KR100914963B1

KR100914963B1 - 백지, 오매, 반하 및 류기노 추출물를 함유하는 미백화장료 조성물

Info

Publication number: KR100914963B1
Application number: KR1020090036688A
Authority: KR
Inventors: 김기호; 김영희; 박선희; 김현미; 이수연; 박선기; 오선택; 금종필
Original assignee: 주식회사 바이오랜드; 주식회사 코스메카코리아
Priority date: 2009-04-27
Filing date: 2009-04-27
Publication date: 2009-09-02

Abstract

본 발명은 미백 효과를 지닌 새로운 천연식물 혼합 추출물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 백지, 오매, 반하 및 류기노 혼합추출물을 함유하는 미백화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 추출물은 멜라닌 생합성 과정에 핵심적으로 작용하는 효소인 티로시나제 활성을 효과적으로 저해하고, B16 멜라노마 세포의 멜라닌의 생합성을 억제하였으며, 제형에 혼합하였을 때 임상시험에서 우수한 미백효과를 나타내었다. 따라서, 본 발명의 추출물은 미백용 화장료 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

백지, 오매, 반하 및 류기노 추출물를 함유하는 미백화장료 조성물 {Composition for skin whitening comprising the extract of Angelica dahurica, Prunus mume, Pinellia ternata, and Artemisiae Anomalae}

사람의 피부색은 멜라닌, 카로틴 및 헤모글로빈의 양에 따라 결정되어 지는데 이중 멜라닌이 가장 결정적인 요소이다. 멜라닌은 피부(표피)내 기저층에 존재하는 색소세포인 멜라노사이트(melanocyte)에서 합성되며 주변 각질세포(Keratinocyte)로 전이되어 사람의 피부색을 나타낸다. 멜라닌이 비정상적으로 적게 생산되면 백반증(Vitiligo)과 같은 피부 병변이 유발된다. 반대로 과잉 생산은 중년 여성들의 주요 고민중 하나인 기미, 주근깨를 형성하며 또한 피부암(Melanoma)과도 밀접한 관계가 있다.

미백 작용을 더욱 자세히 설명하면 다음과 같다. 멜라닌은 피부 표피의 기저층에 존재하는 멜라노사이트라는 세포에서 티로신(Tyrosine)이 효소 및 비효소적 산화반응을 거쳐 생성되며, 표피를 구성하고 있는 각질세포로 전이된다. 멜라닌의 생합성에 관여하는 중요한 효소로는 티로시나제(Tyrosinase), 티로시나제 관련 프로테인 1(Tyrosinase-Related protein 1) 및 도파크롬 토토머라제(dopachrome tautomerase)가 있다. 티로시나제 외의 이 두 효소는 주목을 끌고 있으나 멜라닌 합성에 결정적인 역할을 하는 효소는 티로시나제이다. 멜라닌의 생합성 첫단계는 티로시나제에 의하여 유발된다. 티로시나제에 의해 티로신이 도파(Dopa)로 되고, 이 도파(Dopa)를 도파퀴논(Dopa-quinone)으로 만든다. 이 두 반응의 다음단계 과정들은 비효소적인 반응에 의해서도 가능한 것으로 알려져 있으며 티로시나제 단독으로도 멜라닌 생성이 가능하다고 알려져 있다.

최근에는 피부 세포내의 신호 전달물질의 발현에 따른 멜라닌 형성과정에 대한 새로운 이론이 제시되고 있다. 피부가 자외선에 노출되면 염증을 유발시키는 인터루킨-알파(Interlukin-)가 상피(Epidermis)내에 있는 케라티노사이트(Keratinocyte)로부터 발현되고, 이 인터루킨-알파가 케라티노사이트 엔도셀린(Endothelin)발현을 촉진시킨다. 이러한 일련의 과정이 멜라노사이트의 형성을 증가시키고 멜라노사이트를 활성화시킨다. 이렇게 형성된 멜라노사이트내 멜라노좀에서 티로신이 티로시나제에 의해 멜라닌이 형성된다.

또, NF-κB는 여러 가지 자극에 대해 응답적으로 활성화되어, 면역이나 증식, 염증 등에 관하여 여러 가지 유전자의 발현을 높여준다. NF-κB의 과잉 활성화가 암이나 류마티스, 건선 등과 관계있다는 것이 보고되어, 현재 세계적으로 NF-κB의 억제제 개발이 이루어지고 있다. NF-κB는 피부의 표피각화세포나 진피 섬유아세포에도 존재하고, 자외선이나 염증 등의 자극에 의해 NF-κB가 과잉으로 활성화, 전사활성이 항진하는 것으로 확인되고 있다. NF-κB의 과잉활성화는 세포에서의 염증성 cytokine의 생성시키고 그 cytokine 에 의해 더욱 NF-κB의 발현이 일어난다. 또한, 세포증식인자인 bFGF(basic fibroblast growth factor)나 세포외 매트릭스 분해효소 MMP-1의 신생을 항진하여 표피각화세포의 과증식이나 각화이상에 의한 표피의 비후, 멜라노사이트의 증식에 의한 색소 침착, MMP-1의 진피 콜라겐 분해에 의한 피부 탄력의 저하 등을 일으키고 피부의 광노화와 관계있다. 피부의 멜라닌 세포닌 색소를 만드는 표피 멜라노사이트는 자외선이나 만성적인 염증 등으로 증가하여, 그것이 피부에 있어서 멜라닌 생성량의 증대로 이어진다.

NF-κB는 염증시에 표피 각화세포에서 과잉 발현하고 멜라닌 세포증식작용이 있는 bFGF의 표피 각화세포에서의 생성을 촉진한다. 즉, NF-κB의 작용을 억제하는 물질은, 염증이나 자외선에 의한 기미나 주근깨 등의 색소침착을 막는 효과를 나타낸다.

이미 아스코르빈산(특개평 4-9320), 하이드로퀴논(특개평 6-192062), 코직산(특개 56-7710), 알부틴(특개평 4-9315) 및 일부의 화합물들이 티로시나제 저해 활성을 가지고 있어 미백 화장료의 원료로 이용되고 있으나, 처방계 중에서의 안정성이 떨어져 분해되어 착색되거나, 이취의 발생, 생체 레벨에서의 효능, 효과의 불분명 및 안전성 문제 등으로 그 사용이 제한되고 있는 실정이다. 그리고 티로시나제의 억제 효과는 입증되었으나, 실제 생체 레벨과 유사한 실험에서는 그 효과가 낮게 나타난다. 따라서 생체레벨과 유사한 멜라노마 세포 배양에 의한 저해 효과가 요구되고 있는 실정이다. 또한 하이드로퀴논은 발암성 물질로 규정되어 사용이 금지되고 있다. 코직산과 아스코르빈산은 매우 불안정한 물질이다. 소량 함유한 화장료를 실온에서 수주일동안 보관하면 갈변 현상이 발생한다. 식물성 천연물들은 안전성이 뛰어날 뿐만 아니라 여러 가지 유익한 성분들을 가지고 있어 미백 물질의 좋은 검색대상이 되고 있다.

오래전부터 멜라닌 생성을 억제하여 미백 효과 기능을 지닌 기존원료가 갖는 문제점을 해결하기 위해서 한방제로 사용되고 있는 생약, 야채, 과일, 꽃 등의 안전성이 뛰어난 식물추출물로부터 비정상적인 멜라닌 생성을 억제할 수 있는 여러 가지 효과를 가진 추출물을 찾고자 하는 노력이 있어 왔다.

본 발명자들은 피부 미백 및 개선에 효능이 있는 물질을 찾고자 자연의 여러 가지 천연물질들 중에서 피부 미백에 유효한 물질을 스크리닝한 결과, 백지, 오매, 반하 및 류기노의 혼합 추출물이 매우 우수한 피부 미백 효능을 나타냄을 발견하였고 이에 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 멜라노사이트를 자극하는 원인 중 하나인 자외선에 의해 생성되는 활성산소를 소거하여 멜라노사이트의 자극을 억제하고, 표피 멜라노사이트의 과다 증식작용을 억제하며, 멜라닌 생성을 억제함으로서 우수한 피부 미백효과를 갖고, 안전성에 문제가 없는 식물성 천연 추출물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 이러한 효능을 갖는 추출물을 기존 제형에 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 이러한 견지에서, 본 발명자들은 피부 미백효과가 있는 근본적 물질을 찾고자하여 자연의 여러 가지 천연물들 중에서 미백에 유효한 물질을 검색한 결과, 백지, 오매, 반하, 류기노 혼합추출물(이하 면백여옥고)이 우수한 미백효과를 나타냄을 발견하였으며 안정성 문제를 동시에 해결하였다.

또한 화장료 조성물에서 면백여옥고를 일정농도 이상 배합하여 사람 피부에 직접 도포한 실험 결과에서도 뚜렷한 미백 효과를 발휘하게 됨을 발견하게 되었다. 본 발명은 비정상적인 멜라닌 형성을 근본적으로 막을 수 있는 면백여옥고를 함유하는 미백 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 백지, 오매, 반하 및 류기노의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

백지(Angelica dahurica Bent. et Hooker)는 굼배지, 암굼배지, 용소대, 퉁소대라고도 불리는 구리때의 뿌리로 높이 1~1.5m 되는 여러해살이풀이다. 잎은 2~3번 3개씩 갈라진 깃엽인데 쪽잎은 달걀모양이다. 여름철에 흰색의 작은 꽃이 가지 끝에 모여 핀다. 열매는 작은 타원형인데 날개가 발달하였다. 각지 특히 북부의 산꼴짜기, 개울가의 습한 곳에서 자란다. 백지는 가을에 꽃대가 나오지 않은 어린 식물의 뿌리를 캐어 겉껍질을 벗기고 햇볕에 말린다. 뿌리에 0.3~0.9%의 쿠마린이 들어 있으며, 정유함량은 0.2%이상 함유되어 있다. 백지는 동의치료에서 진정약, 아픔멎이약, 피멎이약, 정혈약으로 감기, 머리아픔, 안면신경아픔, 이쑤심에 쓴다. 또한, 산후에 통경약으로 쓰며 류머티즘과 척수신경근염에도 쓴다. (약초의 성분과 이용, p 513~514, 최옥자, 일월서각).

오매(Prunus mume Sieb. et Zucc)는 매화나무의 선열매로 열맷살을 벗겨 그을음이 섞인 연기에 그을려 말린것이다. 매화나무는 잎지는 작은 큰키나무로 달걀모양의 잎이 어긋나게 붙으며 이른 봄 잎이 나기전에 흰색 또는 붉은색 꽃이 핀다. 열매는 둥글고 여물면 노란색을 띤다. 열매는 둥글고 여물면 노란색을 띤다. 선열매는 레몬산의 원료로도 쓰인다. 오매는 동의치료에서 청량성 수렴약, 설사멎이약, 열내림약, 기침약, 가래약으로 쓴다. 주로 배아픔, 게우기, 설사 등에 쓴다. (약초의 성분과 이용, p 358, 최옥자, 일월서각).

반하(Pinellia ternata Breit)는 끼무릇의 덩이줄기로 이 덩이줄기를 캐어 물에 씻고 잔뿌리와 겉껍질을 벗겨 햇볕에 말린다. 초여름에 잎이 스러지므로 반하라 한다. 덩이줄기에는 에테르엑스 약1%, 글루쿠론산, 정유, 콜린, 아스파라긴산, 아르기닌, 리진, 오르니틴, 세린, 글리신, 포도당 등이 함유되어 있다. 동의치료에서는 예로부터 게우는 것을 멈추는 약으로 중요하게 써왔으며, 급성 위염, 잠을 이루지 못할 때에 쓴다. 민간에서는 신선한 덩이줄기와 생강을 짓찧어 즙을 탈모증에 바른다.

류기노(Artemisiae Anomalae)는 국화과(Compositae)에 속한 여러 해 살이 풀인 기호(奇蒿) Artemisia anomala S. Moore.의 전초(全草)를 건조한 것으로, 8～9월에 채취하여 햇볕에 말린다. 줄기의 길이는 60~90cm, 구부러졌고 지름은 2~3mm이다. 줄기의 바깥면은 황갈색~다갈색이고 가늘고 연한 흰털로 덮였고 질은 단단하며 끊은 면은 섬유질이고 황백색, 가운데 부분은 희고 연하다. 잎은 어긋나고 시들어서 오그라져 있거나 떨어졌고 앞면은 어두운 갈색, 뒷면은 회록색이고 흰털이 밀생하며 질은 부서지기 쉽고 찢어지거나 떨어지기 쉽다. 꽃이삭은 줄기 끝에 달리고 어두운 황색이다. 방향이 있고 맛은 덤덤하다. 성은 따뜻하고 독이 없으며 맛은 쓰다. 산후어조복통(産後瘀阻腹痛), 징가비괴, 소복동통(小腹疼痛), 월경부조, 질타손상(跌打損傷)에 사용한다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 추출물은 종래 알려진 어떠한 추출방법으로 추출될 수도 있으나, 바람직하게는 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올, 아세톤, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜 및 글리세린으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매로 추출된 것을 특징으로 한다. 이들은 친수성 유기용매로서 친수성 알콜기(OH)나 케톤기(COC)을 가지고 있어서 유사한 극성을 나타내므로 용질에 대한 비슷한 추출활성을 나타낼 수 있다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 추출물은 친수성 유기용매로 추출한 후 추가적으로 핵산, 클로로포름, 에틸아세테이트 등의 유기용매로 분획할 수 있는며, 또한, 상기 유기용매로 분획한 후 각종 크로마토그래피로 정제될 수도 있다.

본 발명을 좀 더 상세히 설명하면 다음과 같다. 건조된 백지, 오매, 반하, 류기노를 추출 용매로서 증류수, 에탄올, 메탄올, 함수 부틸렌글리콜, 함수 프로필렌글리콜, 함수 글리세린으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나이상의 용매를 5-10배 부피량을 가한다. 추출 방법으로는 냉각 콘덴서가 장치되어 용매가 증발되는 것을 방지한 상태에서 50-100 ℃, 2-20시간 가열하여 추출하거나 5-37℃에서 1-15일간 침적시켜 유효성분을 추출하는 방법을 사용할 수 있다. 이렇게 추출한 면백여옥고를 냉각 콘덴서가 달린 증류장치를 이용하여 증발되어 나오는 용매를 회수하면서 완전히 감압 농축한 후 그 건조중량으로서 0.001-10%, 바람직하게는 0.01-5%의 양으로 화장료에 첨가하는 것이다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 추출물은 어떤 혼합비로도 추출될 수 있으나, 바람직하게는 백지 : 오매 : 반하 : 류기노를 1 ~ 25 : 0.5~7 : 0.01~2 : 0.5~5 의 혼합 중량비율로 추출된 것임을 특징으로 한다. 본 발명의 실시예에서는 구체적으로 백지 : 오매 : 반하 : 류기노를 25 : 6 : 1.5 : 5 의 혼합 비율로 추출된 것을 사용하였다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 조성물은 티로시나아제의 활성 또는 멜라닌의 생성을 억제함으로써 피부 미백 효과를 갖는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 실험예에서는 본 발명의 혼합 추출물의 티로시나아제 활성 저해 효과 및 멜라닌 생성 억제 효과를 실험적으로 증명하였다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 조성물은 화장수(스킨로션), 로션, 크림, 마사지 크림, 에센스, 팩의 제형을 갖는 것을 특징으로 한다. 상기 제형들은 당업계에 종래 알려진 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 또한, 상기 제형내 추출물의 함량도 당업계에 종래 알려진 미백성분의 함량 범위내(약 1-10 중량%)에서 포함될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함한다.

도 1은 본 발명에 따른 시험예 1의 피부 명암 측정 결과를 나타낸 사진들이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

[실시예 1 ] 면백여옥고의 제조

건조된 백지 250g, 오매 60g, 반하 15g, 류기노 50g을 증류수 2.0kg에 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기를 사용하여 70℃에서 3시간 가온하여 추출한 후 400 메쉬 여과포로 여과하고 상온으로 냉각한 후 5-15℃에서 7일간 방치하여 숙성시킨 후 0.45 필터로 여과하였다. 여액을 감압회전증발기에서 용매를 완전히 제거하여 20.6 g 의 추출물을 얻었다.

[실시예 2-10 ] 면백여옥고의 제조

용매로서 물대신에 아래 표의 용매를 사용한것만 제외하고, 실시예 1과 동일한 방법을 사용하여 실시예 2 내지 10의 추출물을 얻었다.

	용매	수득량 (g)
실시예 2.	함수 부틸렌글리콜 (30 w/w%)	21.3
실시예 3.	함수 프로필렌글리콜 (30 w/w%)	22.5
실시예 4.	함수 에탄올 (30 w/w%)	25.2
실시예 5.	함수 에탄올 (70 w/w%)	23.3
실시예 6.	에탄올	22.9
실시예 7.	메탄올	21.5
실시예 8.	부틸렌글리콜	18.7
실시예 9.	프로필렌글리콜	17.3
실시예 10.	글리세린	19.4

[비교예 1-4 ]

식물재료로서 4가지의 혼합물대신에 아래 표의 식물재료를 사용한것만 제외하고, 실시예 1과 동일한 방법을 사용하여 비교예 1 내지 4의 추출물을 얻었다.

	식물재료	수득량 (g)
비교예 1.	백지 250g	10.3
비교예 2.	백지 250g, 오매 60g	13.2
비교예 3.	백지 250g, 반하 15g	11.1
비교예 4.	백지 250g, 류기노 50g	12.3

실험예 1. 면백여옥고의 세포독성 측정

면백여옥고에 대하여 단층 세포 배양에서의 세포독성을 측정 하였다.

실험 방법

MTT assay는 살아있는 세포의 수를 측정함으로서 세포 증식이나 독성에 많이 사용되는 실험법으로 살아있는 세포는 미토콘드리아내에서 수용성이고 노란색의 염인 MTT(3-[4,5- dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide)가 숙신산탈수소효소(succinate dehydrogenase 또는 mitochondrial dehydrogenase라고도 불림 )에 의해 수불용성인 파란색의 formazan 유도체로 환원되는 원리를 이용하는 것이다. 생성된 formazan 유도체는 용해제(보통 dimethylsulfoxide 사용)를 넣고 용해시킨 후 흡광도를 측정한다. 좀 더 자세히 설명하면, human fibroblasts cell line (ATCC, CRL-2310)을 1x10⁵cells/ml의 농도로 하여 24well plate에 접종하였다. 배지는 소혈청 10%를 함유한 DMEM (Dubelcco'S Modified Eagle Medium, BRL, USA)를 사용하였다. 접종 후 24시간 후 소혈청 2%를 함유한 DMEM (Dubelcco'S Modified Eagle Medium, BRL, USA)를 교체하고, 시험 시료(실시예 1-10)를 50㎍/㎖의 농도로 10㎕ 첨가 한 후 3일 동안 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 배양이 끝난 후 상등액을 제거 하고 다시 5% PBS(phosphate buffered saline) 200ul씩을 가하여 세척하고 MTT 용액을 well당 1.0㎖씩 가한 후 4시간 후에 MTT를 제거하고 DMSO를 well당 1.0㎖씩 가한 후 하룻밤 37℃에서 인큐베이션 후 570nm에서 흡광도를 측정 하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.

[표 1] 면백여옥고의 단층 세포배양에서의 세포독성

실시예	세포 생존율(%)
실시예 1	101.2
실시예 2	102.5
실시예 3	100.9
실시예 4	103.2
실시예 5	104.7
실시예 6	100.7
실시예 7	101.9
실시예 8	101.4
실시예 9	100.2
실시예 10	103.1

실험예 2. 면백여옥고의 프리라디칼(free radical) 소거능 실험

상기 면백여옥고에 대하여, 박의 방법(Park, S. N, 대한화장품학회지, 23(1), pp75-132, 1997)을 따라 DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical)을 사용하여 프리라디칼 소거 효과를 측정하였다. 0.2 mM 의 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 용액 1 ㎖ 에 시험 시료를 각 농도별로 2 ㎖ 을 첨가하고, 상온에서 10 분간 반응 시킨 후, 520 nm 에서 흡광도를 측정하여 프리라디칼 소거효과(%)를 구하였다. 이 때 대조군은 DPPH 대신 메탄올을 사용하며, 실험군과 동일한 농도의 면백여옥고 2 ㎖을 첨가하였다. 또한, 프리라디칼 소거능의 양성 대조군으로는 프리라디칼 소거능이 뛰어난 플라보노이드 성분을 다량 함유하고 있는 녹차 추출물과 비교하였다. 프리라디칼 소거활성 SC₅₀ 은 프리라디칼을 50% 소거하는데 요구되는 면백여옥고의 농도(㎍/㎖) 로써 표시하였다.

하기 표 2의 결과를 보면, 실시예의 면백여옥고는 녹차 추출물의 프리라디칼 소거능보다 비교하여 볼때, 유사하거나 또는 더 낮은 농도에서 SC₅₀ 농도를 나타내어 프리라디칼 소거능이 뛰어남을 확인할 수 있었다.

[표 2] 면백여옥고의 프리라디칼 소거 효과

실 시 예	SC₅₀(㎍/㎖)
실시예 1	62
실시예 2	48
실시예 3	56
실시예 4	53
실시예 5	58
실시예 6	51
실시예 7	56
실시예 8	63
실시예 9	61
실시예 10	50
녹차추출물	49

실험예 3. 면백여옥고의 멜라노사이트 증식억제 효과

상기 면백여옥고에 대하여 NF-κB의 과잉 발현 억제에 의한 멜라노사이트 증식억제 효과를 측정하였다. 사람표피각화세포는 무혈청 배지 EpiLife-KG2 를 이용하여 12well plate에 접종하고 5% CO₂, 37℃에서 24시간 배양하였다. p65 유전자를 발현하는 pCMV-p65 벡터를 Fugene-6 transfection 시약(Roche Diagnostics)을 이용하여 도입하고, 세포가 활성형 NF-κB를 과잉 발현되도록 하였다. 24시간 배양 후, 새 배지로 교환하고 시험 시료(실시예 및 비교예)를 최종 농도가 50㎍/㎖와 100㎍/㎖가 되도록 첨가 한 다음 48시간 배양한 다음 배양 상층액을 회수하였다. 사람 표피 멜라노사이트는 저혈청 배지 Medium154S를 이용하여 24well plate에 접종하고 5% CO₂, 37℃에서 24시간 배양하였다. 배양 후 증식 촉진제를 첨가하지 않은 Medium154S와 회수한 배양상층액을 1:4로 혼합한 배지와 교환하고 72시간 배양하였다. 배양이 끝난 후 세포를 회수하고 헤모사이토미터를 이용하여 세포수를 세었다.

결과는 하기 표 3에 나타내었다. NF-κB를 과잉 발현한 표피각화세포의 배양 상층액을 첨가하고 면백여옥고를 넣지 않은 대조군에서는 표피 멜라닌 세포의 증식이 촉진되었다. 반면, 면백여옥고을 적용한 후 배양한 표피 각화세포의 배양 상층액으로 배양한 군에서는 표피 멜라노사이트 증식 작용이 억제 됨을 보여주었다. 또한, 실시예 1-10의 면백여옥고가 4가지 성분 모두를 가지고 있지 않은 비교예들보다 약 2배이상 표피 멜라노사이트 증식 억제율이 증가된 것을 확인하였다. 이로 볼때 본 발명의 면백여옥고가 자외선이나 염증 반응시 증가하여 표피 각화세포에서 과발현을 보임으로 멜라노사이트의 증식을 촉진하고 이에 따라 멜라닌도 다량 생성되는 것을 효과적으로 억제하여 우수한 미백효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다. [표 3] 면백여옥고의 표피 멜라노사이트 증식 억제 효과

시 료	억제율(%)
시 료	50 ㎍/㎖	100 ㎍/㎖
실시예 1.	35.8	51.2
실시예 2.	47.9	57.6
실시예 3.	43.2	50.3
실시예 4.	44.8	51.3
실시예 5.	39.9	47.6
실시예 6.	35.1	44.8
실시예 7.	36.3	46.1
실시예 8.	38.9	48.5
실시예 9.	49.9	49.0
실시예 10.	32.8	39.5
비교예 1.	13.6	18.4
비교예 2.	19.3	20.1
비교예 3.	16.4	21.5
비교예 4.	21.7	25.9

실험예 4. 면백여옥고의 세포내 티로시나제 활성 저해 효과

상기 면백여옥고에 대하여 티로시나제의 저해활성을 측정하였다. 모든 농도에 따른 웰 수는 3배수로 준비하였다. B16 멜라노마 세포(ATCC CRL6323)를 10% 소혈청과 1%의 항생제를 첨가한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's Medium)에 1x10⁵ 세포의 밀도로 접종하고 하루 동안 5% CO₂, 37℃에서 배양시켰다. 그 후 α-MSH(melanocyte stimulating hormone; 멜라닌세포자극호르몬, 0.34 ug/mL, Sigma)가 처리된 DMEM 10% 배지로 갈아준 후 시료들을 최종 농도가 50㎍/㎖와 100㎍/㎖가 되도록 웰에 처리하여 3일간 배양하였다. 배지를 제거하고 세포들은 트립신을 처리하여 떼어낸 후 1.5mL 튜브에 넣어 12,000rpm에서 5분간 원심분리 하여 상층액을 버리고 PBS로 2회 세척한다. 세포 침전물에 1% 트리톤 X-100과 2mM PMSF(Phenylmethylsulfonyl Fluoride; 단백질 분해 억제제)가 포함된 80mM 포타슘 포스페이트 완충용액(pH6.8) 1mL를 첨가하여 얼음 속에서 20분간 진탕혼합하여 4℃에서 1시간 동안 방치한다. 그 후 4℃, 20분, 12,000rpm에서 원심분리하여 상층액을 모은다. 상층액 0.3mL와 1.5mM 티로신 0.3mL를 37℃에서 3시간 반응시킨다. 강하게 진탕혼합하여 475nm에서 흡광도를 측정하였다. 상층액의 단백질 정량은 Bio-rad 단백질 정량 프로토콜에 따라 분석하였으며, 생성된 멜라닌의 흡광도를 단백질 량으로 나누어 주었다. 대조군으로 사용된 상백피 추출물은 좋은 티로시나제 활성 저해 효능을 가지고 있어 화장품 원료로 널리 사용되고 있는 물질이다.

티로시나제 활성 억제율(%) = [(A-B)/A]x100

A : 시료를 첨가하지 않은 반응용액의 475nm에서 흡광도

B : 시료를 첨가한 반응용액의 475nm에서 흡광도

실험결과는 하기 표 4에 나타내었다. 면백여옥고를 적용한 경우 상백피 추출물과 유사하게 티로시나제 활성이 현저히 저해되었음을 알 수 있었다. 또한, 실시예 1-10의 면백여옥고가 4가지 성분 모두를 가지고 있지 않은 비교예들보다 약 2배이상 티로시나제 저해율이 증가된 것을 확인하였다.

[표 4] 면백여옥고의 티로시나제 활성 저해 효과

시 료	티로시나제 저해율(%)
시 료	50 ㎍/㎖	100 ㎍/㎖
실시예 1.	21.7	34.5
실시예 2.	37.4	48.2
실시예 3.	33.2	38.9
실시예 4.	29.5	34.8
실시예 5.	28.9	32.6
실시예 6.	27.5	32.4
실시예 7.	32.7	38.9
실시예 8.	35.4	40.1
실시예 9.	31.9	37.8
실시예 10.	38.3	45.6
비교예 1.	10.6	16.3
비교예 2.	8.5	14.8
비교예 3.	15.3	20.2
비교예 4.	13.2	20.7
상백피 추출물	36.9	47.2

실험예 5. 면백여옥고의 B16 melanoma 를 이용한 멜라닌 생성 억제 작용 실험

면백여옥고에 대하여 B16 멜라노마 의 멜라닌 생성 억제작용효과를 측정 하였다. B16 멜라노마 세포 배양을 통하여 멜라닌 생성 억제 기능을 세포 수준에서 검정 하였다. B16 멜라노마 세포는 10 % 소혈청을 함유한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's Medium)에서 5% CO₂, 37℃의 조건에서 2일간 배양하여 1.0 X 10⁸ 세포 / T25 프라스크가 될 때까지 배양한다. 그 다음 최종 농도가 50㎍/㎖와 100㎍/㎖가 되도록 시험 시료를 넣고 5% CO₂, 37℃에서 2일간 배양한다. 그 후 트립신을 첨가하여 세포들을 수거하여 세포의 흑화 정도를 관찰한다. 멜라닌이 생성되어 배출된 T25 프라스크의 상층액을 취해 475 nm 에서 흡광도를 측정하여 멜라닌을 정량하고, 세포수는 수거된 세포: tryphan blue = 1 : 9 의 비율로 혼합하여 현미경으로 관찰하여 살아있는 세포수를 세어 단위 세포당 생성된 멜라닌의 양을 정량하여 저해 효과를 나타낸다. 대조군으로 사용된 상백피 추출물은 좋은 티로시나제 활성 저해 효능을 가지고 있어 화장품 원료로 널리 사용되고 있는 물질이다.

실험결과는 하기 표 5에 나타내었다. 면백여옥고를 적용한 경우 상백피 추출물과 유사하게 멜라닌 생합성이 현저히 저해되었음을 알 수 있었다. 또한, 실시예 1-10의 면백여옥고가 4가지 성분 모두를 가지고 있지 않은 비교예들보다 약 2배이상 멜라닌 생합성 저해율이 증가된 것을 확인하였다.

[표 5] B16 melanoma에서 멜라닌 생합성 저해 효과

실 시 예	멜라닌 생합성 저해효과(%)
실 시 예	50㎍/㎖	100㎍/㎖
실시예 1	32.9	47.0
실시예 2	44.6	57.8
실시예 3	33.1	48.5
실시예 4	39.8	42.7
실시예 5	42.5	50.5
실시예 6	40.7	48.2
실시예 7	41.6	49.3
실시예 8	39.6	46.4
실시예 9	35.6	50.2
실시예 10	36.9	49.2
비교예 1	12.5	15.9
비교예 2	10.7	19.6
비교예 3	18.9	24.7
비교예 4	23.1	29.1
상백피추출물	41.2	50.7

[처방예 1]

면백여옥고를 함유한 화장료 중 유연화장수(스킨로션)의 처방예 1은 다음과 같다. 여기에 면백여옥고는 실시예 2의 것이다. 비교예 5는 면백여옥고 대신 동량의 1,3-부틸렌글리콜을 추가하여 첨가한 제형이다.

배합성분	처방예1(중량%)	비교예5(중량%)
면백여옥고	2.0	-
1,3-부틸렌글리콜	2.00	4.00
글리세린	3.00	3.00
올레일알코올	2.00	2.00
폴리솔베이트 20	1.00	1.00
에탄올	6.00	6.00
방부제	미량	미량
향	미량	미량
정제수	잔량	잔량
계	100.00	100.00

[처방예 2]

면백여옥고를 함유한 화장료 중 로션의 처방예 2는 다음과 같다. 여기에 면백여옥고는 실시예 2의 것이다. 비교예 6은 면백여옥고 대신 동량의 1,3-부틸렌글리콜을 추가하여 첨가한 제형이다.

원 료	처방예2	비교예6
면백여옥고	5.0	-
1,3-부틸렌글리콜	4.00	9.00
글리세린	3.00	3.00
올레일알코올	0.05	0.05
폴리솔베이트 20	1.00	1.00
방부제	미량	미량
향	미량	미량
정제수	잔량	잔량
계	100.00	100.00

[처방예 3]

면백여옥고를 함유한 화장료 중 크림의 처방예 3은 다음과 같다. 여기에 면백여옥고는 실시예 2의 것이다. 비교예 7은 면백여옥고 대신 동량의 글리세린을 추가하여 첨가한 제형이다.

원 료	처방예3	비교예7
면백여옥고	5.0	-
글리세린	5.00	10.00
트리에탄올아민	0.50	0.50
토코페릴 아세테이트	1.00	1.00
유동파라핀	5.00	5.00
스쿠알란	5.00	5.00
마카다미아너트 오일	12.00	12.00
폴리솔베이트 60	1.00	1.00
솔비탄세스퀴올레이트	1.00	1.00
카르복실비닐포리머	0.20	0.20
방부제	미량	미량
향	미량	미량
젱제수	잔량	잔량
계	100.00	100.00

[처방예 4]

면백여옥고를 함유한 화장료 중 맛사지 크림의 처방예 4는 다음과 같다. 여기에 면백여옥고는 실시예 2의 것이다. 비교예 8은 면백여옥고 대신 동량의 바세린을 추가하여 첨가한 제형이다.

원 료	처방예4	비교예8
면백여옥고	2.0	-
바세린	5.00	7.00
유동파라핀	30.00	30.00
밀납	3.00	3.00
폴리솔베이트 60	1.00	1.00
솔비탄세스퀴올레이트	1.00	1.00
1,3-부틸렌글리콜	5.00	5.00
글리세린	5.00	5.00
방부제	미량	미량
향	미량	미량
정제수	잔량	잔량
계	100.00	100.00

시험예 1. 인체 피부에서의 미백 효과 평가

건강한 남녀 20명을 대상으로 피검자의 윗 팔뚝 부위에 직경 1.5㎝의 구멍 6개가 뚫린 불투명 테이프를 부착한 다음, 각 피검자의 최소 홍반량(MED ; Minimal Erythema Dose)의 1.5∼2배 정도의 자외선(UVB)을 조사하여 피부의 색소 침착을 유도하고, 시험 물질들을 도포하여 두 달 후에 색차계를 이용하여 피부의 명암을 측정하였다. 각 시험 물질들은 처방예 1~4 및 비교예 5∼8을 아침과 저녁에 걸쳐 매일 2회 바르도록 하였다.

효과의 판정은 피부의 명암을 나타내는 L^* 값을 구하여 결정하였다. 일반적으로 인공적인 색소 침착을 유도하지 않은 한국인 피부의 L^* 값은 50∼70의 영역에 속한다.

시험 물질들을 도포하여 효과가 있을 경우에는 L^* 값이 점차 증가하게 된다. 도포 시작 시점과 완료 시점에서의 피부색의 차이(ΔL^*)를 아래 식에 따라 계산하여 사람 피부에서의 미백 효과를 비교하였으며, 그 측정결과는 표 6과 도1에 나타내었다.

[표 6] 피부 명암 측정 결과

시험 물질	미백 효과(ΔL^*)
처방예 1	4.21
비교예 5	2.30
처방예 2	6.29
비교예 6	2.52
처방예 3	5.98
비교예 7	2.10
처방예 4	4.39
비교예 8	2.26

상기 조사결과와 같이 면백여옥고를 첨가하여 제조한 처방예 1~4의 화장료가 첨가되지 않고 제조한 비교예 5~8 보다 피부 미백 효과가 우수하다는 것을 알 수 있다.

상기 실험예에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 면백여옥고는 멜라노사이트를 자극하여 멜라닌을 생성시키는 프리라디칼 소거 효과, NF-κB의 과잉 발현 억제에 의한 멜라노사이트 증식억제 효과, 티로시나제 활성 저해 효과와 멜라닌 생성 억제 작용을 가지는 본 발명의 혼합 추출물인 면백여옥고를 첨가하여 제조한 화장료의 피부 미백 효과가 우수하였다.

Claims

백지, 오매, 반하 및 류기노의 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올, 아세톤, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜 및 글리세린으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매로 추출된 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 추출물은 백지 : 오매 : 반하 : 류기노를 1 ~ 25 : 0.5~7 : 0.01~2 : 0.5~5 의 혼합 중량비율로 추출된 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 티로시나아제의 활성 또는 멜라닌의 생성을 억제함으로써 피부 미백 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 화장수(스킨로션), 로션, 크림, 마사지 크림, 에센스, 팩의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.