음과 같다.
중량부
ginsenoside Rc 0.005
폴리비닐알콜 13.0
소듐카르복시메틸셀룰로스 0.2
알란토인 0.1
노닐페닐에테르 0.3
방부제 미량
색소 미량
향료 미량
정제수 잔액
계 100.0
<제조예 6∼10>
제조예 1~5에 있어서, 진세노사이드 Rc 대신 진세노사이드 Rd를 사용하는 것을 제외하고는 상기 제조예 1∼5와 동일한 처방으로 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림 및 팩을 제조하였다.
<제조예 11∼15>
제조예 1~5에 있어서, 진세노사이드 Rc 대신 팽화인삼추출물을 사용하는 것을 제외하고는 상기 제조예 1∼5와 동일한 처방으로 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 맛사지 크림 및 팩을 제조하였다.
<실험예 1> 피부의 색소 침착 억제
건강한 남녀 40명의 실험 대상자의 팔 하박부에 4×4cm2의 두 부위를 각각 설정하였다.
실험 대상 부위에만 자외선이 조사되도록 알루미늄 호일을 팔에 씌우고 10 cm 거리에서 일본 도시바 (주) 제 FL20S BLB 램프 및 FL20S E-30 램프를 각 2개 동시에 0.8×107erg/cm3/회로 1일 1회씩 연속 3회 조사하였다.
조사 전에 실험 대상 부위를 70% 이소프로필알콜 수용액으로 잘 세척하였다.
조사 후 자외선 조사 부위에 진세노사이드 Rc, 진세노사이드 Rd와 팽화인삼추출물을 함유한 제조예 1∼15의 처방을 1일 3회씩 도포하였다.
3주 도포한 후에 색차계의 L값으로 색소 침착도를 판정하고, 실험군이 대조군 (기제만 도포)에 비하여 색소 침착을 얼마나 억제하였는가를 현저한 효과, 유효, 무효의 3단계로 평가하였다.
실험 결과, 표 5에서 나타난 바와 같이 유효 이상의 양성 효과가 높게 나타남으로써 탁월하게 색소 침착이 억제되는 효과를 보여주었다.
실험군 현저한 효과 (명) 유효 (명) 무효 (명)
제조예 1 3 11 6
제조예 2 3 12 5
제조예 3 3 13 4
제조예 4 3 13 4
제조예 5 2 13 5
제조예 6 4 11 5
제조예 7 3 12 5
제조예 8 5 11 4
제조예 9 6 13 1
제조예 10 5 13 2
제조예 11 3 14 3
제조예 12 4 11 5
제조예 13 4 13 3
제조예 14 3 14 3
제조예 15 2 12 6
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 진세노사이드 Rc, 진세노사이드 Rd 및 진세노사이드 Rc와 진세노사이드 Rd의 함량을 높인 파핑 처리에 의한 인삼추출물(팽화인삼추출물)은 기존의 아부틴과 코지산에 비하여 멜라닌 생성을 탁월하게 억제하므로 피부 노화 방지, 피부 보호 및 미백 기능을 가지는 화장료, 기미, 주근깨, 반점 또는 임신기 과색소 침착(hyperpigmentation) 등의 과잉 색소증 치료제 등으로 유용하다.

Claims (9)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 인삼을 파핑(puffing) 처리에 의해 가공하여 물 또는 에탄올, 메탄올, 아세톤에서 선택된 1종 이상 40∼99%의 유기용매로 열수 조건 또는 가열 조건하에서 추출하여 수득함으로써 파핑처리 전의 대조구보다 진세사노이드 Rc가 약 21%, 진세노사이드 Rd가 약 20% 증량된 팽화인삼추출물을 함유하는 진세노사이드를 이용한 멜라닌 색소 생합성 저해제.
  4. 하기 화학식 1로 표시되는 진세사노이드 Rc의 화합물을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 생성 억제 및 피부 미백 기능을 가지는 화장료로 사용되는 것을 특징으로 하는 진세노사이드를 이용한 멜라닌 색소 생합성 저해제.
    화학식 1
    Figure 712007004106783-pat00012
  5. 하기 화학식 2로 표시되는 진세사노이드 Rd의 화합물을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 생성 억제 및 피부 미백 기능을 가지는 화장료로 사용되는 것을 특징으로 하는 진세노사이드를 이용한 멜라닌 색소 생합성 저해제.
    화학식 2
    Figure 712007004106783-pat00013
  6. 제 3항에 있어서;
    팽화인삼추출물을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 생성 억제 및 피부 미백 기능을 가지는 화장료로 사용되는 것을 특징으로 하는 진세노사이드를 이용한 멜라닌 색소 생합성 저해제.
  7. 제 6항에 있어서;
    팽화인삼추출물을 유효성분으로 함유하는 기미, 주근깨, 반점 또는 임신기 과색소 침착(hyperpigmentation)을 포함하는 과잉 색소증의 치료에 사용되는 약학적 조성물로 사용되는 것을 특징으로 하는 진세노사이드를 이용한 멜라닌 색소 생합성 저해제.
  8. 제 5항에 있어서;
    기미, 주근깨, 반점 또는 임신기 과색소 침착(hyperpigmentation)을 포함하는 과잉 색소증의 치료에 사용되는 약학적 조성물로 사용되는 것을 특징으로 하는 진세노사이드를 이용한 멜라닌 색소 생합성 저해제.
  9. 제 4항에 있어서;
    기미, 주근깨, 반점 또는 임신기 과색소 침착(hyperpigmentation)을 포함하는 과잉 색소증의 치료에 사용되는 약학적 조성물로 사용되는 것을 특징으로 하는 진세노사이드를 이용한 멜라닌 색소 생합성 저해제.
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