CN101190281A - 梅树提取物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种梅树提取物，它含有0.5－50wt％角鲨烯。所述的梅树提取物主要来自梅树非果部分的脂溶性有效部位和/或水溶性有效部位。本发明还提供了这种梅树提取物的制备方法，主要通过超临界CO₂流体或非极性有机溶剂萃取得到脂溶性有效部位；再将上述超临界流体或非极性溶剂的萃余物(残渣)，用醇－水溶液提取得到水溶性有效部位。本发明公开了含有上述梅树提取物的组合物，并公开了上述梅树提取物的用途。

Description

梅树提取物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及植物提取物领域。更具体地涉及从梅树的非果部位(花、枝、叶)中提取的有效部位群及其制备方法和用途。

背景技术

梅是蔷薇科(Rosaceae)樱桃属植物，学名Prunus mume Sieb.Et Zucc，园艺栽培上将梅分为花梅和果梅，果梅分为白梅、青梅和红梅。

WO00/39249(PCT/JP99/07285)公开了一种具有药效的梅提取物及含有该提取物的组合物，其中公开了如下内容：“使用5倍体积量的甲醇，由梅的茎叶部、梅的果仁和梅花制备提取物，该提取物具有抗氧化作用、胃粘膜损伤抑制作用、醛糖还原酶抑制作用、血糖值上升抑制作用、血小板凝集促进作用、酒精吸收抑制作用和抗炎作用等。”称所涉及的梅提取物用醇提法或干馏法获得，梅叶茎部的甲醇提取物中含有五环三萜化合物，梅花的甲醇提取物中含有槲皮素糖苷等黄酮类物质，但既缺乏对提取工艺的系统探索，又没有关于梅提取物可能有效成分的量化数据，更别提有效部位群的确定及制剂的标准化。这种甲醇粗提物未经分离纯化，杂质含量高，有效成分含量低，色泽深，产品吸湿性很强，不易保藏，加工适应性差。同时，所用的梅树品种不明确，当提取物应用于医药领域时，如不确定植物来源，则不能保证药品有效、安全、稳定的三个基本要求。

因此，本领域迫切需要从梅林非果部分的大宗废弃物入手，采用中药现代化的工程技术和手段，分离提取有效部位群，开发标准化制剂，充分利用梅林资源，有效保护环境。

发明内容

本发明旨在提供一种梅树提取物。

本发明的第二个目的，是提供上述梅树提取物的制备方法。

本发明的第三个目的，是提供一种含有上述梅树提取物的产品。

本发明的第四个目的，是提供上述梅树提取物的用途。

在本发明的第一个方面，提供了一种梅树提取物，它含有0.5-50wt％角鲨烯，按提取物的总重量计。

在另一优选例中，所述的提取物是梅树的花、枝和/或叶的脂溶性有效部位。

在另一优选例中，所述的提取物还含有梅树的花、枝和/或叶水溶性有效部位。

在另一优选例中，所述的脂溶性有效部位是超临界CO₂流体萃取物或非极性和低极性有机溶剂提取物。

在另一优选例中，所述的脂溶性有效部位还含有长链烷烃、多烯烃、VE、植物甾醇和三萜类化合物。

所述的水溶性有效部位是醇-水提取物，含有黄酮糖苷、三萜皂苷和有机酸。

在另一优选例中，所述的水溶性有效部位中含有0.5-10wt％有机酸，按水溶性有效部位的总重量计。

在另一优选例中，所述的梅树提取物含有下述十种化合物中的至少一种：

I角鲨烯(Squalene)

II木栓酮(Friedelin)

III叶绿醇(Phytol)

IV谷甾醇(Sitosterol)

V柠檬酸(Citric acid)

VI酒石酸(Tartaric acid)

VII苹果酸(Malic acid)

VIII绿原酸(Chlorogenic acid)

IX琥珀酸(Succinic acid)

X槲皮素(Quercetin)及其衍生物。

在另一优选例中，所述的梅树为蔷薇科的梅树；更佳地梅树为青梅。

在本发明的第二方面，提供了一种上述的梅树提取物的制备方法，它包括步骤：(i)用超临界CO2流体或非极性有机溶剂萃取梅树原料，所述的原料包括花、枝和/或叶，并分离出脂溶性有效部位作为梅树提取物，其中所述的梅树提取物含有0.5-50wt％角鲨烯。

在另一优选例中，所述的梅树为蔷薇科的梅树；更佳地梅树为青梅。

在另一优选例中，所述的非/低极性有机溶剂是正己烷、石油醚、氯仿、乙醚、丙酮、6号溶剂或其混合。

在另一优选例中，该方法还包括步骤：

(ii)对步骤(i)中经萃取的梅树原料，用醇-水溶剂提取，得到水溶性有效部位，所述的水溶性有效部位含有黄酮糖苷、三萜皂苷和有机酸。

在另一优选例中，所述的醇-水溶剂为0-50v/v％的乙醇溶液或甲醇溶液。

在另一优选例中，所述的提取方法为热回流提取、微波辅助提取、超声波辅助提取，或其组合。

在另一优选例中，还包括步骤(ii’)：对水溶性有效部位进行纯化，所述的纯化方法选自：膜分离、柱层析，或其组合。

在另一优选例中，所述的萃取方法是超临界CO2流体萃取，其中条件如下：萃取压力5-50MPa，萃取温度20-90℃，分离温度20-80℃，分离压力为2-10MPa；循环动态萃取0.5-7小时；所述的非极性有机溶剂的萃取采用浸渍法或渗漉法，浸提温度10-70℃，浸提时间0.2-48小时，料液比W/V：1∶3-30。

在另一优选例中，所述的醇-水溶液提取温度为60-100℃，提取时间0.1-5小时，料液比W/V：1∶3-30。

在本发明的第三方面，提供了一种组合物，它含有梅树提取物，所述的梅树提取物中含有0.5-50wt％角鲨烯，按提取物的总重量计。

在另一优选例中，所述的提取物是梅树的花、枝和/或叶的脂溶性有效部位。

在另一优选例中，所述的梅树为蔷薇科的梅树；更佳地梅树为青梅。

在另一优选例中，所述的组合物还包括选自下组的额外组分：梅果提取物、松花粉、竹黄酮或其混合。

在另一优选例中，所述的组合物包括药物组合物、食品组合物或保健品组合物、食品配料组合物、膳食补充剂组合物、天然药物原料组合物、或化妆品功能成分组合物。

在另一优选例中，所述的组合物选自：

(i)胶囊、软胶囊、粉剂、片剂、颗粒剂、口服液、喷雾剂、霜剂、乳剂、水剂或膏体；

(ii)饮料或酒类。

在本发明的第四方面，提供了一种上述的梅树提取物的用途，它可用于制备抗自由基、抗氧化、抗菌、脱敏、改善肠胃功能、防治血液酸化、促进血液循环、消除疲劳、缓解精神压力、增强免疫功能、调节脂质代谢、减肥、降低血压、保护心脑血管、预防癌症、促进头发生长或防脱发的组合物。

在另一优选例中，所述的组合物包括药物组合物、食品组合物、保健品组合物、食品配料组合物、膳食补充剂组合物、天然药物原料组合物、或化妆品功能成分组合物。

在另一优选例中，所述的组合物选自：

(i)胶囊、软胶囊、粉剂、片剂、颗粒剂、口服液、喷雾剂、霜剂、乳剂、水剂或膏体；

(ii)饮料或酒类。

据此，本发明从梅林非果部分分离提取了有效部位群。

附图说明

图1是梅花脂溶性有效部位(超临界CO₂流体提取物)的GC-MS谱图。

图2是梅枝脂溶性有效部位(超临界CO₂流体提取物)的GC-MS谱图。

图3是梅叶脂溶性有效部位(超临界CO₂流体提取物)的GC-MS谱图。

图4是梅花水溶性有效部位的红外光谱图。经溴化钾压片后的红外图谱显示：该提取物在3404、2929、1606、1516、1403、1270、1078、868、818、780、612cm^-1附近有特征性吸收峰。

图5是梅枝水溶性有效部位的红外光谱图。经溴化钾压片后的红外图谱显示：该提取物在3406、2926、1609、1519、1447、1394、1284、1070和611cm^-1附近有特征性吸收峰。

图6是梅叶水溶性有效部位的红外光谱图。经溴化钾压片后的红外图谱显示：该提取物在3386、2932、1596、1516、1404、1314、1074、776、721、611、527cm^-1附近有特征性吸收峰。

图7是梅花水溶性有效部位的紫外光谱图。提取物溶于光谱纯的甲醇后，在190-700nm的波长范围内进行扫描，结果显示：在327nm处有强吸收，在290nm处有次强吸收。

图8是梅枝水溶性有效部位的紫外光谱图。提取物溶于光谱纯的甲醇后，在190-700nm的波长范围内进行扫描，结果显示：在280nm处有强吸收，在320nm处有次强吸收。

图9是梅叶水溶性有效部位的紫外光谱图。提取物溶于光谱纯的甲醇后，在190-700nm的波长范围内进行扫描，结果显示：在322nm处有强吸收，在285nm处有次强吸收。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现梅树提取物，尤其是梅树的非果部分含有较丰富的角鲨烯。所述的角鲨烯存在于通过超临界CO₂萃取或非极性有机溶剂萃取获得的脂溶性有效部位中。发明人还在梅树的非果部分用醇-水溶液提取得到了水溶性有效部位。这些被发现的有效部位群具有广泛的生物用途。

如本文所用，梅树(Prunus mume Sieb.Et Zucc)指蔷薇科(Rosaceae)樱桃属植物。可用于本发明的梅树包括白梅、青梅和红梅，更佳地为青梅，如选自萧山大青梅中的“大叶青”(Prunus mume‘Da Ye Qing’)、“细叶青”(Prunus mume‘Xi YeQing’)、“红丰”(Prunus mume‘Hong Feng’)和“红顶”(Prunus mume‘HongDing’)。

本发明提供的梅树提取物可来自于梅树的全部，优选其中的非果部分。所述的非果部分包括花、枝、杆、根、或叶，优选其中的花、枝或叶。

梅树提取物

本发明提供的梅树提取物中以提取物计含有0.5-50％的角鲨烯(分子式I)：

I角鲨烯(Squalene)。

本发明提供的梅树提取物包括梅树非果部分的有效部位群，即含有脂溶性有效部位和水溶性有效部位的萃取物或其混合物。所述的脂溶性有效部位含有长链烷烃、多烯烃、VE、植物甾醇和三萜类化合物；以干基计(梅花、梅枝或/和梅叶)脂溶性有效部位含量为1-15％。所述的水溶性有效部位含有黄酮糖苷、三萜皂苷和有机酸；以干基计(梅花、梅枝或/和梅叶)水溶性有效部位含量为1-20％；黄酮糖苷在水溶性有效部位的含量以芦丁计为5-70％。

本发明提供的梅树提取物的形态没有特别的限定，例如可以是粉末状、膏状、或是液体状(包括糊状)。

角鲨烯主要来自深海鲨鱼的肝脏、经提炼精制而成，它是含有碳元素和氢元素(C₃₀H₅₀)的油状液体，在极低温下也不会凝固，不像一般动物性油脂在低温下会凝成块状。大量的实验证明只有深海鲨鱼的肝脏中含有角鲨烯，而其他鱼类的肝油中几乎没有鲨烯的成分存在。

深海鲨在500至1000公尺的海底生存，那里几乎没有阳光，水温约为2℃左右，水压是每立方尺0.1公吨。由于没有阳光，植物和浮游生物难以生存。由于没有植物进行光合作用，氧气十分稀少。深海鲨能在这种严酷环境下生存，其顽强的生命力来自于巨大肝脏中所含的角鲨烯。角鲨烯能向细胞供应大量氧气，使细胞恢复活力，提高身体的自然治愈能力。

角鲨烯的主要功能有：

(1)促进血液循环：帮助预防及治疗因血液循环不良而引致的病变，如心脏病、高血压、低血压及中风等；

(2)活化身体机能细胞：帮助预防及治疗因机能细胞缺氧而引致的病变，如胃溃疡、十二指肠溃疡、肠炎、肝炎、肝硬化、肺炎等，全面增强体质，延缓衰老，增强免疫力，提高抗病(包括癌症)的能力。

(3)消炎杀菌：帮助预防及治疗细菌引致的疾病，如感冒、皮肤病、耳鼻喉炎等。可外用，治疗刀伤、烫伤等。外用时用针刺破胶囊，直接涂抹。

要得到角鲨烯，必须捕猎大量深海鲨，这既相当困难又会破坏海洋生态。本发明首次从蔷薇科樱桃属梅树的非果部位中得到了丰富的角鲨烯，提供了植物源性角鲨烯的新来源。梅树是中国传统的栽培植物，具有十分悠久的历史，已有大量的种植。但迄今，梅树的非果部分尚未得到有效的开发利用，绝大部分是被丢弃的，不仅严重浪费了资源，而且对环境带来不利影响。本发明从梅树非果部分提取得到了具有优异生物效应的角鲨烯，可有效解决上述问题。

梅树提取物的制备方法

本发明提供的梅树提取物可来自于梅树的全部，优选其中的非果部分。所述的非果部分包括花、枝、杆、根、或叶。梅花主要取自未坐果的花朵，人工采摘后晒干、炒干或烘干后备用；梅枝可以是春季删节的营养枝、秋季修剪的枝条，也可以是梅树砍伐后的枝干，晒干、切断、破碎后备用；梅叶一般在夏、秋二季收集，晒干后备用；梅杆和梅根来源于砍伐后的梅树。

本发明采用的梅树原料可以进行预处理，也可以不经预处理。优选的原料是10-20目的碎片，含水量在10％以下。

本发明提供的含0.5-50％角鲨烯的梅树提取物可以通过超临界CO₂流体或非极性有机溶剂萃取得到。通过超临界CO₂流体或非极性有机溶剂萃取，还可以得到梅树提取物中的其它脂溶性有效成分。

在优选例中超临界萃取的萃取压力为5-50MPa，萃取温度20-90℃，分离温度20-80℃，分离压力2-10MPa；循环动态萃取0.5-7小时；更佳地，萃取压力15-35MPa，萃取温度40-70℃，分离温度40-60℃，分离压力为4-8MPa；循环动态萃取1-5小时。超临界CO₂流体萃取过程中可使用夹带剂，也可以选择不使用夹带剂。

可以使用本领域熟知的非极性或低极性有机溶剂，优选正己烷、石油醚、氯仿、乙醚、丙酮、6号溶剂或其混合，可以使用本领域常规的方法进行溶剂萃取，优选浸渍法或渗漉法，萃取温度10-70℃，萃取时间0.2-48小时，料液比W/V：1∶3-30；更佳地，萃取温度20-50℃，萃取时间0.5-36小时，料液比为1∶5-20(W/V)。

本发明提供的梅树提取物中的水溶性有效部位可以通过醇-水溶液提取得到。在优选例中，梅树原料经过超临界CO₂萃取或有机溶剂浸提后，物料挥去溶剂，用醇-水溶液提取。所述的醇-水溶液是体积比为0-50％的醇溶液，可以使用本领域常用的醇类，如乙醇和甲醇，优选乙醇。所述的提取方法是热回流提取、微波辅助提取、超声波辅助提取，或其组合。

在另一优选例中，微波辅助提取的工艺参数为：微波辐射功率100-6000W，辐射时间2分钟-5小时，料液比为1∶3-30(W/V)；更佳地，微波辐射功率为200-4000W，辐射时间为5分钟-2小时，料液比为1∶5-20(W/V)。

在另一优选例中，超声波辅助提取料液比1∶3-30(W/V)，超声波功率50-800W，超声波作用时间0.2-5小时；更佳地，超声波辅助提取料液比1∶5-20(W/V)，超声波功率100-500W，超声波作用时间0.5-3小时。

在另一优选例中，醇-水溶液提取得到的水溶性有效部位可以辅以其他高效分离手段进一步纯化。可以使用本领域常规的方法进行进一步地分离纯化，其中优选膜分离或柱层析。

在另一优选例中，膜分离采用卷式超滤膜系统，操作压力为0.3-3Mpa，操作温度10-70℃；更佳地，卷式超滤膜系统，操作压力为0.6-1Mpa，操作温度20-50℃。

可以将上述花、枝和/或叶的脂溶性有效部位与水溶性有效部位合并混匀，得到梅花、梅枝和/或梅叶的有效部位群。

组合物

本发明提供的组合物将梅树提取物组成作为主要成分或有效成分，所述的梅树提取物中含有可包括梅树非果部分脂溶性有效部位、梅树非果部分水溶性有效部位、梅树非果部分醇提物、梅树非果部分水提物、梅树果实部分提取物，或其混合。优选地，包括梅树非果部分脂溶性有效部位、水溶性有效部位和梅树果实提取物；更优选地，包括梅树非果部分脂溶性有效部位和水溶性有效部位。

组合物中所述的梅树提取物含有下述十种化合物中的至少一种：

I角鲨烯(Squalene)

II木栓酮(Friedelin)

III叶绿醇(Phytol)

IV谷甾醇(Sitosterol)

V柠檬酸(Citric acid)

VI酒石酸(Tartaric acid)

VII苹果酸(Malic acid)

VIII绿原酸(Chlorogenic acid)

IX琥珀酸(Succinic acid)

X槲皮素(Quercetin)及其衍生物。

应理解，本发明的组合物中还可含有其它人体所必需的或对人体有益的成份，例如松花粉、竹黄酮或其混合。

在本发明中，各种组合物可以按本领域熟知的方法配制，可以将活性成分与“药学上可接受的”或“食品学上可接受的”的成分混合配制。“药学上可接受的”或“食品学上可接受的”的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。

“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s PharmaceuticalSciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、润湿剂或乳化剂、矫味剂、pH缓冲物质等。

在本发明的另一优选方式中，所述的食品上学可接受的载体或赋形剂选自：填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、矫味剂、包覆材料、膳食制品、或缓/控释剂。

对于本发明所述的组合物的剂型没有特别的限制，可以是任何适用于哺乳动物服用的剂型；优选的，所述的剂型可选自胶囊、软胶囊、粉剂、片剂、颗粒剂、口服液、喷雾剂、霜剂、乳剂、水剂或膏体等。

本发明的组合物包括药物组合物、食品组合物、保健品组合物、食品配料组合物、膳食补充剂组合物、天然药物原料组合物、或化妆品功能成分组合物；也可以是保健饮料、酒类等。只要它们含有或基本上由梅树提取物组成即可。

梅树提取物的用途

本发明提供的梅树提取物可有效地抗自由基、抗氧化、抗菌、脱敏、改善肠胃功能、防治血液酸化、促进血液循环、消除疲劳、缓解精神压力、增强免疫功能、调节脂质代谢、减肥、降血压、保护心脑血管、预防癌症、促进头发生长或防止脱发。因此，本发明也提供了通过给需要的受试者施加有效量的所述梅树提取物来预防、改善或治疗所述疾病的方法。

当施用时，所用的梅树提取物有效剂量可随施用的模式和待治疗的疾病的严重程度而变化。具体情况根据受试者的个体情况来决定，这在熟练医师或营养师可以判断的范围内。

如本文所用，术语“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

本发明的主要优点在于：

1、在梅树中提取得到了较大量的角鲨烯，尤其是从梅树的非果部分；

2、建立了有效的提取工艺，可确定梅树非果部分有效部位群及相关制剂的标准化；

3、可保证达到药品有效、安全、稳定的三个基本要求；

4、充分利用了以前被丢弃的梅树非果部分，减少了资源浪费，有利于环境保护。

5、提高了梅树资源的利用度，提高了梅林的经济效益，有利于农民的增收。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

测定方法

一、GC-MS分析方法

检测仪器：6890-5973型气-质联用系统(购自美国Agilent公司)；

色谱条件：HP5-MS色谱柱(5％phenyl methyl siloxane，30m×250μm×0.25μm)；进样量1μL；进样口温度270℃；程序升温：柱温在80℃保持3min后从80℃以10℃/min升温到270℃；氦气流速1.0mL/min；

质谱条件：EI离子源，源温230℃；电子能量70eV；倍增管电压1376eV；质谱接口温度280℃；扫描范围50.0～600.0m/z。

二、总黄酮测定方法(硝酸铝-亚硝酸钠比色法，以芦丁计)

本方法参照王光亚主编的《保健食品功效成分检测方法》(中国轻工业出版社，2002，pp29-31)。

精密称取一定量的样品或标准品(芦丁)，用30％的乙醇溶液溶解、定容、并稀释至适宜浓度，记录总体积；取一定体积的待测液，加5％亚硝酸钠溶液0.3mL，振摇后放置5min，加入10％硝酸铝溶液0.3mL摇匀后放置6min，加1.0mol/L氢氧化钠溶液2mL，用30％乙醇定容至刻度，以零管为空白，摇匀后用1cm的比色杯、在510nm的波长处测定吸光度，以吸收度为纵座标、浓度为横座标绘制标准曲线，计算样品中总黄酮的含量。

总黄酮含量(％)＝(m1×V2)/(m×V1×10⁶)×100

式中：m1——依据标准曲线计算出被测液中黄酮含量(μg)；

m——供试品取样量(g)；

V1——待测液分取的体积(mL)；

V2——待测液的总体积(mL)。

三、总三萜测定方法

精密称取一定量的样品或标准品(人参皂甙Re)，用二氯甲烷溶解、定容，分别置10mL具塞试管中，挥干溶剂，加5％香兰素冰醋酸溶液0.2mL，高氯酸0.8mL，置(60±1)℃水浴中加热15min，立即取出，用冰水冷却，加5mL冰醋酸，摇匀。照分光光度法，在560nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算样品中总黄酮的含量。

三萜皂甙含量(％)＝(m1×V2)/(m×V1×10⁶)×100

式中：m1——依据标准曲线计算出被测液中三萜皂甙含量(μg)；

m——供试品取样量(g)；

V1——待测液分取的体积(mL)；

V2——待测液的总体积(mL)。

四、总酸的滴定方法

取适量的样品，加入少量无二氧化碳的蒸馏水，将样品溶解到250mL容量瓶中，在75-80℃水浴上加热0.5小时，冷却、定容，用干燥滤纸过滤，弃去初液，收集滤液备用。准确吸取制备的滤液50mL，加入酚酞指示剂2-3滴，用0.1mol/L标准碱液滴定至微红色30秒不褪色，记录用量，同时做空白实验。以下式计算样品含酸量。

总酸度(％)＝C×(V1-V2)×K×V3×100/(m×V4)

式中：C---标准氢氧化钠溶液的浓度mol/L

V1---滴定所消耗标准碱液的体积mL

V2---空白所消耗标准碱液的体积mL

V3---样品稀释液总体积mL

V4---滴定时吸取的样液的体积mL

M---样品质量或体积(g或mL)

K＝0.064

五、有机酸的HPLC测定方法

仪器条件：Waters 2695高效液相色谱仪、Waters 2996二极管阵列检测器及C18色谱柱；

色谱条件：流动相为3％甲醇和0.01mol/L KH₂PO₄水溶液(pH值＝2.85)，流速为1mL/min，柱温为30℃，检测波长为210nm，进样量为20μL；

预处理方法：分别取青梅花、枝、叶提取物粉末2g溶于50mL超纯水中，过滤上样，测定样品中酒石酸、苹果酸、乳酸、醋酸、柠檬酸、琥珀酸、抗坏血酸马来酸、草酸、富马酸及绿原酸的含量。

实施例1

梅花提取物

用萧山大青梅大叶青(Prunus mume‘Da Ye Qing’)花，经采集、干燥后，粉碎成10目左右的粗粉，取1.5kg放入CO₂超临界萃取釜中萃取。

萃取条件：萃取压力35MPa，萃取温度60℃，分离温度40℃，分离压力4MPa，循环动态萃取2h，在分离釜中得到梅花脂溶性提取物72g[Dietmate^TM(杭州尤美特科技有限公司的商标)-F01]。

经GC-MS分析其主要含长链烷烃、多烯烃、VE、植物甾醇和三萜类化合物，其中特征性化合物角鲨烯(三十碳六烯)在脂溶性有效部位中的含量为质量分数1.04％。结果见表1和图1。

从萃取釜中取出萃余物，萃余物经30％乙醇水溶液热回流提取。

萃取条件：温度为80℃，回流提取2h，料液比为1∶10(W/V)，得到梅花水溶性提取物114g(Dietmate^TM-F02)。

经分析其含有总黄酮18.84％、总三萜皂苷7.08％、总酸5.64％，结果见表2。

红外光谱分析表明，该提取物在3404、2929、1606、1516、1403、1270、1078、868、818、780、612cm^-1附近有特征性吸收峰，见图4；紫外光谱分析表明，其在327nm处有强吸收，在290nm处有次强吸收，见图7。

合并F01和F02即得梅花的有效部位群(Dietmate^TM-F0)。

实施例2

梅枝提取物

用萧山大青梅细叶青(Prunus mume‘Xi Ye Qing’)枝，经采集、干燥后，粉碎成10目的粗粉，取1.5kg放入超临界萃取釜中萃取。

萃取条件：萃取压力为30MPa，萃取温度为55℃，分离温度为45℃，分离压力为4MPa，循环动态萃取2h，得到梅枝脂溶性提取物64.5g(Dietmate^TM-B01)。

经GC-MS分析其主要含长链烷烃、多烯烃、VE、植物甾醇和三萜类化合物，其中特征性化合物角鲨烯(三十碳六烯)在脂溶性有效部位中的含量为质量分数4.87％。结果见表1和图2。

从萃取釜中取出萃余物，萃余物经30％乙醇水溶液热回流提取。

萃取条件：温度为80℃，提取2h，料液比为1∶15(W/V))，得到梅枝水溶性提取物24g(Dietmate^TM-B02)。

经分析其含有总黄酮40.59％、总三萜皂苷19.07％、总酸3.70％，结果见表2。

红外光谱分析表明该提取物在3406、2926、1609、1519、1447、1394、1284、1070和611cm^-1附近有特征性吸收峰，见图5；紫外光谱分析表明其在280nm处有强吸收，在320nm处有次强吸收，见图8。

合并B01和B02即得梅枝的有效部位群(Dietmate^TM-B0)。

实施例3

梅叶提取物

用萧山大青梅红顶种(Prunus mume‘Hong Ding’)叶，经采集、干燥后，粉碎成10目的粗粉，取1.5公斤放入超临界萃取釜中萃取。

萃取条件：萃取压力为35MPa，萃取温度为55℃，分离温度为40℃，分离压力为6MPa，循环动态萃取2h，得到梅叶脂溶性提取物97.5g(Dietmate^TM-L01)。

经GC-MS分析其主要含长链烷烃、多烯烃、VE、植物甾醇和三萜类化合物，其中特征性化合物角鲨烯(三十碳六烯)在脂溶性有效部位中的含量为质量分数44.15％。结果见表1和图3。

从萃取釜中取出萃余物，萃余物经30％乙醇水溶液热回流提取。

萃取条件：温度为70℃，提取3h，料液比为1∶12(W/V))，得到梅叶水溶性提取物168g(Dietmate^TM-L02)。

经分析其含有总黄酮30.46％、总三萜皂苷4.93％、总酸5.96％，结果见表2。

红外光谱分析表明该提取物在3386、2932、1596、1516、1404、1314、1074、776、721、611、527cm^-1附近有特征性吸收峰，见图6；紫外光谱分析结果显示：在322nm处有强吸收，在285nm处有次强吸收，见图9。

合并L01和L02即得梅枝的有效部位群(Dietmate^TM-L0)。

表1青梅非果部分脂溶性有效部位(超临界CO₂萃取物)GC-MS分析结果

表2青梅非果部分水溶性有效部位(30％乙醇提取物)成分分析(％)

原料部位	总黄酮糖苷(以芦丁计)	总三萜皂苷(以人参皂苷计)	总有机酸(以柠檬酸计)
				梅花(DietmateTM-F02)	18.84	7.08	5.96
梅枝(DietmateTM-B02)	40.59	19.07	3.79
				梅叶(DietmateTM-L02)	30.46	4.93	5.65

(注：三个产品代码为Dietmate^TM-F02、Dietmate^TM-B02、Dietmate^TM-L02)

表3青梅非果部分水溶性有效部位中有机酸的HPLC测定结果

	草酸	酒石酸	苹果酸	抗坏血酸	乳酸	醋酸	柠檬酸	马来酸	琥珀酸	绿原酸
											DietmateTM-F02	0.025	-	0.086	-	-	-	0.010	-	-	3.18
DietmateTM-B02	0.068	2.148	0.563	0.028	-	-	2.698	0.010	0.380	0.57
											DietmateTM-L02	1.803	0.235	0.653	0.063	0.765	0.738	1.260	-	0.463	0.43

实施例4

梅花提取物

用萧山大青梅红丰种(Prunus mume‘Hong Feng’)花，经采集、干燥后，粉碎成10目的粗粉，取1.5公斤放入提取罐中，放入正己烷进行浸提。

浸提条件：温度为25℃，时间为4h，料液比为1∶10(W/V)，得到提取液后回收正己烷，得到梅花脂溶性提取物(Dietmate^TM-F11)85g。

梅花残渣挥干溶剂后，加入纯水，采用微波辅助提取。

提取工艺：微波辐射功率为2000W，辐射时间为30min，料液比为1∶12(W/V)，提取液经浓缩、干燥，得梅花水溶性提取物(Dietmate^TM-F12)102g。

合并F11和F12即得Dietmate^TM-F1。

实施例5

梅枝提取物

用萧山大青梅大叶青种(Prunus mume‘Da Ye Qing’)枝，经采集、干燥后，粉碎成10目的粗粉，取1.5公斤放入提取罐中，放入石油醚进行浸提。

浸提条件：温度为20℃，时间为3h，料液比为1∶15(W/V)，得到提取液后回收石油醚，得到梅枝脂溶性提取物(Dietmate^TM-B11)65g。

梅枝残渣挥干溶剂后，用50％乙醇热回流提取。

提取工艺：料液比1∶13(W/V)，温度80℃，提取时间2h，提取液经膜分离、浓缩、微波真空干燥，得梅枝水溶性提取物(Dietmate^TM-B12)20.7g。

合并B11和B12即得Dietmate^TM-B1。

实施例6

梅叶提取物

用萧山大青梅细叶青种(Prunus mume‘Xi Ye Qing’)叶，经采集、干燥后，粉碎成10目的粗粉，取1.5公斤放入提取罐中，放入乙醚进行浸提。

浸提条件：温度为20℃，时间为1.5h，料液比为1∶16(W/V)，得到提取液后回收乙醚，得到梅叶脂溶性提取物(Dietmate^TM-L11)102.6g。

梅叶残渣挥干溶剂后，采用纯水超声波辅助提取。

提取工艺：料液比1∶10(W/V)，超声波功率500W，超声波作用时间1h，提取液经过滤、大孔树脂吸附解析、浓缩、喷雾干燥，得梅叶水溶性提取物(Dietmate^TM-L12)178.4g。

合并L11和L12即得Dietmate^TM-L1。

实施例7

对上述实施例1、2和3中制备的Dietmate^TM-F02、B02和L02的清除自由基(DPPH^·、^·OH和O^· ₂ ^-)活性进行了测定。

方法如下：

(1)对DPPH自由基的清除作用

准确称取20mgDPPH，用无水乙醇定容于250mL容量瓶中，得到浓度为2×10^-4mol/L的DPPH溶液。利用DPPH溶液在517nm波长处的特征性吸收峰，用721紫外可见分光光度计测定加入试样(梅提取物系列)及其对照品(竹叶抗氧化物)后A₅₁₇的下降值、表示其对DPPH自由基的清除能力大小。反应总体积为3mL，按照表4进行加样，混合均匀后反应30mins，测定517nm波长下吸光值的变化。按照下式计算抗氧化物质对DPPH·的抑制率。

抑制率(％)＝1-[DPPH·]_t/[DPPH·]_t＝0×100

式中：[DPPH·]_t＝0-零时刻体系中二苯代苦味酰基自由基的起始浓度。

[DPPH·]_t-t时刻体系中二苯代苦味酰基自由基的起始浓度。

结果见表4。

结果表明，青梅枝提取物具有比竹叶抗氧化物更强的清除DPPH·能力，其IC₅₀(抑制率为50％时的试样浓度)为19.18μg/mL。

(2)对羟基自由基的清除作用

用Vc-Cu²⁺-H₂O₂-酵母多糖体系产生·OH，分别用不同浓度的样品0^#和1^#进行抑制，用化学发光法测定，记录每6秒的发光强度积分(CP6s)。空白用0.05mol/L pH7.8的PBS代替样品。根据试样对发光强度的抑制率来表示其清^·OH的能力。抑制率(I)的计算方法如下：

抑制率(％)＝(CP6s空白-CP6s样品)×100/CP6s空白

抑制率为50％时的试样浓度即为半抑制浓度，记作IC₅₀。其值越小，表明其抗氧化性能越强。从试样浓度与抑制率之间的一级反应线性回归方程求取IC₅₀，比较试样和对照清除^·OH的能力强弱。

结果见表4。

(3)对超氧阴离子自由基的清除作用

用邻苯三酚-Luminol发光体系产生O^·2-，分别用不同浓度的样品0^#和1^#进行抑制，用化学发光法测定，记录每36秒的发光强度积分(CP36s)。空白用0.05mol/L pH7.8的PBS代替样品。根据试样对发光强度的抑制率来表示其清O^·2-的能力。抑制率(I)计算方法同清^·OH能力的测定。用试样浓度和抑制率之间的一级反应线性回归方程求取IC₅₀，比较试样及对照清除O^·2-的能力强弱。

结果见表4。

(4)总抗氧化能力的测定

机体中有许多抗氧化物质，能使Fe³⁺还原成Fe²⁺，后者可与菲啉类物质形成稳固的络合物，通过比色可测出其抗氧化能力的高低。利用南京建成生物工程研究所出品的血清(浆)中总抗氧化能力的测定试剂盒检测青梅枝提取物在血清中的总抗氧化能力。

结果见表5。

表4梅提取物对自由基的清除作用(IC₅₀，μg/mL)

表5梅提取物的总抗氧化能力测定[A₅₂₀(测)-A₅₂₀(空)]

与空白对照比较，*p＜0.05。

结果表明，Dietmate^TM-F02、Dietmate^TM-B02以及Dietmate^TM-L02具有较好的清除DPPH/^·OH/O^· ₂ ^-的能力；与空白对照相比，Dietmate^TM-F02、Dietmate^TM-B02以及Dietmate^TM-L02均能显著提高血清的总抗氧化能力(p＜0.05)。

实施例8

对上述实施例1、2和3中制备的Dietmate^TM-F02和L02促进人游离毛囊生长的作用进行了测定。

方法如下：

显微分离法分离人的游离毛囊后，按每孔1-2个游离毛囊接种48孔板，每组8复孔，用M199培养基培养，样品与培养基以1∶19比例配制成混合培养基培养，隔天换液。游离毛囊接种第1天起，隔天用目镜测微尺测量游离毛囊全长和毛干全长，共测定5次，计算第9天与第1天毛囊和毛干长度的差值(mm)。

结果见表6。

表6梅提取物对人游离毛囊生长的影响(x±SD，n＝8)

与空白对照比较，*p＜0.05；**p＜0.01；

结果表明，Dietmate^TM-F02的低剂量组(5.45μg/mL)对游离毛囊的生长有显著的促进作用；Dietmate^TM-L02中剂量组(50μg/mL)对游离毛囊的生长有较显著的促进作用。

实施例9

对上述实施例1、2和3中制备的Dietmate^TM-F02、B02和L02抗紫外辐射的作用进行了研究。

方法如下：

取Dietmate^TM-F02、B02和L02，用乙醇定容至不同浓度，分别在100-400nm波长的范围内对其进行紫外扫描。

结果表明，Dietmate^TM-F02(1mg/mL)对290-370nm波长范围内的紫外线吸收能力非常强；Dietmate^TM-B02(1mg/mL)对290-355nm波长范围内的紫外线吸收能力非常强；Dietmate^TM-L02(1mg/mL)对290-350nm对紫外线的吸收能力非常强。

实施例10

对上述实施例1、2和3中制备的Dietmate^TM-F02、B02和L02的美白作用进行了测试。

方法如下：

色素细胞内的黑素体合成黑色素时的主要酶是酪氨酸酶，通过测定样品对酪氨酸酶的抑制效果，对其美白效果作出评价。在1mL试验溶液中加入酪氨酸酶溶液0.5mL和磷酸缓冲液0.9mL，在25℃下，保湿10min，再在25℃保湿情况下加入试样1mL到此反应混合液中，反应5min后在475nm波长下测定吸光度D1，另一个试验使用失活的酶进行同样反应，在475nm波长下测定吸光度D2，以及无试验溶液的情况下，测定吸光度D3，计算出试样对酪氨酸酶活性的抑制率。

抑制率(％)＝(D3-D1)×100/(D3-D2)，抑制活性一般以IC₅₀来表示，即半抑制浓度。

结果表明，Dietmate^TM-F02、B02、L02均能显著抑制酪氨酸酶的活性，其半抑制浓度分别为6.59、2.37和4.41mg/mL。

实施例11

将实施例3中制备的梅叶超临界萃取物(Dietmate^TM-L01，角鲨烯含量44.15％)根据以下配方(表7)制成软胶囊。

表7软胶囊配方

组成	重量(％)
		DietmateTM-L01	90
明胶	适量
		甘油	适量
去离子水	余量

本发明给10位志愿者服用了上述软胶囊，每日两粒。结果表明，该软胶囊具有显著的提高免疫力、增强体质，改善缺氧状态、消除大脑及周身疲劳、充沛精力，降低胆固醇、防治心脑血管疾病，加速细胞代谢、促进溃疡愈合，护肤美容等功能。

实施例12

以实施例2制备的Dietmate^TM-B0与破壁松花粉为主料，按照如下配方制成片剂，每片2g，配方见表8。

表8片剂配方(平面冲和浅弧冲)

给20位志愿者服用，每日两片，结果表明，制成的片剂具有显著增强人体免疫力的作用。

实施例13

以实施例3制备的Dietmate^TM-L0与竹黄酮为原料(1∶1)，不添加任何其他成分，灌制成0号胶囊，净重每粒300mg。

给6位志愿者服用，每日两粒，结果表明，该胶囊能显著增强人体的免疫力。

实施例14

以实施例2制备的Dietmate^TM-B02为原料，与梅精、糖、天然甜蜜素、柠檬酸等复配制备饮料，其重量配比如下：每1000克饮用水配：Dietmate^TM-B022-6克、梅精1-3克、食用糖20-40克、天然甜蜜素1-3克和柠檬酸1-2克，配制过程包括：配料、过滤、均质杀菌、封口灌装及质量检验。

给12位志愿者饮用，每日500mL，结果表明，这是男女老少皆宜的健康饮料，属碱性食品，具有防治血液酸化、提高机体免疫、改善亚健康状态及提高智力之功效。

实施例15

以实施例1制备的Dietmate^TM-F02(100g)为原料，直接加入1000L酒精度为18％的黄酒中，充分溶解、混匀，罐装，即制得梅花养生酒，具有延年益寿的保健作用。

实施例16

应用实施例1中制备的Dietmate^TM-F01，根据常规工艺制备本发明的香水，具有高雅的梅花幽香和抗菌、消炎的作用。

表9香水配方

组份	重量(％)
		DietmateTM-F01	0.2-1.5
贯中提取物	0.5-4.5
		双花提取物	0.2-2.5
黄芪提取物	3-2.5
		板兰根提取物	0.3-3.5
干姜提取物	2-2.5
		薄荷	0.1-1.5
乙醇	65-95
		香精	3-10
去离子水	余量

实施例17

应用实施例1中制备的Dietmate^TM-F02，根据《化妆品》(徐艳萍、杜薇薇，2003版，科学技术文献出版社)中所述的生发剂常规工艺制备本发明的生发剂。给10位志愿者(年龄45-67岁)试用，每两天洗一次头，每次5mL，连续2个月，结果表明，该生发剂具有防止脱发，促进毛发生长的作用。

表10生发剂配方

组份	重量(％)
		DietmateTM-F02	0.1
石蜡	1.2
		巴西棕榈蜡	1.2
视黄酸	0.005
		乙酸基化椰子胺	2.4
多分子增稠剂(Carbopol 941)	1.2
		防腐剂	适量
香精	适量
		抗氧化剂	适量
去离子水	余量

实施例18

应用实施例2中制备的Dietmate^TM-B02，根据《化妆品原理、配方、生产工艺》(王培义，1999年版，化学工业出版社)中所述的防晒霜常规工艺制备本发明的防晒霜。给10位志愿者(女性)试用，每日出门前，涂于手背，连续1个月，结果表明，该防晒霜具有显著的防晒和美白皮肤的作用。

表11防晒霜配方

组成	重量(％)
		DietmateTM-B02	2.5％
棕榈酸辛酯	5.0
		单硬脂酸甘油脂	4.0
十八醇	2.0-4.0
		二甲基硅油	2.0-4.0
羊毛脂	3.0-5.0
		蜂蜡	10
聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯	3.0-5.0
		维生素E乙酸酯	0.1-0.2
咪唑烷基脲	0.2-0.3

香精	0.5-1.0
		去离子水	余量

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

Claims (10)

1.一种梅树提取物，其特征在于，它含有0.5-50wt％角鲨烯，按提取物的总重量计。

2.如权利要求1所述的梅树提取物，其特征在于，所述的提取物是梅树的花、枝和/或叶的脂溶性有效部位。

3.如权利要求1所述的梅树提取物，其特征在于，所述的梅树为蔷薇科的梅树；更佳地梅树为青梅。

I角鲨烯(Squalene)

II木栓酮(Friedelin)

III叶绿醇(Phytol)

IV谷甾醇(Sitosterol)

V柠檬酸(Citric acid)

VI酒石酸(Tartaric acid)

VII苹果酸(Malic acid)

VIII绿原酸(Chlorogenic acid)

IX琥珀酸(Succinic acid)

X槲皮素(Quercetin)及其衍生物。

4.一种权利要求1所述的梅树提取物的制备方法，其特征在于，它包括步骤：

(i)用超临界CO2流体或非极性有机溶剂萃取梅树原料，所述的原料包括花、枝和/或叶，并分离出脂溶性有效部位作为梅树提取物，其中所述的梅树提取物含有0.5-50wt％角鲨烯。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，该方法还包括步骤：

(ii)对步骤(i)中经萃取的梅树原料，用醇-水溶剂提取，得到水溶性有效部位，所述的水溶性有效部位含有黄酮糖苷、三萜皂苷和有机酸。

6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的萃取方法是超临界CO2流体萃取，其中条件如下：萃取压力5-50MPa，萃取温度20-90℃，分离温度20-80℃，分离压力为2-10MPa；循环动态萃取0.5-7小时；所述的非极性有机溶剂的萃取采用浸渍法或渗漉法，浸提温度10-70℃，浸提时间0.2-48小时，料液比W/V：1∶3-30。

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的醇-水溶液提取温度为60-100℃，提取时间0.1-5小时，料液比W/V：1∶3-30。

8.一种组合物，其特征在于，它含有如权利要求1-3中任一所述的梅树提取物。

9.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述的组合物还包括选自下组的额外组分：梅果提取物、松花粉、竹黄酮或其混合。

10.一种如权利要求1所述的梅树提取物的用途，其特征在于，它可用于制备抗自由基、抗氧化、抗菌、脱敏、改善肠胃功能、防治血液酸化、促进血液循环、消除疲劳、缓解精神压力、增强免疫功能、调节脂质代谢、减肥、降低血压、保护心脑血管、预防癌症、促进头发生长或防脱发的组合物。

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