CN108578317B

CN108578317B - 一种提取竹叶活性成分的方法及其护肤应用

Info

Publication number: CN108578317B
Application number: CN201810541086.7A
Authority: CN
Inventors: 胡东辉
Original assignee: Individual
Current assignee: Hu Donghui
Priority date: 2018-05-30
Filing date: 2018-05-30
Publication date: 2020-06-16
Anticipated expiration: 2038-05-30
Also published as: CN108578317A

Abstract

本发明提供了一种提取竹叶活性成分的方法，该方法包括以下步骤：采用超临界CO₂提取法对竹叶进行提取，使用乙醇作为共溶剂，提取压力为12‑25MPa，提取温度为40‑90℃。该方法得到的竹叶提取物具有良好的抗氧化活性和良好的抗细胞凋亡活性。还公开了提取物的护肤应用。

Description

一种提取竹叶活性成分的方法及其护肤应用

技术领域

本发明属于精细化工提取或萃取技术领域，具体地涉及一种提取竹叶活性成分的方法，更具体地涉及一种超临界CO₂方法提取竹叶活性成分的方法，同时还涉及该提取物的护肤应用。

背景技术

我国拥有十分丰富的竹类资源。据不完全统计，我国有1亿多人口全部或部分从竹林和竹林产品加工中获取生活费用。竹类植物作为森林资源的重要组成部分，不仅以其较高的经济价值，而且具有广泛的生态环境与社会效益。随着人民生活水平的提高，国家“退耕还林还草”、“长江中下游防护林体系”等生态工程建设的逐步实施，使我国的竹子产量进一步提高，如何提高竹子产品的综合经济效益，在我国可持续发展战略中具有越来越重要的作用。但目前，在绝大部分竹产区，竹叶仍是一种废弃物，急需要进行研究开发和综合利用。

皮肤是维护人体生命和健康的重要部分，直接与外界接触，是机体的第一道屏障，极易受到环境因素的影响而导致损伤。除了年龄带来的老化因素外，应激反应、污染、阳光和紫外线的照射都是引起皮肤出现皱纹或皱褶的重要原因。由于皮肤每天暴露于各种物理和化学应激中，导致皮肤的功能受损，出现皮肤的各种老化现象。皮肤干燥是皮肤老化产生皱纹的主要原因，皮肤老化现象包括皱纹和产生斑。表皮皱纹称为细皱纹，这是由于皮肤干燥引起的角质层表皮中水分量的减少而引起的暂时性皱纹。作为改善细纹的方法，通常使用具有保湿效果的化妆品。皮肤皱纹是日光中包含的紫外线和由老化形成的皱纹。作为其形成机理，目前已知的是紫外线和老化引起的真皮成纤维细胞中胶原蛋白合成能力降低，以及基质金属蛋白酶(MMP)促进胶原分解。当皮肤接受过多日光照射时，表皮就会产生更多的黑素颗粒，而且，紫外线的照射会引起黄褐斑，普通脸部色斑颜色加深。研究还发现，阳光中的紫外线一方面刺激皮下的色素细胞活动频繁，制造出大量的黑色素；另一方面损伤皮肤细胞正常的新陈代谢功能，令黑色素无法顺利排出而残留在皮肤上，甚至沉积在真皮中。

人们将越来越需要长时、高效的调节性和预防性的护肤品，更需要安全性较高的护肤品。广大消费者对使用化学合成物制造的化妆品持更加谨慎的态度，近年来，化妆品生产开始原料天然化，形成了开发天然资源的世界热潮。在现有的具有美白、祛斑功效的化妆品中，主要是加入具有保湿作用的成分使皮肤保持湿润，另外加入具有祛斑功效的成分来抑制皮肤内的一些酶例如酪氨酸酶、基质金属蛋白酶的活性，从而有助于减少黑色素的形成。研究发现，天然植物和水果中的一些成分具有上述功效，并且还具有安全无害的特点，因此含有天然产物提取物的化妆品受到了广泛研究和关注。

竹叶黄酮是上世纪90年代末开发的一种具有本土资源特色的竹叶提取物，关于其抗自由基、抗氧化、抗衰老、保护心脑血管等的生物学功效以及应用已有得到广泛研究，所述应用包括利用其皮肤生理学功效应用于化妆品行业。

CN107812118A公开了从淡叶竹中提取竹叶黄酮物质，其是按下面的步骤进行：一、收割新鲜的淡叶竹叶，清洗干净，离心、晾晒干燥叶片水分；二、将干燥淡叶竹用粉碎机粉碎成竹叶粉，将竹叶粉放进圆柱形玻璃缸中，竹叶粉应占玻璃缸体积1/2以下；三、向玻璃缸中加入85℃-90℃的酒精，一边加入酒精，一边搅拌，使竹叶粉与酒精混合均匀，直至混合液面达到玻璃缸高度的2/3，成为混合液浆；四、将混合液浆加盖、静置萃取4小时-5小时，每隔1小时搅拌一次，随后用滤布加压过滤，去渣，取滤汁，再过滤、离心澄清，取得上层澄清液；五、将澄清液放进蒸馏塔，蒸馏温度60℃-65℃，挥发完酒精，收集塔底的黄色粉状物，同时塔顶冷却回收酒精。

CN107596157A公开了一种竹叶黄酮的提取方法，其包括以下步骤：S1.取新鲜的竹叶放入烘箱中，以50-60℃的温度烘干至恒重，然后粉碎制备得到干料，以重量份数计，取220-250份干料加入装有1000份水的容器中，然后向容器中加入3份碳酸氢钠和质量分数为25％的氨水调节pH值到8-8.5，先将容器密闭，以300-450r/min的转速磁力搅拌，以65-75℃的温度加热1-2h，然后将容器打开，以85℃蒸煮，直至容器中水位降至原水位的0.3-0.5倍，再过滤，保留滤液；S2.以重量份数计，取100份滤液加入分离器中，然后再向分离器中加入90-98份乙醇和38-42份磷酸氢二钾，然后混合均匀，然后静置分层；S3.取出分离器中的上层溶液，以蒸馏的方法分离出乙醇和固体产物，分离出的乙醇回收利用，固体产物烘干至恒重既得竹叶黄酮。

CN103262943B公开了一种淡竹叶提取物及其应用，该淡竹叶提取物由以下方法制成：取淡竹叶茎叶，粉碎，加入体积浓度为70％-85％的乙醇溶液，回流提取，过滤；滤液浓缩至含固量12wt％-16wt％，喷雾干燥，得淡竹叶醇溶性提取物；取滤渣，加蒸馏水，于70-90℃下浸泡提取3-4h，过滤或离心后，滤液或离心液浓缩至含固量12wt％-16wt％，喷雾干燥，得淡竹叶水溶性提取物；将所得淡竹叶醇溶性提取物和淡竹叶水溶性提取物以质量比1:1－3的比例混合配制。

CN102526515B公开了一种提取竹叶黄酮的方法，所述方法包括：将干燥竹叶与固相试剂都投入球磨机中研磨均匀，取出球磨粉末，向所述球磨粉末中加入水，室温搅拌均匀，过滤，得滤液A，浓缩，加入无机酸调pH值；过滤，得滤液B，滤液B经大孔树脂层析柱，先用水作为洗脱剂洗脱，再用50％～80％的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩蒸去溶剂，干燥，得到竹叶黄酮提取物；所述的固相试剂为氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钾、碳酸氢钾、碳酸钾、氢氧化钙、碳酸钙、磷酸氢二钠、氯化钠、硫酸钠、硅胶或硼砂中的一种或两种以上的任意组合；所述的干燥竹叶与固相试剂的质量比为5～25∶1。

CN105687826A公开了一种竹叶提取物，它包含2～10wt％的竹叶总黄酮。

CN106491464A公开了一种杀毒抑菌型漱口液用竹叶提取物，其由以下重量份的成份组成：天然多酚类化合物30-45份、竹叶黄酮15-25份、竹叶多糖15-20份。

CN106691954A公开了一种护肤型洗手液用竹叶提取物，所述护肤型洗手液用竹叶提取物由以下重量份的成份组成：天然多酚类化合物10-15份、竹叶黄酮15-25份、竹叶多糖5-10份、超氧化物歧化酶8-15份、竹叶氨基酸3-5份。

CN108003126A公开了一种蒸汽爆破处理槐米制备槲皮素的方法，将槐米进行蒸汽爆破处理，在蒸汽爆破过程中控制压力在0.2-3.0MPa并维持此过程0.5-4.0min，然后瞬间爆破得到经过爆破处理的槐米碎粒，在此高温高压条件下槐米中的芦丁被转化成其苷元槲皮素。

CN102351826A公开了一种用本发明蒸汽爆破预处理银杏叶提取银杏黄酮的制备工艺，它包括以下步骤：清洗、烘干、浸泡过夜,蒸汽爆破处理、过滤、烘干、乙醇提取银杏黄酮。

KR2007/005004A公开了用于特应性皮炎的治疗和预防的药物组合物，其活性成分为竹子提取物和黄芩提取物的混合物，其中所述竹子提取物和所述黄芩提取物用极性溶剂进行提取，并且竹子提取物对黄芩提取物的重量比是1-10∶1-10，其中所述极性溶剂选自水、C1-4醇和其混合物。

EP2014/055483A公开了一种抗氧化活性的组合物，其包括至少一种富含多酚的植物提取物；至少一种卟啉；和至少一种由芪类化合物构成的附加的化合物，以及所述组合物的应用。

“天然功能性竹叶提取物--竹叶黄酮”，张英，中国食品添加剂，2002(3):54-58，指出竹叶提取物是我国新开发的一种植物类黄酮制剂,具有优良的抗自由基、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗病毒及保护心脑血管、防治老年退行性疾病等生物学功效，以其丰富的原料来源、明确的功能因子、良好的食用安全性、高效稳定的制剂品质和清新甜香的竹子风味,近年来在天然功能性食品添加剂和医药保健品领域崭露头角。

然而，在现有技术中，虽然认识到竹叶提取物可以用作护肤品的有效活性成分，然而现有技术主要集中在竹叶中黄酮化合物的护肤作用，忽略了竹叶中的多酚化合物，现有技术的提取工艺主要是针对黄酮化合物(即总黄酮)的提取，多酚化合物实际上大多未被提取而被弃去，从而无法发挥黄酮类化合物和多酚化合物的组合作用效果，同时现有技术中还忽视了黄酮化合物和多酚化合物中高活性特定化合物的提取，通常黄酮化合物和多酚化合物都是作为包含多种成分的复杂混合物使用，然而实际上，并非所有的黄酮化合物都适合护肤应用，有些黄酮组分对皮肤具有一定刺激作用，这降低了竹叶提取在护肤品尤其是高档护肤品中的应用。

另外还发现，在现有技术中，对竹叶的提取多沿用其它植物叶子的提取工艺，没有注意到植物叶子的组织结构特殊性，导致提取效率不高，并且为了提高提取率，温度普遍较高，导致副产物或降解产物也较多。

本领域需要一种能够提高竹叶提取物活性成分提取效率并且兼发挥黄酮类化合物和多酚化合物协同效果的护肤剂。

发明内容

为了同时解决上述技术问题，本发明人经过对竹叶提取工艺和有效成分深入研究和大量试验，并且通过多方联合研发，对竹叶提取物的成分在护肤剂使用中作用发挥机制进行了研究，提出了下面技术方案。

在本发明的一方面，提供了一种提取竹叶活性成分的方法，该方法包括以下步骤：采用超临界CO₂提取法对竹叶进行提取，使用乙醇作为共溶剂，提取压力为12-25MPa，提取温度为40-90℃。

提取压力优选为20MPa，提取温度优选为50℃。优选地，提取时间为10min-60min，更优选30min。在该提取温度和压力下，既能保证了一定的提取率，又能够确保活性成分不分解。克服了过高温度和压力所带来的副产物较多的缺陷。

优选地，在该方法中，乙醇相对于CO₂的摩尔比为6-15％，优选8-10％。优选地，CO₂的流速为0.1L-1.0L/min。CO₂的流速实际上可以根据具体的提取设备和原料量进行调整。

更优选地，所述共溶剂除乙醇外还包含水，水相对于CO₂的摩尔比为1-5％，特别优选3％。

参见图2，本发明人经过动力学模拟，确定了上述超临界CO₂提取工艺参数。

优选地，本发明的超临界CO₂提取工艺包括：(1)在超临界CO₂提取反应器中，加入竹叶原料(例如破碎的竹叶，优选新鲜竹叶，或者下文经蒸汽破解处理的竹叶)，首先将CO₂以液体形式压入并流经冷却装置，流速保持在0.1-5.0L/min，在其进入提取容器之前，与共溶剂乙醇混合；和(2)控制提取容器的温度，并且控制压力以使溶剂达到其超临界状态；(3)使CO₂返回到气态，与乙醇捕集阱中的提取的化合物分离，除去乙醇即得竹叶提取物。

优选地，在步骤(3)中，气态CO₂然后流过湿气表，读取其在大气气体状态下的体积以便进行流量计量，提取的化合物在后续分析前保持冷藏。

该提取物可以直接用于护肤产品，或者可以进一步纯化后用于护肤产品。

在本发明的一个优选方式中，在提取前对竹叶进行破碎(包括破解)。特别优选地，进行蒸汽破解即蒸汽爆破，蒸汽破解方法包括：将竹叶(优选切碎的新鲜竹叶)放入蒸汽破解反应器中，然后在120-240℃和1.0-4.8MPa的蒸汽温度下蒸汽加热，蒸煮时间为0.5-5分钟，然后将反应器的球阀突然打开，使反应器迅速达到大气压力，在接收器中回收包含固体和液体物质的破解产物，分离出固体物质和液体物质，将固体物质用作前述超临界CO₂提取的原料。

通过所述蒸汽破解，在短时间内使竹叶纤维快速蒸发掉纤维细胞内部的水分，能够除去大部分竹叶中的水分，有利于后续提取的进行，这对于含水量相对较高的新鲜竹叶特别有利。另外，通过蒸汽破解，使纤维分离，并且柔软扭曲程度明显增加，纤维发生断裂，细胞被破坏，从而有利于活性物质特别是多酚物质后续被提取出。如果不采取蒸汽破解，多酚物质由于极性较大而容易与纤维素发生缔合，从而难以被提取出。并且，这种快速蒸汽爆破还具有不明显破坏活性组分的优点。在现有的工艺中，尚未见在有效成分提取之前对竹叶进行蒸汽破解的报导，现有技术中对生物质进行蒸汽爆破基本都是为了获得半纤维素。

在已报导的工艺中，通常都是将竹叶干燥，粉碎成粉末，然后再进行萃取。然而，竹叶在干燥过程中会导致活性组分挥发或降解损失，活性组分降解产生的副产物与活性组分在纯化步骤中极难分离。

特别优选地，在本发明的蒸汽破解中，向竹叶原料中加入柠檬酸-乙酸催化剂，即竹叶(优选切碎的新鲜竹叶)与柠檬酸-乙酸溶液混合，然后放入蒸汽破解反应器中进行蒸汽破解。优选地，柠檬酸-乙酸为水溶液形式，柠檬酸-乙酸总浓度为2-20wt.％，柠檬酸与乙酸的摩尔比为1:3-3:1。优选地，柠檬酸-乙酸溶液与竹叶的重量比为1:(50-500)。乙酸的使用有助于使纤维中的多糖主链断裂，并且能够抑制竹叶中发酵的发生，从而获得较好的破解效果，并且保证较高的提取率。单纯的乙酸虽然酸性较强，具有较强的发酵抑制作用，但是缺乏络合缔合效果，对后续多酚化合物的提取并不有利，而柠檬酸具有较高的络合缔合，使得多酚化合物易于解离出。因此，二者配合使用能够确定较好的综合效果。

优选地，本发明的提取物中，基于提取物的总重量计，多酚总含量为1.0wt.％以上，优选20.0wt.％以上，更优选40.0wt.％以上，黄酮类物质(即类黄酮化合物)总含量为2.0wt.％以上，优选20.0wt.％以上，更优选30.0wt.％以上。

在本发明的竹叶提取物中，在多酚中，下式(I)所述的酚类化合物优选占多酚总量的50mol％以上，优选70mol％以上：

和/或，

在本发明的竹叶提取物中，在黄酮类物质即黄酮类化合物中，下式(II)所述的黄酮化合物优选占黄酮类化合物总量的50mol％以上，优选70mol％以上：

在现有的竹叶类黄酮提取物中，通常是将类黄酮提取物作为混合物使用，其中含有很多其它杂质和低活性的类黄酮化合物，某些黄酮化合物甚至对皮肤具有一定刺激作用例如对羟基肉桂酸。为此，本发明针对黄酮类化合物中的各种黄酮化合物的护肤性能进行筛选，并且结合该化合物的实际含量和提取难度，综合确定了上述式(I)所述的酚类化合物作为最理想的多酚化合物。同理，基于酚类化合物的护肤性能和含量，综合确定了上述式(II)所述的黄酮化合物作为最理想的黄酮化合物。

为了获得高含量的上述式(I)所述的酚类化合物和式(II)所述的黄酮化合物，对超临界提取产物进行纯化，本发明人经过大量研究和反复实验，确定了如下纯化步骤，该纯化步骤包括：

(1)采用硅胶柱(如青岛海洋化工100-200目)，首先使用MeOH-H₂O混合溶液对所述前述超临界CO₂提取物(例如120.5g)进行梯度洗脱，来进行柱色谱分离，优选的洗脱步骤为0:1(1L)，2:8(1L)，4:6(1L)，5:5(2L)，6:4(2L)，8:2(1L)，1:0(2L)，然后使用石油醚(2L)，依次得到8个洗脱组分，记为洗脱组份a-h；

(3)将洗脱组分c(例如12.0g)在反相硅胶柱(优选ODS，60cm×5cm)上进行色谱分离，使用乙酸乙酯-MeOH-H₂O混合溶液进行梯度洗脱(洗脱梯度优选为20:1:0(1L)，10:1:0(2L)，30:8:1(2L)和15:6:1(2.5L))，得到4个洗脱组份，记为洗脱组分c1-c4，将c2洗脱液减压浓缩至干，得到淡黄色粉末，即得到式(II)所示化合物；

(4)将洗脱组分c4用MeOH-H₂O(1:1)在Sephadex LH-20(优选100cm×3cm)上分离，得到4个次洗脱组分，记为洗脱组分c4(1)-c4(4)，将c4(3)洗脱液减压浓缩至干，得到淡黄色粉末，即为式(I)所示化合物。

(5)将式(I)所示化合物和式(II)所示化合物合并得到二者的混合物，即可用于本发明的护肤品添加成分。

该混合物可以替代上述竹叶提取物使用。

在柱层析过程中，可以通过HPLC-MS对洗脱组分进行监测和分析，式(I)所示化合物的纯度可达98.2％，式(II)所示化合物的纯度可达99.1％。经¹HNMR和质谱分析，它们均与CAS中记载的经表征的已知化合物一致。例如，对于式(II)所示化合物，经检测其与标准谱图一致，具体地，经检测，m.p.＝289±291℃；[α]_D ²⁸:+20℃(c 0.25,DMSO)；UV(MeOH):λ_max＝215,259,269,348nm；IR(KBr):ν_max＝3330(OH),2947,1654(C＝O),1611,1506cm±1(Ar)；ESI-MS(pos):m/z＝330[M]+,330,287,259,213,178,153,135,69；¹H-NMR(丙酮-d6):d＝3.95(6H,s,2CH3),6.23(1H,d,J＝2.0Hz,H-6),6.54(1H,d,J＝2.0Hz,H-8),6.72(1H,s,H-3),7.37(2H,brs,H-2’,6’),8.08(1H,s,2’-OH),9.56(1H,s,7-OH),13.00(1H,s,5-OH)。

实验发现，由于分子结构和极性的近似性，从多种酚类化合物和黄酮类化合物中分离出所述分子式的化合物是困难的，例如式(I)所示的对羟基肉桂醇与竹叶提取物中的愈创木基醇区别仅仅在于苯环上的一个小极性醚基。由于采用了所述逐级密切配合的级配柱层析系统，才获得了高纯度的式(I)所示化合物和式(II)所示化合物。

在本发明的另一方面，提供了所述提取物的应用，其用作护肤品中的活性添加成分。即，提供了包含所述提取物的护肤品。

优选地，所述提取物用作抗氧化活性添加成分。优选地，所述提取物用作抗表皮细胞凋亡活性添加成分。更优选地，所述提取物兼具有作抗氧化活性和抗表皮细胞凋亡活性。

在本发明的另一方面，提供了一种包含上述竹叶提取物的护肤品。优选地，提供了一种包含式(I)所示化合物和式(II)所示化合物的组合(即混合物)的护肤品。

就本发明的包含竹叶提取物的护肤品而言，基于护肤品总重量，以重量百分比计，其包A组成分、B组成分和C组成分，其中A组成分包含山茶油5.0-20.％，甘油1.0-5.0％，羊毛脂0.5-2.0％，单硬脂酸甘油酯0.2-2.0％，黄原胶0.1-0.5％和水；B组成分包含1,3-丁二醇1.0％-10％，丙二醇0.5-1.0％，本发明的竹叶提取物1.0-5.0％，透明质酸0.2-2.0％，聚二甲氧基硅氧烷1.0-5.0％；C组成分为三乙醇胺0.01-0.5％，香精0.001％-0.1％；所述水的量为不足100％。

该护肤剂的制备方法包括以下步骤：在搅拌下分别将A组成分、B组成分分别并加热至约60-70℃，待各组分充分溶解后，保温待用；将B组成分加入A组成分中，搅拌使两相充分混合，然后均质乳化5-10min，继续搅拌并冷却降温；当温度降至50℃以下时，加入C相搅拌使各相物料混合均匀，继续搅拌降温；当温度降至40℃以下时，停止搅拌，各项指标检验合格后分装。

当上述护肤剂中的竹叶提取物替换为使用式(I)所示化合物和式(II)所示化合物的混合物时，上述竹叶提取物的用量可以降至0.02-0.5％。

优选地，在本发明的护肤剂中，所述透明质酸为复合透明质酸，具体而言，可以为大分子量透明质酸、中分子量透明质酸和小分子量透明质酸的混合物，大分子量透明质酸、中分子量透明质酸和小分子量透明质酸的重量比为(1-5):(10-15):(0.1-0.5)。通过三种不同大小分子量的透明质酸的复配，使不同分子量大小的透明质酸可发挥更好的作用效果，能够使肤感柔滑、富有弹性的效果，并且能够在皮肤表面形成长效生物保护膜，增加皮肤屏障功能，激活细胞因子，从而起到更有效的护肤作用。如本领域技术人员所已知，大、中和小分子量透明质酸的定义在本领域是已知的。

换言之，本发明的竹叶提取物兼顾了多酚化合物和类黄酮化合物的活性。含有其二者的混合物的护肤剂通过它们的协同作用而表现出更好的保护皮肤的作用。进一步实验发现，本发明的竹叶提取物即使含量为现有市售技术竹叶提取物用量的1/3，也能实现基本相当的皮肤保护效果。

本发明的护肤剂可制成霜剂、乳剂、洗面乳液、面膜等各种剂型。

附图说明

图1是根据本发明的新鲜竹叶在蒸汽破解后的组织纤维织构SEM图。

图2是本发明的超临界提取动力学模拟图，其中R1表示活性成分提取效率值。

具体实施方式

以下是说明本发明的具体实施例和对比例，但本发明并不限于此

实施例1

取20kg新鲜竹叶(紫竹，得自湖南桂东)，将竹叶粉碎，然后放入蒸汽破解反应器(河南鹤壁正道生物能源公司制造)中，然后在160℃和2.0MPa的蒸汽温度下蒸汽加热，蒸煮时间为5分钟，然后将反应器底部的球阀突然打开，使反应器迅速达到大气压力，包含固体和液体物质的破解产物在接收器中被回收，分离出固体物质和液体物质，将固体物质用作超临界CO₂提取的原料；然后采用超临界CO₂提取法对竹叶进行提取，使用乙醇作为共溶剂，乙醇相对于CO₂的摩尔比为8％，提取压力为20MPa，提取温度为50℃，提取时间为30min，CO₂的流速为0.6L/min，室温下减压浓缩除去乙醇得到提取物。

使用标准测试方法测试所述竹叶提取物清除自由基的能力，测试方法如下：

将1.5毫升100μM DPPH(2,2-二苯基-1-苦基肼基，购自上海甄准生物科技)与0.5ml竹叶提取物混合，将混合物在室温放置15分钟，然后使用分光光度计(热电GENESYS10S)在517nm处测量吸光度，使用以下公式计算DPPH自由基清除活性：

DPPH自由基清除活性＝(空白-样品)/空白×100％

其中空白样品和A样品分别对应于在517nm空白处的吸光度(加入0.2ml甲醇代替预处理的提取物)和加入DPPH自由基溶液后的预处理提取物。经检测，DPPH自由基清除活性为46.33％。同时按照上述相同程序对市售竹叶提取物(得自浙江圣氏生物科技)的DPPH自由基进行测试，DPPH自由基清除活性仅为28.76％。

对比例1

重复实施例1，对比例1与实施例1的区别仅在于直接将竹叶粉碎，不经蒸汽破解。按照上述相同程序测得的DPPH自由基清除活性为27.09％。该DPPH自由基清除活性与市售竹叶提取物相当，也间接证明了市售竹叶提取物在提取过程中基本都未经蒸汽破解。

实施例2

将实施例1的提取物按下面步骤进行纯化：采用硅胶柱(购自青岛海洋化工，100-200目)，首先使用MeOH-H₂O混合溶液对所述前述超临界CO₂提取物60.5g进行梯度洗脱，来进行柱色谱分离，洗脱步骤为0:1(1L)，2:8(1L)，4:6(1L)，5:5(2L)，6:4(2L)，8:2(1L)，1:0(2L)，然后使用石油醚(2L)，依次得到8个洗脱组分，记为洗脱组份a-h；将洗脱组分c(7.1g)在反相硅胶柱(ODS，60cm×5cm)上进行色谱分离，使用乙酸乙酯-MeOH-H₂O混合溶液进行梯度洗脱(洗脱梯度为20:1:0(1L)，10:1:0(2L)，30:8:1(2L)和15:6:1(2.5L))，得到4个洗脱组份，记为洗脱组分c1-c4，将c2洗脱液减压浓缩至干，得到淡黄色粉末，即得到式(II)所示化合物；将洗脱组分c4用MeOH-H₂O(1:1)在Sephadex LH-20(100cm×3cm)上分离，得到4个次洗脱组分，记为洗脱组分c4(1)-c4(4)，将c4(3)洗脱液减压浓缩至干，得到淡黄色粉末，即为式(I)所示化合物，将式(I)所示化合物和式(II)所示化合物合并，该混合物即可用于本发明的护肤品添加成分。将该混合物用乙醇配制成0.5M的溶液，按照与实施例1相同的程序测试DPPH自由基清除活性，经测试活性值为71.04％。该活性值显著高于实施例1的未经纯化的竹叶提取物。同时，将待测试溶液的体积由0.5ml减至0.2ml，经测试DPPH自由基清除活性值为52.33％。发现活性值并未随用量的减少而等比例下降。

实施例3

按如下比例制备护肤剂，以重量百分比计：基于护肤品总重量，以重量百分比计，其包A组成分、B组成分和C组成分，其中A组成分包含山茶油12.0％，甘油2.0％，羊毛脂1.0％，单硬脂酸甘油酯1.0％，黄原胶0.2％和水；B组成分包含1,3-丁二醇2％，丙二醇0.8％，根据实施例1的竹叶提取物2.0％，透明质酸1.0％，聚二甲氧基硅氧烷3.0％；C组成分为三乙醇胺0.03％，香精0.005％；所述水的量为不足100％；在搅拌下分别将A组成分、B组成分分别并加热至约65℃，待各组分充分溶解后，保温待用；将B组成分加入A组成分中，搅拌使两相充分混合，然后均质乳化10min，继续搅拌并冷却降温；当温度降至50℃以下时，加入C相搅拌使各相物料混合均匀，继续搅拌降温；当温度降至40℃以下时，停止搅拌，各项指标检验合格后分装。使用ELISA法，检测本发明的护肤剂竹叶提取物在表皮细胞中的抗细胞凋亡作用，其中采用的表皮细胞为人角质形成细胞(HaCat细胞，购自中国典型培养物武汉大学保藏中心)，测试暴露于50mJ/cm²的UVB下24小时之后的成活率，成活率为57.2％。

实施例4

重复实施例3，与实施例3的区别仅在于竹叶提取物使用实施例2的式(I)所示化合物和式(II)所示化合物的混合物，并且该混合物的用量为0.2％。按照与实施例3相同的测试方法，细胞成活率为52.1％。

在竹叶提取物含量降低很多的情况下，仍能够获得较好的细胞成活率，即具有良好的抗细胞凋亡活性，从而使得竹叶提取物的用量大大降低，从而显著降低成本，并且可以显著减少竹叶提取物中有害成分对皮肤的刺激作用。另外，由于该混合物与一般粗提取物相比，减少了低效或有害组分的不利影响。研究发现某些有害杂质组分会降低活性组分效果例如抗细胞凋亡作用的发挥，因此，使用纯化的目标化合物使得能以显著更低的用量获得较好的效果。

本书面描述使用实例来公开本发明，包括最佳模式，且还使本领域技术人员能够制造和使用本发明。本发明的可授予专利的范围由权利要求书限定，且可以包括本领域技术人员想到的其它实例。如果这种其它实例具有不异于权利要求书的字面语言的结构元素，或者如果这种其它实例包括与权利要求书的字面语言无实质性差异的等效结构元素，则这种其它实例意图处于权利要求书的范围之内。在不会造成不一致的程度下，通过参考将本文中参考的所有引用之处并入本文中。

Claims

1.一种提取竹叶活性成分的方法，该方法包括以下步骤：采用超临界CO₂提取法对竹叶进行提取，使用乙醇作为共溶剂，提取压力为12-25MPa，提取温度为40-90℃，其中在提取前对竹叶进行蒸汽爆破，在该蒸汽破解中，向竹叶原料中加入柠檬酸和乙酸催化剂，即竹叶与柠檬酸和乙酸溶液混合，然后放入蒸汽破解反应器中进行蒸汽破解，柠檬酸和乙酸为水溶液形式，柠檬酸和乙酸总浓度为2-20wt.％，柠檬酸与乙酸的摩尔比为1:3-3:1，柠檬酸和乙酸溶液与竹叶的重量比为1:(50-500)；

该方法使得在得到的竹叶活性成分中，在多酚中，下式(I)所述的酚类化合物占多酚总量的50mol％以上：

和/或，

该方法使得在得到的竹叶活性成分中，在黄酮类化合物中，下式(II)所述的黄酮化合物占黄酮类化合物总量的50mol％以上：

对超临界提取产物进行纯化，纯化步骤包括：

(1)采用硅胶柱，首先使用MeOH-H₂O混合溶液对所述前述超临界CO₂提取物进行梯度洗脱，来进行柱色谱分离，洗脱步骤为0:1(1L)，2:8(1L)，4:6(1L)，5:5(2L)，6:4(2L)，8:2(1L)，1:0(2L)，然后使用石油醚(2L)，依次得到8个洗脱组分，记为洗脱组份a-h；

(2)将洗脱组分c在反相硅胶柱上进行色谱分离，使用乙酸乙酯-MeOH-H₂O混合溶液进行梯度洗脱(洗脱梯度优选为20:1:0(1L)，10:1:0(2L)，，30:8:1(2L)和15:6:1(2.5L))，得到4个洗脱组份，记为洗脱组分c1-c4，将c2洗脱液减压浓缩至干，得到淡黄色粉末，即得到式(II)所示化合物；

(3)将洗脱组分c4用MeOH-H₂O(1:1)在Sephadex LH-20上分离，得到4个次洗脱组分，记为洗脱组分c4(1)-c4(4)，将c4(3)洗脱液减压浓缩至干，得到淡黄色粉末，即为式(I)所示化合物；其中所述Sephadex LH-20即表示羟丙基葡聚糖凝胶。

2.根据权利要求1所述的方法，其中乙醇相对于CO₂的摩尔比为6-15％。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中CO₂的流速为0.1L-1.0L/min。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中共溶剂除乙醇外还包含水，水相对于CO₂的摩尔比为1-5％。