KR100731613B1 - 산뽕나무 줄기 심재 추출물을 포함하는 미백 및 항노화화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 제주도에서 자생하는 산뽕나무의 줄기 심재 추출물을 이용하여 미백 및 항산화 효능이 우수한 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서는 희귀종은 아니지만 제주도 산간지역의 야생 생육환경 속에서 적응하여온 산뽕나무, 특히 이들의 생육상태에 해로운 영향을 주지 않기 위하여 세지가 제외된 중간 크기의 줄기 심재 부분만을 화장품 원료화에 사용하였으며, 인체 피부자극을 나타내었던 껍질부분을 제외함으로써 화장품 원료의 중요한 조건인 안전성을 확보할 수 있다.

또한, 기존의 뽕나무과 식물의 원료였던 상백피를 포함하는 여러 부위별 추출물들에 대한 미백 및 항산화 효능을 비교한 결과 산뽕나무의 줄기 심재 추출물에서 가장 우수한 효능이 나타났고, 이러한 효능에 유효 활성성분으로 밝혀져 온 레스베라트롤(resveratrol)과 옥시레스베라트롤(oxyresveratrol)의 함량도 줄기 심재 추출물에서 월등히 높게 존재하였다.

따라서, 미백 및 항노화 기능성 화장품 원료로서 산뽕나무의 줄기 심재 추출물은 다른 부위의 추출물들보다 우수한 효능을 가지고 있으며, 동시에 인체 피부 안전성의 장점들을 가지고 있으므로, 화장품 원료로서 기존의 상백피 추출물보다 유리하다.

산뽕나무, 줄기 심재, 미백, 항산화, 화장품

Description

산뽕나무 줄기 심재 추출물을 포함하는 미백 및 항노화 화장료 조성물{Whitening and anti-aging cosmetic composition comprising stem heartwood extract of Morus bombycis koidz}

도 1은 산뽕나무 부위별 추출물의 티로시나아제 저해율을 비교한 그래프이다.

도 2는 산뽕나무 부위별 추출물의 세포독성을 비교한 그래프이다.

도 3은 알부틴 농도에 따른 멜라닌 합성 저해효과를 나타낸 그래프이다.

도 4는 산뽕나무 부위별 추출물의 멜라닌 합성 저해효과를 비교한 그래프이다.

도 5는 산뽕나무 줄기 심재 추출물 농도에 따른 멜라닌 합성 저해효과를 나타낸 그래프이다.

도 6은 산뽕나무 줄기 심재 추출물의 멜라닌 합성 저해효과를 나타낸 사진이다.

도 7은 DPPH 라디칼 소거 활성법에 의한 산뽕나무 부위별 추출물의 항산화 효능을 비교한 그래프이다.

도 8은 DCF-DA 방법에 의한 산뽕나무 부위별 추출물의 항산화 효능을 비교한 그래프이다.

도 9는 표준 레스베라트롤의 HPLC 크로마토그램이다.

도 10은 산뽕나무 줄기 심재 추출물의 HPLC 크로마토그램이다.

도 11은 산뽕나무 줄기 심재 추출물의 Prep-HPLC 크로마토그램이다.

도 12는 화학식 1 화합물의 LC/MASS 스펙트럼이다.

도 13은 화학식 1 화합물의 ¹H-NMR 스펙트럼이다.

도 14는 화학식 1 화합물의 ¹³C-NMR 스펙트럼이다.

도 15는 화학식 1 화합물의 HPLC 크로마토그램이다.

도 16은 심재 추출물의 HPLC 크로마토그램이다.

본 발명은 산뽕나무의 줄기 심재 추출물을 포함하여 미백 및 항산화 효능이 우수한 화장료 조성물에 관한 것이다.

사회가 발달하고 여성의 사회 진출이 활발해짐에 따라 예전에 비해 화장을 향유하는 사람과 계층이 확대 재생산되어 왔으며, 화장과는 무관하다고 인식되어졌던 남성에게 조차 그 가치가 파고들고 있다. 이러한 인식의 변화에 따라 주요 생활 도구인 화장품에도 변화의 바람이 불고 있으며 그 가치도 부상하고 있다. 전통적 화장품 산업이 활성화되고 있는 가운데 새로운 가치를 창출하고 화장품이 효과와 효능을 표방하는 기능성 제품으로서 부각되고 있다.

기능성 화장품은 크게 다음과 같이 구분된다. 즉, 피부의 미백에 도움을 주는 기능을 가진 화장품, 피부에 탄력을 주어 피부의 주름을 완화 또는 개선하는 기능을 가진 화장품, 자외선 차단 또는 산란시켜 피부를 보호하는 기능을 가진 화장품으로 구분된다(식약청 고시 제2001-60호).

미백효과에 대한 연구는 티로시나아제(tyrosinase) 활성 억제, DOPA(tyrosine) 산화 억제, 각질층 제거 촉진 및 자외선 차단 등에 대해서 이루어지고 있는데, 각질형성세포에 있는 멜라닌의 양과 분포에 의해 피부색 및 피부색소침착의 대부분이 결정되므로, 미백소재의 미백효과를 검정하기 위해서는 멜라닌 형성을 억제하는지 여부가 중요하다. 피부의 색소침착과 관련하여 티로시나아제의 작용을 억제하는 물질로 알부틴(arbutin), 코직산(Kojic acid), 상백피추출물, 닥나무추출물, 감초추출물 등이 있다.

또한, 현재 화장품에서 응용되는 성분 중 자유 라디칼(free radical)의 소거능을 가진 식물추출물로는 녹차추출물, 은행추출물, 솔잎추출물 등이 있다. 이러한 기능을 검증하는 실험으로 DPPH 라디칼 소거능을 검색하는 방법과 섬유아세포의 증식을 감소시키는 효과를 측정하는 방법이 있는데, 여기서 노화관련 피부 생리적 변화 중 하나로 섬유아세포 증식의 감소는 콜라겐(collagen) 합성 감소로 이어진다.

이러한 기능성 화장품의 원료로서, 최근 부작용이 적고 그 효과가 지속적이며 전반적으로 피부를 좋게 한다는 것이 장점으로 부각되어 자연주의와 자연성분을 표방하는 다양한 한방 및 천연원료를 함유하는 화장품의 개발이 활발히 진행되고 있다. 이와 같은 목적으로 이 등은(약학회지, 41(4), 456-461, 1997) 고등식물로부터 피부멜라닌 생성에 관여하는 티로시나아제 활성억제 물질의 탐색에 관한 연구결과에서 130여종을 검색하고 18종의 식물 추출물을 선발하였으며, 이들 중 상백피, 감초가 가장 우수하였다고 발표하였다. 특히 상백피에 존재하는 미백 활성 성분은 레스베라트롤(resveratrol)류로 밝혀졌고, 레스베라트롤류 화합물 중에 옥시레스베라트롤(oxyresveratrol)은 티로시나아제 활성 억제 효과(IC₅₀ 1 μM)가 매우 우수한 미백 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다(Biochem. and Biophys. Res. Communications, 243, 801-803, 1998).

식물 추출물 유래 미백 화장품 원료들 중 우수한 미백 효능을 갖는 것으로 알려져 있는 상백피(뿌리껍질) 추출물이 이미 화장품 원료로 개발되어 왔다.　그러나 이러한 원료(뿌리껍질) 확보를 위해서는 생태학적인 환경파괴의 문제가 있다.

본 발명자들은 천연물질 유래의 기능성 화장품 소재를 개발하기 위하여, 미백 효능이 우수한 상백피의 원재료로 잘 알려진 뽕나무와 속이 다른 산뽕나무를 대상으로 선정하였고, 부위별로 줄기전체, 줄기의 수피, 줄기의 심재, 뿌리껍질로 세분화하여 유효 추출물을 얻어서 미백 및 항산화 효능 그리고 인체 피부 안전성을 조사하였으며, 기존의 연구보고(J. Immunol. Meth., 156, 39-45, 1992)에서 유효 활성 성분으로 분리 동정되어 왔던 레스베라트롤과 옥시레스베라트롤을 대상으로 각 부위별 함량을 정량 비교분석한 후 효능 비교 결과들과 상호연관성을 조사함으 로써, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명의 목적은 산뽕나무 추출물을 포함하는 미백 및 항노화 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 산뽕나무 추출물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 특히 미백 및 항산화 효능과 피부안전성이 우수한 산뽕나무의 줄기 심재 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 화장료 조성물이 미백 및 항노화 효과를 나타내기 위해서는, 옥시레스베라트롤 함량이 20 내지 95 중량%로 유지되는 산뽕나무 추출물을 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.01 내지 30 중량%로 사용하는 것이 바람직하다. 미백 및 항노화 효능의 주요 활성 성분인 옥시레스베라트롤의 산뽕나무 추출물내 함량을 기준으로 화장료 조성물 내 사용 중량을 결정함으로써 완제품의 효능 품질 규격화가 가능한 것이 특징이다.

본 발명에 따른 산뽕나무 추출물, 특히 줄기 심재 추출물은 기존의 상백피 추출물 등에 비하여 미백 활성 성분인 레스베라트롤과 옥시레스베라트롤을 다량으로 함유하며, 따라서 미백 및 항노화 화장품의 원료로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.

산뽕나무(Morus bombycis koidz)는 중국이 원산으로 알려진 높이 10 내지 12 m의 낙엽교목으로, 자생종은 논, 밭둑이나 산기슭의 양지에서 자란다. 나무껍질은 회갈색이며 세로로 불규칙하게 갈라진다. 잎이 어긋나며, 잎자루는 길이 2 내지 6 ㎝, 잎몸은 길이 7 내지 15 ㎝, 폭 5 내지 15 ㎝, 앞면은 껄끄럽고 뒷면은 주맥에 흰털이 있다. 잎몸 밑 부분이 비대칭적으로 깊게 파이기도 한다. 암수의 그루가 다르나 드물게는 같기도 하며, 꽃은 6월에 핀다. 꽃잎은 없고 꽃밥은 연한 노란색이다. 열매는 집합과이며 길이 5 내지 14 ㎜로 흑자색으로 익는다. 목재는 가구재, 악기재, 조각재 등으로 쓰이며 어린잎과 열매는 식용, 약용으로 사용한다. 뽕나무에 비해 주두가 씨방보다 긴 것이 특징이다. 또한, 산뽕나무는 항균 및 항산화 활성이 우수하다고 보고되었다(Biol. Pharm. Bull., 27, 731-735, 2004).

[제조예]

본 발명에서 사용되는 추출물 시료들은 제주도 중산간 지역에서 자생하는 10년 이상의 수령을 가진 산뽕나무들로부터 얻었다.　중간 크기의 줄기를 이용하여 수피와 심재 부위 시료를 얻었고, 또한 뿌리껍질의 생체 시료를 동일 산뽕나무로부터 얻은 후, 실온에서 자연 건조시켰다. 이들 100 g을 직경 1 ㎜의 크기로 분쇄하고 80% 에탄올 1,000 ㎖에 침적한 후, 실온에서 24시간 동안 교반하여 추출물을 얻었다. 추출액들을 감압 흡입 여과기를 이용하여 여과한 후, 감압 농축하여 동결건조시켰다. 그리고 건조분말 시료들을 DMSO(Dimethyl sulfoxide)에 정확한 농도로 녹여서 효소와 동물세포를 이용한 활성 테스트 실험에 이용하였다.

[실험예]

1. 미백 효능 평가

1-1. 티로시나아제 활성 저해효과

산뽕나무 부위별 추출물 0.5, 1, 10, 20, 30 ㎍/㎖를 포함하는 인산화 완충용액 240 ㎕에 1,500 units/㎖ 버섯 티로시나아제 20 ㎕와 1.5 mM L-티로신 40 ㎕를 넣고 잘 섞은 후, 37℃에서 10분간 반응시키고 반응 생성물인 도파(dopa)에 대한 흡광도를 475 ㎚에서 마이크로플레이트 리더(microplate reader, μ-Quant, Bio-tech)를 이용하여 측정하였다. 양성 대조구(positive control)으로 80, 100, 120, 140, 160 ㎍/㎖의 알부틴을 사용하여 상기와 동일한 실험을 수행한 후, 산뽕나무 부위별 추출물의 버섯 티로시나아제 활성 억제 정도를 비교하였다.

도 1 및 표 1은 산뽕나무 부위별 추출물들의 티로시나아제 저해율 측정에 의한 미백 효능을 비교한 것으로,　이때 미백 기능성 원료로서 식품의약안전청에 의해 고시된 알부틴을 양성 대조구로 사용하였으며, IC₅₀은 저해율이 50%일 때의 샘플 농도로서, 3번의 반복실험에서 5가지 다른 농도를 이용한 회귀선으로부터 계산되었다.

산뽕나무의 각 부위별 80% 에탄올 추출물들의 농도 변화에 따라서 티로시나아제 저해율을 조사한 결과, 산뽕나무의 줄기 전체, 줄기의 수피, 줄기의 심재, 뿌리껍질의 추출물들 모두 알부틴보다 월등히 높은 티로시나아제 저해효과를 나타내었고, 또한 줄기의 심재 추출물이 가장 높은 저해효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

부위별 추출물	티로시나아제 저해농도(IC50)
줄기 전체	2.84 ㎍/㎖
줄기의 수피	17.7 ㎍/㎖
줄기의 심재	1.45 ㎍/㎖
뿌리껍질	27.43 ㎍/㎖
알부틴(양성 대조군)	132.72 ㎍/㎖

1-2. 멜라닌 합성 저해효과

B16-F1 멜라노마(melanoma) 세포주는 ATCC(CRL-6323)에서 구입하였고, 열(56℃, 30분)에 의해 불활성된 FBS(Fetal Bovine Serum)를 10% 포함하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)으로 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

멜라닌 합성 저해율을 조사하기 위해서 세포 밖으로 분비되어 배지에 존재하는 멜라닌 함량을 측정하였다. 6-웰(well) 플레이트에 1.0×10⁵/웰의 농도로 세포를 접종하여 24시간 동안 배양한 후, 산뽕나무 부위별 추출물과 알부틴 추출물을 각각 농도별로 함유하는 배지로 교체하였다. 배지 교체 후 60시간이 지난 후 배양을 종료하였다. 배양을 끝내고 배지를 회수하여 3,000×g로 10분간 원심분리한 다음, 96-웰 플레이트에 200 ㎕씩 넣어 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 리더로 405 ㎚에서의 흡광도를 측정하였다.

상기 과정에서 세포의 생존률을 알아보기 위해 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 어세이를 수행하였다. 96-웰 플레이트에 3.0×10³/웰의 농도로 세포를 접종하여 24시간 동안 배양한 후, 산뽕나무 부위별 추출물과 알부틴 추출물을 각각 농도별로 함유하는 배지로 교체하였다. 배양이 끝나면 배지를 회수하고 D-PBS(Dulbecco's phosphate buffered saline)로 배지를 씻어내었다. 각 웰에 0.5 ㎎/㎖의 MTT 용액을 50 ㎕씩 넣고 5시간 동안 37℃ 인큐베이터에서 반응시킨 다음, MTT 용액을 제거하고 200 ㎕ DMSO로 생성된 포르마잔 결정(formazan crystal)을 용해시켰다. ELISA 리더로 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

도 2는 산뽕나무 부위별 추출물의 세포독성을 비교한 것으로, 산뽕나무 부위별 추출물들의 B16-F1 마우스 멜라노마 세포에서 미백 효능을 확인하기 전에 추출물들의 농도별 세포 독성을 MTT 방법으로 확인하였다. 산뽕나무 각 부위별 80% 에탄올 추출물들을 8개의 농도(5 내지 200 ㎍/㎖)로 B16-F1 세포에 처리한 후, MTT를 사용하여 MTT의 환원에 의해 생성되는 포르마잔의 흡광도를 측정함으로써 추출물질들이 B16-F1 세포에 독성을 미치는 영향을 평가하였다.　도 2에 나타나듯이, 줄기 전체, 줄기의 수피, 줄기의 심재 그리고 뿌리껍질 추출물들 모두 50 ㎍/㎖ 농도 이상에서부터 세포독성을 나타냄을 확인하였고, 따라서 B16-F1 세포주를 이용한　 멜라닌 합성 저해율 측정 실험은 상기 농도 범위 안에서 수행하였다.

부위별 추출물들이 B16-F1 마우스 멜라노마 세포에 대하여 세포독성을 나타내지 않는 농도 범위인 50 ㎍/㎖ 이하에서 멜라닌 합성 저해율을 조사하였다. 그리고 세포내에서 합성된 멜라닌이 세포 밖으로 분비되어 축적되는 상기 세포주의 생육특성을 이용하여 배양배지의 멜라닌을 직접 측정할 수 있었는데, 도 3에 나타나듯이 양성 대조구인 알부틴에 대한 멜라닌 합성 저해율을 조사함으로써 이러한 방법을 확인하였다.

도 4는 B16-F1 세포배양 시스템에서 산뽕나무 부위별 추출물의 멜라닌 합성 저해율 조사에 의한 미백 효과를 비교한 것으로, 부위별 추출물들의 멜라닌 합성 저해율을 비교 조사한 결과, 버섯 티로시나아제 활성 저해율이 가장 높았던 줄기 심재의 추출물에서 동일하게 가장 높은 멜라닌 합성 저해율을 나타내었다.

이와 같은 실험 조건에서 산뽕나무의 줄기 심재 추출물에 대한 미백 효능을 알부틴과 정량적으로 비교하기 위하여, 도 5와 같이 추출물의 농도별 멜라닌 합성 저해율을 조사하였다. 그 결과 줄기 심재 추출물의 IC₅₀ 값은 1.33 ㎍/㎖로서, 알부틴의 경우(104.09 ㎍/㎖)보다 약 90배 더 높은 미백 효능을 나타내었다.

줄기 심재 추출물의 멜라닌 합성 저해에 의한 미백 효능은 세포배양 중에도 육안으로 직접 확인할 수 있었는데,　도 6과 같이 추출물을 처리하지 않은 대조구와 비교하여 멜라닌 합성이 현격하게 저해됨을 알 수 있었다.

2. 항산화 효능 평가

2-1. 전자공여능(DPPH)

여러 농도의 시료와 1.5×10^-4 M의 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 용액을 혼합한 후 격렬하게 섞은 다음 1 시간 동안 실온에서 반응시킨 후 남아 있는 DPPH 양을 520 ㎚에서 측정하였다.　그리고 시료를 넣지 않은 경우를 대조군으로 하여 아래의 수학식 1에 의해 시료의 산소 라디칼 소거량(Radical scavenging activity, %)을 계산하였으며, 양성 대조구로 비타민 C를 사용하였다.

도 7은 DPPH 자유 라디칼 소거 활성법에 의한 산뽕나무 부위별 추출물들의 항산화 효능을 비교한 것으로, 각 부위별 추출물들의 농도에 따른 항산화 활성을 조사하고, 이때에 비타민 C를 양성 대조구로 사용하여 항산화력을 검증하였다. 그 결과 부위별 추출물들 모두 양성 대조구인 비타민 C 만큼의 자유 라디칼 소거활성을 나타내지 않았지만, 줄기의 심재 추출물이 다른 부위의 추출물들보다 더 높은 항산화 활성을 갖는 것으로 확인되었다.

2-2. DCF-DA 방법에 의한 세포내 활성 산소종 저해효과

V79-4 폐 섬유아세포들을 DMEM(10% 우태아 혈청 첨가, 1% 항생제 포함) 배지에 현탁하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하고 대수기에서 성장하는 세포를 주로 실험에 사용하였다.　웰당 약 4×10⁵ 세포 수가 되도록 96웰에 각각 접종한 후, 시료 추출물을 여러 처방으로 처리한 다음, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 30분간 배양하였다.　H₂O₂(stock 20 mM)를 10 ㎕씩 가한 후(최종 농도 1 mM) 다시 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 30분간　 배양하고, DCF-DA(dichlorofluorescin diacetate, stock 500 μM)를 20 ㎕씩 가한 후 형광분광광도계(spectrofluorophotometer, excitation 485 ㎚, emission 535 ㎚)로 형광 측정하였다.　시료를 넣지 않고 활성 산소종(Reactive oxygen species)의 형성만을 측정한 것을 대조군으로 정하고, 시료를 넣어 활성 산소종을 소거시키는 시료 처치군과 비교하여, 상기 수학식 1로 활성 산소종 저해율을 구하였으며, 모든 실험은 3번 반복하였다.

도 8은 DCF-DA 방법을 이용하여 산뽕나무 부위별 추출물들의 항산화 효능을 비교한 것으로, V79-4 폐 섬유아세포를 이용하는 DCF-DA 방법으로 부위별 추출물들의 농도에 따른 항산화 활성을 조사하고, 이때에 비타민 C를 양성 대조구로 사용하여 항산화력을 검증하였다. 부위별 추출물들에 대한 항산화력을 비교하기 위하여 활성 산소종 소거 능력의 정량적 비교 기준인 SC₅₀값을 조사한 결과, 줄기 전체와 줄기 심재 추출물에서 각각 6.2 ㎍/㎖와 6.7 ㎍/㎖ 값을 나타낸 반면, 뿌리껍질과 줄기 수피 추출물에서는 활성이 저조하였다. 그리고 양성 대조구인 비타민 C(SC₅₀ 3.7㎍/㎖)와 비교하여 줄기심재 추출물의 항산화 활성이 유사함을 확인할 수 있었다.

3. 인체 피부 일차 자극 평가

산뽕나무의 각 부위별 추출물들을 1,3-BG(butylene glycol)에 1%(weight/volume)의 농도로 녹여서 임상 시험에 사용하였다. 이들 추출물들의 인체피부 일차 자극 평가시험은 전문 임상시험 기관인 (주)더마프로에 의뢰하여 수행하였다.

*시험방법: 48시간 단일 패치 시험(Single Patch Test)

a. 피험자 선정: 선정기준에 부합하고 제외기준에 해당되지 않는 피험자 30명 이상 선정

b. 첩포부위: 피험자의 등 부위에 시험물질을 도포하여 48시간 후 제거

c. 관찰: 제거 30분 후와 24시간 후 관찰

d. 평가: Frosch & Kligman, CTFA(Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association) 가이드라인에 의해 평가

e. 결과 계산: 표 2의 등급 판정기준에 따라 아래의 수학식 2를 이용하여 48시간 및 72시간의 평균 반응도를 비교하였으며, 각 물질에 대한 평균 반응도를 기준으로 하여 그 결과를 판정하였다.

기호	등급	판정기준
+	1	약간의 홍반, 반점 또는 미만성(diffuse)
++	2	증등도의 균일한 홍반
+++	3	부종을 동반한 심한 홍반
++++	4	부종과 소수포를 동반한 심한 홍반

표 3은 산뽕나무 부위별 추출물들의 인체 피부 안전성 임상 시험 결과로서, 부위별 추출물들이 화장품 원료로 사용되었을 때 실제 인체 피부에서의 안전성을 확인하기 위하여 인체 피부 일차 자극시험을 수행한 결과, 줄기 전체 추출물에서는 피시험자 1명으로부터 피부자극이 나타났고, 줄기의 수피 추출물에서는 3명이 피부반응이 나타났으며, 줄기의 심재 추출물에서는 어떠한 피부자극도 나타나지 않았다. 안전성 임상테스트는 임상기관인 더마프로에서 시행되었다.

부위별 추출물	반응자 수	48시간			72시간			반응 등급
		1+	2+	3+	1+	2+	3+	48시간	72시간	평균
줄기 전체	1	0	0	0	1	0	0	0	0.8	0.4
줄기의 수피	3	2	0	0	1	0	0	1.7	0.8	1.3
줄기의 심재	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0

4. 산뽕나무 부위별 추출물들의 유효 활성 성분 함량 비교

4-1. 레스베라트롤 함량 비교

각각의 부위별 추출물들을 250 ppm 농도로 메탄올(MeOH)에 녹인 후, 0.45 ㎛ 주사기 필터(syringe filter)로 여과하여 HPLC 분석을 수행하였다. 분석 장비는 워터스(Waters)사의 HPLC 시스템(USA, Waters 2690 XE)을 이용하였고, 이동상으로 0.5% CH₃COOH를 혼합한 물과 0.5% CH₃COOH를 혼합한 아세토니트릴(acetonitrile)을 사용하였다. 각 부위별 추출물들의 레스베라트롤 함량을 분석하기 위하여 시그마 알드리치에서 표준품을 구입하여 사용하였고, HPLC 분석을 위한 운전 조건 및 이동상(mobile phase) 조건은 각각 표 4 및 표 5와 같다.

컬럼	C18 컬럼 (5 ㎛, 4.6㎜×150㎜)
유속	0.6 ㎖/분
온도	25℃
주입량	10 ㎕
검출	흡광도 308 ㎚(레스베라트롤), 328 ㎚(옥시레스베라트롤)
검출기	광다이오드 어레이(Photodiode array) 검출기

레스베라트롤 분석 이동상 조건			옥시레스베라트롤 분석 이동상 조건
시간(분)	물(%)	아세토니트릴(%)	시간(분)	물(%)	아세토니트릴(%)
0	70	30	0	90	10
15	40	60	40	45	55
18	0	100	50	0	100
21	70	10	55	90	10
25	70	30	60	90	10

도 9 및 도 10은 각각 표준 레스베라트롤 및 산뽕나무 줄기 심재 추출물의 HPLC 크로마토그램으로, 산뽕나무 부위별 추출물들의 레스베라트롤 함량을 상호 비교하기 위하여 HPLC 분석을 실시하고, 시그마 알드리치 공급사로부터 해당 표준품을 구입하여 정량 분석을 수행한 결과, 상기 분석 조건에서 줄기 전체와 줄기의 심재에서 레스베라트롤이 존재함을 확인할 수 있었고, 그 함량을 계산할 수 있었다.

표 6은 산뽕나무 부위별 추출물의 레스베라트롤 함량을 나타낸 것으로, 줄기 심재 추출물에서 레스베라트롤 함량이 가장 높음을 알 수 있었다.

부위별 추출물	레스베라트롤 함량 (레스베라트롤 중량/에탄올 추출물 건조 중량)
줄기 전체	0.035%
줄기의 수피	0%
줄기의 심재	0.614%
뿌리껍질	0%

4-2. 옥시레스베라트롤의 분리 동정 및 함량 비교

옥시레스베라트롤을 포함하는 유효 활성 분획물을 대량으로 얻기 위하여, ODS(octadecyl silane) 컬럼(SunFire^TM prep C18, 19×150㎜, 5 ㎛)이 장착된 Prep-HPLC(Preparative High Performance Liquid Chromatography)를 사용하였고, 20% 내지 55% CH₃CN의 전개용매 조건으로 수행하였다. 화학구조와 분자량 분석에 의한 동정방법은 각각 NMR과 LC/MASS 분석으로 수행하였고, 각각의 부위별 추출물들에 대한 함량 분석은 1,000 ppm 농도로 레스베라트롤의 경우와 같은 조건으로 전처리 후 표 4와 표 5의 조건으로 분석을 수행하였다.

뽕나무과 식물들의 미백 및 항산화 효능에 크게 기여하고 있는 유효 활성 성분인 옥시레스베라트롤은 상용화된 표준품이 없으므로, 본 발명에 따라 산뽕나무 에탄올 추출물들로부터 직접 분리 정제하여 동정한 후 표준품으로 사용하였다. 도 11에서 확인할 수 있듯이 옥시레스베라트롤의 분리 정제는 Prep-HPLC에 의하여 수행하였고, 분획물의 순도 확인은 TLC(Thin Layer Chromatography)에 의하여 수행하였다.

또한, 정제된 분획물(이하 화합물 I 이라고 명칭)이 옥시레스베라트롤과 같은 미백 유효 활성 성분을 포함하고 있는지의 여부를 티로시나아제 활성 억제율 조사로 확인하였다. 그 결과 표 7에서 확인할 수 있듯이, 화합물 I은 알부틴과 코직산에 비하여 매우 높은 미백 활성을 가지고 있음을 알 수 있었다.

추출물	티로시나아제 저해율 (IC50)
화합물 I	1.64 ㎍/㎖
알부틴	132.72 ㎍/㎖
코직산	5.86 ㎍/㎖

따라서, LC/MASS와 NMR 분석을 통하여 화합물 I이 옥시레스베라트롤과 같은 것인지 조사하였다. 표 8과 같은 LC/MASS(waters ZQ 4000) 분석조건으로 화합물 I의 분자량을 확인한 결과, 도 12에서 확인할 수 있듯이 스펙트럼상에서 m/z 242.84은 [M-H]-이온 피크로서 분자량을 244로 추정할 수 있었다.

모세관 전압(㎸)	3.80
콘(Cone) 전압(V)	35.0
소스(Source) 온도(℃)	120
탈용매(Desolvation) 온도(℃)	350
콘 가스 유속(L/Hr)	15
탈용매 가스 유속(L/Hr)	600
주입량(㎕)	20

도 13에 나타난 바와 같이, NMR 스펙트럼의 경우 ¹H-NMR을 확인한 결과,　δ_H 6.29(1H, d), δ_H 7.31(1H, d), δ_H 6.23(2H, dd), δ_H 7.61(1H, d), δ_H 6.42(1H, d), δ_H 6.11(1H, t) ppm에서 나타나는 신호(signal)로 보아 방향족 고리의 수소가 있음이 예상되었고,　δ_H 6.29(1H, d), δ_H 6.23(2H, dd) ppm에서 나타나는 신호가 각각 1개의 프로톤(proton) J=2.1Hz의 더블릿(doublet)으로 나타나 메타 결합(meta coupling)하는 것으로 보아 2개의 OH기가 메타 위치로 방향족 고리(aromatic ring)에 치환되어 있음을 알 수 있었다. δ_H 6.42(2H, d) ppm의 신호 J=2.2HZ로 2개의 프로톤이 더블릿으로　δ_H 6.11(1H, t) ppm의 신호 J=2.2Hz로 1개의 프로톤이 트리플릿(triplet)으로 나타나는 것으로 보아 2개의 OH기가 대칭되게 메타 위치로　치환됨을 예상할 수 있었다. 그리고 δ_H 7.25(1H, d) ppm, δ_H 6.79(1H, d) ppm의 신호 모두 J=16.4Hz로 나타나는 것으로 보아　트랜스 올레핀성 프로톤(trans olefinic proton)이 있음을 예상할 수 있었다.

도 14에 나타난 바와 같이, ¹³C NMR스펙트럼을 통해서는 탄소수가 14개임을 확인할 수 있었고, δ_C 159.57(2개), δ_C 159.26, δ_C 157.35 ppm에서 나타나는 신호로 보아 OH기로 치환된 4개의 탄소가 존재함을 예상할 수 있었고, δ_C 126.4 ppm과 128.3 ppm에서 신호가 나타나는 것으로 올레핀성 탄소가 있음을 예상할 수 있었다.

이상과 같은 정보로 4개의 OH기가 치환된 스틸벤(stilbene) 화합물로 추정할 수 있었다.　표 9에서와 같이 상기 NMR 데이터를 종합하여 문헌(상지의 성분 및 항산화 효과, 중앙대학교 대학원 석사학위 논문, 2002)에 보고된 데이터와 비교한 결과, 화합물 I 을　화학식 1의 구조를 가지는 옥시레스베라트롤로서 동정할 수 있었다.

위치	화합물 I		옥시레스베라트롤
	δ 13C	δ 1H(multi, JHz)	δ 13C	δ 1H(multi, JHz)
1	117.8		116.9
2	157.4		156.3
3	102.2	6.29(1H, d, J=2.1Hz, H-3)	101.6	6.32(1H, d, J=2.1Hz, H-3)
4	159.3		158.2
5	108.3	6.23(1H, dd, J=8.5Hz, J=2.1Hz, H-5)	107.4	6.23(1H, dd, J=8.5Hz, J=2.1Hz, H-5)
6	124.8	7.31(1H, d, J=9.2Hz, H-6)	123.9	7.33(1H, d, J=8.5Hz, H-6)
1`	142.2		141.3
2`	105.6	6.42(1H, d, J=2.2Hz, H-2')	104.7	6.46(1H, d, J=2.1Hz, H-2')
3`	159.6		158.6
4`	103.5	6.11(1H, t, J=2.2 Hz, H-4')	102.6	6.15(1H, t, J=2.1Hz, H-4')
5`	159.6		158.6
6`	105.6	6.42(1H, d, J=2.2Hz, H-6')	104.2	6.34(1H, d, J=2.1Hz, H-6')
a	126.4	7.25(1H, d, J=16.4Hz, H-a)	125.6	7.28(1H, d, J=16.4Hz, H-a)
b	128.3	6.79(1H, d, J=16.4Hz, H-b)	127.4	6.83(1H, d, J=16.4Hz, H-b)

위와 같은 실험결과에서 얻어진 화합물 I을　옥시레스베라트롤의 표준품으로서 사용하여 산뽕나무의 부위별 추출물들에서 옥시레스베라트롤 함량을 서로 비교 조사할 수 있었다. 표 4와 표 5의 HPLC 분석 조건을 사용하여 산뽕나무의 부위별 추출물들의 옥시레스베라트롤 함량을 정량적으로 조사하였다. 분석 결과 도 15, 도 16 및 표 10에서 확인할 수 있듯이, 부위별 추출물 희석농도가 1,000 ppm일 때,　줄 기의 심재 추출물에서 80%(옥시레스베라트롤 중량/에탄올 추출물 건조 중량) 함량으로 옥시레스베라트롤이 가장 높게 존재하는 것으로 나타났다.

추출물	화합물 I 함량 (화합물 I 중량/에탄올 추출물 건조 중량)
줄기 전체	30.50%
줄기의 수피	2.20%
줄기의 심재	80.76%
뿌리껍질	1.15%

5. 기존 상백피 추출물과 본 발명에 따른 산뽕나무 부위별 추출물의 미백 효과 비교

표 11은 산뽕나무의 뿌리 껍질 추출물과 줄기 심재 추출물의 미백 효능을 좀 더 정확히 비교하기 위하여 서로 다른 7 개체(A ~ G)의 산뽕나무와 재배되고 있는 뽕나무 그리고 국내 화장품 원료 생산업체인 B사의 상백피 추출물 원료를 대상으로 티로시나아제 활성 저해효과를 비교한 것이다. 모든 산뽕나무 개체들에서 줄기 심재 추출물들은 뿌리껍질 추출물들보다 티로시나아제 저해 활성이 높은 것으로 나타났고, 또한 재배되고 있는 뽕나무의 상백피 추출물 및 화장품 미백 원료로 시판되고 있는 B사의 상백피 추출물 원료들과 비교하여도 더 높은 미백 효능을 갖는 것으로 조사되었다.

추출물 종류	티로시나아제 저해농도(IC50)
	줄기 심재 추출물	뿌리 껍질 추출물
A	1.5	25.59
B	7.2	11.96
C	2	11.38
D	6.65	11.37
E	2	12.92
F	2.17	7.84
G	9.84	11.62
국내 화장품 원료회사 B사의 상백피 추출물		110.17
재배되고 있는 뽕나무의 뿌리껍질(상백피) 추출물		23.7
알부틴 (양성 대조구)	150.05

표 12는 미백 작용의 주 효능 물질로 결론된 화합물 I의 함량을 조사함으로써 위의 결과를 확인한 것이다. 역시, 모든 개체의 산뽕나무 줄기 심재 추출물들에서 뿌리껍질 추출물 및 기존의 상백피 추출물들보다 더 높은 화합물 I의 함량을 갖는 것으로 분석되었다.

추출물 종류	화합물 I 함량 　　(화합물 I 중량/에탄올 추출물 건조 중량)
	줄기 심재 추출물	뿌리 껍질 추출물
A	91.20%	0.80%
B	29.10%	5.37%
C	70.40%	0.80%
D	31.70%	0.93%
E	26.90%	7.32%
F	67.10%	0.86%
G	20.30%	0.82%
국내 화장품 원료회사 B사의 상백피 추출물		0.86%
재배되고 있는 뽕나무의 뿌리껍질(상백피) 추출물		0%

[실시예]

산뽕나무 심재 추출물을 함유하는 화장료 조성물

1. 유연 화장수 (스킨) 제조

산뽕나무 심재 추출물 2.0 중량%, 글리세린 7.0 중량%, 1,3-부틸렌글리콜 4.0 중량%, 히아루론산 0.2 중량%, 알란토인 0.1 중량%, DL-판테놀 0.1 중량%, EDTA-2Na 0.02 중량%, 에탄올 5.0 중량%, 폴리솔베이트 20 0.4 중량%, 옥틸도데세스-16 0.6 중량%, 파라옥시안식향산에스텔 0.2 중량%, 녹차추출물 0.2 중량%, 황금추출물 0.2 중량%, 젖산 0.2 중량%, 소듐락테이트 0.2 중량% 및 미량의 색소, 향과 잔량의 정제수를 혼합하여 산뽕나무 심재 추출물을 함유하는 유연 화장수를 제조하였다.

2. 영양 크림의 제조

산뽕나무 심재 추출물 6.0 중량%, 밀납 0.7중량%, 세토스테아릴알코올 1.2 중량%, 글리세릴모노스테아레이트 1.1 중량%, 마이크로크리스탈린납 0.8 중량%, 폴리옥시에틸렌소르비탄트리이소스테아레이트(20,E.O) 1.1 중량%, 싸이클로메티콘 1.0 중량%, 디메티콘 0.3 중량%, 호호바유 1.0 중량%, 스쿠알란 2.0 중량%, 옥틸도데칸올 2.0 중량%, 유동 파라핀 3.0 중량%, 글리세린 3.0 중량%, 1,3-부틸렌 글리콜 3.0 중량%, 카버모 940 0.08 중량%, 녹차추출물 1.0 중량%, 황금추출물 0.2 중량%, 젖산 0.25 중량%, 소듐락테이트 0.2 중량% 및 미량의 색소, 향과 잔량의 정제수를 혼합하여 산뽕나무 심재 추출물을 함유하는 영양 크림을 제조하였다.

3. 영양 로션의 제조

산뽕나무 심재 추출물 6.0 중량%, 밀납 0.2 중량%, 세토스테아릴알코올 0.3 중량%, 글리세릴모노스테아레이트 0.5 중량%, 마이크로크리스탈린납 0.4 중량%, 폴리옥시에틸렌소르비탄트리이소스테아레이트(20,E.O) 1.1 중량%, 싸이클로메티콘 1.0 중량%, 디메티콘 0.3 중량%, 호호바유 0.5 중량%, 스쿠알란 2.0 중량%, 유동 파라핀 3.0 중량%, 글리세린 3.0 중량%, 1,3-부틸렌 글리콜 3.0 중량%, 카버모 940 0.08 중량%, 녹차추출물 1.0 중량%, 황금추출물 0.2 중량%, 젖산 0.25 중량%, 소듐락테이트 0.2 중량% 및 미량의 색소, 향과 잔량의 정제수를 혼합하여 산뽕나무 심재 추출물을 함유하는 영양 로션을 제조하였다.

결론적으로, 본 발명에서는 제주도에서 자생하는 산뽕나무를 대상으로 기능성 화장품 원료 탐색의 일환으로, 부위별 추출물을 이용하여 미백, 항산화 효능을 조사하고, 유효 활성성분인 레스베라트롤과 옥시레스베라트롤의 함량을 비교하였으며, 사용된 부위는 산뽕나무의 세지가 제외된 중간크기의 줄기를 이용하여 줄기전체, 줄기의 수피, 줄기의 심재로 구분하였고, 그 외의 부위로 뿌리껍질을 이용하여 그 활성을 비교하였으며, 그 결과는 다음과 같다.

첫째, 산뽕나무 각 부위별 추출물들의 티로시나아제 저해　활성을 비교한 결과, 줄기 심재 추출물(IC₅₀: 1.45 ㎍/㎖)의 경우 알부틴(IC₅₀: 132.75 ㎍/㎖) 및 코직산(IC₅₀: 5.86 ㎍/㎖)과 비교하여 각각 90배와 4배 더 높은 저해 효과를 나타내었고,

둘째, B16-F1 세포배양 시스템에서의　멜라닌 합성 저해를 비교한 결과, 줄기 심재 추출물(IC₅₀: 1.33 ㎍/㎖)의 경우 알부틴(IC₅₀: 104.09 ㎍/㎖)과 비교하여 약 80배 더 높은 저해효과를 나타내었으며,

셋째, 항산화 효과를 확인한 결과, 줄기 심재 추출물은 비타민 C와 유사한 항산화 효과를 나타내었고,

넷째, 인체 피부 일차 자극 평가 시험 결과, 줄기 심재 추출물의 경우 어떠한 피부반응도 보이지 않았으며,

다섯째, 줄기 심재 추출물에서 활성 성분인 화합물 I을 분리 정제하여 화학구조를 동정한 결과 옥시레스베라트롤로 동정되었고,

여섯째, 레스베라트롤과 옥시레스베라트롤이 산뽕나무 줄기 심재 추출물의 미백 및 항산화 효과의 주요 활성 성분임을　 확인하였으며, 산뽕나무 줄기 전체, 줄기수피, 뿌리껍질보다 레스베라트롤과 옥시레스베라트롤을 가장 많이 함유하고 있는 줄기 심재 부위가 활성이 가장 높음을 확인하였다.

이상의 결과에서 줄기의 심재 추출물이 다른 부위별 추출물과 비교하여 미백 및 항산화 활성이 더 우수하였던 것은, 높은 함량으로 존재하는 레스베라트롤 및 옥시레스베라트롤과 연관성이 있음을 확인할 수 있었다. 따라서, 미백 및 항노화 기능성 화장품 원료로서 산뽕나무의 줄기 심재 추출물은 다른 부위의 추출물들보다 우수한 장점들을 가지고 있으며, 원료화에 유리할 수 있다.

본 발명은 제주도에서 자생하는 산뽕나무의 줄기 심재 추출물을 이용하여 미백 및 항산화 효능이 우수한 화장료 조성물을 제공하며, 특히 생태학적인 측면에서 산뽕나무의 생육상태에 해로운 영향을 주지 않기 위하여 세지가 제외된 중간 크기의 줄기 심재 부분만을 화장품 원료화에 사용하였으며, 인체 피부자극을 나타내었던 껍질부분을 제외함으로써 화장품 원료의 중요한 조건인 안전성을 확보할 수 있다.

또한, 기존의 뽕나무과 식물의 원료였던 상백피를 포함하는 여러 부위별 추출물들에 대한 미백 및 항산화 효능을 비교한 결과 산뽕나무의 줄기 심재 추출물에서 가장 우수한 효능이 나타났고, 이러한 효능에 유효 활성성분으로 밝혀져 온 레스베라트롤과 옥시레스베라트롤의 함량도 줄기 심재 추출물에서 월등히 높게 존재하며, 따라서 미백 및 항노화 기능성 화장품 원료로서 산뽕나무의 줄기 심재 추출물은 다른 부위의 추출물들보다 우수한 효능을 가지고 있으며, 동시에 인체 피부 안전성의 장점들을 가지고 있으므로, 화장품 원료로서 기존의 상백피 추출물보다 유리하다.

Claims (5)

1. 삭제
2. 산뽕나무의 줄기 심재 추출물을 포함하는 화장료 조성물.
3. 제2항에 있어서, 산뽕나무의 줄기 심재 추출물이 유효활성 성분으로서 옥시레스베라트롤을 전체 추출물 중량 대비 20 내지 95 중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
4. 제2항에 있어서, 상기 산뽕나무의 줄기 심재 추출물이 조성물 전체 중량 대비 0.01 내지 30 중량% 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
5. 제2항에 있어서, 상기 화장료 조성물이 미백 및 항노화 화장품인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.

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