KR101438543B1

KR101438543B1 - 항염증, 항노화 기능성 옥시레스베라트롤, 트란스-레스베라트롤 및 모라신이 함유된 뽕나무 가지추출물의 제조방법

Info

Publication number: KR101438543B1
Application number: KR1020120014928A
Authority: KR
Inventors: 최상원; 김은옥; 임현희
Original assignee: 대구가톨릭대학교산학협력단; 최상원
Priority date: 2012-02-14
Filing date: 2012-02-14
Publication date: 2014-09-18
Also published as: KR20130093372A

Abstract

본 발명은 항염증 및 항노화성 옥시레스베라트롤, 트란스-레스베라트롤 및 모라신 함유 뽕나무가지(상지)추출물의 제조방법에 관한 것으로, 상지를 찜처리한 후 건조하고 80% 에탄올수용액으로 추출하여 얻은 에탄올추출물을 pectinex 효소처리한 후 에틸아세테이트로 분획하고 농축한 후 최종 다이아이온 HP-20 흡착이온수지 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 항염증성 및 항노화성 옥시레스베라트롤 (oxyresveratrol), 트란스-레스베라트롤(trans-resveratrol) 및 모라신(moracin)을 함유하는 상지추출물을 제조하고, 이의 피부 염증 치료제 및 피부미백 기능성화장품 신소재용도를 개시한다.

Description

항염증, 항노화 기능성 옥시레스베라트롤, 트란스-레스베라트롤 및 모라신이 함유된 뽕나무 가지추출물의 제조방법 {Preparation method of oxyresveratrol, t-resveratrol, and moracin having anti-inflammatory and anti-aging function from Mulberry twig extract}

본 발명은 항염증 및 항노화성 옥시레스베라트롤, 트란스-레스베라트롤 및 모라신 함유 고품질의 상지추출물의 제조방법에 관한 것이다.

식물분류학상 뽕나무는 Morus alba L. 로 표시되는 교목식물이다. 뽕나무(Mulberry)는 열매(桑子)로부터 잎(桑葉), 가지(桑枝), 뿌리껍질(桑白皮), 뽕나무에 기생하는 겨우살이(桑寄生), 상황버섯(桑黃), 누에(白蠶), 동충하초(冬蟲夏草)에 이르기까지 하나도 버릴게 없는 신목으로서 ‘동의보감’ 및 ‘본초강목’에는 고혈압과 동맥경화, 중풍을 비롯해 각기에 의한 부종, 신경통과 관절염, 감기의 기침과 가래 등에 효과가 있고, 자양강장 효과도 있는 것으로 적혀있다(약품식물학연구회, 신약품식물학, 학창사, p. 242, 1994; Tsuneo Namba 和漢藥百科圖鑑 I, 보육사, p 320, 1980).

동의보감에는 뽕나무가지(상지)를 말려 만든 상지차는 풍습을 없애고 관절을 이롭게 하고 수기로 뼈마디가 쑤시고 저리는 풍한습비, 사지 비틀림, 기침, 중풍에 의해 입이 돌아가는 증상을 치료해 준다고 씌여져 있으며, 또한 몸이 비대한 사람은 살이 빠지는 효과도 있다고 한다. 또한, 상지는 편풍과 함께 모든 풍을 다스리고 소화를 촉진하고 기를 내리며, 입이 마르는 것을 다스린다고 적혀 있다. 일본 끽다양생기에는 상지를 넣어 만든 뽕죽은 당뇨병에 좋다고 기록되어 있다. 또한, 상지나 상백피를 달여 농축한 즙으로 빚은 상주(뽕가지술)는 약주로 쓰이는데 특히 중풍, 오체마비, 각기, 기침에 효험이 있다고 한다(Tsuneo Namba 和漢藥百科圖鑑 I, 보육사, p 320, 1980).

지금까지 알려진 상지의 생리적작용으로는 항간독성, 항산화, 항비만, 항염증, 항노화, 항관절염작용 등이 보고되었으며, 그 주된 생리활성성분으로서 prenylflavonoids, coumarin, stilbene 등이 알려져 있다(Oh et al., Planta Med 68: 932-934, 2002; Hu et al., J Nat Prod 74: 816-824, 2011; Kim et al., J Ethnopharmacol 136: 392-398, 2011; Chang et al., Food Chem Toxicol 49: 785-790, 2011).

상지의 옥시레스베라트롤 및 레스베라트롤 등의 스틸벤(stilbene) 화합물과 모라신 등은 뽕나무 열매 오디 뿐만 아니라 상엽, 상백피 등 여러 잠상산물에도 존재한다(Kim et al., J Korean Soc Food Sci Nutr 37: 124-128, 2008; Kim et al., Korean J Seric Sci 47: 51-55, 2005; Piao et al., Phytochem Anal 22: 230-235, 2011, Kim et al., J Biol Chem 277: 16340-16344, 2002). 특히 상지의 옥시레스베라트롤은 피부 멜라닌 색소 생성을 촉진하는 티로시나제(tyrosinase)의 강력한 저해제로서 미백화장품 원료로 각광을 받고 있을뿐 아니라(Shin et al., Biochem Biophys Res Commun 243: 801-803, 1998; Oh et al., Arch Pharm Res 21: 703-706, 1998; Shimizu et al., Planta Med 66: 11-15, 2000; Chung et al., J Pharm Pharm 55: 1695-1700, 2003; Kim et al., J Biol Chem 277: 16340-16344, 2002) 염증성 매개물질인 엔오(NO) 생성 효소인 inducible nitric oxide synthase(iNOS)를 억제하고, 염증 촉진물질인 NF-kB 및 cyclooxygenase-2(COX-2) 활성을 억제하는 항염증물질로서 밝혀진 바가 있다(Chung et al., J Pharm Pharm 55: 1695-1700, 2003). 또한, 트란스-레스베라트롤은 포도와인의‘French Paradox'의 주된 물질로서(Ren명 Lorgeril, The Lancet 339: 1523-1526, 1992) 항암뿐 아니라, 항고혈압, 항염증, 항노화 및 항산화성 물질로 잘 알려져 있으며(Fremont Life Sci 66: 663-673, 2000), 최근에는 수명연장 효과도 있음이 보고된 바가 있다. 한편, 모라신유도체는 항당뇨뿐 아니라 항염증 및 항노화성 물질로 잘 알려져 있으며(Basnet et al., Chem Pharm Bull 41: 1238-1243, 1993; Lee et al., Biol Pharm Bull 25: 1045-10488, 2002), 특히 미백효능이 있는 항티로시나제 물질로서 보고(Lee et al., Biol Pharm Bull 25: 1045-10488, 2002)된 바가 있다.

한편, 상지의 옥시레스베라트롤, 트란스-레스베라트롤 및 모라신 등의 생리활성물질은 잠상산물에서 거의 대부분 배당체로 존재하며, 식물의 종류 및 품종, 산지, 계절 및 가공처리에 따라 그 함량이 천차만별이다(Kim et al., J Korean Soc Food Sci Nutr 37, 124-128, 2008; Kim et al., Korean J Seric Sci 47, 51-55, 2005; Piao et al., Phytochem Anal 22, 230-235, 2011). 특히 상지의 옥시레스베라트롤은 거의 대부분 배당체로 존재하며, 상백피의 주된 생리활성물질로 알려져 있으나 상엽이나 오디에는 거의 존재하지 않는다(Kim et al., J Korean Soc Food Sci Nutr 37, 124-128, 2008; Kim et al., Korean J Seric Sci 47, 51-55, 2005; Piao et al., Phytochem Anal 22, 230-235, 2011). 반면, 상지의 트란스-레스베라트롤(trans-resveratrol)은 오디뿐 아니라 상엽, 상백피에도 존재하며, 그의 이성질체인 시스-레스베라트롤(cis-resveratrol)과 함께 거의 대부분 배당체로 존재한다(Kim et al., J Biol Chem 277, 16340-16344, 2002). 모라신 성분도 상지를 비롯하여 오디, 상엽 및 상백피에도 함유되어 있으며, 대부분 배당체로 존재한다(Basnet et al., Chem Pharm Bull 41: 1238-1243, 1993).

한편, 상지에 함유된 옥시레스베라트롤, 트란스-레스베라트롤 및 모라신 성분들은 대부분 비활성형 배당체로 존재하고 있기 때문에 상지추출물을 그대로 사용할 때는 인체 흡수능이 낮을뿐 아니라 노화 억제 효능이 매우 낮다. 따라서 이들 생리활성물질이 실제로 항피부노화 기능을 충분히 발휘하기 위해서는 기존의 비활성형 성분을 활성형 성분으로 전환시키는 생물전환(Bioconversion)기술 개발이 필요하다.

생물전환기술이란 발효에 의해 식물이 지니고 있는 비활성형 고분자물질을 활성형 저분자물질로 변형하거나 미생물이 생산하는 효소에 의해 기존의 활성형물질을 보다 고활성의 새로운 유도체를 생산방법으로서 피부 항노화 효능성분을 배가 시켜줄뿐 아니라 피부 깊숙한 곳까지 보다 많이 빠르게 흡수시켜 피부 노화를 억제하는 효과가 매우 크다. 최근 국내에서 생물전환기술을 이용한 항피부노화 기능성신소재의 개발이 활발히 이루어지고 있으며, 그 대표적인 예로서 콩의 isoflavone, 대황의 rhapontigenin 및 인삼의 ginsenoside 유도체 성분들은 현재 기능성화장품 소재로서 크게 각광을 받고 있다.

지금까지 상지를 포함한 잠상산물로부터 옥시레스베라트롤, 트란스-레스베라트롤 및 모라신 유도체의 분리 및 동정 그리고 그들의 생리적작용에 관한 다수의 연구가 보고된(Shin et al., Biochem Biophys Res Commun 243, 801-803, 1998; Oh et al., Arch Pharm Res 21, 703-706, 1998; Shimizu et al., Planta Med 66, 11-15, 2000) 바가 있으나 비활성형이 아닌 활성형 항염증 및 항노화성 옥시레스베라트롤, 레스베라트롤 및 모라신 함유 고부가가치 상지추출물 제조에 관한 연구는 거의 없는 실정이다.

본 발명의 목적은 항염증, 항노화 기능성을 가진 옥시레스베라트롤, 트란스-레스베라트롤 및 모라신이 함유된 뽕나무 가지추출물의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 상기 목적은 상지의 찜처리 단계, 건조 상지의 에탄올 추출 단계, pectinex 효소에 의한 가수분해처리 단계, 에틸아세테이트 분획 단계, Diaion HP-20 흡착이온수지 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 옥시레스베라트롤, 레스베라트롤 및 모라신 함유 상지추출물을 제조함으로써 달성하였다.

이상 설명한 바와 같이 본 발명의 분리 및 정제방법은 뽕나무 가지로부터 항염증 및 항노화 기능성 옥시레스베라트롤을 함유하고 있는 정제분말을 대량생산할 수 있을 뿐만 아니라 항암, 항고혈압 및 항노화 기능성 트란스-레스베라트롤 및 모라신 성분을 기능성식품 및 화장품의 신소재로서 제공하는데 뛰어난 효과가 있다.

도 1은 항염증 및 항노화성 옥시레스베라트롤, 트란스-레스베라트롤 및 모라신 함유 상지추출물의 제조방법을 나타낸 것이다.
도 2는 옥시레스베라트롤, 트란스-레스베라트롤 및 모라신 함유 상지추출물의 고속액체크로마토그램 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 상지의 찜처리 단계, 건조 상지의 에탄올 추출 단계, pectinex 효소에 의한 가수분해처리 단계, 에틸아세테이트 분획 단계, Diaion HP-20 흡착이온수지 칼럼 크로마토그래피에 의한 옥시레스베라트롤, 레스베라트롤 및 모라신의 분리 및 정제 단계로 구성된다.

본 발명은 다음의 단계를 포함하는 찜처리 상지로부터 옥시레스베라트롤, 레스베라트롤 및 모라신의 분리 및 정제방법을 제공한다. 상지를 찜통에 넣고 1시간 찜처리한 후 방냉하고 다시 열풍건조기에서 건조하여 건조 상지를 얻고, 건조 상지에 80% 에탄올수용액을(650 kg/100 kg 시료) 가하여 40 ~ 50℃에서 12시간 초음파추출기에서 추출한 다음 여과 및 감압농축하여 상지에탄올추출물을 얻었다.

상기의 상지추출물에 80% 에탄올수용액으로 다시 용해시킨 다음 일야 방치하여 얻은 상층에 2 배량의 100% 노르말-헥산을 첨가한 후 분획하여 탈지하였다. 상기에서 얻은 하층의 상지 탈지에탄올추출물을 부분 감압농축한 후 다시 추출물에 대해 5배 가량의 20% 에탄올수용액을 첨가하여 현탁시킨 후 여기에 상기 탈지 에탄올추출물에 대해 10% 펙틴나제 효소를 가하여 30 ~ 40℃에서 12시간 동안 가수분해시켰다. 상기로부터 얻은 가수분해물을 실온에서 방냉한 후 에틸아세테이트를 가하여 분획하여 얻어진 상층을 감압농축한 후 이온흡착수지 칼럼 크로마토그래피를 각각 수행하였다.

상기에서 수득한 에틸아세테이트 분획물은 먼저 20% 에탄올수용액으로 용해시킨 다음 다이아이온 HP-20 이온수지에 흡착시킨 후 20% 에탄올수용액으로 칼럼을 충분히 수세한 후 다시 40% 및 60% 에탄올수용액으로 각각 용출시키고 농축하여 항염증 및 항노화성 옥시레스베라트롤, 레스베라트롤 및 모라신을 분리 및 정제한다.

본 발명의 찜처리 상지로부터 옥시레스베라트롤, 레스베라트롤 및 모라신의 분리 및 정제방법에서 에탄올수용액의 바람직한 농도는 75% 내지 95%이며, 가장 바람직하게는 80% 내지 90% 에탄올수용액이다. 이 때 추출용매로써 에탄올 대신 메탄올을 사용할 수도 있다.

본 발명의 찜처리 상지에서 옥시레스베라트롤, 레스베라트롤 및 모라신 성분의 분리 및 정제방법에서 가열추출의 바람직한 온도는 40℃ 내지 60℃ 이며, 가장 바람직하게는 50℃이다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 찜처리 , 효소처리, 용매분획 및 흡착이온수지 칼럼 크로마토그래피에 의한 상지 에탄올추출물로부터 옥시레스베라트롤 , 레스베라트롤 및 모라신의 분리 및 정제

상지로부터 항염증 및 항노화성 옥시레스베라트롤, 레스베라트롤 및 모라신 을 분리 정제하기 위해 찜처리 상지 탈지에탄올추출물을 효소처리, 에틸아세테이트 분획, 및 Diaion HP-20 흡착이온수지 칼럼 크로마토그래피를 실시하였다. 우선, 상지를 찜통에 넣어 1시간 찜처리한 후 건조하여 얻은 건조 상지(Morus Twig) 100 kg에 80% 에탄올수용액 650 kg을 가하여 초음파추출기에서 50℃에서 12시간 동안 초음파추출한 후 여과하였다. 상기 추출과정을 2회 반복 실시하여 얻은 혼합 에탄올추출액을 부분 감압ㆍ농축하여 상지 에탄올추출물(10 kg)을 얻었다.

다음, 에탄올추출물에 80% 에탄올수용액(50 kg)을 가하여 용해시킨 후 하룻밤 실온에서 방치한 다음 얻어진 상등액을 분리한 다음 여기에 노르말-헥산(100 kg)를 가하고 교반하면서 분획하여 상층의 지방과 색소를 제거하고 하층을 감압농축하여 상지 탈지에탄올추출물(8.5 kg)을 얻었다.

이것을 다시 20% 에탄올수용액(50 kg)으로 현탁시킨 후 여기에 펙틴나제(pectinex 5 XL, Novozymes, Denmark) 4 L을 가하여 30 ~ 40℃에서 12시간 교반하면서 가수분해시킨 후 방냉한 다음 여기에 에틸아세테이트(100 kg)을 가하여 2회 반복 분획하여 얻어진 상층을 무수망초(10 kg)로 탈수하고 여과한 후 감압농축하여 에틸아세테이트추출물(2.1 kg)을 얻었다. 이것을 20% 에탄올수용액(5 kg)으로 현탁시킨 후 미리 20% 에탄올수용액으로 평형화시켜 놓은 Diaion HP-20 흡착이온수지(Mistubishi Chem. Co., Japan) 칼럼(10 cm × 50 cm)에 충진시킨 후 20% 에탄올수용액(40 L)로 충분히 수세한 후 40% 에탄올수용액(20 L) 및 60% 에탄올수용액(20 L)으로 각각 용출하였다. 이때 40% 에탄올수용액으로 용출되는 분획을 회전식 증발감압농축기(rotary evaporator)로 50℃ 이하에서 감압농축시켜 옥시레스베라트롤(순도: 60%)를 함유한 상지추출물 I(1.2 kg, 수율: 1.2%)을 얻었다.

다음, 같은 방법으로 60% 에탄올수용액 분획으로부터 트란스-레스베라트롤(순도: 70%) 및 모라신(순도: 80%)를 함유한 상지추출물 Ⅱ(110 g, 수율: 0.11%)을 얻었다 (도 1).

실시예 2 : 본 발명의 방법에 따라 제조된 상지추출물 I 및 Ⅱ 중의 옥시레스베라트롤 , 트란스 - 레스베라트롤 및 모라신의 정량분석

상기 실시예 1에 따라 제조된 상지추출물 I 및 Ⅱ 중의 옥시레스베라트롤, 트란스-레스베라트롤 및 모라신의 정량분석은 고속액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 다음과 같이 실시하였다. 우선, 상지 정제분말 1 g을 100% 메탄올 적절히 용해한 후 같은 용액으로 100 mL로 정용하였다. 상기 용액을 같은 용매로 10배 희석한 후 이 중 1 mL을 취하여 0.45 ㎛ membrane filter(gelman Sci, USA)를 통과시킨 후 20 ㎕를 HPLC에 주입시켜 정량분석하였으며, 이때 HPLC 분석은 워트스 e2690/5 고속액체크로마토그래피, 칼럼; YMC-Pack C₁₈ (5 ㎛, 250 × 4.6 mm I.D., YMC Inc., USA), 이동상(용매 A --> 용매 B로 60분간 농도구배 용출); 용매 A(0.05% 인산) & 용매 B(100% 메탄올), 자외선 검출기; UV₃₂₀ _nm, 유속; 0.8 mL/min 조건으로 수행하였다.

상기 실시예 1에 따라 제조된 상지로부터 분리된 옥시레스베라트롤(화합물 1), 트란스-레스베라트롤(화합물 2) 및 모라신(화합물 3)의 고속액체크로마토그램은 도 2에 나타내었으며, 각각의 화학구조는 다음과 같다.

(화합물 1)

(화합물 2)

(화합물 3)

그리고 상지로부터 분리된 옥시레스베라트롤, 트란스-레스베라트롤 및 모라신의 화학구조 동정을 위해 먼저 3가지 화합물의 자외선 및 핵자기공명 스펙트럼을 측정하였고 아울러 전보(Shin et al., Biochem Biophys Res Commun 243: 801-803, 1998; Oh et al., Arch Pharm Res 21: 703-706, 1998; Kim et al., J Korean Soc Food Sci Nutr 37, 124-128, 2008)에 의해 이미 보고된 그들의 자외선 및 핵자기공명 스펙트럼과 비교분석을 통해 각 화합물을 동정하였다.

상기 실시예 1에 따라 제조된 상지로부터 제조된 추출물 I 및 Ⅱ 중의 옥시레스베라트롤, 트란스-레스베라트롤 및 모라신의 함량을 측정한 결과를 [표 1] 에 나타내었다.

[표 1] 상지 탈지에탄올추출물을 효소처리, 에틸아세테이트 분획 및 Diaion HP -20 흡착이온수지 칼럼 크로마토그래피 순으로 실시하여 제조된 상지추출물 I 및 Ⅱ 중의 옥시레스베라트롤 , 트란스 - 레스베라트롤 및 모라신의 함량

상기 [표 1]에서와 같이 상지 탈지에탄올추출물을 효소처리, 에틸아세테이트 분획, 및 다이아이온 HP-20 칼럼 크로마토그래피 순으로 분리하여 제조된 정제분말 I 및 Ⅱ 중의 옥시레스베라트롤, 트란스-레스베라트롤 및 모라신의 함량은 각각 60.50%, 40.64%, 및 45.16%이었고 수율은 정제분말 I이 1.2% 그리고 정제분말 Ⅱ가 0.11%를 얻을 수 있었다.

실시예 3 : 효소처리 유무에 따른 상지추출물의 옥시레스베라트롤 , 트란스 - 레스베라트롤 및 모라신의 정량분석

상기 실시예 2에 의한 효소처리 유무에 따른 상지추출물에 함유된 4가지 생리활성물질(옥시레스베라트롤 3-O-베타-디글리코사이드, 옥시레스베라트롤, 트란스-레스베라트롤 및 모라신)을 정량하기 위해 앞서 HPLC 조건에 따라 비효소처리구의 탈지 에탄올추출물을 HPLC 분석한 결과 도 2와 같이 4가지 생리활성물질을 확인할 수 있었으며, 이때 미리 상지로부터 순수하게 분리된 4가지 생리활성물질을 이용하여 작성된 표준검량곡선[옥시레스베라트롤 3-O-베타-디글리코사이드: y=10.12x + 0.19 (r²=0.997), 옥시레스베라트롤: y=10.17x + 0.12 (r²=0.998), 트란스-레스베라트롤: y=6.78x + 0.08 (r²=0.997), 및 모라신: y=6.89x + 0.10 (r²=0.998)]을 토대로 효소처리 유무에 따른 상지 에탄올추출물 중의 4가지 생리활성물질의 함량을 측정한 결과는 [표 2] 와 같다.

[표 2] 효소처리에 따른 상지추출물 중의 4가지 생리활성물질의 함량 비교

상기 [표 2] 에서와 같이, 비효소처리구 상지 에탄올추출물의 4가지 생리활성물질의 함량을 보면 옥시레스베라트롤 3-O-베타-디글리코사이드 43.82 mg/100 g , 옥시레스베라트롤(미량), 트란스-레스베라트롤 0.54 mg/100 g, 및 모라신 (미량) 으로서 옥시레스베라트롤 3-O-베타-디글리코사이드가 대부분 차지하고 있었으나 반면, 효소처리구에서는 옥시레스베라트롤 아글리콘 성분이 42.93 mg/100 g으로 대부분 차지하고 있었으며, 약간의 트란스-레스베라트롤 및 모라신이 존재하였다. 이와같이 효소처리에 의해 상지에 존재하는 옥시레스베라트롤 배당체 성분은 거의 아글리콘 성분으로 전환되었음을 확인하였다.

Claims

상지를 찜통에서 1시간 찜처리한 후 건조하여 얻은 건조 상지(Morus Twig) 100 kg에 75 ~ 95% 에탄올수용액을 650 kg를 가하여 40 ~ 50℃에서 12시간 초음파 추출한 다음 감압농축하고,
상기에서 얻은 농축물을 80% 에탄올수용액로 다시 용해시킨 다음, 일야 실온에서 방치하여 침전물을 제거한 다음 여기에 노르말-헥산을 첨가하여 분획시켜 상층의 기름을 제거하고 하층은 감압 농축하여 탈지에탄올추출물을 얻고,
상기에서 얻은 상지 탈지에탄올추출물에 20% 에탄올수용액을 첨가하여 현탁시킨 후 상기 추출물에 대해 10% 펙틴나제 효소를 처리하여 30 ~ 40℃에서 12시간동안 교반하여 가수분해시키고,
상기에서 얻은 가수분해물을 에틸아세테이트 용매로 분획한 후 얻어진 상층을 감압농축한 후 다시 20% 에탄올수용액으로 용해한 후 다이아이온 HP-20 흡착이온수지 칼럼에 흡착시킨 후 먼저 20% 에탄올수용액으로 충분히 수세한 후 다시 40% 에탄올수용액으로 용출시키고 농축하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 옥시레스베라트롤 함유 상지추출물 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 흡착이온수지로부터 60% 에탄올수용액으로 용출시키고 농축하는 단계를 더 포함함을 특징으로 하는 상지로부터 트란스-레스베라트롤 및 모라신 함유 상지추출물의 제조방법.
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