KR20100056422A - 효소에 의해 가수분해된 상백피 추출물을 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 효소에 의해 가수분해된 상백피 추출물을 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 β-글루코시다아제 또는 탄나아제 및 펙티나아제를 더 포함하는 효소복합제로 상백피 추출물을 처리하여 생물전환된 상백피 추출물을 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 미백효과를 가지는 상백피 추출물을 당류의 분해를 촉매하는 효소 복합제로 처리하여 생물전환 시켰을 때 미백효과가 현저히 증가함을 티로시나아제 활성 억제 실험과 멜라닌 색소 억제 실험을 통해 확인하였다.

상백피 추출물, β-글루코시다아제, 탄나아제, 펙티나아제, 생물전환, 미백효과, 티로시나아제, 멜라닌

Description

효소에 의해 가수분해된 상백피 추출물을 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물 {Cosmetic compositions for whitening skin comprising extracts from Mulberry root hydrolyzed by enzymes}

본 발명은 효소에 의해 가수분해된 상백피 추출물을 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 β-글루코시다아제 또는 탄나아제 및 펙티나아제를 더 포함하는 효소복합제로 상백피 추출물을 처리하여 생물전환된 상백피 추출물을 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.

최근 산업의 급격한 발달로 대기가 오염되고, 오존층이 심하게 파괴됨에 따라 지표면에 강한 자외선이 조사되어 현대인들의 피부가 심한 스트레스를 받아 쉽게 노화되며, 피부에 멜라민 색소가 침작되어 피부가 검게 변하거나 또는 모공이 미세한 먼지 등에 의해 막혀 기미, 주근깨, 여드름 등과 같은 피부 질환이 빈번하게 유발됨에 따라 이러한 피부 질환의 예방과 자외선으로부터 피부를 보호하기 위한 다양한 종류의 피부 미백용 화장품들이 개발되고 있고 있으며, 가능한 피부의 자극을 최대한 줄이기 위한 방법으로 각종 한방 생약 약제들을 소재로 한 피부 미백용 화장품의 개발이 붐을 이루고 있다.

일반적으로 피부, 머리카락, 눈동자 등 인간을 비롯한 생물체에 널리 분포되어 있는 색소 성분인 멜라닌은 인체 표피층의 멜라노사이트(Melanocyte)라는 색소세포 내의 멜라노좀(Melanosome)에서 합성되는데, 아미노산의 일종인 티로신을 시발 물질로 하여 티로시나아제 효소에 의해 DOPA(3,4-dihydroxy-phenylalanine) 또는 DOPA 퀴논(quinone)으로 산화된 후 비효소적 반응과 자동 산화 과정을 거쳐 단백질 또는 그 구성 아미노산과 중합 반응으로 멜라닌이 합성된다 [Lee et al., Kor. J. Pharmacogn. 34(1) 33-39, 2003]. 이때 생성된 멜라닌은 피부의 색을 검게 하므로 티로시나아제의 활성을 효과적으로 저해하는 실험이 미백효과를 찾아내려는 매우 유용한 연구방법으로 평가받고 있다.

현재까지 천연물로부터 분리된 티로시나아제 활성 억제물질은 월귤나무 유래의 알부틴 (Arbutin), 상백피 유래의 옥시레스베라톨 (Oxyresveratrol), 인삼 유래의 페눌산 (Ferulic acid), 대두 유래의 이소플라보노이드류(Isoflavonoids) 등이 있고, 이중 알부틴은 이미 기능성 미백 제품의 성분으로 상용화되고 있다. 또한, 미생물 유래의 티로시나아제 활성 억제제에 관한 연구는 당화 곰팡이 균주인 아스퍼질루스 속(Aspergillus oryzae) 유래의 코지산(kojic acid)[Cabanes J. et al. Kojic acid, a cosmetic skin whitening agent, is a slow binding inhibitor of catecholase activity of tyrosinase. J. Pharm. Pharmacol. 46, 982-985, 1994]이 있지만 생성량이 많지 않아 합성된 코지산이 미백화장품에 사용되어 오다 부작용이 있어 현재는 사용되지 않고 있으며, 페니실리움 속(Penicillium sp.) 20135 유래의 테레인(terrein)[Kim WO et al. Terrein, a melanin biosynthesis inhibitor, from Penicillium sp. 20135. J. Microbiol. Biotechnol. 15(4) 891-894, 2005]은 멜라닌 색소 조절의 신경전달 경로를 조절하는데, 특히 MITF(microphthalmia associated transcription factor)라는 티로시나아제 생성에 중요한 전사인자의 발현을 조절하여 미백효과를 나타낸다고 하였고, 효모 배양액 추출물인 멜라노스톤(melanoston)[이승선 외, 효모에서 분리한 멜라닌 생성 억제 물질의 작용 기전. 한국생물공학회지 19(2) 118-124, 2004], Streptococcus thermophilus YIT 2001 배양 생산물[Yakult 1993], 사카로미세스 속(Saccharomyces sp.) 활성 추출물[대한민국 등록특허 제616445호], 해양 미생물 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) KCTC 11119BP 균주의 배양액 및 배양액 추출물을 유효성분으로 하는 피부 미백용 조성물 특허가 등록되어 있다.

한편, 상백피는 뽕나무과의 뽕나무(Morusalba L.), 또는 동속식물의 뿌리껍질로 만든 약재로 혈압강하 작용, 이뇨 작용, 소염 작용, 항균 작용 및 진해, 진통, 해열 작용 등을 가지고 있으며, 특히 피부 보습과 미백에 뛰어난 효과를 가지고 있는 것으로 알려져 많은 천연물 성분의 화장품 제조에 있어 상백피를 주성분으로 하거나 복합성분의 일부로 사용하는 조성에 관한 특허가 이미 국내에 다수 출원되어 있을 정도로 화장품 제조업체들이 이를 이용한 기능성 미백 화장품의 개발에 주력하고 있다.

그러나 이들 기술들로부터 얻은 미백물질들은 대체로 미백효과가 크지 않거 나 생성량 또는 수율이 높지 않아 미백화장품의 생산에 사용하는데 어려움이 있으며, 이를 극복하기 위해 다수의 천연물을 이용하거나 이를 추출, 정제, 농축, 미생물 발효 등의 방법을 사용하는 시도가 있었으나 제조공정이 복잡하고 생산비용이 증가하게 되므로, 미백 화장품의 제품 단가가 높아지는 결과를 나타낸다. 또한, 미생물 발효의 경우에도 생물전환의 수율이 높지 않고 추가 정제공정을 필요로 하는 문제점이 있었다. 따라서 본 발명자들은 상기와 같은 천연물질의 미백효과를 증대시키고 제조수율 또한 높일 수 있는 방법을 연구하게 되었고, 다수의 천연물이 아닌 단일재료로서 상백피 추출물을 이용하여 미백효과가 증대된 천연물을 얻을 수 있는 방법을 연구하게 되었다.

이에, 본 발명자들은 종래 잘 알려져 있는 상백피 추출물의 미백효과를 더욱 증대시켜 미백 화장품의 품질을 향상시키고 소비자 만족도를 향상시킬 수 있는 방법을 연구노력한 결과, 당류의 분해를 촉매하는 효소 복합제를 처리하였을 때 생물전환된 추출물의 미백효과가 현저히 증가함을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 당류의 분해를 촉매하는 효소 복합제에 의해 가수분해되어 증대된 미백효과를 갖는 상백피 추출물을 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 증대된 미백효과를 갖는 상백피 추출물의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 β-글루코시다아제를 포함하는 효소에 의해 가수분해된 상백피 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 사용된 상백피 추출물은 뽕나무 뿌리껍질의 추출물로 피부진정, 멜라닌 생성 억제 및 보습, 미백에 효과가 있고 자극에 의해 스트레스를 받는 피부의 진정에도 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 전통 한방 약재와 미백 기능성 화장품의 재료로 널리 사용되고 있다. 상백피 추출물에 포함된 성분으로는 플라보노이드(Flavonoid)계 성분과 스틸벤(stilbene) 배당체인 mulberroside A가 있으며, 그 외에도 다수의 배당체를 함유하고 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 화장료 조성물에서, 상기 추출물은 상백피를 열수추출 등과 같은 통상적인 식물 추출방법으로 추출할 수 있으며, 바람직하게는 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매를 이용하여 추출하는 것이 적당하다.

구체적으로, 상백피 건조물을 세절하여 무게(㎏)의 약 2배 내지 20배, 바람직하게는 약 2배 내지 10배의 물, 메탄올 또는 에탄올 등의 저급(C1-C4) 알코올의 극성용매 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물 또는 물과 에탄올과의 혼합용매로 10℃ 내지 100℃, 더욱 바람직하게는 40℃ 내지 90℃ 추출온도에서 약 1시간 내지 10시간, 바람직하게는 약 2시간 내지 4시간 동안 열수 추출, 초음파 추출 등의 추출방법을 이용하여 수득한 추출액을 여과, 감압농축하여 상백피 추출물을 얻을 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에서, 상기 상백피 추출물은 열수추출된 후 β-글루코시다아제를 포함하는 효소에 의해 가수분해된 것을 특징으로 한다.

본 발명의 화장료 조성물에서, 상기 효소는 β-글루코시다아제(β-glucosidase)외에 탄나아제(tannase) 및 펙티나아제(pectinase)를 더 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명에서, 상기 효소 복합제는 상백피 추출물 내에서 미백효과를 가지는 다수의 배당체를 비당체(aglycone)로 전환시킨다. 특히 상기 효소 복합제에 포함된 β-글루코시다아제는 β-1,4 결합으로 연결된 두 분자의 포도당을 절단하는 기능을 가지고 있으며, 섬유소와 배당체의 당사슬을 절단하는 역할을 한다.

상기 효소 복합체에 함유된 탄나아제(tannase)는 가수분해 효소로 자연계에 빈번히 나타나는 카르복실 에스테르 결합을 절단하는 역할을 하며, β-글루코시다아제와 같은 기능을 수행하기도 한다. 또한 상기 효소 복합체에 함유된 펙티나아 제(pectinase)는 이형다당체(heteropolysaccharide) 펙틴을 분해하는 효소로 식물에 존재하는 다양한 당류의 분해에 이용된다.

이와 같이, 당분해 효소를 처리하여 미백효과를 가지는 상백피 추출물 내 다수의 배당체를 비당체(aglycone)로 전환하는 공정을 ‘생물전환’이라고도 하며, 이러한 생물전환된 상백피 추출물을 이하 실시예에서 본 발명의 ‘효소에 의해 가수분해된 상백피 추출물’을 일컫는 용어로서 사용하였다.

본 발명의 화장료 조성물에서, 상기 가수분해된 상백피 추출물은 옥시레스버라트롤(oxyresveratrol)을 함유하는 것을 특징으로 한다. 본 발명자들은 당분해 효소를 이용하여 생물전환된 상백피 추출물을 제조하였고, 이 후 추가적인 실험을 통해 생물전환에 의해 상백피 추출물에 포함된 유효성분이 미백효과가 뛰어난 옥시레버라트롤로 변환됨을 확인하였다 (실시예 6 참조).

본 발명의 화장료 조성물에서, 상기 조성물은 생물전환된 상백피 추출물을 0.01-90중량%로 함유시켜 제조할 수 있으나, 바람직하게는 0.01-20중량%로 함유하는 것이 적당하다.

또한 상기 조성물은, 상기 생물전환된 상백피 추출물을 유효성분으로 함유할 수 있으나, 이들 추출물을 다시 냉각 콘덴서가 달린 증류장치를 이용하여 증발되어 나오는 용매를 회수하면서 완전히 감압 농축하여 얻은 잔류분말(건조분말)을 유효성분으로 함유할 수도 있다.

본 발명의 화장료 조성물에서, 상기 조성물은 스킨, 스킨로션, 스킨소프트너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 영양로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양크림, 맛사지크림, 모이스쳐크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징 폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디클린져, 바디로션, 샴푸, 유액, 파운데이션, 프레스파우더, 루스파우더, 아이새도우로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 제형을 가질 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 증대된 미백효과를 갖는 상백피 추출물의 제조방법을 제공한다:

a) 상백피를 열수 추출하는 단계; 및

b) 상기 상백피 추출물을 β-글루코시데이즈를 포함하는 효소에 의해 가수분해시키는 단계.

본 발명의 제조방법에서, 상기 b)의 가수분해 반응단계에서 첨가되는 효소의 양은 첨가되는 상백피 추출물에 대하여 0.01-5 중량%가 바람직하다.

본 발명의 제조방법에서, 상기 효소에 의한 가수분해반응은 30-70℃에서 교반하면서 3-24시간 동안 항온반응으로 수행하는 것이 바람직하다.

본 발명의 제조방법에서, 상기 b) 단계후에 원심분리 또는 크로마토그래피 등의 방법으로 더 정제할 수도 있으나, 추가 공정 없이 상기 효소가 포함된 채로 미백용 화장료로 사용될 수도 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 상백피로부터 옥시레스버라트롤(oxyresveratrol)의 제조방법을 제공한다:

a) 상백피로부터 멀베로사이드 A(mulberroside A)를 분리 및 정제하는 단계; 및

b) 상기 멀베로사이드 A를 β-글루코시다아제를 포함하는 효소에 의해 가수분해시키는 단계.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 상백피로부터 옥시레스버라트롤(oxyresveratrol)의 제조방법을 제공한다:

a) 상백피 추출물을 β-글루코시다아제를 포함하는 효소에 의해 가수분해시키는 단계; 및

b) 상기 가수분해물로부터 옥시레스버라트롤을 분리 및 정제하는 단계.

본 발명의 옥시레스버라트롤의 제조방법에서, 상백피로부터 옥시레스버라트롤을 제조하기 위해 수행되는 효소에 의한 가수분해 단계는, 50-70 ℃에서 pH 4-5 범위에서 수행되는 것이 바람직하며, 실시예 6에서와 같이, 최적의 효소 반응 조건은 온도 60℃, pH 4.5로서, 이 때 효소 반응시 생성물의 양이 가장 높게 나타났다. 또한 첨가되는 효소의 양은 상백피 추출물에 대하여 0.01-5 중량%가 바람직하며, 반응시간은 3-24시간 동안 항온반응을 수행할 수 있다 (실시예 5-6 참조).

지금까지 알려진 상백피의 주요 미백성분은 Mulberroside A, Astragalin, Piceide 등이 있다. 이들 물질은 배당체로 β-글루코시다아제 효소에 의해 당이 가수분해 되면 oxyresveratrol, kaempferol, resveratrol로 전환될 것으로 예상하였다 (도 1). 효소 가수분해에 의해 생성된 아글리콘(또는 비당체) 물질들은 기존의 배당체 물질보다 미백효과가 높은 것으로 알려져 있다. 본 발명에서는 효소 가수분해를 통해 미백효능이 향상된 물질을 생산하고 제품화하는 것이 목적이다. 상백피 추출물에 다량 함유된 배당체인 멀베로사이드 A에서 당이 제거된 아글리콘 형태인 옥시레스버라트롤은 천연물인 멀베로사이드 A보다 반응성과 피부흡수가 좋을 것으로 예상된다. 천연물로부터 배당체를 제거하는 방법으로는 산, 알칼리에 의한 가수분해, β-글루코시다아제 등을 이용한 효소 가수분해 방법이 있다. 산, 알칼리 가수분해는 부산물이 많이 발생하여 수율이 낮고, 제조 공정 중 폐수로 인한 환경오염 문제도 뒤따른다. 반면, 효소 가수분해는 부산물 발생이 적어 수율이 높고, 안전하며, 제조 공정이 간편하다. 본 발명에서는 β-글루코시다아제의 활성이 함유된 식품용 첨가 효소인 Pectinex®을 이용하여 상백피로부터 추출한 액을 효소 가수분해하여 옥시레스버라트롤을 제조하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 상백피 추출물의 제조공정

상백피 300g에 증류수 1.5 L를 넣어 90℃에서 1차 추출을 한 후 다시 증류수 500 ml을 넣고 2차 추출을 하였다. 다시 증류수 500 ml을 최종 부피를 2.5 L로 하여 90℃에서 3차 추출하여 총 2시간 30분 동안 추출하였다. 추출 후 추출물을 냉각시키고, 여과한 후 여액을 동결하여 보관하였다.

실시예 2: β-글루코시다아제를 이용한 생물전환 공정

실시예 1에서 동결하여 보관한 상백피 추출물 2500 ml을 녹인 후, 아세테이트 버퍼(acetate buffer, pH 4.0) 500 ml과, 0.1mg/100ml 농도의 β-글루코시다아제(β-glucosidase, 60U/g, Fluka) 25ml을 넣어 55℃에서 100 rpm으로 4시간 동안 반응시켰다. 다음으로, 90℃로 5분간 가온하여 효소반응을 완료한 후, 반응물을 진공 농축하였다. 진공 농축된 농축물은 진공 감압건조기를 사용하여 60℃에서 30시간 건조하였다.

실시예 3: 효소 복합제를 이용한 생물전환 공정

실시예 1에서 동결하여 보관한 상백피 추출물 2500 ml을 녹인 후, 아세테이트 버퍼(pH 4.0) 500 ml과, β-글루코시다아제, 탄나아제 및 펙티나아제의 효소복합제인 Pectinex® (Novozymes, DENMARK) 25 ml을 넣어 55℃에서 100 rpm으로 4시간 동안 반응시켰다. 다음으로, 90℃로 5분간 가온하여 효소반응을 완료한 후, 반응물을 진공 농축하였다. 진공 농축된 농축물은 진공 감압건조기를 사용하여 60℃에서 30시간 건조하였다.

실험예 1: 티로시나아제(tyrosinase) 저해 활성 측정을 통한 미백효과 실험

생물전환된 추출물의 티로시나아제 저해활성은 Tomita의 방법을 변형하여 다음과 같이 측정하였다. 반응액은 0.1 M 인산완충용액(phosphate buffer, pH 6.5) 1.15 ml, 0.05 M 인산완충용액(phosphate buffer, pH 6.5) 50 μl, 머쉬룸 티로시나아제(mushroom tyrosinase, Sigma, 2,000 U/ml) 50 μl, 1.5 mM L-티로신(L-tyrosine, Sigma) 0.2 ml, 그리고 상백피 추출물, β-글루코시다아제 또는 효소복합제로 생물전환된 상백피 추출물을 각각 0.1 ml씩으로 하여 구성하였다.

다음으로, 1.5 ml 마이크로튜브에 상기 반응액을 첨가하여 25℃의 항온수조(heating bath, BS-11, Lab. Companion, Korea)에서 10분간 반응시켰다. 반응 후 얼음에서 효소반응을 정지시킨 후 UV-Vis spectrophotometer(CE 9020, Cecil Instrument, ENGLAND)를 이용하여 470 nm에서 흡광도를 측정하였다.

상백피 추출물의 대조군(control)으로서 증류수 0.1 ml를 사용하였다. 또한 티로시나아제 대신 0.1 M 인산완충용액(pH 6.5) 50 μl을 가하여 블랭크로 하였다. 이때의 효소 활성 저해율(%)은 도 3에 나타내었고, 효소의 활성을 50% 저해하는 농도(IC₅₀)를 아래와 같이 구하여 하기 표 1에 나타내었다.

Tyrosinase 활성 저해율(%) = (A-B)/A× 100

A; OD at 470 nm without sample.

B; OD at 470 nm with sample.

[표 1]. 티로시나아제 활성 저해 실험

상기 표 1과 도 3에서, 상백피 추출물을 효소로 가수분해하기 전과 후, 즉 생물전환 전과 후의 티로시나아제 저해율을 비교하였다. 그 결과, 티로시나아제 저해율 및 IC₅₀은 β-글루코시다아제 및 효소복합제에 의한 생물전환 후 각각 약 3.7 배 및 약 5배가 높게 나타났다. 따라서 상백피 추출물은 본 발명의 효소에 의한 생물전환 후 티로시나아제 활성 저해효과가 향상되는 것으로 판단할 수 있다.

실험예 2: 멜라닌(melanin) 생성 억제 측정을 통한 미백효과 실험

티로시나아제 저해활성과 마찬가지로 Tomita의 방법을 변형하여 다음과 같이 실험하였다. V-8 juice(Campbell Soup Company, USA) 200 ml, glucose 2 g, yeast extract 2 g(Difco), CaCO₃ 1 g, agar 20 g를 증류수 800 ml에 용해시켜 제조한 Papavizas'VDYA agar에 스트렙토마이세스 비키니엔시스(Streptomyces bikiniensis, KCTC 9172)를 계대하여 28℃에서 2주간 배양하였다. 회색의 포자가 형성되면 멸균수 10 ml에 적당한 농도로 포자를 현탁시키고, Bacto-yeast extract(Difco)를 0.2% 포함하는 ISP No.7 medium에 0.1 ml를 도말하여 배지에 흡수시킨다. 배지표면이 완 벽히 마르면 8 mm paper disc(ADVANTEC, Toyo Roshi kasha, LTd., JAPAN)를 배지중앙에 올리고, 생물전환전 상백피 추출물과 효소복합제로 생물전환된 상백피 추출물 20 μl를 각각 분주하여 disc를 적신 후 28℃에서 48시간 배양하였다. 이때 disc를 적시는 20 μl의 상백피 추출물의 농도가 2,000 - 4,000 μg/ml이 되도록 하였고, control은 DMSO로 하였다. 배양 후 나타나는 inhibition zone의 크기는 vernier calipers(Digimatic caliper 500-182, Mitutoyo Corporation, JAPAN)를 사용하여 측정하여 도 4 및 하기 표 2에 나타내었다.

[표 2]. 멜라닌 색소 억제 능력 확인

상기 표 2와 도 4에서, inhibition zone의 크기는 생물전환 후 상백피 추출물의 농도 2000 μg/ml일 때 17.91 mm가 증가하였고, 농도 4000 μg/ml일 때 18.42 mm가 증가하였다. 따라서 상백피 추출물은 본 발명의 효소에 의한 생물전환 후 멜라닌 색소 억제 능력이 증대되는 것으로 판단할 수 있다.

실시예 4: 멀베로사이드 A의 분리를 위한 상백피 추출물의 제조

이하, 실험에서는 효소로 Pectinex® (Novozymes, DENMARK)를 사용하였고 L- tyrosine, 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA), mushroom tyrosinase, resveratrol, kojic acid 및 arbutin은 Sigma (St. Louis, MO, USA) 제품을 사용하였다.

1) 상백피 추출물의 획득

상백피(안동, 건화약품) 3.6kg을 물 18kg에 넣고 80℃로 가온하여 4시간동안 1차 추출하였다. 냉각 후 추출액을 분리하여 1차 추출액 15Kg을 얻었다. 다시 남은 잔사에 물 15Kg을 사용하여 동일조건으로 2차 추출하여 추출액 15kg을 얻었다. 1, 2차 추출액에 규조토를 처리 한 후 여과(Filter press, SA 955) 하여 맑은 액의 상백피 추출물을 얻었다.

2) 상백피 추출물의 흡착수지에 의한 회수

상기의 방법으로 얻은 상백피 추출물을 합성흡착수지(SP 207, DIAION) 3L를 사용하여 유속 20 ml/min 으로 통과시켜 흡착시킨 후 물 8L를 사용하여 세척하였다. 흡착된 물질을 분리하기 위해 메탄올 6L를 통과시켜 얻은 액을 진공증류 및 건조하여 상백피 추출 파우더(Powder) 80g을 얻었다.

3) 멀베로사이드 A의 분리 정제

MPLC (Medium-pressure liquid chromatography; FLASH 40M, Biotage) 및 실리카 수지(Silica gel si 60, WATCHERS) 100g을 이용하여 상기 방법으로 얻은 파우 더 3g을 메탄올에 용해하여 여과하고 로딩하였다. 로딩한 후 이동상(Chloroform : Methanol = 2.5 : 1)을 사용하여 10 ml/min으로 분리하였다. TLC확인(Chloroform 2.5 : Methanol 1, UV 및 Anisaldehyde 황산액) 후 #26 ~ #35 분획을 수집하고 증류, 건조하여 0.18g의 멀베로사이드 A(mulberroside A)를 얻었다.

실시예 5: 생물전환에 의한 상백피 추출물의 유효성분의 변화

실시예 4-1에서 얻은, 상백피 추출물을 β-글루코시다아제를 다량 함유한 것으로 알려진 Pectinex® (Novozymes, DENMARK) 효소를 사용하여 가수분해한 후 유효 물질의 변화를 HPLC로 확인하였다. 사용된 효소량은 반응액량 대비 1%, 반응 온도 55℃, pH 4.5, 반응시간 4시간으로 반응하면서 상백피 추출물로부터 생성물의 변화를 확인한 결과, 도 5a와 5b에서와 같이, 멀베로사이드 A로 추정되는 2.1분대의 물질은 감소하고 옥시레스버라트롤(oxyresveratrol)로 추정되는 4.5분대의 물질이 새롭게 생성되었음을 확인할 수 있었다 (도 5a, 5b). 사용된 Novozymes사의 Pectinex®는 FDA로부터 안전성, 안정성을 인정받아 오렌지 주스 청징화 등 식품용으로 널리 사용 중인 효소이기 때문에 화장품 원료 제조에도 문제가 없다고 사료되었다. 따라서 본 발명에서는 Novozymes사의 Pectinex®를 이용하여 상백피 추출물의 효소 가수분해를 수행하였다.

실시예 6: 최적 생물전환 조건의 확립

Novozymes사의 Pectinex®를 이용하여 상백피 추출물의 유효성 분(mulberroside A 추정)에 대한 최적 가수분해를 위한 효소 반응 조건 실험을 행하였다. 최적의 효소 반응 조건 설정을 위해, 온도, pH 및 반응 시간에 따른 생성물(oxyresveratrol 추정물질)의 량을 비교 검토하였다. 온도에 따른 2.1분대 물질(mulberroside A 추정물질)의 감소율과 생성물의 량을 비교한 결과, 도 6에서와 같이, 65℃가 가장 높게 나타났으나 효소의 온도에 따른 불안정성 등을 고려하여 최적 반응 온도를 60℃로 결정하였다 (도 6). 또한 최적 pH 실험 결과, pH 4.5에서 반응 시 생성물의 량이 가장 높은 것으로 나타났다 (도 7). 그러나 본 실험을 통하여 효소 반응 초기에는 2.1분대 물질로부터 2.8분대 물질(생성물 A)이 생성됨을 확인할 수 있었고 (도 8a와 도 8b) 효소반응 시간이 길어짐에 따라 2.8분대 물질이 감소하면서 4.5분대 물질(생성물 B)이 생성됨을 확인할 수 있었다 (도 9). 2.8분대 물질(생성물 A)은 멀베로사이드 A로부터 당이 하나 분해된 것으로 예상되며 4.5분대 물질(생성물 B)은 멀베로사이드 A로부터 당이 2개 분해되어 생성된 옥시레스버라트롤로 추정된다. 따라서 효소의 가수분해에 의해 만들어지는 옥시레스버라트롤은 멀베로사이드 A로부터 생성물 A를 거쳐 생성되는 것으로 판단하였다.

실시예 7: 효소전환된 생성물의 정제 및 구조 확인

1) 효소전환 조건 및 정제

상백피 추출물 40 mL에 아세테이트 버퍼(acetate buffer; pH 4.0) 4 mL와 Pectinex® 0.88 mL를 넣어 60℃, 120 rpm으로 4시간 반응하였다. 반응완료 후 95℃에서 2분간 효소반응을 정지시켰다. 효소 반응액을 SP-207 흡착레진을 사용하여 흡착 시킨 후 물로 충분히 세척하였다. 세척된 레진을 100% 아세톤(acetone)으로 용출시킨 후 용출된 용액을 50℃에서 감압 농축했다. 이때 얻어진 상백피 추출물 파우터(powder) 3g을 메탄올에 용해하여 여과한 후 실리카 겔(silica gel) 칼럼에 로딩하였다. 로딩 후 이동상(Chloroform : Methanol = 2.5 : 1)을 사용하여 10 ml/min의 유속으로 분리하였다. 분리된 분획을 TLC (Chloroform 2.5 : Methanol 1, UV 및 Anisaldehyde 황산액)로 확인 후 멀베로사이드 A와 옥시레스버라트롤 샘플을 얻었다 (도 10). 분획된 정제 용액을 모아 50℃에서 감압 농축한 후 재차 진공 건조하여 정제된 샘플을 제조하였다.

2) 생성물의 정량분석 조건

멀베로사이드 A와 옥시레스버라트롤의 정량분석에 사용한 기기는 Thermo Electron (USA)사의 HPLC LCQ Advantage MAX를 사용하였으며, 티로시나아제 저해활성 측정과 enzyme kinetic assay에서 사용한 UV-Vis spectrophotometer는 Cecil Instrument (ENGLAND)사의 CE 9020 및 Microplate reader (Spectramax 340pc, Molecular Devices)를 사용하였다. 또한, MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization)-Mass는 서울대학교 농생명과학공동기기원에서 보유하고 있는 Applied Biosystems Inc. (USA)의 Voyager-DE STR Biospectrometry Workstation을 사용하였으며, 1H-NMR와 14C-NMR은 한양대학교 공동장비센터에서 보유하고 있는 Varian Inc. (USA)의 Varian 400-MR (500 MHz)를 사용하였다.

3) HPLC 분석 조건

상백피 추출물과 이를 효소 가수분해하여 제조한 생성물의 정량분석은 HPLC (LCQ Advantage MAX, Thermo Electron, USA)로 수행되었다. HPLC 분석조건은 다음과 같다: 검출기 PDA detector, 검출파장 325 nm, 분석 칼럼 Luna-Pak® C-18 (5 μm, 4.6ⅹ250 mm, Waters), 시료 주입량 20 μL, 유량 1.0 mL/min, 전개용매 CH3CN:10 mM H3PO4=35:65.

4) 순도 및 구조분석

상백피 추출물 및 효소전환 후 정제한 물질은 HPLC 분석결과 순도가 매우 높은 결과를 나타내었다 (도 11a와 11b). 정제물질의 분자구조 확인을 위해 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 분석을 한 결과, 효소전환 후 생성된 물질은 상백피의 주성분인 멀베로사이드 A의 아글리콘(aglycone)형태인 옥시레스버라트롤로 확인되었으며 (도 12 내지 15), Mass-Spectrum (negative mode)을 사용하여 분자량을 측정한 결과도 옥시레스버라트롤의 분자량인 224로 확인되었다 (도 16).

HPLC 분석 및 NMR, Mass 분석결과로부터 상백피 추출물에서는 멀베로사이드 A가 주성분을 이루고 있음을 알 수 있었고, 멀베로사이드 A로부터 효소전환 후 정제된 물질은 옥시레스버라트롤임을 알 수 있었다. 또한 정제된 옥시레스버라트롤은 표준품인 레스버라트롤(resveratrol)을 기준으로 환산한 결과 98% 이상의 순도를 나타내었다.

상기 결과로부터, 상백피로부터 주성분인 멀베로사이드 A가 추출되었고, 멀베로사이드 A로부터 효소전환에 의해 아글리콘인 옥시레스버라트롤이 생성되었음이 확인되었다 (도 17).

실험예 3: 옥시레스버라트롤의 티로시나아제 활성저해 실험

1) 티로시나아제 활성저해 실험

상백피 추출물과 이를 효소 가수분해하여 제조한 생성물의 티로시나아제 저해활성은 Tomita [Tomita, K., et al., 1990. J. Antibiot. 43(12): 1601-1605] 등을 변형하여 다음과 같이 측정하였다. 티로시나아제는 L-tyrosine을 L-DOPA로 전환하는 monophenolase 활성 및 L-DOPA로부터 DOPAquinone을 생성하는 diphenolase 활성을 통해 melanin 합성을 유도한다. 따라서 본 발명의 티로시나아제 활성저해 실험의 경우에는 monophenolase 및 diphenolase 활성 저해에 대한 실험을 병행하였다. 효소반응을 위해 96웰 플레이트를 사용하였으며 반응액은 각 웰에 0.1 M phosphate buffer (pH 6.8) 150 μl, 2 mM L-tyrosine (또는 L-DOPA) 30 μl, DMSO (dimethylsulfoxide)에 녹인 시료 10 μl, 증류수 100 μl의 반응액을 만든 후 머쉬룸 티로시나아제(mushroom tyrosinase; 2,000 U/ml) 10 μl를 첨가하여 25℃에서 10분간 반응시켰다. 반응 후 마이크로플레이트 리더(Spectramax 340pc, Molecular Devices)를 이용하여 470 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 시료 대신 DMSO 10 μl를 사용하였으며, 비교물질로 코직산(kojic acid) 및 알부틴(arbutin)을 사용하였다. 또한 티로시나아제 대신 0.1 M phosphate buffer (pH 6.8) 10 μl 을 가하여 블랭크(blank)로 하였다. 이 때의 효소 활성 저해율(%)은 아래와 같이 계산하고, 효소의 활성을 50% 저해하는 농도를 내삽법으로 구하여 이를 IC₅₀ 값으로 나타내었다.

Tyrosinase 활성 저해율 (%) = [(A-B)-(C-D)]/(A-B) × 100

A, OD at 470 nm without the test substance but with tyrosinase

B, OD at 470 nm without the test substance and without tyrosinase

C, OD at 470 nm with the test substance and with tyrosinase

D, OD at 470 nm with the test substance but without tyrosinase

2) 머쉬룸 티로시나아제 효소 활성억제 기작

Enzyme kinetic assay는 기본적으로 티로시나아제 저해활성 측정방법과 동일한 조건 하에서 수행되었다. 단, L-tyrosine (또는 L-DOPA)의 농도는 각각 0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5 mM로 변화시켜 각각의 시료에 적용하였다. 멀베로사이드 A의 경우는 각각 0, 10, 50, 100 μM으로 변화시켜 적용하였으며, 옥시레스버라트롤의 경우는 0, 0.1, 0.5, 1.0 μM 로 변환시켜 적용하였다. 25℃에서 10분간 반응시킨 후 470 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정결과는 Lineweaver-Burk plot을 이용하여 분석하였다.

3) 측정결과

티로시나아제 활성 저해를 L-tyrosine을 기질로 하여 시료들의 농도별로 측정해 본 결과, 옥시레스버라트롤의 경우 멀베로사이드 A에 비해 효소활성저해 효과가 크게 향상되었으며 비교물질로 사용한 코직산 및 알부틴에 비해서도 월등히 우수한 효소활성저해 효과를 보였다 (도 18).

또한, 머쉬룸 티로시나아제의 활성 저해효과를 효소의 활성을 50% 감소시키는 IC₅₀값을 기준으로 비교해 보면, L-tyrosine을 기질로 한 monophenolase 활성억제의 경우 효소처리 전의 멀베로사이드 A에 비해 생물 전환시킨 후의 생성물 옥시레스버라트롤에 의한 활성저해가 약 100배 이상 증가하였다 (표 3).

[표 3]. 멀베로사이드 A, 옥시레스버라트롤, 코직산 및 알부틴의 머쉬룸 티로시나아제에 대한 저해 효과

또한 미백 효과가 큰 것으로 알려져 미백제의 원료로 널리 사용되어온 코직산의 효소 활성 저해율 보다 43배가 증가한 것으로 나타났다. 알부틴은 피부의 미 백에 도움을 주는 기능성 화장품의 원료로 식품의약품안전청에 등록된 물질이다. 알부틴과 옥시레스버라트롤의 활성저해 효과를 비교해 보면 옥시레스버라트롤의 경우 알부틴에 비해 1500배 이상의 활성 저해 효과를 보였다. L-DOPA를 기질로 사용한 diphenolase 활성 저해는 옥시레스버라트롤의 경우 코직산에 비해 약 33배의 활성저해 증가효과를 보였다. 멀베로사이드 A 및 알부틴의 경우 3000 μM이상에서도 diphenolase 활성 저해를 보이지 않았다. 따라서 상백피 추출물 중의 멀베로사이드 A와 같은 배당체를 생물전환에 의해 당을 제거함으로써 티로시나아제 저해활성을 월등히 증가시킬 수 있음을 알 수 있다. 옥시레스버라트롤의 경우 L-tyrosine을 L-DOPA로 전환하는 단계에서의 효소 활성을 2.5 μM의 낮은 농도에서 거의 100% 억제할 뿐만 아니라 L-DOPA를 DOPAquinone으로 전환하는 단계에서의 효소활성도 IC₅₀값이 11.9 μM로 코직산의 387.9 μM과 비교하여 크게 억제하는 효과를 나타내었다.

실험예 4: 스트렙토마이세스 비키니엔시스를 이용한 멜라닌 생성 억제효과 측정

티로시나아제 저해활성과 마찬가지로 Tomita 등의 방법을 변형하여 다음과 같이 실험하였다. 멜라닌 생산균주인 스트렙토마이세스 비키니엔시스(Streptomyces bikiniensis KCTC 9172)는 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, Daejeon, Korea)로부터 확보하였다. 본 균주는 -70℃에서 동결보관하고 그것을 ISP No. 7 medium (Difco)에 도말하여 28℃에서 48시간 배양하였다. V-8 juice (Campbell Soup Company, USA) 200 ml, glucose 2 g, yeast extract 2 g (Difco), CaCO3 1 g, agar 20 g을 증류수 800 ml에 용해시켜 제조한 Papavizas' VDYA agar에 균주를 계대하여 28℃에서 2주간 배양하였다. 회색의 포자가 형성되면 멸균증류수 2 ml에 적당한 농도로 포자를 현탁시키고, Bacto-yeast extract (Difco)를 0.2% 포함하는 ISP No. 7 medium에 0.1 ml를 도말하여 배지에 흡수시킨다. 배지표면이 완벽히 마르면 시료 용액 20 μl를 8 mm paper disc (ADVANTEC, Toyo Roshi kasha, Ltd., JAPAN)에 흡수시킨 후 배지의 중앙에 올리고, 28℃에서 48시간 배양하였다. 이때 시료의 농도는 20 μl 내에 100 μg, 500 μg, 1,000 μg이 되도록 하였고, control은 DMSO을 사용 하였다. 배양 후 나타나는 inhibition zone의 크기는 vernier calipers (Digimatic caliper 500-182, Mitutoyo Corporation, JAPAN)를 사용하여 측정하였다.

스트렙토마이세스 비키니엔시스를 이용한 멜라닌 생성 억제효과를 검토한 결과, 1000 μg의 농도에서는 시험에 사용한 옥시레스버라트롤, 멀베로사이드 A, 알부틴, 레스버라트롤 및 코직산 모두에서 저해지대(inhibition zone)가 나타났다 (Fig. 34). 시료를 용해시키는데 사용된 DMSO를 음성 대조군(negative control)으로 이용한 경우에는 저해지대가 나타나지 않았다. 저해지대의 크기는 농도 의존적으로 증가 하였으며, 옥시레스버리트롤의 멜라닌 생성 억제효과가 멀베로사이드 A 보다 뛰어남을 알 수 있었다 (표 4). 비교물질로 사용한 알부틴, 레스버라트롤 및 코직산과 비교하여도 우수한 멜라닌 생성 억제효과를 보였다. 이 결과를 티로시나아제 저해 측정 결과와 비교해 보면, 두 결과가 매우 유사하여 높은 상관성을 나타내었다.

[표 4]. 스트렙토마이세스 비키니엔시스 KCTC 9172에서 멜라닌 생성 및 성장에 대한 화합물의 저해 효과

본 실험에서 관찰된 저해지대는 시료에 따라 S. bikiniensis의 증식이 억제되어 투명하게 보이는 부분과 균이 증식은 되었으나 멜라닌 색소를 생성하지 못하여 흰색을 띄는 부분이 동시에 관찰되는 결과를 보였다. 이것은 옥시레스버라트롤과 레스버라트롤이 멜라닌의 생성을 억제함과 동시에 S. bikiniensis의 증식 또한 억제한다는 의미로 해석할 수 있다. 따라서 옥시레스버라트롤 및 레스버라트롤은 멜라닌 생성 억제효과 뿐만 아니라 항균제로써의 이용 가능성도 있을 것으로 기대된다.

제형예 1. 생물전환된 상백피 추출물을 함유한 화장수

상기 실시예 2 또는 실시예 3의 생물전환 공정 후 상백피 추출물을 함유한 화장료 중 화장수(스킨)의 제형예를 하기 표 5에 나타내었다.

[표 5]

제형예 2. 생물전환된 상백피 추출물을 함유한 영양화장수

상기 실시예 2 또는 실시예 3의 생물전환 공정 후 상백피 추출물을 함유한 화장료 중 영양화장수(로션)의 제형예를 하기 표 6에 나타내었다.

[표 6]

제형예 3. 생물전환된 상백피 추출물을 함유한 영양크림

상기 실시예 2 또는 실시예 3의 생물전환 공정 후 상백피 추출물을 함유한 화장료 중 영양크림의 제형예를 하기 표 7에 나타내었다.

[표 7]

제형예 4. 생물전환된 상백피 추출물을 함유한 맛사지크림

상기 실시예 2 또는 실시예 3의 생물전환 공정 후 상백피 추출물을 함유한 화장료 중 맛사지크림의 제형예를 하기 표 8에 나타내었다.

[표 8]

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 미백효과를 가지는 상백피 추출물을 당류의 분해를 촉매하는 효소 복합제로 처리하여 생물전환 시켰을 때 미백효과가 현저히 증가함을 확인하였다. 따라서 증대된 미백효과를 갖는 생물전환된 상백피 추출물을 화장료의 원료로서 사용할 경우 제품의 품질을 향상시킬 수 있으며 상백피를 함유하는 스킨, 로션, 영양크림, 맛사지 크림 등 다양한 화장품의 수요를 증가시킬 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 상백피 추출물에 함유되어 있는 Mulberroside A의 구조 및 효소 처리에 의해 분해된 구조를 나타낸다.

도 2는 본 발명의 효소에 의해 가수분해된 상백피 추출물을 이용하여 피부 미백제를 개발하는 과정을 설명하는 모식도이다.

도 3은 본 발명의 효소에 의해 가수분해된 상백피 추출물의 티로시나아제 저해율을 나타내는 그래프이다.

도 4는 본 발명의 효소에 의해 가수분해된 상백피 추출물의 멜라닌 색소 억제 능력을 시험한 결과 사진이다.

도 5a와 5b는 각각 본 발명의 효소를 처리하기 전(A)과 처리한 후(B) 상백피 추출물의 HPLC 변화를 나타낸다.

도 6은 본 발명의 효소반응에서 온도조건에 따른 상백피 생성물의 변화를 나타낸다 (pH 4.5, 반응시간 30분).

도 7은 본 발명의 효소반응에서 pH에 따른 상백피 생성물의 변화를 나타낸다 (온도 60℃, 반응시간 30분).

도 8a와 8b는 각각 본 발명의 효소반응에서 반응온도, pH, 배양시간에 따른 생성물의 변화를 나타낸다: 도 8a는 60℃, 30분 효소 반응시 생성된 생성물 (A), 도 8b는 pH 4.5, 30분 효소 반응시 생성된 생성물 (B).

도 9는 본 발명의 효소반응에서 60℃, pH 4.5, 4시간 반응시의 HPLC profile을 나타낸다.

도 10은 본 발명의 효소반응 후 생성된 생성물에서 멀베로사이드 A를 분리, 정제하기 위해 사용된 MPLC를 나타낸다.

도 11a와 11b는 각각 본 발명의 효소반응 후 생성된 생성물에서 정제된 멀베로사이드 A와 옥시레스버리트롤의 HPLC 결과를 나타낸다.

도 12는 상백피 추출물(Mulberroside A)의 ¹H-NMR spectrum을 나타낸다.

도 13은 상백피 추출물(mulberroside A)을 효소 전환시킨 후 정제한 물질(oxyresveratrol)의 ¹H-NMR spectrum을 나타낸다.

도 14는 상백피 추출물로부터 정제된 효소전환 전 물질(mulberroside A)의 ¹⁴C-NMR spectrum을 나타낸다.

도 15는 상백피 추출물을 효소 전환시킨 후 정제된 물질(oxyresveratrol)의 ¹⁴C-NMR spectrum을 나타낸다.

도 16은 상백피 추출물을 효소 전환시킨 후 정제된 물질(oxyresveratrol)의 Mass spectrum을 나타낸다.

도 17은 본 발명에 따라 상백피 추출물의 멀베로사이드 A가 효소처리에 의해 옥시레스버라트롤로 생물전환되는 것을 나타내는 모식도이다.

도 18은 본 발명에 따라 제조된 옥시레스버라트롤의 티로시나아제 활성저해 효과를 멀베로사이드 A, 코직산 및 알부틴과 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 19a 내지 19c는 각각의 화합물에 따른 멜라닌 생성억제 효과를 스트렙토 비키니엔시스 KCTC 9172를 이용하여 비교한 결과를 나타낸다. 디스크는 각각의 화합물 1000 μg (도 19a), 500 μg (도 19b), 및 100 μg (도 19c)을 포함하였고 대조군은 DMSO만 포함하였다: A, 대조군(control); B, 레스버라트롤; C, 알부틴; D, 멀베로사이드; E, 옥시레스버라트롤; F, 코직산.

Claims (11)

1. β-글루코시다아제를 포함하는 효소에 의해 가수분해된 상백피 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 상백피 추출물은 열수추출된 후 β-글루코시다아제를 포함하는 효소에 의해 가수분해된 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 효소는 β-글루코시다아제(β-glucosidase)외에 탄나아제(tannase) 및 펙티나아제(pectinase)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
4. 제 1항에 있어서, 상기 가수분해된 상백피 추출물은 옥시레스버라트롤(oxyresveratrol)을 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
5. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 상기 가수분해된 상백피 추출물을 0.01-20 중량%로 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 스킨, 스킨로션, 스킨소프트너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 영양로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양크림, 맛사지크림, 모이스쳐크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징 폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디클린져, 바디로션, 샴푸, 유액, 파운데이션, 프레스파우더, 루스파우더, 아이새도우로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
7. 하기 단계를 포함하는 증대된 미백효과를 갖는 상백피 추출물의 제조방법:

   a) 상백피를 열수 추출하는 단계; 및

   b) 상기 상백피 추출물을 β-글루코시다아제를 포함하는 효소에 의해 가수분해시키는 단계.
8. 제 7항에 있어서, 상기 b)의 가수분해 반응단계에서 첨가되는 효소의 양은 첨가되는 상백피 추출물에 대하여 0.01-5 중량%인 것을 특징으로 하는 제조방법.
9. 제 7항에 있어서, 상기 효소에 의한 가수분해반응은 30-70℃에서 교반하면서 3-24시간 동안 항온반응으로 수행하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
10. 하기 단계를 포함하는 상백피로부터 옥시레스버라트롤(oxyresveratrol)의 제조방법:

    a) 상백피로부터 멀베로사이드 A(mulberroside A)를 분리 및 정제하는 단계; 및

    b) 상기 멀베로사이드 A를 β-글루코시다아제를 포함하는 효소에 의해 가수분해시키는 단계.
11. 하기 단계를 포함하는 상백피로부터 옥시레스버라트롤(oxyresveratrol)의 제조방법:

    a) 상백피 추출물을 β-글루코시다아제를 포함하는 효소에 의해 가수분해시키는 단계; 및

    b) 상기 가수분해물로부터 옥시레스버라트롤을 분리 및 정제하는 단계.

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