이하, 본 발명의 구성과 작용을 당업자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명하면 다음과 같다.
삼칠은 다년생 초본으로 오가과 식물 Panax pseudoginseng, P. notoginseng의 뿌리로서 각종혈증, 질타종통, 심교통의 치료에 사용되어 왔다(동의보감). 또한, 삼칠 성분중 ginsenoside Rg1이 항암 효과를 나타낸다는 보고가 있으나(Food Factors Cancer Prev.,(Int.Conf.)(1997), 235-239) 본 발명과는 무관하다. 첨과는 박과(Cucurbitaceae)에 속하며 학명은 Cucumis melo로서 열매, 줄기, 잎, 뿌리, 종자, 꽃등이 어혈, 월경과다에 약제로 쓰인다(중약대사전). 기존의 첨과 성분 동정 연구에 의하면 β-carotene, cry ptoxanthine, meloside A, L등의 화합물이 보고되어 있다. 석곡은 다년생 초본으로 난초과 식물 Dendrobium nobile, D. lina wianum, D. officinale, D. moniliforme, D. hercoglossum 등을 포함하며 줄기를 약재로 사용하여 진액을 생성하고 열을 내리고 음을 자양하는데 사용하여 왔다(중약대사전).
본 발명은 약재로 구입할 수 있는 삼칠, 첨과, 석곡을 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급알코올 또는 에틸아세테이트 또는 아세톤 등의 유기 용매로 1차 추출한 후 감압 농축한 다음 동결건조하거나 분무건조하여 1차 추출물을 제조하였다. 이러한 방법으로 제조된 삼칠, 첨과, 석곡 추출물은 쥐의 멜라노마 세포(B-16 mou se melanoma cell)에서 매우 강력한 멜라닌 합성 저해 효과를 나타낸다. 또한, 건조된 삼칠, 첨과, 석곡 추출물을 함유한 피부 외용연고나 화장료를 제조하여 사람 의 피부에 도포하였을 때, 피부 미백 효과가 매우 우수하다.
본 발명을 상세하게 설명하면 다음과 같다.
생약재로 시판되는 삼칠, 첨과, 석곡을 구입하여 잘게 분쇄하고 분쇄물 건조 중량에 대하여 5-20 부피의 물이나, 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 에틸아세테이트 또는 아세톤으로 환류 냉각기가 달린 추출기에서 50-100℃로 1-5시간 가열하여 추출한다. 여과포로 여과한 후 잔사를 같은 방법으로 1회 이상씩 더 추출한다. 추출액을 합하여 감압농축한 후 동 결건조나 분무 건조하여 건조 추출물을 얻는다. 건조된 삼칠, 첨과, 석곡 추출물을 쥐의 멜라노마 세포(B-16 mouse melanoma cell)에 처리하였을 때, 매우 강력한 멜라닌 합성 저해 효과를 나타내었다. 상기와 같이 얻어진 삼칠, 첨과, 석곡 추출물을 함유하는 피부외용연고나 로션같은 여러 화장료를 제조한다. 삼칠, 첨과, 석곡 추출물을 함유한 피부 외용연고나 로션등의 화장료를 제조하여 사람의 피부에 도포하였을 때 피부 미백 효과가 매우 우수하였다. 또한, 어떤 부작용도 발생하지 않아 삼칠, 첨과, 석곡 추출물이 안 전하고 효과가 매우 뛰어난 기미나 주근깨 개선 및 피부 미백제임을 알 수 있다.
피부 외용연고나 화장료 제조시에 함유되는 삼칠, 첨과, 석곡 추출 물의 함량은 건조 중량으로 0.0001-10.0중량%, 바람직하게는 0.0005-10.0 중량%가 적당하다. 0.0001중량% 이하의 농도에서는 뚜렷한 효과를 기대할 수 없었고, 10중량% 이상의 농도에서는 함유량의 증가에 따른 뚜렷한 효과의 증가가 나타나지 않았다.
다음으로 실시예에 의거하여 본 발명을 자세히 설명하고자 하며, 본 발명은 하기 실시예에만 국한되지는 않는다.
실시예 1-18
시판되는 삼칠, 첨과, 석곡을 구입하여 분쇄한 분쇄물 100g을 물이나, 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급알코올, 에틸아세테이트 또는 아세톤등의 용매 3L에 넣고, 냉각콘덴서가 달린 환류 추출기에서 3시간 끓여 추출한 다음, 100메쉬 여과포로 여과한 후 잔사를 같은 방법으로 1회 더 추출하였다. 각각의 추출액을 합하여 상온에서 화트만(Whatman) 2번 여과지로 여과하여 불용성 물질을 제거한 후, 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 60℃로 감압 농축한 후 동결건조하여 하기 표 1과 같이 각각의 건조 중량을 얻었다.
추출용매 및 추출물의 건조중량
|
삼칠 |
첨과 |
석곡 |
80% 메탄올 |
26g(실시예 1) |
14g(실시예 7) |
11g(실시예 13) |
정제수 |
24g(실시예 2) |
15g(실시예 8) |
13g(실시예 14) |
85% 에탄올 |
27g(실시예 3) |
14g(실시예 9) |
13g(실시예 15) |
70% 아세톤 |
16g(실시예 4) |
18g(실시예 10) |
9g(실시예 16) |
에칠아세테이트 |
15g(실시예 5) |
13g(실시예 11) |
10g(실시예 17) |
포화노말부탄올 |
20g(실시예 6) |
12g(실시예 12) |
12g(실시예 18) |
실험예 1. 세포수준에서의 미백효과
상기 실시예 1-18에 따라 얻어진 각 추출물들을 쥐의 멜라노마 세포(B-16 mouse melanoma cell)의 배양액에 첨가하여 세포수준에서의 미백효과를 실험하였다(Lotan R., Lotan D. Cancer Res. 40:3345-3350, 1980). 실시예 1-18에 따라 얻어진 각 추출물들을 최종농도가 0.005%가 되도록 하여 하이드로퀴논 수용액과 함께 각각 B-16 멜라노마 세포의 배양배지에 첨가하여 3일간 배양한 후 세포들을 트립신(trypsin) 처리하여 배양용기로부터 떼어내 원심분리한 후 멜라닌을 추출 하였다. 이것에 수산화나트륨 용액(1N 농도) 1ml를 가하여 10분간 끓여 멜라닌을 녹이고 분광광도계를 이용, 400나노미터(nm)에서 흡광도를 측정하여 생성된 멜라닌의 양을 단위 세포수당(106 cell)의 흡광도로 나타내는 방법으로 수행하였으며, 대조군에 대한 상대적인 멜라닌 생성량을 저해율(%)로 계산하고, 그 결과를 표 2에 정리하였다.
삼칠 추출물, 첨과 추출물, 석곡 추출물의 세포수준에서의 멜라닌 생성 저해효과
시료 |
멜라닌 생성 |
저해율(%) |
대조군(무첨가) |
0.045±0.004 |
- |
실시예 1(최종농도 0.005%) |
0.030±0.002 |
33% |
실시예 2(최종농도 0.005%) |
0.030±0.003 |
33% |
실시예 3(최종농도 0.005%) |
0.027±0.002 |
40% |
실시예 4(최종농도 0.005%) |
0.025±0.002 |
44% |
실시예 5(최종농도 0.005%) |
0.024±0.003 |
47% |
실시예 6(최종농도 0.005%) |
0.026±0.003 |
42% |
실시예 7(최종농도 0.005%) |
0.036±0.004 |
20% |
실시예 8(최종농도 0.005%) |
0.037±0.002 |
18% |
실시예 9(최종농도 0.005%) |
0.032±0.002 |
29% |
실시예 10(최종농도 0.005%) |
0.030±0.002 |
33% |
실시예 11(최종농도 0.005%) |
0.028±0.002 |
38% |
실시예 12(최종농도 0.005%) |
0.024±0.002 |
47% |
실시예 13(최종농도 0.005%) |
0.027±0.003 |
40% |
실시예 14(최종농도 0.005%) |
0.030±0.004 |
33% |
실시예 15(최종농도 0.005%) |
0.028±0.002 |
38% |
실시예 16(최종농도 0.005%) |
0.023±0.002 |
49% |
실시예 17(최종농도 0.005%) |
0.021±0.002 |
53% |
실시예 18(최종농도 0.005%) |
0.022±0.002 |
51% |
하이드로퀴논(최종농도 0.0001%) |
0.025±0.002 |
44% |
*반복수=3 |
상기 표 2의 결과에서 볼 수 있듯이, 실시예 1-18에 따라 얻어진 각 시료들은 전혀 정제되지 않은 추출물임을 감안하면 기존에 알려진 미백물질인 하이드로퀴논과 비교할 때 배양된 쥐의 멜라노마 세포에 대하여 매우 강력한 멜라닌 생성 억제능이 있음을 알 수 있다.
실험예 2. 멜라닌 생성 억제능 조사
실험예 1과 같은 방법으로 배양된 쥐의 멜라노마 세포에 대하여 실시예 1, 7, 13의 추출물에 대하여 농도에 따른 멜라닌 생성 억제능을 조사하였으며, 그 결과는 하기 표 3과 같다.
농도에 따른 세포수준에서의 멜라닌 생성 저해 효과
시료 |
적용농도(%) |
멜라닌 생성량 |
저해율(%) |
대조군(무첨가) |
- |
0.045±0.004 |
- |
실시예 1 |
최종농도 (0.0005%) |
0.037±0.002 |
18% |
최종농도 (0.005%) |
0.030±0.002 |
33% |
최종농도 (0.05%) |
0.025±0.002 |
44% |
최종농도 (0.5%) |
0.019±0.001 |
58% |
실시예 7 |
최종농도 (0.0005%) |
0.040±0.002 |
11% |
최종농도 (0.005%) |
0.036±0.004 |
20% |
최종농도 (0.05%) |
0.025±0.002 |
44% |
최종농도 (0.5%) |
0.020±0.001 |
56% |
실시예 13 |
최종농도 (0.0005%) |
0.035±0.002 |
22% |
최종농도 (0.005%) |
0.027±0.003 |
40% |
최종농도 (0.05%) |
0.016±0.002 |
64% |
최종농도 (0.5%) |
0.015±0.001 |
67% |
하이드로퀴논 |
(0.0001%) |
0.025±0.002 |
44% |
·반복수=3 |
상기 표 3의 결과에서 볼 수 있듯이, 삼칠 추출물, 첨과 추출물, 석곡 추출물은 배양된 쥐의 멜라노마 세포에 대하여 매우 강력한 멜라닌 생성 억제능을 가지고 있음을 알 수 있다. 하이드로퀴논은 저농도에서 강력한 멜라닌 생성 억제능을 가지지만 세포 독성이 심해 0.0001% 이상에서는 실험을 할 수 없는 것에 반하여, 본 발명에서의 추출물들은 0.05%농도 이상에서도 세포 독성을 나타내지 않으면서 사용가능한 최대량의 하이드로퀴논보다 높은 멜라닌 생성 억제 효과를 갖는다. 또한, 삼칠 추출물, 첨과 추출물, 석곡 추출물이 단일 물질이 아니고 혼합물질이라는 것을 고려할 때 매우 높은 멜라닌 생성 억제능을 가지고 있으므로, 기미나 주근깨
개선 또는 피부미백에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
이하 삼칠, 첨과, 석곡 추출물을 함유하는 화장료의 처방예를 제조예에 의해 나타내었다.
제조예 1-3 및 비교예1
삼칠, 첨과, 석곡 추출물을 함유하는 피부 외용연고 처방예는 다음과 같다. 여기서 삼칠, 첨과, 석곡 추출물은 각각 실시예 5, 11, 17의 것을 말한다.
조성물 |
제조예(중량%) |
비교예 1 |
1 |
2 |
3 |
-추출물 |
|
|
|
|
삼칠 추출물 |
10 |
- |
- |
- |
첨과 추출물 |
- |
10 |
- |
- |
석곡 추출물 |
- |
- |
10 |
- |
-디에틸세바케이트 |
8 |
8 |
8 |
8 |
-경납 |
5 |
5 |
5 |
5 |
-폴리옥시에틸렌올레일에테르 포스페이트 |
6 |
6 |
6 |
6 |
-벤조산 나트륨 |
적량 |
적량 |
적량 |
적량 |
-바셀린 |
to 100 |
to 100 |
to 100 |
to 100 |
제조예 4-6 및 비교예 2
삼칠, 첨과, 석곡 추출물을 함유하는 화장료 중 크림의 처방예는 다음과 같다. 여기서 삼칠, 첨과, 석곡 추출물을 각각 실시예 5, 11, 17의 것을 말한다.
조성물 |
제조예(중량%) |
비교예 2 |
4 |
5 |
6 |
-추출물 |
|
|
|
|
삼칠 추출물 |
1.0 |
- |
- |
- |
첨과 추출물 |
- |
1.0 |
- |
- |
석곡 추출물 |
- |
- |
1.0 |
- |
-스테아린산 |
15.0 |
15.0 |
15.0 |
15.0 |
-세탄올 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
-수산화칼륨 |
0.7 |
0.7 |
0.7 |
0.7 |
-글리세린 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
-프로필렌글리콜 |
3.0 |
3.0 |
3.0 |
3.0 |
-방부제 |
적량 |
적량 |
적량 |
적량 |
-향 |
적량 |
적량 |
적량 |
적량 |
-정제수 |
to 100 |
to 100 |
to 100 |
to 100 |
제조예 7-9 및 비교예 3
삼칠, 첨과, 석곡 추출물을 함유하는 화장료 중 유연화장수의 처방예는 다음과 같다. 여기서 삼칠, 첨과, 석곡 추출물은 각각 실시예 5, 11, 17의 것을 말한다.
조성물 |
제조예(중량%) |
비교예 3 |
7 |
8 |
9 |
-추출물 |
|
|
|
|
삼칠 추출물 |
0.2 |
- |
- |
- |
첨과 추출물 |
- |
0.2 |
- |
- |
석곡 추출물 |
- |
- |
0.2 |
- |
-에탄올 |
10.0 |
10.0 |
10.0 |
10.0 |
-폴리라우린산폴리옥시에틸렌소르비탄 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
-파라옥시안식향산메칠 |
0.2 |
0.2 |
0.2 |
0.2 |
-글리세린 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
-1,3-부틸렌글리콜 |
6.0 |
6.0 |
6.0 |
6.0 |
-향 |
적량 |
적량 |
적량 |
적량 |
-색소 |
적량 |
적량 |
적량 |
적량 |
-정제수 |
to 100 |
to 100 |
to 100 |
to 100 |
제조예 10-12 및 비교예 4
삼칠, 첨과, 석곡 추출물을 함유하는 화장료 중 영양화장수의 처방예는 다음과 같다. 여기서 삼칠, 첨과, 석곡 추출물은 각각 실시예 5, 11, 17의 것을 말한다.
조성물 |
제조예(중량%) |
비교예 4 |
10 |
11 |
12 |
-추출물 |
|
|
|
|
삼칠 추출물 |
0.1 |
- |
- |
- |
첨과 추출물 |
- |
0.1 |
- |
- |
석곡 추출물 |
- |
- |
0.1 |
- |
-와셀린 |
2.0 |
2.0 |
2.0 |
2.0 |
-세스퀴올레인산소르비탄 |
0.8 |
0.8 |
0.8 |
0.8 |
-폴리옥시에틸렌올레일에틸 |
1.2 |
1.2 |
1.2 |
1.2 |
-파라옥시안식향산메칠 |
적량 |
적량 |
적량 |
적량 |
-프로필렌글리콜 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
-에탄올 |
3.2 |
3.2 |
3.2 |
3.2 |
-카르복시비닐폴리머 |
18.0 |
18.0 |
18.0 |
18.0 |
-수산환칼륨 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
-색소 |
적량 |
적량 |
적량 |
적량 |
-향 |
적량 |
적량 |
적량 |
적량 |
-정제수 |
to 100 |
to 100 |
to 100 |
to 100 |
제조예13-15 및 비교예 5
삼칠, 첨과, 석곡 추출물을 함유하는 화장료 중 팩의 처방예는 다음과 같다. 여기서 삼칠, 첨과, 석곡 추출물은 각각 실시예 5, 11, 17의 것을 말한다.
조성물 |
제조예(중량%) |
비교예 5 |
13 |
14 |
15 |
-추출물 |
|
|
|
|
삼칠 추출물 |
0.5 |
- |
- |
- |
첨과 추출물 |
- |
0.5 |
- |
- |
석곡 추출물 |
- |
- |
0.5 |
- |
-글리세린 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
-프로필렌글리콜 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
-폴리비닐알코올 |
15.0 |
15.0 |
15.0 |
15.0 |
-에탄올 |
8.0 |
8.0 |
8.0 |
8.0 |
-폴리옥시에틸렌올레일에칠 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
-파라옥시안식향산메칠 |
0.2 |
0.2 |
0.2 |
0.2 |
-향 |
적량 |
적량 |
적량 |
적량 |
-색소 |
적량 |
적량 |
적량 |
적량 |
-정제수 |
to 100 |
to 100 |
to 100 |
to 100 |
제조예 16-18 및 비교예 6
삼칠, 첨과, 석곡 추출물을 함유하는 화장료 중 에센스의 처방예는 다음과 같다. 여기서 삼칠, 첨과, 석곡 추출물은 각각 실시예 5, 11, 17의 것을 말한다.
조성물 |
제조예(중량%) |
비교예 6 |
16 |
17 |
18 |
-추출물 |
|
|
|
|
삼칠 추출물 |
5 |
- |
- |
- |
첨과 추출물 |
- |
5 |
- |
- |
석곡 추출물 |
- |
- |
5 |
- |
-프로필렌글리콜 |
10.0 |
10.0 |
10.0 |
10.0 |
-글리세린 |
10.0 |
10.0 |
10.0 |
10.0 |
-히아루론산나트륨수용액(1%) |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
-에탄올 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
-폴리옥시에틸렌경화피마자유 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
-파라옥시안식향산메칠 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
-향 |
적량 |
적량 |
적량 |
적량 |
-정제수 |
to 100 |
to 100 |
to 100 |
to 100 |
실험예 3. 색소 침착 저해효과 측정
건강한 남녀 20명씩을 선정하여 양팔의 하박부에 직경 7mm 크기의 구멍이 6개씩 2줄로 파인 알루미늄 호일을 붙이고, 팔에서 10cm 떨어진 거리에서 ORIEL solar simulator 1000W를 사용하여 60mJ/cm2의 광량을 조사하였다. 조사전에 70% 에탄올 수용액으로 조사부위를 잘 세척하였다. 조사하기 3일전부터 조사 후 3주째까지 1일 2회씩 제조예 1-18 및 비교예 1-6에 따라 제조된 삼칠, 첨과, 석곡 추출물을 함유한 시료와 각각의 추출물이 함유되지 않은 기제를 한쌍으로 같은 줄에 도포하였다(제조예 13, 14, 15 및 비교예 5의 팩 처방의 경우 도포한 다음 15분 후에 떼어내었다). 각각에 대하여 제조예와 비교예의 색소 침착도를 육안으로 판정하고, 제조예가 비교예에 비해 색소침착을 억제한 정도를 뚜렷한 효과, 효과있음, 차이없음의 3단계로 평가하였으며, 그 결과는 하기 표 4와 같다.
삼칠, 첨과, 석곡 추출물을 함유한 연고 및 화장료의 색소 침착 저해 효과
실험물질 |
뚜렷한 효과(명) |
효과있음(명) |
차이없음(명) |
제조예 1 |
3 |
12 |
5 |
제조예 2 |
2 |
11 |
7 |
제조예 3 |
4 |
10 |
6 |
제조예 4 |
2 |
9 |
9 |
제조예 5 |
2 |
10 |
8 |
제조예 6 |
2 |
9 |
9 |
제조예 7 |
1 |
9 |
10 |
제조예 8 |
1 |
9 |
10 |
제조예 9 |
2 |
9 |
9 |
제조예 10 |
0 |
9 |
11 |
제조예 11 |
1 |
10 |
9 |
제조예 12 |
1 |
9 |
10 |
제조예 13 |
1 |
9 |
10 |
제조예 14 |
1 |
10 |
9 |
제조예 15 |
1 |
11 |
8 |
제조예 16 |
2 |
7 |
11 |
제조예 17 |
2 |
8 |
10 |
제조예 18 |
3 |
8 |
9 |
상기 표 4의 결과에서 볼 수 있듯이, 제조예 1-18에 따라 제조된 삼칠, 첨과, 석곡 추출물 함유 미백연고 및 화장료는 피시험자 20명 중에서 최소 9명 이상 에 대하여 미백 효과를 나타내었으며, 특히 많은 양의 삼칠, 첨과, 석곡 추출물이 적용된 제조예 1, 2, 3과 비교예 1의 비교 실험에서는 65%가 색소 침착 저해 효과를 보이고, 피부내에서 어떤 부작용도 나타나지 않아, 삼칠, 첨과, 석곡 추출물이 안전하고 효과가 매우 뛰어난 기미나 주근깨 개선 및 피부 미백용 화장료임을 알 수 있다.