KR20010017516A

KR20010017516A - 새로운 멜라닌 생합성 저해제

Info

Publication number: KR20010017516A
Application number: KR1019990033077A
Authority: KR
Inventors: 이윤형; 이승재; 박시용; 이현국
Original assignee: 박인배; 해태제과 주식회사
Priority date: 1999-08-12
Filing date: 1999-08-12
Publication date: 2001-03-05

Abstract

본 발명은 티로시나제 저해 활성, 멜라닌 색소 형성 미생물인 스트렙토마이세스 비키니엔시스 (Streptomyces bikiniensis)의 멜라닌 생합성 억제 효과와 자외선 조사 후 피부 미백효과를 가지는 잣나무, 소나무 껍질과 잎 또는 쑥으로부터 추출물과 추출물로부터 분리한 시키미산, 프로토카테쿠산, 아세토페논, p-비닐페놀, 루코안토시안 중의 1종 이상의 각각의 피부 미백효과를 갖는 성분조성물 및 이들 물질과 이들 식물체에 함유되어 있는 벤조산, 신나미산, 클로로제니산, p-쿠마르산, 바닐리산 중의 1종 이상을 추가로 포함하는 피부 미백 조성물 및 그 용도에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 당류와 단백질을 제거한 후 물 또는 유기용매를 사용하여 열수 또는 가열 조건에서 잣나무, 소나무의 껍질과 잎 또는 쑥으로부터 추출한 추출물과 추출물로부터 성분 분리한 미백효과를 갖는 페놀산과 루코안토시안 및 이들에 함유되어 있는 기존에 알려진 페놀산들과의 피부미백 성분조성물 및 이의 화장료, 멜라닌 관련 질환의 치료제 및 식품 첨가물로서의 용도에 관한 것이다.

Description

새로운 멜라닌 생합성 저해제{New Melanin Biosynthesis Inhibitors}

본 발명은 소나무, 잣나무의 잎과 껍질 또는 쑥등으로부터 당류와 단백질을 효소를 이용하여 제거하고, 이를 물 또는 유기용매로 추출한 후 수득되는 티로시나제 저해 및 멜라닌 색소형성억제 활성을 지니는 신규한 추출물 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

즉 본 발명은 티로시나제(tyrosinase) 저해 활성, 멜라닌 색소 형성 미생물인 스트렙토마이세스 비키니엔시스(Streptomyces bikiniensis)의 멜라닌 생합성 억제 효과와 자외선 조사 후 미백효과를 지니는 잣나무(Pinus koraiensis Sieb. et zucc.), 소나무(Pinus densiflora Sieb. et Zucc.)의 잎과 껍질 또는 쑥으로부터 추출된 추출물에 관한 것으로, 잣나무, 소나무의 껍질(bark)로부터 분리한 시키미산(Shikimic acid), 프로토카테쿠산(Protocatechuic acid)과 잣나무잎와 솔잎 성분의 아세토페논(Acetophenone), p-비닐페놀(p-Vinylphenol), 루코안토시안(Leucoanthocyan), 시키미산, 프로토카테쿠산 등의 성분 중 하나 이상을 함유하는 미백 추출물에 관한 것이다.

이들의 추출 성분은 기존의 미백제인 페놀산류의 벤조산[Benzoic acid(일본특허공개 평 9-77,718호)], 클로로제니산[Chlorogenic acid(일본특허공개 평8-92,057호)], p-쿠마르산[p-Coumaric acid(일본특허공개 평 5-105,620호)], 신나미산[Cinnamic acid(미국특허 제4,978,523호)], 바닐리산[Vanillic acid(Journal of Food Biochemistry, 21(2), 125(1997))]등의 화합물을 1종 이상 포함하는 조성물이다.

한편으로는, 당류와 단백질 성분을 예비 전처리 공정에 의해 제거하고, 물, 에탄올, 메탄올, 아세톤 또는 이들의 혼합용매에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용하여, 열수 또는 가열 조건하에서 수득된 추출물과 이들에 함유되어 있는 페놀산등의 성분조성물 및 이 조성물의 화장료, 멜라닌 관련 질환의 치료제 및 식품 첨가물로서의 용도에 관한 것으로, 상기 피부미백제들은 강력한 항산화 활성으로 인하여 멜라닌 생성 억제, 피부 노화 방지, 피부 보호, 미백 기능을 가지는 화장료, 기미, 주근깨, 반점 또는 임신기 과색소 침착(hyper pigmentation)의 치료제 및 식품의 갈변 억제제로 사용될 수 있는 용도를 지닌 것이다.

멜라닌(melanin)은 검은 색소와 단백질의 복합체 형태를 지니는 페놀류의 생체 고분자 물질로서, 사과, 감자, 바나나의 잘린 표면이 공기 중에 노출될 때 발생하는 갈변 또는 동물의 외피, 깃털, 피부, 머리, 눈 등에서 관찰된다. 그러나 멜라닌이 과잉 생산되는 경우 피부에 기미, 주근깨 등이 형성되고 피부 노화도 촉진되며, 피부암도 유발될 수 있고 또한 식품에서는 채소, 과일, 생선 등의 품질을 저하시키는 작용도 한다.

멜라닌은 주로 티로시나제의 작용에 의하여 생합성되는 것으로 보고되고 있다. 티로시나제는 구리와 결합한 효소로서, 동물, 식물, 미생물 및 사람 등에 넓게 분포되어 있고, 모노하이드록시 또는 디하이드록시 페닐알라닌 (dihydroxy-phenylalanine, DOPA)등의 페놀 화합물에서 호기적 산화를 촉진시키고, 자외선에 심하게 노출된 피부에 멜라닌토스(melanintorth)를 침착시켜 피부의 노화나 손상을 유발시키는 작용을 한다. 또한 야채 또는 과실류에서도 티로시나제 등과 같은 폴리페놀 옥시다제(polyphenol oxidase)가 식품의 갈변화 현상을 초래한다.

멜라닌의 생합성 대사는 피부암과의 관련하여 최근 집중적으로 연구되고 있고, 이로부터 다양한 멜라닌 생성 저해제 등이 개발되어 의약품 산업에서 피부 질환 치료제, 화장품 산업에서 기미, 주근깨 등을 예방 및 치료하는 피부 미백제 또는 식품 산업에서 갈변 방지제 등으로 적용되고 있다. 또한 최근에는 환경문제와 관련하여 그 수요가 급격히 증가되고 있다.

지금까지 멜라닌 생성 저해제의 연구는 주로 티로시나제 저해제를 개발하는 방향으로 집중되어 왔고, 대표적인 티로시나제 저해제로는 티로시나제 활성부위의 구리이온에 대한 킬레이트 형성물질, 퀴논류를 페놀류로 환원시키는 아스코빅산등의 환원제 그리고 티로시나제 자체를 변성시키는 비설파이트(bisulfites) 제제 등을 들 수 있다.

이와 같이 티로시나제 저해제가 다양한 미백제 등으로 개발되어 현재 사용되고 있지만, 여러 가지 문제점도 동시에 제기되고 있다. 실제로 기미, 주근깨, 반점 및 임신기 과색소 침착과 같은 과잉 색소증 치료에 국부적으로 사용되고 있는 4-하이드록시아니솔(4-hydroxyanisole) 및 하이드로퀴논 등은 강력한 멜라닌 생성 저해활성은 있으나 동시에 색소세포의 변성 또는 치사를 유발하고 세포 본래의 기능을 손상시키는 등의 부작용을 나타낸다. 특히 하이드로퀴논 계열의 화합물은 멜라닌 생합성을 저해하는 미백용 크림으로 개발되어 사용되었으나, 세포 독성으로 인한 피부 자극 또는 피부병을 유발하는 것으로 알려져 현재 일부 국가에서만 사용이 허가되고 있는 실정이다. 따라서, 미리 안정성이 입증되어 있는 천연물을 이용하여 티로시나제 저해물질을 선별하려는 시도들이 이루어지고 있다.

이에 본 발명자들은 천연물로부터 멜라닌 생성을 억제하는 티로시나제 저해제와 멜라닌 색소 생성 저해제를 개발하기 위하여 연구하던 중, 잣나무, 소나무의 잎과 껍질 또는 쑥으로부터 분리한 추출물과 이들로부터 유래하는 기존에 미백효과가 알려지지 않은 페놀산등과 루코안토시안과의 혼합 또는 단독으로, 기존에 미백효과가 알려진 페놀산등과의 혼합물로서 멜라닌 생성이 효과적으로 억제됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 피부미백제로서의 천연 추출물과 천연 추출물로부터의 페놀산류와 루코안토시안과의 단독 또는 혼합물의 미백효과 및 그들의 다양한 용도를 발명한 것이다.

도 1은 본 발명의 방법에 따라 잣나무, 소나무 잎과 껍질 및 쑥으로부터 추출한 멜라닌 생합성 저해 추출물과 기존 하이드로퀴논과 아부틴의 티로시나제 저해활성을 농도에 따라 비교한 도면이다.

● : 소나무잎 추출물; ◇ : 잣나무잎 추출물;

○ : 쑥 추출물; △ : 하이드로퀴논;

▲ : 소나무 껍질 추출물; □ : 아부틴;

도 2는 본 발명의 실시예에 따라 탈지된 추출물들의 유리형 페놀산, 가용성 에스테르형 페놀산 및 불용성 페놀산의 추출 공정도이다.

도 3는 본 발명의 방법에 따라 추출된 피부 미백성분들 중 프로토카테쿠산의 미백효과를 스트렙토마이세스 비키니엔시스 (Streptomyces bikiniensis) 균주를 사용하여 조사한 사진이다.

도 4는 자외선 조사후 본 발명의 방법에 따라 제조된 미백제를 도포한 부위(A)와 도포하지 않은 부위(B)를 사진을 찍어 비교한 것이다.

도 5a는 본 발명 추출물의 기미 치료제의 사용전 사진을 나타낸 것이다.

도 5b는 본 발명의 추출물의 기미 치료제 사용 후(7주 경과) 효과를 나타낸사진이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 소나무, 잣나무의 잎과 껍질 또는 쑥으로부터 당류 및 단백질 성분을 효소를 이용하여 제거한 후, 탈지 전처리 공정을 거치고 수득된 대상물을 물 또는 에탄올, 메탄올, 아세톤, 에틸아세테이트 또는 이들의 혼합용매에서 선택된 1종 이상 유기용매로 열수 조건 또는 가열 조건하에서 추출하여, 유리형 페놀산 획분, 가용성 에스테르형 페놀산 획분 및 불용성 페놀산 획분을 수득함을 특징으로 하는 티로시나제 저해 및 멜라닌 색소 형성억제 활성 추출물을 제공하는 것이다.

이때 유기용매 사용시 유기용매의 농도는 60∼99범위로 하고 열수 조건 또는 가열 조건에서 페놀산류와 루코안토시안들의 유효성분들의 추출 함량을 높이는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 식물류 추출물을 유효성분으로 하는 멜라닌 생성 억제, 피부 노화 방지, 피부 보호 및 미백 기능을 가지는 화장료를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 식물류로부터 유래하는 페놀산들의 단독과 혼합물을 유효성분으로 하는 멜라닌 생성 억제, 피부 노화 방지, 피부 보호 및 미백 기능을 가지는 화장료를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 식물류의 추출물과 페놀산들과 루코안토시안의 혼합물을 유효성분으로 하는 멜라닌 생성 억제제용 약학적 조성물을 제공한다. 이는 기미, 주근깨, 반점 또는 임신기 과색소 침착의 치료에 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 식물류의 추출물과 페놀산들과 루코안토시안의 혼합물을 유효 성분으로 하여 과일, 야채 및 생선 등의 식품의 갈변을 억제하는 식품 첨가물을 제공한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명은 티로시나제 저해활성을 가지는 잣나무, 소나무의 잎과 껍질 또는 쑥으로부터 페놀산류와 루코안토시안을 다량 함유하는 추출물을 제조하기 위하여, 석유에테르로 지방을 제거하고, 효소를 이용하여 당류와 단백질을 제거한 추출물을 물과 유기용매 등을 사용하여 다양한 온도에서 추출한다.

바람직하게는 추출 용매와 온도에 따른 건조 수율과 유효성분 함량을 고려할 때 열수 추출 조건에서 60∼99아세톤을 사용하거나, 가열 조건에서 60∼99에탄올 또는 60∼99메탄올을 사용하여 추출물을 제조하고 건조시켜 건조 분말을 얻는다. 더욱 바람직하게는 열수 추출 조건에서 70∼80아세톤을 사용하거나, 가열 조건에서 70∼80에탄올 또는 70∼80메탄올을 사용하여 추출물을 제조한다.

상기 잣나무, 소나무의 잎과 껍질 또는 쑥으로부터 페놀산이 다량 함유된 추출물들의 티로시나제 저해 활성을 버섯 티로시나제 등을 L-디하이드록시페닐알라닌 (L-DOPA) 등과 반응시켜 측정한 흡광도로부터 조사한 결과, 상기 추출물들 중 소나무와 잣나무잎의 추출물들은 기존의 하이드로퀴논, 아부틴(arbutin), 4-하이드록시아니솔, 아스코빅산, 레티놀(retinol), 하이드로코티손(hydrocortison)보다 티로시나제 저해 활성이 우수한 것으로 나타났다 (도 1, 표 2 참조).

솔잎의 70에탄올 추출물을 조(crude) 상태로 HPLC로 분석하였다. 1아세트산-메탄올 (v/v) 용매계를 이용한 μBondapak C₁₈컬럼(0.3×30 cm, Waters)과 Delta-PAK C₁₈컬럼(1.9×30.0 cm)의 HPLC를 실시하여 용출(Model 510 solvent delivery system, Waters)분획 하였으며, 검출은 UV 검출기(254 nm, Model 486 absorbance detecter, Waters)를 이용하였다. 그 결과치를 각각의 표준 물질의 체류 시간(retention time)으로 비교한 결과, 시키미산과 프로토카테쿠산, 클로로제니산과 바닐리산 등이 많이 포함되어 있음을 알 수 있었다.

특히 잣나무, 소나무의 잎과 껍질 또는 쑥으로부터 상기 공정에 의한 추출물의 벤조산과 신나미산을 분석하기 위하여 국등(Korean J. Food Sci. Technol., 29(4), 823(1997), Korean J. Food Sci. Technol., 29(2), 204(1997)))의 방법에 기초하여 추출물을 용매 분별법(solvent fractionation), n-헥산/에틸 아세테이트(n-hexane/ ethyl acetate) 혼합용매계에 의한 분획, 실리카 겔 흡수 컬럼 크로마토그래피, Sephadex LH 20 컬럼 크로마토그래피, 재결정화 등으로 순차 정제하였다. 페놀산류의 분리는 재결정과정에서 침상결정을 제외한 여액을 1아세트산-메탄올(6:4 v/v) 용매계를 이용한 μBondapak C₁₈컬럼(0.3×30 cm, Waters)과 Delta-PAK C₁₈컬럼(1.9×30.0 cm)의 HPLC를 실시하여 용출(Model 510 solvent delivery system, Waters)분획하였으며, 검출은 UV 검출기(254 nm, Model 486 absorbance detecter, Waters)를 이용하였다. 정제된 활성물질의 구조확인을 MS,¹H-NMR,¹³C-NMR 등의 기기분석을 통해 실시하였다. MS분석은 Hewlett Packard 5890A(USA)의 GC와 VG. Co.(England)의 Trio-1 매스 스펙트로메트리(Mass spectrometry)가 연결된 기기를 이용하여 이온화(70 eV), ion source 온도 200℃의 조건으로 분석하였다.¹H-NMR과¹³C-NMR분석은 FT-NMR 스펙트로스코피 [spectroscopy(Unity Plus-300, 300 MHz, Varian, USA)]를 사용하여 분석하였고 용매는 CDCl₃를 사용하였으며, 내부표준물질로 테트라메틸실란[Tetramethylsilance (TMS)]을 사용하였다. 티로시나제 저해활성이 있는 분리 정제된 그 이외의 페놀산류를 EI-MS와 NMR에 의한 분석과 김등(J. Food Hygiene 7(2,3) 107-1129 (1992))한 추출방법에 근거하여 추출물들을 유리형 페놀산과 에스테르형 페놀산과 불용성 페놀산으로 분리 정제하여 N.O. 비스-트리메틸시릴 아세타미드:아세토니트릴 (bis-trimethylsilyl acetamide : acetonitril(1:4 v/v))용액 0.9ml를 가하여 TMS화시킨 후 가스 크로마토그래피(Hewlett Packard 5890)로 FID 검출기를 사용한 분석결과와 GC/MS를 병행하여 분석하였다.

그 결과 시키미산, 프로토카테쿠산, 아세토페논, p-비닐페놀, 벤조산, 클로로제니산, 신나미산, p-쿠마르산, 바닐리산이 함유되어 있었고, 잣나무와 소나무잎에는 가장 많은 성분으로 시키미산, 프로토카테쿠산, 클로로제니산, 루코안토시안, 아세토페논, p-비닐페놀, 벤조산, 신나미산, p-쿠마르산 등의 미백활성물질이 함유되어 있는 것으로 나타나, 솔잎의 70에탄올 추출물의 조(crude) 상태의 HPLC결과와 같았다.

추출시료 중 잣나무, 소나무의 잎과 껍질 또는 쑥으로부터 페놀산류 함량이 높은 가열 조건에서 70∼80에탄올 또는 메탄올을 사용하고 얻은 추출물들이 바람직한 상기 저해 활성을 나타낸다.

또한, 상기 추출물의 페놀산 각각과 혼합물의 멜라닌 생합성 저해 활성도 멜라닌을 생합성하는 미생물인 스트렙토마이세스 비키니엔시스 균주 등을 이용하여 조사한다(도 3 참조). 이 때 멜라닌 생성 저해환(Inhibition zone, mm)의 크기를 측정한 결과, 상기 잣나무와 소나무잎과 껍질 또는 쑥으로부터의 시키미산, 프로토카테쿠산, 루코안토시안, 아세토페논, p-비닐페놀 각각과 벤조산, 클로로제니산, 신나미산, p-쿠마르산, 바닐리산과 혼합물들은 코지산(kojic acid), 아부틴보다 비교적 크고 깨끗한 저해환을 생성시켰다.

따라서, 상기 식물류의 추출물과 그 추출물의 성분들인 페놀산과 루코안토시안과의 단독 또는 혼합물은 티로시나제 활성을 저해 및 상승적으로 저해하는 멜라닌 생성 억제제로서 기미, 주근깨, 반점 또는 임신기 과색소 침착 등의 예방 및 치료에 사용될 수 있다(도 4와 도 5참조). 또한, 상기 식물류의 추출물과 그 추출물의 성분들인 페놀산과 루코안토시안과의 단독 또는 혼합물은 멜라닌 생성 억제, 피부 노화 방지, 피부 보호 또는 미백 기능을 가지는 화장료로도 사용되어 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 맛사지크림, 에센스, 팩 등에 첨가될 수 있다. 또한, 상기 식물류의 추출물과 그 추출물의 성분들인 페놀산과 루코안토시안과의 단독 또는 혼합물은 과일, 야채 및 생선 등의 식품의 갈변을 억제하여 신선도를 높이는 식품 첨가제로 사용될 수 있다.

상기 잣나무, 소나무의 잎과 껍질 또는 쑥으로부터의 추출물과 그들의 성분인 페놀산류와 루코안토시안은 이미 독성이 없음이 확인된 식용의 천연물이고, 상기 과정을 통하여 제조된 추출물이 치료용 약제로 이용되기 위해서 약제학적 분야에서 공지의 방법에 의하여 제조될 수 있으며, 그 자체 또는 약학적으로 허용되는 담체(carrier), 부형제(forming agent), 희석제(diluent) 등과 혼합하여 연고제, 분말, 과립, 정제, 캡슐제 또는 주사제 등의 제형으로 제조되어 사용될 수 있다. 또한, 이들은 비경구 또는 경구로 투여되거나 피부에 도포하여 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 유효 성분의 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성화율, 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증정도 등에 따라 적절히 선택되나, 일반적으로 성인에게 1일에 30 - 300 mg 정도를 사용하나 50 - 200 mg 정도를 사용하는 것이 바람직하다. 이렇게 제형화된 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감시하거나 관찰하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나, 일정시간 간격으로 수회 투여하거나 피부에 도포할 수 있다.

이하 실시예, 제조예 및 실험예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예, 제조예 및 실험예들은 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 범위가 이들 내용에 의하여 한정되는 것은 아니다.

(실시예 1) 페놀산과 루코안토시안을 다량함유하고 있는 잣나무, 소나무의 잎과 껍

질 또는 쑥추출물과 페놀산들의 분리정제

잣나무, 소나무의 잎과 껍질, 쑥을 수세하고 분쇄기로 분쇄하여 물을 첨가하고 구연산으로 pH를 4∼7의 범위로 조정하여 25∼60℃의 온도범위에서 Novo사의 셀룰라제(cellulase)인 셀루클라스트(celluclast)와 단백질분해효소인 프로타맥스 (protamax)를 0.01∼1.5의 농도범위로 순차적으로 30분씩 반응시켜 당류와 단백질을 제거하여 건조시키고 석유에테르나 헥산으로 지방을 제거한 다음 건조시켜 얻은 분말 100g에 각각 추출용매로 물과 온도를 달리한 에탄올, 메탄올 또는 아세톤을 0.5∼3L 첨가하여 12시간 이하로 각 추출 온도에 따라 진탕 배양기(shaking incubator, 30℃) 또는 온도 조절 수조가 부착된 환류추출기 (95℃)로 추출한 다음 회전증발기(rotary evaporator)를 사용하여 50℃에서 상기 추출물을 감압 농축시키고 다시 진공 건조시켜 분말 상태의 추출물을 얻었다.

특히, 솔잎의 70에탄올 추출물을 조(crude) 상태로 HPLC로 분석하였다. 1아세트산-메탄올 (v/v) 용매계를 이용한 μBondapak C₁₈컬럼(0.3×30 cm, Waters)와 Delta-PAK C₁₈컬럼(1.9×30.0 cm)의 HPLC를 실시하여 용출(Model 510 solvent delivery system, Waters)분획하였으며, 검출은 UV 검출기(254 nm, Model 486 absorbance detecter, Waters)를 이용하였다. 그 결과치를 각각의 표준 물질의 체류시간으로 비교한 결과, 시키미산과 프로토카테쿠산, 클로로제니산과 바닐리산 등이 많이 포함되어 있음을 알 수 있었다.

최종 추출물의 페놀산 중 벤조산과 신나미산을 분석하기 위하여 다음과 같은 정제 공정을 거쳤다.

① 용매 분별법 : 용매가 제거된 추출물을 에틸 아세테이트와 완충용액(0.2M Na₂HPO₄-0.2M NaH₂PO₄, pH7.5)으로 수상획분(buffer fraction)과 중성획분(에틸 아세테이트-soluble neutral fraction)으로 분배하였다. 수상획분을 0.1M HCl을 이용하여 pH 3.0으로 조절한 뒤 다시 에틸 아세테이트로 분배하여 티로시나제 저해활성을 검증하였다.

② n-헥산/에틸 아세테이트 혼합용매계에 의한 분획 : n-헥산/에틸 아세테이트 용매계에 대한 용해성의 차를 이용하여 분획 하고자 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 농도를 0에서 100까지 2.5씩(농도별로 150 mL씩) 단계적으로 증가시키면서 가용획분을 얻어 분획하고 활성을 검정하였다.

③ 실리카 겔 흡수 컬럼 크로마토그래피 : 시료의 약 10배량에 상당하는 실리카 겔(180 g, 70∼230 mesh, column chromatography용, Merck사)을 에틸 아세테이트로 슬러리를 만들어 컬럼(3.2×48 ㎝)에 충진시킨 후, 메탄올-에틸 아세테이트 용매계로 메탄올농도를 0, 2, 4, 6, 100로 단계적으로 증가시킨 단계적(step-wise) 용출방법으로 용출분획하여 활성을 검정하였다. 또한, 시료의 약 10배량에 상당하는 실리카 겔(100 g, 70∼230 mesh, column chromatography용, Merck사)을 클로로포름으로 슬러리를 만들어 컬럼(2.7×41 ㎝)에 충진시킨후, 메탄올-클로로포름용매계로 메탄올 농도를 0, 10, 20, 30, 40, 50, 100로 단계적으로 증가시킨 단계적 용출방법으로 용출분획하여 활성을 검정하였다.

④ Sephadex LH 20 컬럼 크로마토그래피 : Sephadex LH 20(70∼230 mesh, Pharmacia사)을 메탄올-클로로포름(4:1 v/v) 용매계로 하룻밤 팽윤시킨후, 컬럼 (3.3×100 ㎝, bed volume 1000 mL)에 충진하고 동 용매계를 사용하여 용출분획하여 활성을 검정하였다.

⑤ 재결정화 : 소량의 n-헥산을 넣어 수욕(water bath)상에서 서서히 가온(45℃)하면서 완전히 용해시킨 후 냉각시켜 재결정화하였다.

페놀산의 분리는 재결정과정에서 침상결정을 제외한 여액을 1아세트산-메탄올(v/v) 용매계를 이용한 μBondapak C₁₈컬럼(0.3×30 cm, Waters)과 Delta-PAK C₁₈컬럼(1.9×30.0 cm)의 HPLC를 실시하여 용출(Model 510 solvent delivery system, Waters)분획하였으며, 검출은 UV 검출기(254 nm, Model 486 absorbance detecter, Waters)를 이용하였다. 정제된 활성물질의 구조확인을 MS,¹H-NMR,¹³C-NMR 등의 기기분석을 통해 실시하였다. MS분석은 Hewlett Packard 5890A(USA)의 GC와 VG. Co.(England)의 Trio-1 매스 스펙트로메트리가 연결된 기기를 이용하여 이온화(70 eV), ion source 온도 200℃의 조건으로 El-MS분석하였다.¹H-NMR과¹³C-NMR분석은 FT-NMR 스펙트로스코피(Unity Plus-300, 300 MHz, Varian, USA)를 사용하여 분석하였고 용매는 CDCl₃를 사용하였으며, 내부표준물질로 테트라메틸실란(TMS)을 사용하였다.

그 이외의 페놀산들의 분석은 미백활성이 있는 분리 정제된 페놀산(phenolic acid)들을 EI-MS와 NMR에 의한 분석과 김등(J. Food Hygiene 7(2,3) 107-1129 (1992))에 의하여 추출물들을 유리형 페놀산과 가용성 에스테르형 페놀산과 불용성 페놀산으로 분리 정제하였다(도 2 참조).

즉 50g의 시료들을 에탄올 200 ㎖로 5회 추출하여 6000 rpm에서 원심분리해서 상등액과 잔사로 분리하였다. 이 상등액을 200 ㎖로 농축하였다. 이 농축액을 유리형 페놀산과 에스테르형 페놀산의 분석에 사용하였으며 잔사는 불용성 페놀산의 추출에 사용하였다. 농축액을 6 N-HCl로 pH 2로 조절한 다음 6000 rpm에서 20분간 원심분리하여 부유물을 제거하였다. 잔존의 지방산을 제거하기 위하여 n-헥산으로 3회 추출하여 지질을 제거하였다. 수층은 디에틸 에테르/에틸 아세테이트[diethyl ether/ethyl acetate(1:1 v/v)]로 같은 분량을 첨가하여 6회 추출하였으며 추출된 디에틸 에테르(DE)/에틸 아세테이트(EA)는 무수 소디움 설페이트(Sodium sulfite)로 잔여수분을 제거하였다. 유리형 페놀산을 함유한 DE/EA 추출물을 40℃에서 증발시켜 잔사를 에탄올 25 ㎖로 녹였다.

에스테르형 페놀산 추출을 위하여 수층을 200 ㎖ 4N-NaOH로 가수분해하기 위해 질소 충진하에서 4시간 실온에 방치한 후 pH 2로 조절하여 6000 rpm에서 원심분리하였다. 가수분해된 페놀산은 DE/EA로 상기와 같은 방법으로 추출 후 농축하여 잔사를 에탄올 25 ㎖로 녹였다.

불용성 페놀산의 추출을 위하여 에탄올로 추출한 잔사를 200 ㎖ 4N-NaOH로 가수분해를 위해 질소 충진하에서 4시간 실온에서 방치한 후 pH 2로 산성화시켜 원심분리한 상등액을 잔여지질을 제거하기 위해 n-헥산으로 3회 추출하였다. 수층을 DE/EA로 상기와 같은 방법으로 농축하여 잔사를 에탄올 25 ㎖로 녹였다. 시료들의 페놀산 확인을 위하여 Katagi 등(J. Chromatographys, 79, 1973)의 방법에 따라 추출물에 N.O 비스-트리메틸실리아세타미드 : 아세토니트릴(1:4 v/v)용액 0.9 ㎖을 가하여 60℃에서 5분간 TMS화시킨 후 그중 2 ㎖를 취하여 GC로 분석하였다. 사용되는 GC는 Hewlett Packard 5890이며 검출기로서 FID를 사용했고, 컬럼은 Chromosorb W10SE30(1.5 m×4 mm, glass)을 사용하였고 오븐온도는 130℃에서 1분간 유지 후 170℃ 까지 13℃/분 속도로 승온 후 다시 170℃에서 3분간 유지 후 200℃에서 3분간 유지 후 10℃/분 속도로 230℃ 까지 승온하였다. 주입구의 온도는 260℃였고 검출기의 온도는 270℃로 하였다. 캐리어 가스(Carrier gas)는 질소 가스를 30 ㎖/분로 하였으며 차트 속도는 5 mm/분으로 하였다. 가스 크로마토그래피(Hewlett Packard 5890)로 FID 검출기를 사용한 분석결과와 MS를 병행하여 분석하였다.

분석 결과 시키미산, 프로토카테쿠산, 클로로제니산, 루코안토시안, 아세토페논, p-비닐페놀, 벤조산, 신나미산, p-쿠마르산과 함유되어 있었다. 특히 잣나무와 소나무잎에는 가장 많은 성분으로 시키미산, 프로토카테쿠산, 클로로제니산, 루코안토시안, 아세토페논, p-비닐페놀, 벤조산, 신나미산, p-쿠마르산의 미백활성물질이 함유되어 있었으며 잣나무와 소나무의 껍질에는 프로토카테쿠산, 시키미산, 바닐리산이 함유되어 있었고 쑥에는 루코안토시안과 클로로제니산이 함유되어 있었다.

또한 잣나무와 소나무의 잎에는 아세토페논, p-비닐페놀, 벤조산, 클로로제니산, 신나미산, p-쿠마르산의 가장 많은 종류의 미백활성물질과 폴린-데니스(Follin-Dennis)법에 의한 전체 폴리페놀 함량과 중림[과실 및 체류의 탄닌 성분, 일본 식품공업학회지, 15, 73(1968)]의 분석방법에 의한 루코안토시안의 함량은 표 1과 같다.

추출 용매 및 온도에 따른 추출물들의 총 폴리페놀과 루코안토시안의 함량

추출물	추출 온도 (℃)	총 폴리페놀함량()	루코안토시안
잣나무잎	80	29	7.5
소나무잎	80	30	8.0
잣나무껍질	80	10
소나무껍질	80	10
쑥	80	15	0.5
대두	80	18

(실시예 2) 본 발명에 따른 잣나무, 소나무의 잎과 껍질, 쑥추출물들과 그 성분들

의 티로시나제 저해 활성 조사

상기 실시예 1에서 제조한 분말 상태의 잣나무, 소나무의 잎과 껍질, 쑥추출물과 추출물들의 성분인 페놀산류와 루코안토시안의 티로시나제 저해 활성을 조사하기 위하여, 버섯 티로시나제 (mushroom tyrosinase, Sigma, E.C. 1.14.18.1)를 사용하여 저해 정도를 측정하였다. 이 때 티로시나제는 1/15 M 인산완충용액 (phosphate buffer, pH 6.8)에 1560 units/mL 농도로 녹여 냉동고에 동결보관하고, 사용시에 빙상에서 녹여 효소원으로 이용하였다. 또한 기질로는 L-3,4-디하이드록시페닐알라닌 (L-3,4-dihydroxyphenylalanine, L-DOPA)을 차광병에서 1/15M 인산 완충용액에 녹여 사용하였고, 이 용액은 사용직전에 조제하였다.

티로시나제 저해 활성은 티로시나제 (78 units/mL) 0.0625mL, 1/15M 인산 완충용액 1.4615mL를 함께 넣어 25℃에서 5분간 프리인큐베이션 (preincubation)시키고 이에 상기 L-DOPA를 0.476mL 넣어 475nm에서 10분 30초간 흡광도를 측정하였다. 즉, 티로시나제 효소와 포도씨의 용매 추출물 또는 분획물을 모두 넣은 시료군 (C), 시료 대신 동량의 1/15M 인산 완충용액을 넣은 대조군 (A), 효소 대신 1/15M 인산 완충용액을 넣은 효소 대조군 (D) 그리고 효소 및 시료 대신 1/15M 인산 완충용액을 넣은 공시험군 (B)으로 나누어 실험을 수행하였다.

각 군은 모두 3개씩 반복하여 실험하였고, 아래의 수식으로부터 효소 저해율 ()을 산출하였다. 이 때 대조군으로는 코지산, 하이드로퀴논, 아부틴, 4-하이드록시아니솔, 아스코빅산, 레티놀, 하이드로코티손 (hydrocortison)을 사용하였다.

그 결과, 잣나무와 소나무의 잎으로 부터의 추출물이 상기 대조군보다 높은 저해 활성을 나타내었다(도 1, 표 2참조). 또한 잣나무와 소나무의 잎과 껍질, 쑥추출물 성분들의 티로시나제 저해도를 표 3에 나타내었다.

티로시나제 저해도 () =

× 100

A : 시료가 없는 대조군의 475nm 에서 흡광도;

B : 시료와 효소가 없는 대조군의 475nm 에서 흡광도;

C : 시료와 효소를 넣은 실험군의 475nm 에서 흡광도;

D : 효소가 없는 대조군의 475nm 에서 흡광도;

본 발명에 의한 추출물들의 티로시나제 활성에 대한 저해도 ()

추출 용매	추출 온도 (℃)	첨가 농도 (mg/mL)	저해도 ()
쑥 열수추출물	95	1	5.37
솔잎 열수 추출물	95	1	8.28
쑥 40에탄올 추출물	30	1	18.29
솔잎 40에탄올 추출물	30	1	25.10
쑥 70, 80에탄올 추출물	30	1	23.57
솔잎 70, 80에탄올 추출물	30	1	29.20
쑥 40에탄올 추출물	80	1	24.80
솔잎 40에탄올 추출물	80	1	34.85
쑥 70, 80에탄올 추출물	80	1	35.73
솔잎 70, 80에탄올 추출물	80	1	51.99
솔잎 99에탄올 추출물	75	1	52.12
쑥 40아세톤 추출물	30	1	12.10
솔잎 40아세톤 추출물	30	1	19.75
쑥 70, 80아세톤 추출물	30	1	16.27
솔잎 70, 80아세톤 추출물	30	1	21.96
쑥 40메탄올 추출물	80	1	20.81
솔잎 40메탄올 추출물	80	1	30.62
쑥 70, 80메탄올 추출물	80	1	29.43
솔잎 70, 80메탄올 추출물	80	1	42.36

추출물과 성분들의 티로시나제 저해도

대조군	첨가 농도 (mg/mL)	저해도()
소나무잎 추출물	1	51.99
소나무 껍질 추출물	1	17.29
잣나무 잎 추출물	1	51.86
잣나무 껍질 추출물	1	12.94
쑥 추출물	1	35.73
아세토페논	1	11.06
p-비닐페놀	1	10.23
루코안토시안	1	31.87
벤조산	1	50.89
클로로제니산	1	22.65
신나미산	1	35.46
p-쿠마르산	1	30.26
시키미산	1	6.58
프로토카테쿠산	1	20.17
바닐리산	1	0.74
아세토페논 + p-비닐페놀 + 루코안토시안 + 벤조산	1	29.56
아세토페논 + p-비닐페놀 + 루코안토시안 + 클로로제니산	1	17.00
아세토페논 + p-비닐페놀 + 루코안토시안 + 신나미산	1	24.52
아세토페논 + p-비닐페놀 + 루코안토시안 + p-쿠마르산	1	24.84
아세토페논 + p-비닐페놀 + 루코안토시안 + 시키미산	1	15.92
아세토페논 + p-비닐페놀 + 루코안토시안 + 프로토카테쿠산	1	20.95
아세토페논 + p-비닐페놀 + 루코안토시안 + 바닐리산	1	15.95

(실시예 3) 본 발명에 따른 잣나무, 소나무의 잎과 껍질, 쑥추출물들과 그 성분들

의 멜라닌 생합성 저해 활성 조사

상기 실시예 1에서 제조한 추출물과 추출물들의 성분인 페놀산들과 루코안토시안의 멜라닌 생합성 저해 활성을 조사하기 위하여, 멜라닌 생합성 미생물인 스트렙토마이세스 비키니엔시스 B-1049 (Streptomyces bikiniensis NRRL B-1049)를 사용하였다. 구체적으로 상기 스트렙토마이세스 비키니엔시스 균주를 V-8 쥬스 (Cambell Soup Co., USA) 200mL, 포도당 2g, 효모 추출물 2g, CaCO₃1g, 박토 아가 2g과 증류수 800mL을 함유하는 pH 7.2의 파파비자스 VDYA (Papavizas' VDYA(15)) 사면 배지에 접종하고 이를 28℃에서 2주일간 배양한 다음 상기 사면 배양배지 표면에 2mL의 증류수를 가하여 기균사에 형성된 포자를 백금이로 긁어내고 포자 현탁액을 만든 다음, 이 포자 현탁액을 멸균된 시험관에 냉동 보관하였다.

또한, 포도당 1.5, L-타이로신 0.05, L-아스파라진 0.1, K₂HPO₄0.05, MgSO₄·7H₂O 0.05, NaCl 0.05, FeSO₄·7H₂O 0.001, 박토 아가 2를 함유하는 타이로신 아가(ISP No. 7) 배지 조성에 박토 효모 추출물(Bacto-yeast extract)을 0.2로 첨가하여 고체 배지를 만들고 멸균하여 패트리디쉬(90mm i.d.)당 40 mL로 분주하였다. 이렇게 제작한 아가 플레이트에 각 플레이트당 0.4mL의 상기 S. bikiniensis 포자 현탁액을 가하여 유리 하키 바(glass hockey bar)로 균일하게 도포하였다. 다음 배지 표면을 건조시키고 이에 50μL의 시료를 적신 8mm 직경의 종이 디스크(paper disc, Toyo Roshi Kasha Ltd., Japan)를 올려놓아 28℃ 조건에서 48시간 동안 배양함으로 멜라닌 생성 저해환(inhibition zone, mm)이 생성되도록 하였다. 이 멜라닌 생성 저해환의 크기는 배지의 배면에서 계측하였고, 이 때 대조군으로는 코지산, 하이드로퀴논, 아부틴을 사용하였다.

그 결과, 본 추출물들과 페놀산과 루코안토시안 단독 및 혼합조성물들의 저해환은 대조군인 코지산과 아부틴과 비교하였을 때 비교적 크고 깨끗하게 나타났다 (도 2, 표 4, 표 5 참조).

기등록 특허(특허 제 120277호)로 개시된 솔잎으로부터 분리, 정제하였다는 4-히드록시-5-메틸-3[2H]-퓨라논 물질은 솔잎에 함유되어 있는 물질이라기보다는 추출과정 중 열처리 공정에 의해 단백질과 당류, 보다 상세하게는 당류인 자일로즈(xylose)와 단백질의 아미노산인 글리신(glycine)과의 열반응에 의해 형성된 물질로 본 추출공정 중 초기 전처리공정인 당과 단백질의 제거에 의해서 추출한 본 발명물의 4-히드록시-5-메틸-3[2H]-퓨라논의 함유여부를 분석한 결과 함유되어 있지 않았다. 또한 4-히드록시-5-메틸-3[2H]-퓨라논을 기 특허에서 표준품으로 사용하였던 자일로스와 글리신의 갈변반응에 의해 4-히드록시-5-메틸-3[2H]-퓨라논을 직접 제조하여 티로시나제 저해와 미생물 멜라닌 색소 형성 저해도를 측정한 결과 본 발명의 측정농도범위에서 저해도가 전혀 나타나지 않아 피부 미백효과가 전혀 없음을 알 수 있었다.

추출물 성분과의 S.bikiniensis NRRL B-1049의 멜라닌 생합성에 대한 저해도

대조군	첨가 농도 ()	저해환(mm)
소나무잎 추출물	2	35
소나무 껍질 추출물	2	25
잣나무 잎 추출물	2	34
잣나무 껍질 추출물	2	26
쑥 추출물	2	14
아세토페논	2	10
p-비닐페놀	2	25
루코안토시안	2	36
벤조산	2	40
클로로제니산	2	28
신나미산	2	35
p-쿠마르산	2	34
시키미산	2	29
프로토카테쿠산	2	28
바닐리산	2	31
아세토페논 + p-비닐페놀 + 루코안토시안 + 벤조산	2	32
아세토페논 + p-비닐페놀 + 루코안토시안 + 클로로제니산	2	26
아세토페논 + p-비닐페놀 + 루코안토시안 + 신나미산	2	29
아세토페논 + p-비닐페놀 + 루코안토시안 + p-쿠마르산	2	28
아세토페논 + p-비닐페놀 + 루코안토시안 + 시키미산	2	30
아세토페논 + p-비닐페놀 + 루코안토시안 + 프로토카테쿠산	2	25
아세토페논 + p-비닐페놀 + 루코안토시안 + 바닐리산	2	27

대조군의 스트렙토마이세스 비키니엔시스의 멜라닌 생합성에 대한 저해도

대 조 군	첨가 농도 ()	저해환 (mm)
코지산	2	30
하이드로퀴논	2	72
아부틴	2	14

(제조실시예 1)

소나무와 잣나무의 잎과 껍질 및 쑥 추출물과 부분 정제물을 함유한 화장료 중 유연 화장수 처방예는 다음과 같다. 여기서 추출물들(p 추출물로 통칭)과 부분 정제물들(p 부분정제물로 통칭)은 실시예 1 의 유기용매 추출물과 HPLC와 GC/MS 분석을 위해 보다 정제한 부분정제물을 사용하였다.

중량부

p 추출물(또는 p 부분 정제물) 0.01

글리세린 3.0

부틸렌글리콜 2.0

프로필렌글리콜 2.0

카르복시비닐폴리머 0.1

에탄올 10.0

트리에탄올아민 0.1

방부제 미량

색소 미량

향료 미량

정제수 잔액

계 100.0

(제조실시예 2)

소나무와 잣나무의 잎과 껍질 및 쑥 추출물과 부분 정제물을 함유한 화장료 중 영양 화장수 처방예는 다음과 같다. 여기서 추출물들(p 추출물로 통칭)과 부분정제물들(p 부분정제물로 통칭)은 실시예 1 의 유기용매 추출물과 HPLC와 GC/MS 분석을 위해 보다 정제한 부분정제물을 사용하였다.

중량부

p 추출물(또는 p 부분 정제물) 0.01

밀납 4.0

폴리솔베이트 60 1.5

솔비탄세스퀴올레이트 0.5

유동파라핀 5.0

스쿠알란 5.0

카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 5.0

글리세린 3.0

부틸렌글리콜 3.0

프로필렌글리콜 3.0

카르복시비닐폴리머 0.1

트리에탄올아민 0.2

방부제 미량

색소 미량

향료 미량

정제수 잔액

계 100.0

(제조실시예 3)

소나무와 잣나무의 잎과 껍질 및 쑥 추출물과 부분 정제물을 함유한 화장료 중 영양크림 처방예는 다음과 같다. 여기서 추출물들(p 추출물로 통칭)과 부분정제물들(p 부분정제물로 통칭)은 실시예 1 의 유기용매 추출물과 HPLC와 GC/MS 분석을 위해 보다 정제한 부분정제물을 사용하였다.

중량부

p 추출물(또는 p 부분 정제물) 0.005

밀납 10.0

폴리솔베이트 60 1.5

솔비탄세스퀴올레이트 0.5

유동파라핀 10.0

스쿠알란 5.0

카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 5.0

글리세린 5.0

부틸렌글리콜 3.0

프로필렌글리콜 3.0

트리에탄올아민 0.2

방부제 미량

색소 미량

향료 미량

정제수 잔액

계 100.0

(제조실시예 4)

소나무와 잣나무의 잎과 껍질 및 쑥 추출물과 부분 정제물을 함유한 화장료 중 맛사지크림 처방예는 다음과 같다. 여기서 추출물들(p 추출물로 통칭)과 부분정제물들(p 부분정제물로 통칭)은 실시예 1 의 유기용매 추출물과 HPLC와 GC/MS 분석을 위해 보다 정제한 부분정제물을 사용하였다.

중량부

p 추출물(또는 p 부분 정제물) 0.005

밀납 10.0

폴리솔베이트 60 0.8

솔비탄세스퀴올레이트 0.5

유동파라핀 40.0

스쿠알란 5.0

카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 4.0

글리세린 5.0

부틸렌글리콜 3.0

프로필렌글리콜 3.0

트리에탄올아민 0.2

방부제 미량

색소 미량

향료 미량

정제수 잔액

계 100.0

(제조실시예 5)

소나무와 잣나무의 잎과 껍질 및 쑥 추출물과 부분 정제물을 함유한 화장료 중 팩의 처방예는 다음과 같다. 여기서 추출물들(p 추출물로 통칭)과 부분정제물들(p 부분정제물로 통칭)은 실시예 1 의 유기용매 추출물과 HPLC와 GC/MS 분석을 위해 보다 정제한 부분정제물을 사용하였다.

중량부

p 추출물(또는 p 부분 정제물) 0.005

폴리비닐알콜 13.0

소듐카르복시메틸셀룰로스 0.2

알란토인 0.1

노닐페닐에테르 0.3

방부제 미량

색소 미량

향료 미량

정제수 잔액

계 100.0

(실험예 1) 피부의 색소 침착 억제

건강한 남녀 20명의 실험 대상자의 양 팔 하박부에 2×2cm²의 부위를 설정하였다. 실험 대상 부위에만 자외선이 조사되도록 알루미늄 호일을 팔에 씌우고 10 cm 거리에서 일본 도시바 (주) 제 FL20S BLB 램프 및 FL20S E-30 램프를 각 2개 동시에 0.8×10⁷erg/cm³/회로 1일 1회씩 연속 3회 조사하였다. 조사전에 실험 대상 부위를 70이소프로필알콜 수용액으로 잘 세척하였다. 조사후 자외선 조사 부위에 포도씨 추출물을 함유한 제조예 1 ∼ 5의 처방을 1일 3회씩 도포하였다. 3주 도포한 후에 육안으로 색소 침착도를 판정하고, 실험군이 대조군 (기제만 도포)에 비하여 색소 침착을 얼마나 억제하였는가를 현저한 효과, 유효, 무효의 3단계로 평가하였다. 표 6에서 나타난 바와 같이 유효 이상의 양성 효과가 높게 나타남으로써 탁월하게 색소 침착이 억제되는 효과를 보여주었다(도 4 참조).

실험군	현저한 효과 (명)	유효 (명)	무효 (명)
제조예 1	2	11	7
제조예 2	2	12	6
제조예 3	3	13	4
제조예 4	2	13	5
제조예 5	1	13	6

본 발명의 효과는 소나무, 잣나무의 잎과 껍질 또는 쑥으로부터의 추출물과 이들 추출물의 성분들인 페놀산과 폴리페놀인 루코안토시안과의 혼합물은 천연물로서 부작용이 전혀 없고, 티로시나제 활성을 저해하여 탁월하게 멜라닌 생성을 억제하므로 피부 노화 방지, 피부 보호 및 미백 기능을 가지는 화장료, 기미, 주근깨, 반점 또는 임신기 과색소 침착 등의 과잉 색소증 치료제 및 식품의 갈변을 억제하는 식품 첨가제 등을 제공할 수 있는 것이다.

Claims

소나무, 잣나무의 잎과 껍질 또는 쑥으로부터 당류 및 단백질 성분을 효소를 이용하여 제거한 후, 탈지 전처리 공정을 거치고 수득된 대상물을 물 또는 에탄올, 메탄올, 아세톤, 에틸아세테이트 또는 이들의 혼합용매에서 선택된 1종 이상 유기용매로 열수 조건 또는 가열 조건하에서 추출하여, 유리형 페놀산 획분, 가용성 에스테르형 페놀산 획분 및 불용성 페놀산 획분을 수득함을 특징으로 하는 티로시나제 저해 및 멜라닌 색소 형성 억제 활성 추출물
제 1항에 있어서, 유기용매의 농도는 60∼99의 유기용매임을 특징으로 하는 추출물
유효성분으로 시키미산, 프로토카테쿠산을 포함하는 제 1항의 추출물을 주성분으로 함유하는 멜라닌 생성 억제, 피부 노화 방지, 피부 보호 및 미백 기능을 지니는 조성물
제 3항에 있어서, 아세토페논, 루코안토시안, p-비닐페놀에서 선택된 1종이상의 성분을 추가로 포함하는 제 1항의 추출물을 주성분으로 함유하는 멜라닌 생성 억제, 피부 노화 방지, 피부 보호 및 미백 기능을 지니는 조성물
제 3항 또는 제 4항에 있어서, 바닐리산, 벤조산, 신나미산, 클로로제니산, p-쿠마르산에서 선택된 1종 이상의 성분을 추가로 포함하는 제 1항의 추출물을 주성분으로 함유하는 멜라닌 생성 억제, 피부 노화 방지, 피부 보호 및 미백 기능을 지니는 조성물
제 1항의 추출물을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 생성 억제제용 약학적 조성물
제 1항의 추출물을 유효성분으로 함유하는 과일, 야채 및 생선을 포함하는 식품의 갈변을 억제하는 식품 첨가물