CN105902440A

CN105902440A - 一种梅花叶提取物、其制备方法及应用

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Publication number: CN105902440A
Application number: CN201610393956.1A
Authority: CN
Inventors: 朱剑虹; 王智富; 朱侗明
Original assignee: SHANGHAI SHENYIN BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI SHENYIN BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2016-06-06
Filing date: 2016-06-06
Publication date: 2016-08-31
Anticipated expiration: 2036-06-06
Also published as: CN105902440B

Abstract

一种梅花叶提取物、其制备方法及应用，该梅花叶提取物各组分重量百分比为：槲皮素0.5～10.0％，异鼠李素0.5～5.0％，植物糖苷50.0～70.0％，槲皮素衍生物和异鼠李素衍生物5～10％，及不可避免的杂质，通过采用乙醇浸提和超声提取结合的方法，对梅花叶进行提取，利用40～65℃的乙醇浸提，能增加槲皮素和异鼠李素的溶解度，超声浸提加快其溶出速度，使其溶出更加彻底。本发明的梅花叶提取物为纯天然成分，具有减少紫外线辐射，抗氧化等作用，从而保护皮肤细胞，该提取物还能起到预防皮肤粉刺生成的作用，减少色素沉积，抑制色斑生成，使肌肤白皙鲜亮。

Description

一种梅花叶提取物、其制备方法及应用

技术领域

本发明属于植物组分提取领域，具体涉及一种梅花叶提取物、其制备方法及应用。

背景技术

梅花，系蔷薇科李属的落叶乔木，稀灌木；小枝绿色，光滑无毛；叶片卵形或椭圆形，梅花耐寒耐热，无论是在-10℃的低温环境还是在40℃的高温中都可以很好地存活。

梅花原产自我国南方，是我国传统名花之一，在1929年曾被定为中国国花。梅花作为中国的传统花卉，也是标志性花卉之一，多取清白卓然之意，宋代词人周邦彦有词云：“一剪梅花万样娇，斜插疏枝，略点眉梢”引出了中华千年的“一剪梅”的文化理念。

梅花不仅是理想的观赏花卉，也可做切花，桩景，花可泡茶、酿酒、入药、提取香精，其根茎叶也有止咳等效用。《本草纲目》记载梅花有“清头目、利肺气、祛痰壅滞上热”，梅花叶可入药，有预防霍乱的功效。

梅花叶发于每年的二三月之交，一般晚于花期，梅花叶中存在丰富的槲皮素异鼠李素以及植物糖苷，现有技术中对梅花进行提取时，利用超声辅助提取时多采取低频(10-20KHz)及中频(40kHz)，在分离时洗脱剂中添加了醇类溶剂(如丁二醇-丙酮体系)，洗脱剂体系极性较大，提取物的组分类别繁杂而且多为挥发性物质，提取物组成不稳定，影响应用效果，应用受到限制。

发明内容

本发明的目的在于提供一种梅花叶提取物、其制备方法和应用，该提取物含多种天然活性成分，活性高、对皮肤亲和性强、安全性高，易于通过皮肤表层进入皮肤深层，有助于肌肤锁水，具有减少紫外线辐射，抗氧化等作用，同时减少色素沉积，抑制了色斑生成，使肌肤白皙鲜亮，可应用于肌肤护理产品的开发。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案如下：

一种梅花叶提取物，其组分及重量百分比为：槲皮素0.5～10.0％、异鼠李素0.5～5.0％、植物糖苷50.0～70.0％，槲皮素衍生物和异鼠李素衍生物5～10％，及不可避免的杂质。

进一步，所述的异鼠李素和槲皮素的质量比为1：1～3。

一种梅花叶提取物的制备方法，包括以下步骤：

1)将梅花叶清洗、切碎、研磨；

2)加入温度为40～65℃的乙醇，梅花叶和乙醇的质量体积比为1：10～50，在密封避光条件下，搅拌0.5～2h，得到混合物；

3)将混合物过滤，收集滤液，保留滤渣，减压蒸发至滤液体积减少50～70％，得到梅花叶提取物的乙醇溶液；

4)向梅花叶提取物的乙醇溶液中加入1,2-丁二醇和步骤3)中保留的滤渣，在室温条件下超声提取1～2h，再减压蒸发，过滤，将滤液浓缩，利用色谱柱进行层析纯化，梯度洗脱，洗脱剂为石油醚-丙酮，浓缩收集的洗脱液，并进行真空干燥，得到所述的梅花叶提取物。

优选地，步骤1)中梅花叶和乙醇的质量比为1：20～30。

进一步，步骤2)中用乙醇对梅花叶进行提取时，在无氧条件下进行。

优选地，步骤3)中，超声提取时，温度为20～40℃，时间为1～1.5h，所加入的1,2-丁二醇为步骤3)中得到的梅花叶提取物的乙醇溶液的5～20％，体积分数。

步骤4)中，利用色谱柱层析纯化时，用硅胶柱纯化2～5次，用羟丙基葡聚糖凝胶柱色谱纯化2～5次，收集洗脱剂中石油醚和丙酮体积比在100：8～10时的洗脱液。

一种含有所述梅花叶提取物的组合物，包括：甘油2～7wt.％、丁二醇3～5wt.％、1,2-戊二醇1～5wt.％、EDTA二钠0.1～0.4wt.％、甘油硬脂酸酯1～3wt.％、透明质酸钠0～0.1wt.％、黄原胶1～10wt.％、梅花叶提取物2～8wt.％，余量为水。

本发明的梅花叶提取物可用于制备化妆品，尤其是抗衰老类、美白类或/和保湿类化妆品。

本发明采用乙醇浸提和超声提取结合的方法，提取出梅花叶中的槲皮素、异鼠李素以及植物糖苷，由于槲皮素和异鼠李素对于乙醇的溶解度并不高，溶解速度慢，而加热至40～65℃的乙醇可以提高槲皮素和异鼠李素的溶解度，在超声条件下可以加快槲皮素和异鼠李素的溶出速度，

本发明对梅花叶进行提取时，超声频率为60-100kHz，较高的超声频率可以加快成分的溶出，并能够提高溶质的溶解度，对腊梅提取物进行柱层析纯化时，采用石油醚-丙酮洗脱剂体系，梯度洗脱，获取石油醚和丙酮的体积比在100：8～10时的洗脱液，得到的梅花叶提取物含有丰富的槲皮素及其衍生物、异鼠李素及其衍生物及植物糖苷，具有减少紫外线辐射，抗氧化等作用，从而保护皮肤细胞，该复合物也可以起到预防皮肤粉刺的作用，与此同时可以减少色素沉积，抑制了色斑生成，使肌肤白皙鲜亮。

本发明的梅花叶提取物中含有0.5％～10.0％的槲皮素以及0.5～5.0％的异鼠李素，槲皮素和异鼠李素都具备抗氧化效果，但槲皮素清除DPPH自由基的能力强于异鼠李素，并且槲皮素可以促进皮肤毛细血管的抗性，缓解敏感性皮肤，异鼠李素在抑制脂质的过氧化方面效果更好，可以防止皮肤表面的细胞细胞膜中的磷脂降解，保护了细胞膜的功能性，有助于皮肤细胞的生长和活力保持。经过实验分析，在本发明的提取物中，保持槲皮素相对高的含量对于皮肤细胞的保护效果更佳，而仅有槲皮素，则缺少了对于皮肤细胞完整性的保护，本发明用温度在40～65℃的乙醇作为溶剂，在热乙醇中，异鼠李素的溶解度相对有所提高，但依然低于槲皮素的溶解度，更进一步，在本发明的梅花叶提取物中，异鼠李素和槲皮素的质量比为1：1～3时，对皮肤细胞以及皮下毛细血管有良好的保护效果。

本发明的梅花叶提取物中含有50.0～70.0％的植物糖苷，植物糖苷易溶于水和乙醇，其完全来自于梅花叶，是纯天然产物，将本发明获得的高质量比重的糖苷，溶于溶剂后，控制其比例，可以调节提取物溶液的渗透压，加强皮肤细胞的对提取物的吸收，维持细胞的渗透压，改善皮肤生长的微环境。

有益效果：

本发明的梅花叶提取物中的槲皮素和异鼠李素可以防止透明质酸等保水物质的分解，使皮肤保持弹性，持久保持皮肤的活力，与此同时，还能减少色素沉积，具有美白功效，抑制了色斑生成并增强皮肤的美白保湿能力，对于促进真皮中成纤维细胞产生胶原蛋白有一定作用。

本发明采用乙醇浸提和超声提取结合的方法，对梅花叶进行提取，初步提取时利用加热至40～65℃的乙醇做提取剂，可以提高槲皮素和异鼠李素的溶解度，而在超声条件下，乙醇和1,2-丁二醇配合可以加快槲皮素和异鼠李素的溶出速度，使提取物中槲皮素和异鼠李素的含量保持在较高水平。

附图说明

图1为本发明实施例2中羟脯氨酸的标准曲线。

图2为本发明实施例2中羟脯氨酸的增长百分比。

图3为本发明实施例3中透明质酸的标准曲线。

图4为本发明实施例3中透明质酸的增长百分比。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1一种梅花叶提取物的制备方法，包括以下步骤：

1)将50g梅花叶清洗、切碎、研磨；

2)加入1L温度为50℃的乙醇，梅花叶和乙醇的质量比保持在1：10～50，在密封避光条件下，搅拌30min；

3)过滤，收集滤液，保留滤渣，减压蒸发浓缩，得到500毫升梅花叶提取物的乙醇溶液；

4)加入100mL 1,2-丁二醇，加入滤渣，室温，在超声条件下再次提取1.5h，减压蒸发，过滤，利用硅胶柱纯化2次，用羟丙基葡聚糖凝胶柱色谱纯化2次，梯度洗脱，石油醚和丙酮的体积比从100：0到100：14，收集洗脱剂中石油醚和丙酮体积比在100：8～10时的洗脱液，真空干燥，得到梅花叶提取物0.3g，其中槲皮素6mg、异鼠李素4mg、植物糖苷0.2g。

实施例2

羟脯氨酸是胶原蛋白中一种重要且含量稳定(占13.4％)的氨基酸，在弹力蛋白中含量甚微，在其他蛋白中均不存在，因此，测定其含量是检测胶原蛋白合成能力的可靠方法，羟脯氨酸的检测包括如下步骤：

1.准备人的皮肤细胞

取正常人的真皮成纤维细胞作为原代细胞，于75cm²培养瓶中(含有生长因子的培养基2ml)，37℃、CO₂浓度为5％的条件下培养细胞至80％浓度，进行传代，传代细胞175cm²方瓶中继续培养细胞至80％浓度，得到人真皮成纤维细胞。

2.制备待测样品

配制含有梅花叶提取物的精华液，精华液成分：甘油5.0wt.％、丁二醇4.0wt.％、1,2-戊二醇3.0wt.％、EDTA二钠0.1wt.％、甘油硬脂酸酯1.5wt.％、透明质酸钠0.05wt.％、黄原胶4.0wt.％、梅花叶提取物5.0wt.％，余量为去离子水。

用含有10％胎牛血清的DMEM培养液培养上述步骤培养得到的人真皮成纤维细胞，37℃，5％CO₂培养24小时，待细胞接近融合，用含0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA的消化液消化后按1：2传代，选取第四代细胞，备用。

用含有10％胎牛血清的DMEM培养液将第四代细胞稀释至密度为10⁵个细胞/ml，再接种到12孔板中，接种量为5×10⁴个细胞/孔，选取15个孔，其中5个孔为一组，设3组平行对照，每组的5个孔内分别加入A样品(精华液0.01mL+生理盐水0.29mL)、B样品(精华液0.05mL+生理盐水0.25mL)、C样品(精华液0.1mL+生理盐水0.2mL)、D样品(精华液0.3mL)和对照组样品(0.3mL生理盐水)，在37℃，5％CO₂条件下培养一天，之后分别收集A样品、B样品、C样品、D样品和对照组样品的培养上清液备用。

3.绘制羟脯氨酸标准曲线

配制6个羟脯氨酸标准品溶液，浓度依次为：0μg/mL，3μg/mL，6μg/mL，12μg/mL，24μg/mL，48μg/mL，用酶标仪测试上述标准品溶液在450nm波长下的OD值，测试结果参见表1；

表1

羟脯氨酸标准品(μg/mL)	0	3	6	12	24	48
							OD(450nm)	0	0.40	0.71	1.20	2.24	3.61

根据羟脯氨酸标准品的吸光度测试结果，以吸光度为纵轴，以羟脯氨酸浓度为横轴绘制羟脯氨酸的标准曲线，参见图1；

OD＝0.074×c+0.2131，R2＝0.9839，p＝0.00009，

其中，c为羟脯氨酸的浓度(μg/mL)；

即羟脯氨酸浓度c＝(OD-0.2131)/0.074

4.测定羟脯氨酸含量

依照人羟脯氨酸酶联免疫分析试剂盒说明书(上海酶联生物科技有限公司)，用试剂盒中的溶剂将步骤2)中获得的A样品、B样品、C样品、D样品和对照组样品的培养上清液稀释5倍后，分别测定其在450nm波长下的吸光度，根据绘制的羟脯氨酸浓度标准曲线计算A样品、B样品、C样品、D样品和对照组样品的培养上清液中的成纤维细胞产生的羟脯氨酸的含量，结果参见表2和图2。

表2

	对照组	A样品	B样品	C样品	D样品
						稀释5倍后OD值	0.64	0.64	0.65	0.74	0.73
羟脯氨酸含量(μg/mL)	28.84	28.84	29.52	35.60	34.93
						含量与对照组相比(％)	0.00	0.00	2.36	23.44	21.10

由表3可以看出，与对照组相比，加入本发明的梅花叶提取物的组合物后，羟脯氨酸的含量增加，随着梅花叶提取物含量的增加，羟脯氨酸的浓度也在增大，但C样品效果较佳，具体参见图2，因此，本发明的梅花叶提取物可以使皮肤的成纤维细胞分泌的胶原蛋白的量提高。

实施例3

对实施例2步骤2获得的A样品、B样品、C样品、D样品和对照组样品的培养上清液进行透明质酸含量测定，包括以下步骤：

1.绘制透明质酸标准曲线

配制6个透明质酸标准品溶液，浓度依次为：0μg/mL，10μg/mL，20μg/mL，40μg/mL，80μg/mL，160μg/mL，利用酶标仪分别测试其在450nm下的OD值，测试结果参见表3；

表3

透明质酸标准品(μg/mL)	0	10	20	40	80	160
							OD(450nm)	0	0.45	0.64	0.90	1.41	2.70

根据透明质酸标准品测试结果，以吸光度为纵轴，以透明质酸浓度横轴绘制透明质酸的标准曲线，参见图3；OD＝0.0156×c+0.2083，R²＝0.9841，p＝0.0001，其中，c为透明质酸的浓度，单位μg/mL，经过换算，透明质酸浓度c＝(OD-0.2083)/0.0156。

2.测定透明质酸含量

依照人透明质酸酶联免疫分析试剂盒说明书，用试剂盒中的溶剂将实施例2步骤2获得的A样品、B样品、C样品、D样品和对照组样品的培养上清液稀释5倍，其OD值，再计算透明质酸含量，结果见表4和图4。

表4

	对照组	A样品	B样品	C样品	D样品
						稀释5倍OD值	0.66	0.68	0.72	0.90	1.17
透明质酸含量(μg/ml)	144.78	151.19	164.01	221.70	308.24
						含量与对照组相比(％)	0.00	4.42	13.28	53.13	112.90

由表4和图4可以看出，加入本发明的梅花叶提取物的组合物后，皮肤成纤维细胞分泌的透明质酸的量有显著提高，提高皮肤的保水能力，可以保持皮肤湿润。

实施例4

在酪氨酸酶的作用下，左旋多巴(L-DOPA)氧化为棕褐色的多巴色素，在抑制剂的存在条件下，该反应将得到抑制，测试本发明的梅花叶复合物对酪氨酸酶活性的抑制率，包括如下步骤：

将本发明实施例2第2步骤获得的A样品、C样品、D样品和对照组样品的培养上清液各取0.1ml，分别与预先在30℃恒温水浴中保温的2.8ml的L-DOPA底物溶液分别加入试管，混匀，然后加入0.1ml的600单位/ml的酪氨酸酶溶液，充分混匀后于30℃进行水浴10分钟，使用分光光度计，于475nm处测定多巴色素的吸收峰值。

由测定的吸光度(OD值)，计算原液稀释液对酪氨酸酶活性的抑制率(％)，参见表5，其中，抑制率的计算公式如下：

抑制率＝[1-(T1-T2)/(C1-C2)]×100％

上述计算公式中，

C1为未加试样(A样品、C样品、D样品)加酪氨酸酶的混合物所测的吸光度值；

C2为未加试样(A样品、C样品、D样品)也未加酪氨酸酶的混合物所测的吸光度值；

T1为加入试样(A样品、C样品、D样品)和酪氨酸酶的混合物所测的吸光度值；

T2为加入试样(A样品、C样品、D样品)未加酪氨酸酶的混合物所测的吸光度值。

表5

样品	C1	C2	T1	T2	抑制率(％)
						A样品	0.82	0.27	0.81	0.27	2.30
C样品	0.81	0.24	0.70	0.27	24.55
						D样品	0.78	0.23	0.48	0.26	60.85
对照组	0.80	0.26	0.80	0.28	0

由表5可以看出，本发明所得到的梅花叶复合物对于酪氨酸酶的活性有明显的抑制作用，随着浓度升高，抑制作用加强，这可以抑制色斑的形成，起到使皮肤美白的作用。

实施例5梅花叶提取物组合物的应用验证

清洁手臂，将本发明实施例2第2步骤的A样品、C样品、D样品分别涂布在手臂上2.5cm×2.5cm的皮肤，并以生理盐水为对照样涂布在相同面积，分别在1小时、2小时、5小时后观察皮肤状态并进行记录，结果见表6。

表6

	A样品	C样品	D样品	对照组
					1小时后	湿润	湿润、亮白	湿润、亮白	湿润
2小时后	稍有干燥	正常	湿润	稍有干燥
					5小时后	油腻	正常	正常	油腻

由表6可以看出，加入本发明的梅花叶提取物组合物后，皮肤的锁水能力提高，能发挥较好的提亮作用，保持皮肤湿润。

本发明的梅花叶提取物可以促进皮肤胶原蛋白、透明质酸的产生，其中，对透明质酸效果尤其明显，可以在一定程度上抑制皮肤色素的产生，具有显著的皮肤保水效果，改善皮肤细胞的生长状态，可以用于美白保湿类化妆品。

Claims

1.一种梅花叶提取物，其各组分重量百分比为：槲皮素0.5～10.0％，异鼠李素0.5～5.0％，植物糖苷50.0～70.0％，槲皮素衍生物和异鼠李素衍生物5～10％，及不可避免的杂质。

2.根据权利要求1所述的梅花叶提取物，其特征在于，所述的异鼠李素和槲皮素的质量比为1：1～3。

3.如权利要求1或2所述的梅花叶提取物的制备方法，包括以下步骤：

1)将梅花叶清洗、切碎、研磨；

4.如权利要求3所述的梅花叶提取物的制备方法，其特征在于，步骤2)中用乙醇对梅花叶进行提取时，在无氧条件下进行，梅花叶和乙醇的质量体积比为1：20～30。

5.如权利要求3所述的梅花叶提取物的制备方法，其特征在于，步骤3)中，超声提取时，温度为20～40℃，时间为1～1.5h，所加入的1,2-丁二醇为步骤3)中得到的梅花叶提取物的乙醇溶液的5～20％，体积分数。

6.如权利要求3所述的梅花叶提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中，利用色谱柱层析纯化时，用硅胶柱纯化2～5次，用羟丙基葡聚糖凝胶柱色谱纯化2～5次，收集洗脱剂中石油醚和丙酮体积比在100：8～10时的洗脱液。

7.一种含有权利要求1或2所述梅花叶提取物的组合物，包括：甘油2～7wt.％、丁二醇3～5wt.％、1,2-戊二醇1～5wt.％、EDTA二钠0.1～0.4wt.％、甘油硬脂酸酯1～3wt.％、透明质酸钠0～0.1wt.％、黄原胶1～10wt.％、权利要求1或2所述梅花叶提取物2～8wt.％，余量为水。

8.如权利要求1或2所述的梅花叶提取物在化妆品中的应用。

9.如权利要求7所述的梅花叶提取物的组合物在化妆品中的应用。

10.如权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述的化妆品为抗衰老类、美白类或/和保湿类化妆品。