CN115252489A - 一种红山茶花叶提取物的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种红山茶花叶提取物的制备方法及其应用；山茶花、叶中含有大量的黄酮和多酚类物质，经过超临界CO2预处理，超声萃取和酶解萃取最大限度的提取其含有的黄酮和多酚；再经过絮凝、超滤膜纯化、大孔树脂纯化，可以极大地提高提取物中黄酮和多酚的含量，其中，多酚类物质，儿茶素、芦丁、没食子酸、原儿茶酸等活性物质的含量增加一倍以上；黄酮类物质槲皮素、金丝桃苷、木犀草素等含量提高一倍以上。经过上述工艺制备的山茶花、叶提取物具有优秀的抗糖化、抗氧化、抗皱、美白等功效，用其制备的化妆品具有很高抗氧化、抗糖化、抗衰老、提亮肤色、提高皮肤弹性等修复皮肤屏障的功效。

Description

一种红山茶花叶提取物的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于红山茶深加工技术与应用领域，具体涉及一种红山茶花叶提取物的制备方法及其应用，本发明制得的红山茶花叶提取物中的红山茶活性物质具有抗糖化、抗氧化、抗皱、美白等功效，可以作为功效原料广泛的应用于化妆品。
背景技术
山茶花(Camellia japonica L.)为山茶科山茶属植物，同属植物有220种以上，主产东亚，原产我国的有190种以上。原产于喜玛拉雅山一带，重庆、浙江、江西、四川及山东；日本、朝鲜半岛也有分布，尤以云南为盛。后来山茶花传入欧美，成为世界知名的花卉之一。
近年来含天然植物成分的护肤品因其安全性、有效性逐渐收到人们的喜爱和认可。作为天然资源的山茶花，富含黄酮、多酚、VE、油酸、角鲨烯、植物甾醇等多种生物活性成分及钙、钾、镁、锰等营养元素；其提取物具有良好的修复皮肤屏障的功效。然而，即便是同种山茶花，不同产地的山茶花提取液中活性物含量和抗氧化能力存在显著差异。因此，有必要对山茶花提取技术开展深入研究。
红山茶花属于山茶花中的一种，有研究通过对西南山茶花的95％乙醇提取物进行广泛的活性筛选，结果表明西南红山茶花醇提取物有较强的抗过敏作用。但目前对红山茶花的提取技术及提取物活性成分的分析等研究仍有待加强。
超声萃取利用超声波辐射压强产生的强烈空化应效应、机械振动、扰动效应、高的加速度、扩散、击碎和搅拌作用等多级效应，增大山茶花叶中活性物质分子运动频率和速度，增加溶剂穿透力，从而加速活性物质成分进入溶剂，提高活性物质的萃取效率；山茶花、叶中含有很多纤维素，植物细胞的细胞壁也含有大量的纤维素，通过加入生物酶可以把花、叶中的纤维素分解成寡糖或单糖，破坏纤维素和细胞壁从而提高多酚和黄酮等活性物的提取率。
大孔树脂吸附纯化技术是纯物理纯化过程，工作原理是依靠它和被吸附的分子之间的范德华引力，通过它巨大的比表面进行物理吸附而工作，使有机化合物根据有吸附力及其分子量大小可以经一定溶剂洗脱分开而达到分离、纯化、除杂、浓缩等不同目的。通过大孔树脂的吸附作用可以纯化山茶花叶提取物中的黄酮和多酚，使其纯度大大提高。中国专利CN201310290155.9公开大孔树脂吸附纯化油茶多酚的方法，但目前还未有采用大孔树脂吸附的方法同时纯化红山茶花叶提取物中黄酮和多酚研究。
膜分离技术是指在分子水平上不同粒径分子的混合物在通过半透膜时，依据膜孔径和分子粒径大小不同，实现选择性分离的技术，本发明采用超滤膜分离技术，可以更有效的红山茶花叶提取物中的物质进行筛分，是一种高效活性物纯化技术。把大孔树脂纯化技术和膜分离纯化技术结合起来用于红山茶花叶中活性成分纯化属首次。
发明内容
为了解决红山茶中活性物提取率低，提取物杂质含量高、产品不稳定、功效差等原因引起的红山茶资源利用率低的问题，本发明提供了一种红山茶花叶提取液的制备方法及其应用，本发明提供的提取工艺可以大大的提高红山茶花叶中黄酮和多酚的提取率，同时本发明首次把大孔树脂吸附技术和膜分离技术结合起来用于红山茶花叶提取物中黄酮和多酚纯化，使得最终制备的红山茶花叶提取物中黄酮和多酚含量大大提高，其中多酚类物质，儿茶素、芦丁、没食子酸、原儿茶酸等物质的含量增加一倍以上；黄酮类物质槲皮素、金丝桃苷、木犀草素等含量提高一倍以上。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
第一方面，本发明提供一种红山茶花叶提取物的制备方法，所述方法包括如下步骤：
S1、将红山茶叶粉末和红山茶花粉末混匀，进行超临界CO2萃取，萃取结束后，取出红山茶花叶粉末；
S2、在步骤S1萃取得到的红山茶花叶粉末中加入醇溶液，超声处理；
S3、超声处理后溶液中加入纤维素酶萃取，过滤得到红山茶花叶粗提液；
S4、超滤膜过滤步骤S3所得滤液，再经大孔树脂吸附纯化，即得所述红山茶花叶提取液。
本发明中，红山茶叶粉末和红山茶花粉末，是将避光干燥后的红山茶花和红山茶叶分别粉碎，过筛而得。
步骤S1中，红山茶叶粉末和红山茶花粉末的质量比为10:1-1:10。
本发明中，所述超临界CO2萃取，萃取压力为10MPa-30 MPa，萃取温度为35℃-50℃，萃取时间为30min-2h。
步骤S2中，所述醇溶液为乙醇的含量为10％-90％的乙醇水溶液，所述乙醇水溶液的用量是红山茶花叶粉末质量的10-20倍。
步骤S2中，所述超声处理的温度控制在40℃以下，超声时间为10min-60min，超声功率为500W-3000W。
步骤S3中，纤维素酶萃取温度控制在40℃-70℃，搅拌萃取1h-4h。
步骤S3中，纤维素酶的用量是红山茶花叶粉末质量的0.2-2％。
步骤S3中，萃取完成后，等提取液温度降至室温，过滤得到红山茶花叶粗提液。
步骤S4中，超滤膜截留分子量为500-3500。
步骤S4中，所述大孔树脂包括D-101系列、AB-8、X-5、NKA-9或HPD系列。
步骤S4中，所述大孔树脂使用前经过预处理，所述预处理包括如下步骤：
A1、先于大孔树脂吸附柱内加入相当于装填树脂体积0.4-0.5倍的无水乙醇，然后将树脂投入柱中，使其液面高于树脂层0.2-0.4m处，并浸泡20-28小时；
A2、用1-3BV无水乙醇，以1BV/h的流速通过树脂层，并浸泡4-5小时；
A3、用无水乙醇以1BV/h的流速通过树脂层，洗至流出液加水不呈白色混浊和无异味为止，并用水以同样流速洗净乙醇；
A4、用1-2BV的3-5％HCl溶液，以1BV/h的流速通过树脂层，并浸泡2-4小时，然后用水以同样流速洗至出水pH中性；
A5、用1-2BV的3-5％NaOH溶液，以1BV/h的流速通过树脂层，并浸泡2-4小时，然后用水以同样流速洗至出水pH中性。
步骤S4中，所述吸附纯化包括如下步骤：
B1、把0.5-3BV(BV：大孔树脂的床层体积)的红山茶花叶提取液，以0.5-3BV/h的速度通过大孔树脂吸附柱；
B2、用水以1-3BV/h的速度冲洗大孔树脂吸附柱，洗至流出液无色；
B3、再用2-5BV的乙醇溶液以0.5-3BV/h流速洗脱大孔树脂柱，其中乙醇溶液中乙醇的含量为30％-90％，回收洗脱液；浓缩到其质量的1/4-1/10；
B4、向浓缩液中加入其质量1-2倍的水和多元醇的混合溶液，混合溶液中多元醇质量为0.1％-65％，其余为水；过滤。
本发明中，所述多元醇选自丙二醇、丁二醇系列、戊二醇中的一种或几种。
第二方面，本发明提供一种上述方法制得的红山茶花叶提取液，所述红山茶花叶提取液中含儿茶素、芦丁、没食子酸、原儿茶酸、槲皮素、金丝桃苷、木犀草素。
第三方面，本发明提供一种红山茶组合物，所述组合物中主要活性成分为所述红山茶花叶提取液。
第四方面，本发明提供一种红山茶组合物在制备化妆品中的应用。
本发明中，所述化妆品包括化妆水、精华液、护肤乳、护肤膏/霜、面贴膜、洁面制剂。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)采用超临界CO2萃取技术预处理红山茶花叶粉末，可以把红山茶花叶中的挥发性油、脂溶性成分去除，可以提高后面黄酮和多酚的提取率；
(2)采用超声萃取和酶解萃取结合的方法可以提高红山茶花叶中黄酮和多酚的提取率，跟传统的溶剂萃取法对比黄酮提取率由1.2％提高到3％以上，多酚的提取率由0.8％提高到2％以上，这是由于超声具有强烈空化应效应、机械振动、扰动效应、可以增加花叶中活性物质分子运动频率和速度，增加溶剂穿透力，从而加速活性物质成分进入提取溶剂；生物酶可以增加花叶细胞壁、细胞膜的通透性，有利于活性物质的释放和浸出。花叶中活性物质提取率的提高，大大提升了红山茶花叶的利用率；
(3)首次将大孔树脂吸附纯化技术和膜分离纯化技术结合起来用于红山茶花叶提取物中活性物质黄酮和多酚的纯化，经过纯化后提取物中黄酮的含量28％提高到50％以上，如槲皮素、金丝桃苷、木犀草素等含量提高一倍以上，多酚的含量由26％提高到50％以上，如儿茶素、芦丁、没食子酸、原儿茶酸等物质的含量增加一倍以上大大的提高提取物中黄酮和多酚的含量，进而提高了红山茶花叶提取物的护肤功效；
(4)本发明通过超声、酶解、絮凝、大孔树脂吸附、膜分离制备的山茶花叶提取物，含有大量的黄酮和多酚等活性物质，具有抗氧化、抗糖化、抗衰老、美白、提高皮肤弹性等修复皮肤屏障的功效，实验研究表明，该提取物的DPPH和ABTS自由基的半清除浓度IC50分别为0.10％和0.09％；该提取物在5mg/mL的浓度下，AGEs的抑制率为64.16％；该提取物在10mg/mL的浓度下，黑色素细胞内外黑色素的抑制率分别为88.19％和90.26％；该提取物在10mg/mL的浓度下，体外成纤维细胞中Ⅰ型胶原蛋白合成的促进率和MMP(基质金属蛋白酶)1的抑制率分别为20.68％和30.28％；该提取物在5％的浓度下，使用者皮肤弹性R2值的变化率高达10.73％；
(5)本发明首次发现了红山茶花叶提取物中活性成分-木犀草素，以及首次发现红山茶花叶提取物具有抗糖化的功效。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为实施例1提取物的物质图谱；
图2为实施例3提取物的物质图谱；
图3为对比例1提取物的物质图谱；
图4为对比例2提取物的物质图谱；
图5为对比例4提取物的物质图谱；
图6为对比例8提取物的物质图谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
(1)本发明涉及的红山茶花叶中活性物质的测试方法：
总多酚的测试方法参照T/AHFIA005-2018
总黄酮的测试方法参照DB43/T 476-2009
槲皮素含量测试方法参照GB/T 19427-2003
金丝桃苷含量测试方法参照GB/T 40643-2021
木犀草素含量测试方法参照权洪峰,付雪艳,董琳,等.HPLC法测定苦苣菜中槲皮素和木犀草素的含量.
儿茶素含量测试方法参照GB/T 8313-2018
芦丁含量测试方法参照李振志,朱华,谢锋,等.不同产地槐米中芦丁的含量测定[J].世界中医药,2013(8):3.
没食子酸含量测试方法参照中国药典2020
原儿茶酸含量测试方法参照罗锐,何智建.不同产地狗脊中原儿茶酸和原儿茶醛的含量测定[J].临床医学工程,2011,18(7):2.
(2)大孔树脂预处理方法
(a)先于吸附柱内加入相当于装填树脂体积0.4-0.5倍的无水乙醇，然后将树脂投入柱中，使其液面高于树脂层约0.3m处，并浸泡24小时；(b)用2BV无水乙醇，以1BV/h的流速通过树脂层，并浸泡4-5小时；
(c)用无水乙醇以1BV/h的流速通过树脂层，洗至流出液加水不呈白色混浊和无异味为止，并用水以同样流速洗净乙醇；
(d)用1BV的4％HCl溶液，以1BV/h的流速通过树脂层，并浸泡2-4小时，然后用水以同样流速洗至出水pH中性；
(e)用1BV的4％NaOH溶液，以1BV/h的流速通过树脂层，并浸泡2-4小时，然后用水以同样流速洗至出水pH中性；
实施例1
(1)将避光干燥后的红山茶花和红山茶叶分别粉碎，然后过筛；
(2)将上述过筛后的红山茶叶粉末和红山茶花粉末按照质量10:1的比例均匀混合，装入超临界萃取釜，用超临界CO2萃取，萃取压力10MPa，萃取温度35℃，萃取时间30min，萃取结束后，把花叶粉末取出。
(3)把上述红山茶花叶粉末加入其质量10倍的乙醇水溶液中，其中乙醇的含量为10％；将上述乙醇溶液控制在40℃以下，然后超声10min，其中超声功率为500W-；
(4)把上述溶液温度控制在40℃，然后加入红山茶花叶质量0.2％的纤维素酶，搅拌萃取1h；
(5)萃取完成后，等提取液温度降至室温，过滤得到红山茶花叶提取液；
(6)经过测试溶液中多酚含量2496.4ppm，多酚的提取率1.8％，其中儿茶素、芦丁、没食子酸、原儿茶酸的含量分别为51.2ppm、12.8ppm、36.2pm、21.4ppm；黄酮含量3342.8ppm，黄酮的提取率2.2％，其中槲皮素、金丝桃苷、木犀草素的含量分别为18.4ppm、15.6ppm、3.6ppm，相关物质图谱见图1。
(8)用超滤膜过滤上述液体，其中超滤膜截留分子量为500；
(9)把上述液体用D-101-1大孔树脂吸附纯化，大孔树脂吸附纯化工艺为：
(a)把0.5BV(BV：大孔树脂的床层体积)的红山茶花叶提取液，以0.5BV/h的速度通过大孔树脂吸附柱；
(b)用水以1BV/h的速度冲洗大孔树脂柱，洗至流出液无色；
(c)再用2BV的乙醇溶液以0.5BV/h流速洗脱大孔树脂柱，其中乙醇的含量为30％，回收洗脱液；
(10)上述液体浓缩到其质量的1/4；
(11)向上述浓缩液中加入其质量1.5倍水和多元醇(丙二醇系列、丁二醇系列、戊二醇系列等)，其中多元醇质量为0.1％，其余为水；
(12)将上述溶液过滤。
(13)经过测试上述溶液中多酚含量3195.5ppm，其中儿茶素、芦丁、没食子酸、原儿茶酸的含量分别为135.6ppm、30.1ppm、83.2pm、51.7ppm；黄酮含量4344.1ppm，其中槲皮素、金丝桃苷、木犀草素的含量分别为47.6ppm、37.1ppm、12.4ppm。
实施例2
(1)将避光干燥后的红山茶花和红山茶叶分别粉碎，然后过筛；
(2)将上述过筛后的红山茶叶粉末和红山茶花粉末按照质量1:10的比例均匀混合，装入超临界萃取釜，用超临界CO2萃取，萃取压力30MPa，萃取温度35℃，萃取时间32h，萃取结束后，把花叶粉末取出。
(3)把上述红山茶花叶粉末加入其质量20倍的乙醇水溶液中，其中乙醇的含量为90％；将上述乙醇溶液控制在40℃以下，然后超声60min，其中超声功率为3000W；
(4)把上述溶液温度控制在70℃，然后加入红山茶花叶质量2％的纤维素酶，搅拌萃取4h；
(5)萃取完成后，等提取液温度降至室温，过滤得到红山茶花叶提取液；
(6)经过测试溶液中多酚含量1826.4ppm，多酚的提取率2.1％，其中儿茶素、芦丁、没食子酸、原儿茶酸的含量分别为30.7ppm、7.8ppm、23.5pm、12.8ppm；黄酮含量2342.8ppm，黄酮的提取率2.6％，其中槲皮素、金丝桃苷、木犀草素的含量分别为12.1ppm、8.7ppm、2.3ppm；
(7)把过滤后红山茶花叶提取液加热到70℃，然后加入提取液质量8％的天然澄清剂B，搅拌均匀，然后每隔60min搅拌一次，搅拌6次；再加入提取液质量6％的天然澄清剂A，搅拌均匀，然后每隔360min搅拌一次，搅拌6次；最后过滤；
(8)用超滤膜过滤上述液体，其中超滤膜截留分子量为3500；
(9)把上述液体用NKA-9大孔树脂吸附纯化，大孔树脂吸附纯化工艺为：
(a)把3BV(BV：大孔树脂的床层体积)的红山茶花叶提取液，以3BV/h的速度通过大孔树脂吸附柱；
(b)用水以3BV/h的速度冲洗大孔树脂柱，洗至流出液无色；
(c)再用5BV的乙醇溶液以3BV/h流速洗脱大孔树脂柱，其中乙醇的含量为90％，回收洗脱液；
(10)上述液体浓缩到其质量的1/10；
(11)向上述浓缩液中加入其质量1.5倍水和多元醇(丙二醇系列、丁二醇系列、戊二醇系列等)，其中多元醇质量为65％，其余为水；
(12)将上述溶液过滤；
(13)经过测试上述溶液中多酚含量2765.7，其中儿茶素、芦丁、没食子酸、原儿茶酸的含量分别为83.48ppm、21.57ppm、67.5pm、42.2ppm；黄酮含量3748.1ppm，其中槲皮素、金丝桃苷、木犀草素的含量分别为35.2ppm、24.9ppm、7.8ppm。
实施例3
(1)将避光干燥后的红山茶花和红山茶叶分别粉碎，然后过筛；
(2)将上述过筛后的红山茶叶粉末和红山茶花粉末按照质量1:5的比例均匀混合，装入超临界萃取釜，用超临界CO2萃取，萃取压力20MPa，萃取温度45℃，萃取时间1h，萃取结束后，把花叶粉末取出。
(3)把上述红山茶花叶粉末加入其质量15倍的乙醇水溶液中，其中乙醇的含量为60％；将上述乙醇溶液控制在40℃以下，然后超声30min，其中超声功率为3000W；
(4)把上述溶液温度控制在50℃，然后加入红山茶花叶质量2％的纤维素酶，搅拌萃取4h；
(5)萃取完成后，等提取液温度降至室温，过滤得到红山茶花叶提取液；
(6)经过测试溶液中多酚含量2145.4ppm，多酚的提取率2.2％，其中儿茶素、芦丁、没食子酸、原儿茶酸的含量分别为33.7ppm、10.1ppm、31.4pm、16.7ppm；黄酮含量3156.2ppm，黄酮的提取率3.1％，其中槲皮素、金丝桃苷、木犀草素的含量分别为16.3ppm、14.7ppm、3.1ppm；相关物质图谱见图2。
(7)把过滤后红山茶花叶提取液加热到50℃，然后加入提取液质量4％的天然澄清剂B，搅拌均匀，然后每隔50min搅拌一次，搅拌3次；再加入提取液质量2％的天然澄清剂A，搅拌均匀，然后每隔40min搅拌一次，搅拌2次；最后过滤；
(8)用超滤膜过滤上述液体，其中超滤膜截留分子量为2000；
(9)把上述过滤液用X-5大孔树脂吸附纯化，大孔树脂吸附纯化工艺为：
(a)把2BV(BV：大孔树脂的床层体积)的红山茶花叶提取液，以1.5BV/h的速度通过大孔树脂吸附柱；
(b)用水以2BV/h的速度冲洗大孔树脂柱，洗至流出液无色；
(c)再用3BV的乙醇溶液以2BV/h流速洗脱大孔树脂柱，其中乙醇的含量为70％，回收洗脱液；
(10)上述液体浓缩到其质量的1/5；
(11)向上述浓缩液中加入其质量1.5倍水和多元醇(丙二醇系列、丁二醇系列、戊二醇系列等)，其中多元醇质量为15％，其余为水；
(12)将上述溶液过滤；
(13)经过测试上述溶液中多酚含量2895.8，其中儿茶素、芦丁、没食子酸、原儿茶酸的含量分别为71.6ppm、26.3ppm、74.6pm、40.3ppm；黄酮含量4418.4ppm，其中槲皮素、金丝桃苷、木犀草素的含量分别为37.6ppm、31.3ppm、7.5ppm。
实施例4
(1)将避光干燥后的红山茶花和红山茶叶分别粉碎，然后过筛；
(2)将上述过筛后的红山茶叶粉末和红山茶花粉末按照质量1:6的比例均匀混合，装入超临界萃取釜，用超临界CO2萃取，萃取压力15MPa，萃取温度40℃，萃取时间1.5h，萃取结束后，把花叶粉末取出。
(3)把上述红山茶花叶粉末加入其质量13倍的乙醇水溶液中，其中乙醇的含量为30％；将上述乙醇溶液控制在38℃，然后超声45min，其中超声功率为3000W；
(4)把上述溶液温度控制在60℃，然后加入红山茶花叶质量1％的纤维素酶，搅拌萃取4h；
(5)萃取完成后，等提取液温度降至室温，过滤得到红山茶花叶提取液；
(6)经过测试溶液中多酚含量2035.4ppm，多酚的提取率2.3％，其中儿茶素、芦丁、没食子酸、原儿茶酸的含量分别为31.4ppm、9.6ppm、30.7pm、15.2ppm；黄酮含量3471.8ppm，黄酮的提取率3.3％，其中槲皮素、金丝桃苷、木犀草素的含量分别为15.7ppm、13.2ppm、3.3ppm；
(7)把过滤后红山茶花叶提取液加热到60℃，然后加入提取液质量6％的天然澄清剂B，搅拌均匀，然后每隔30min搅拌一次，搅拌4次；再加入提取液质量4％的天然澄清剂A，搅拌均匀，然后每隔30min搅拌一次，搅拌5次；最后过滤；
(8)用超滤膜过滤上述液体，其中超滤膜截留分子量为1500；
(9)把上述液体用AB-8大孔树脂吸附纯化，大孔树脂吸附纯化工艺为：
(a)把1.5BV(BV：大孔树脂的床层体积)的红山茶花叶提取液，以1BV/h的速度通过大孔树脂吸附柱；
(b)用水以2BV/h的速度冲洗大孔树脂柱，洗至流出液无色；
(c)再用3BV的乙醇溶液以1BV/h流速洗脱大孔树脂柱，其中乙醇的含量为70％，回收洗脱液；
(9)用超滤膜过滤上述洗脱液，其中超滤膜截留分子量为1500；
(10)上述液体浓缩到其质量的1/4.5；
(11)向上述浓缩液中加入其质量1.5倍水和多元醇(丙二醇系列、丁二醇系列、戊二醇系列等)，其中多元醇质量为5％，其余为水；
(12)将上述溶液过滤；
(13)经过测试上述溶液中多酚含量3256.7，其中儿茶素、芦丁、没食子酸、原儿茶酸的含量分别为80.6ppm、36.7ppm、81.4pm、44.2ppm；黄酮含量5380.2ppm，其中槲皮素、金丝桃苷、木犀草素的含量分别为46.2ppm、34.3ppm、10.6ppm。
对比例1
本对比例为实施例1的对比例，本对比例不采用超临界CO2萃取预处理，即将实施例1中的步骤(2)中的超临界CO2萃取取消，其余步骤相同。经过测试，萃取完成后的溶液中多酚含量2345.1ppm，多酚的提取率1.7％，其中儿茶素、芦丁、没食子酸、原儿茶酸的含量分别为48.7ppm、12.1ppm、34.3pm、20.5ppm；黄酮含量3216.5ppm，黄酮的提取率2.1％，其中槲皮素、金丝桃苷、木犀草素的含量分别为16.9ppm、14.7ppm、3.5ppm；最终的产品中多酚含量3003.7ppm，其中儿茶素、芦丁、没食子酸、原儿茶酸的含量分别为127.4ppm、28.3ppm、78.2pm、48.6ppm；黄酮含量4096.3ppm，其中槲皮素、金丝桃苷、木犀草素的含量分别为45.2ppm、35.4ppm、11.6ppm。相关物质图谱见图3。
对比例2
本对比例为实施例1的对比例，本对比例不采用超声萃取，即将实施例1中的步骤(3)取消，其余步骤相同。经过测试，萃取完成后的溶液中多酚含量2011.6ppm，多酚的提取率1.5％，其中儿茶素、芦丁、没食子酸、原儿茶酸的含量分别为41.5ppm、10.3ppm、29.3pm、17.3ppm；黄酮含量2674.2ppm，黄酮的提取率1.8％，其中槲皮素、金丝桃苷、木犀草素的含量分别为14.7ppm、12.5ppm、2.8ppm；最终的产品中多酚含量2566.7ppm，其中儿茶素、芦丁、没食子酸、原儿茶酸的含量分别为94.7ppm、23.6ppm、65.4pm、36.3ppm；黄酮含量3265.2ppm，其中槲皮素、金丝桃苷、木犀草素的含量分别为34.6ppm、27.8ppm、0ppm。相关物质图谱见图4。
对比例3
本对比例为实施例1的对比例，本对比例不采用酶解萃取，即将实施例1中的步骤(4)取消，其余步骤相同。经过测试，萃取完成后的溶液中多酚含量1802.6ppm，多酚的提取率1.3％，其中儿茶素、芦丁、没食子酸、原儿茶酸的含量分别为35.9pm、9.6ppm、26.8pm、15.8ppm；黄酮含量2303.9ppm，黄酮的提取率1.6％，其中槲皮素、金丝桃苷、木犀草素的含量分别为13.1ppm、11.6ppm、2.6ppm；最终的产品中多酚含量2076.3ppm，其中儿茶素、芦丁、没食子酸、原儿茶酸的含量分别为84.7ppm、21.6ppm、63.1pm、33.7ppm；黄酮含量2763.6ppm，其中槲皮素、金丝桃苷、木犀草素的含量分别为28.8ppm、24.5ppm、7.9ppm。
对比例4
本对比例为实施例1的对比例，本对比例不采用超声萃取和酶解萃取，即将实施例1中的步骤(3)(4)取消，其余步骤相同。经过测试，萃取完成后的溶液中多酚含量1086.7ppm，多酚的提取率0.8％，其中儿茶素、芦丁、没食子酸、原儿茶酸的含量分别为20.8pm、5.8ppm、16.1pm、9.5ppm；黄酮含量1724.6ppm，黄酮的提取率1.2％，其中槲皮素、金丝桃苷、木犀草素的含量分别为9.3ppm、8.7ppm、2.1ppm；最终的产品中多酚含量1304.1ppm，其中儿茶素、芦丁、没食子酸、原儿茶酸的含量分别为43.5ppm、12.3ppm、41.6pm、22.8ppm；黄酮含量2241.6ppm，其中槲皮素、金丝桃苷、木犀草素的含量分别为21.5ppm、17.4ppm、0ppm。相关物质图谱见图5。
对比例5
本对比例为实施例3的对比例，本对比例不采用膜过滤纯化，即将实施例3中的步骤(8)取消，其余步骤相同。经过最终产品中多酚含量2681.2，其中儿茶素、芦丁、没食子酸、原儿茶酸的含量分别为61.4ppm、18.2ppm、56.5pm、30.1ppm；黄酮含量3945.3ppm，其中槲皮素、金丝桃苷、木犀草素的含量分别为27.6ppm、27.5ppm、5.6ppm。
对比例6
本对比例为实施例3的对比例，本对比例不采用大孔树脂吸附纯化，即将实施例3中的步骤(9)中的大孔树树脂换成没有吸附效果的玻璃珠，其余步骤相同。经过最终产品中多酚含量2564.5，其中儿茶素、芦丁、没食子酸、原儿茶酸的含量分别为57.1ppm、16.3ppm、51.8ppm、27.6ppm；黄酮含量3785.3ppm，其中槲皮素、金丝桃苷、木犀草素的含量分别为25.3ppm、26.2ppm、4.7ppm。
对比例7
本对比例为实施例3的对比例，本对比例不采用膜分离纯化和大孔树脂吸附纯化，即将实施例3中的步骤(8)取消，步骤(9)中的大孔树树脂换成没有吸附效果的玻璃珠，其余步骤相同。经过最终产品中多酚含量2113.5，其中儿茶素、芦丁、没食子酸、原儿茶酸的含量分别为32.6ppm、9.8ppm、30.7ppm、16.3ppm；黄酮含量3148.8ppm，其中槲皮素、金丝桃苷、木犀草素的含量分别为15.6ppm、14.1ppm、2.9ppm。
对比例8
本对比例为实施例3的对比例，具体实施步骤如下：
(1)将红山茶花、红山茶叶按1:1的比例混合，粉碎过筛，粉碎目数为80目，样品过筛率≥98％；
(2)将过筛后的山茶籽进行超临界萃取，然后进行两级分离；超临界萃取的参数：CO2流体的流速为30ml/min；萃取压力为20Mpa；萃取温度为40℃；萃取时间为1.5h；两级分离的参数为：Ⅰ级分离压力为10Mpa，温度为30℃；Ⅱ级分离压力为7Mpa，温度为30℃；
(3)将步骤上述制得的红山茶花叶残渣中，加入占山茶花叶残渣重量0.5‰的果胶酶、占山茶花叶残渣重量1‰的纤维素酶、占山茶花叶残渣重量5‰的淀粉酶作为酶制剂，加入15倍山茶花叶残渣重量的乙醇溶液(质量分数为60％)，并在40-50℃下搅拌反应30-60min，搅拌速度为100-200rpm/min，得红山茶花叶残渣酶解醇提物，经过测试溶液中多酚含量877.6ppm，多酚的提取率0.9％，其中儿茶素、芦丁、没食子酸、原儿茶酸的含量分别为13.5ppm、4.1ppm、12.6pm、6.7ppm；黄酮含量1325.6ppm，黄酮的提取率1.3％，其中槲皮素、金丝桃苷、木犀草素的含量分别为6.7ppm、6.3ppm、0ppm。相关物质图谱见图6。
功效验证实验：
(1)抗氧化实验
将上述所有的实施例和对比例制备的红山茶花叶提取物进行DPPH自由基清除率的抗氧化测试，同时为了更直观的观察红山茶花叶提取物的抗氧化能力，选用常见的抗氧化剂Vc作为对照。具体方法如下：
实验步骤：试管中加入2mL DPPH乙醇溶液和2mL待测样品(红山茶花叶提取物、Vc)溶液，震荡混匀后避光反应30min，于517nm处测吸光值A，同时测2mL DPPH乙醇溶液和2mL无水乙醇混合液的吸光值A0，以及2mL无水乙醇和2mL待测样品混合液的吸光值Ab。
计算DPPH自由基清除率：DPPH·自由基的清除率(％)＝(A0-(A-Ab))/A0×100；IC50为半数抑制率浓度：也就是指自由基清除率为50％时的自由基清除剂的浓度。IC50值是评价自由基清除剂效果的常用指标，其值越小表示达到50％自由基清除率时所用的自由基清除剂的浓度剂量越小，其自由基清除效果也就越好。在作出提取物对DPPH自由基清除作用曲线后，计算IC50值表示其抗氧化活性。结果如下表1所示：
表1实施例1-4，对比例1-8的红山茶花叶提取液和Vc的DPPH自由基的IC50值
样品 IC50(mg/mL)
实施例1 0.11
实施例2 0.12
实施例3 0.12
实施例4 0.10
对比例1 0.13
对比例2 0.17
对比例3 0.23
对比例4 0.26
对比例5 0.14
对比例6 0.15
对比例7 0.20
对比例8 0.42
Vc 0.0042
(2)抗糖实验
将上述所有的实施例和对比例制备的红山茶花叶提取物进行抗糖化实验，同时为了更直观的观察红山茶花叶提取物的抗糖化能力，选用常见的抗糖化剂氨基胍作为对照。原理如下：
利用牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)在葡萄糖(Glucose)非酶糖化反应(Maillard reaction)的晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)。由于某些糖基化蛋白质具有发荧光的特性，因而可用荧光分光光度计，测定在激发波长355nm/发射波长460nm荧光值可判定蛋白质糖基化水平。具体实验方法参照：Meeprom,A.,W.Sompong,C.B.Chan and S.Adisakwattana(2013)."Isoferulic acid,a new anti-glycation agent,inhibits fructose-and glucose-mediated protein glycation invitro."Molecules 18(6):6439-6454.
AGEs抑制率计算公式
AGEs抑制率(％)＝[(FC-FCB)-(FS-FSB)]/(FC-FCB)×100
表2实施例1-4，对比例1-8的红山茶花叶提取液和氨基胍的AGEs抑制率
Figure BDA0003744149730000131
Figure BDA0003744149730000141
(3)黑色素抑制实验
将上述所有的实施例和对比例制备的红山茶花叶提取物进行B16-F10黑色素细胞生成抑制实验，同时为了更直观的观察红山茶花叶提取物的黑色素抑制能力，选用常见的美白剂β-熊果苷作为对照。B16-F10黑色素细胞株是用细胞黑色素生成研究的典型实验，具体实验方法参照：Kim,J.H.,S.H.Baek,D.H.Kim,T.Y.Choi,T.J.Yoon,J.S.Hwang,M.R.Kim,H.J.Kwon and C.H.Lee(2008)."Downregulation of melanin synthesis by hagininAand its application to in vivo lightening model."J Invest Dermatol 128(5):1227-1235.
细胞外黑色素抑制率计算方法：
细胞外黑色素抑制率(％)＝1-(OD475nm样品-OD475nm空白)/(OD475nm对照-OD475nm空白)×100％
细胞内黑色素抑制率计算方法：
细胞内黑色素抑制率(％)＝1-(OD405nm样品-OD405nm空白)/(OD405nm对照-OD405nm空白)×100％
表3实施例1-4，对比例1-8的红山茶花叶提取液对细胞内外的黑色素抑制率
Figure BDA0003744149730000142
Figure BDA0003744149730000151
(4)抗皱实验
将上述所有的实施例和对比例制备的红山茶花叶提取物通过促进成纤维I型胶原蛋白合成实验来验证提取物的抗皱效果，实验方法参照T/SHRH 031—2020，化妆品紧致、抗皱功效测试-体外成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白含量测定.上海日用化妆品行业协会,2018.
表4实施例1-4，对比例1-8的红山茶花叶提取物对Ⅰ型胶原蛋白促进率
Figure BDA0003744149730000152
Figure BDA0003744149730000161
应用例1
本应用例提供了红山茶花叶提取物在化妆品水配方中的应用和制备方法，具体配方如下：
序号 标准中文名称 含量(％)
1 水 TO 100
2 EDTA二钠 0.05
3 透明质酸钠 0.05
4 甘油 8.0
5 1,2-己二醇 0.5
6 对羟基苯乙酮 0.5
7 红山茶花叶提取物 60
其制备方法如下：
A、常温下将1、2、3、4项依次加入乳化锅中，充分搅拌分散均匀，再升温加热至90±2℃，均质3分钟，搅拌均匀；
B、80±2℃，依次加入5、6项，搅拌均匀；
C、65±2℃，依次加入7项，搅拌均匀。
应用例2
本应用例提供了红山茶花叶提取物在精华液配方中的应用和制备方法，具体配方如下：
Figure BDA0003744149730000162
Figure BDA0003744149730000171
其制备方法如下：
A、常温下将1、2、3、4、5、6、7、8、9项依次加入水锅中，充分搅拌分散均匀，再升温加热至90±2℃，搅拌均匀后抽入乳化锅中，均质3分钟，搅拌均匀；
B、常温下将10、11、12、13、14、15项依次加入油锅中，再升温加热至85±2℃，完全溶解后，抽入乳化锅中。
C、均质10分钟，加入16项，保温15分钟，搅拌均匀；
D、80±2℃，依入加入17、18、19、20项，搅拌均匀；
E、50±2℃，加入21项，搅拌均匀。
应用例3
本应用例提供了红山茶花叶提取物在护肤乳液配方中的应用和制备方法，具体配方如下：
Figure BDA0003744149730000172
Figure BDA0003744149730000181
其制备方法如下：
A、常温下将1、2、3、4、5、6、7、8项依次加入水锅中，充分搅拌分散均匀，再升温加热至90±2℃，搅拌均匀后抽入乳化锅中，均质3分钟，搅拌均匀；
B、常温下将9、10、11、12、13、14项依次加入油锅中，再升温加热至85±2℃，完全溶解后，抽入乳化锅中。
C、均质10分钟，加入15项，保温15分钟，搅拌均匀；
D、80±2℃，依入加入16、17、18、19项，搅拌均匀；
E、50±2℃，加入20项，搅拌均匀。
应用例4
本应用例提供了红山茶花叶提取物在护肤膏霜配方中的应用和制备方法，具体配方如下：
Figure BDA0003744149730000191
其制备方法如下：
A、常温下将1、2、3、4、5、6、7、8项依次加入水锅中，充分搅拌分散均匀，再升温加热至90±2℃，搅拌均匀后抽入乳化锅中，均质5分钟，搅拌均匀；
B、常温下将9、10、11、12、13、14、15项依次加入油锅中，再升温加热至85±2℃，完全溶解后，抽入乳化锅中。
C、均质10分钟，加入16项，保温15分钟，搅拌均匀；
D、80±2℃，依入加入17、18、19、20项，搅拌均匀；
E、50±2℃，加入21项，搅拌均匀。
应用例5
本应用例提供了红山茶花叶提取物在面贴膜配方中的应用和制备方法，具体配方如下：
序号 标准中文名称 含量(％)
1 水 TO 100
2 EDTA二钠 0.05
3 透明质酸钠 0.05
4 1,3-丙二醇 4.0
5 丁二醇 4.0
6 甘油 5.0
7 丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物 0.1
8 黄原胶 0.2
9 氨丁三醇 0.08
10 1,2-己二醇 0.4
11 对羟基苯乙酮 0.4
12 甘草酸二钾 0.1
13 红山茶花叶提取物 0.5
其制备方法如下：
A、常温下将1、2、3、4、5、6、7、8项依次加入水锅中，充分搅拌分散均匀，再升温加热至90±2℃，搅拌均匀后抽入乳化锅中，均质3分钟，搅拌均匀；
B、85±2℃，依次加入9项，保温15分钟，搅拌均匀；
C、80±2℃，依入加入11、12项，搅拌均匀；
D、50±2℃，加入13项，搅拌均匀。
应用例6
本应用例提供了红山茶花叶提取物在洁面配方中的应用和制备方法，具体配方如下：
Figure BDA0003744149730000201
Figure BDA0003744149730000211
其制备方法如下：
A、常温下将1、2、3、4、5、6、78项依次加入乳化锅中，充分搅拌分散均匀，再升温加热至90±2℃，搅拌均匀；
B、85±2℃，依次加入8项，保温15分钟，搅拌均匀；
C、80±2℃，依入加入9、10、11、12项，搅拌均匀；
D、50±2℃，加入13项，搅拌均匀。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

Claims (10)

1.一种红山茶花叶提取物的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、将红山茶叶粉末和红山茶花粉末混匀，进行超临界CO2萃取，萃取结束后，取出红山茶花叶粉末；
S2、在步骤S1萃取得到的红山茶花叶粉末中加入醇溶液，超声处理；
S3、超声处理后溶液中加入纤维素酶萃取，过滤得到红山茶花叶粗提液；
S4、超滤膜过滤步骤S3所得滤液，再经大孔树脂吸附纯化，即得所述红山茶花叶提取物。
2.根据权利要求1所述的红山茶花叶提取物的制备方法，其特征在于，步骤S1中，红山茶叶粉末和红山茶花粉末的质量比为10:1-1:10；所述超临界CO2萃取，萃取压力为10MPa-30 MPa，萃取温度为35℃-50℃，萃取时间为30min-2h。
3.根据权利要求1所述的红山茶花叶提取物的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述醇溶液为乙醇的含量为10％-90％的乙醇水溶液，所述乙醇水溶液的用量是红山茶花叶粉末质量的10-20倍.
4.根据权利要求1所述的红山茶花叶提取物的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述超声处理的温度控制在40℃以下，超声时间为10min-60min，超声功率为500W-3000W。
5.根据权利要求1所述的红山茶花叶提取物的制备方法，其特征在于，步骤S3中，纤维素酶萃取温度控制在40℃-70℃，搅拌萃取1h-4h；纤维素酶的用量是红山茶花叶粉末质量的0.2-2％。
6.根据权利要求1所述的红山茶花叶提取物的制备方法，其特征在于，步骤S4中，超滤膜截留分子量为500-3500。
7.根据权利要求1所述的红山茶花叶提取物的制备方法，其特征在于，步骤S4中，所述吸附纯化包括如下步骤：
B1、把0.5-3BV的红山茶花叶提取液，以0.5-3BV/h的速度通过大孔树脂吸附柱；BV指的是大孔树脂的床层体积；
B2、用水以1-3BV/h的速度冲洗大孔树脂吸附柱，洗至流出液无色；
B3、再用2-5BV的乙醇溶液以0.5-3BV/h流速洗脱大孔树脂柱，其中乙醇溶液中乙醇的含量为30％-90％，回收洗脱液；浓缩到其质量的1/4-1/10；
B4、向浓缩液中加入其质量1-2倍的水和多元醇的混合溶液，混合溶液中多元醇质量为0.1％-65％，其余为水；过滤。
8.一种根据权利要求1-7中任一项所述的制备方法制得的红山茶花叶提取物，其特征在于，所述红山茶花叶提取物中含儿茶素、芦丁、没食子酸、原儿茶酸、槲皮素、金丝桃苷、木犀草素。
9.一种红山茶组合物，所述组合物中主要活性成分为根据权利要求8所述的红山茶花叶提取物。
10.一种根据权利要求9所述的红山茶组合物在制备化妆品中的应用，所述化妆品包括化妆水、精华液、护肤乳、护肤膏/霜、面贴膜、洁面制剂。
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